Abdul-Khaliq, Hashim: Untersuchungen zur Entwicklung neuroprotektiver Strategien bei operativer Behandlung angeborener Herzfehler

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Kapitel 5. Biochemische Marker für die Hirnschädigung nach Korrekturoperationen angeborener Herzfehler

5.1 Protein S-100B

Die S-100-Familie der Ca-bindenden Proteine enthalten 16 Mitglieder mit unterschiedlicher Organexpression und zellulären und extrazellulären Funktionen . Das Protein S-100 wurde bereits 1965 von Moore aus Rinderhirn isoliert und erhielt seinen Namen aufgrund seiner Löslichkeit (Solubility) in 100%igem Ammoniumsulfat . Das Protein S-100 ist in drei Isomeren (alphaalpha (S-100ao), betabeta (S-100B), alphabeta (S-100a)) in verschiedenen Organen und Geweben vorhanden . Das Dimer S-100B hat ein Molekulargewicht von ca. 21 kD und kommt reichlich in den Astrogliazellen des Nervensystems (80%) neben zusätzlich S-100alpha (20%) vor . Das Protein S-100B ist zum größten Teil intrazellulär vorhanden, wird jedoch sowohl unter physiologischen als auch nicht-physiologischen Bedingungen in den extrazellulären Raum freigesetzt .

Mehrere Funktionen wurden dem intrazellulären Protein S-100B im Zentralnervensystem durch Identifikation von Zielproteinen zugeschrieben . Das Ca++-bindende Protein S-100 kann bei der Regulation der intrazellulären Ca++-Hämeostase in physiologischen und ischämischen Zuständen eine Rolle spielen . In Vitro S-100B triggert den Ca++-Einstrom in die PC12 Zellen und induziert dabei einen cytotoxischen Effekt . Ähnliche Wirkung in vivo wird vermutet . Weitere Funktionen wie Hemmung der Phosphorylisation und axonale Proliferation von Microtubuli wurden nachgewiesen . In vitro wurde nicht nur ein neuroprotektiver Effekt in niedrigeren Konzentrationen (pM-nM), sondern auch ein toxischer Effekt durch Induktion eines apoptotischen Zelltods der Astrozyten in höheren Konzentrationen (µM) beobachtet . Die Apoptoseinduktion durch S-100 in vitro wird durch Erhöhung der intrazellulären Ca++-Konzentration und durch Aktivierung der NO-Synthase vermutet .

Erhöhte S-100B-Konzentrationen wurden im Serum und/oder Liquor bei Patienten mit neurologischen Affektionen und neurodegenerativen Erkrankungen wie Schizophrenie , Alzheimer , Trisomie 21 , Epilepsie , Creutzfeldt-Jakob-Krankheit Meningitis und amyotrophische Lateralsklerose gefunden . Diese Erkenntnisse in klinischen und experimentellen Studien über das Verhalten des S-100B weisen auf eine wichtige Rolle des Proteins S-100B in physiologischen und pathologischen Prozessen im Zentralnervensystem hin.

Da die Astroglia etwa die Hälfte der Hirnmasse ausmacht und sich nicht auf ein bestimmtes Hirnareal beschränkt, erscheint die Bestimmung eines Zellproteins dieser Zellen von diagnostischer


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neurologischer Bedeutung. Der genaue Mechanismus der Freisetzung des Proteins S-100B in die Blutbahn im Zusammenhang mit zerebraler Ischämie während der extrakorporalen Zirkulation ist unklar.

5.1.1 S-100B Serumwerte nach herzchirurgischen Eingriffen im Kleinkindesalter

Die frühzeitige Erkennung von zerebralen Schädigungen durch einen zusätzlichen spezifischen biochemischen Hirnzellmarker könnte von besonderer diagnostischer und prognostischer Bedeutung sein. Mehrere klinische Studien bei Erwachsenen und Kindern wiesen bereits auf die Spezifität und den neurologisch prädiktiven Wert des Protein S-100B nach herzchirurgischen Eingriffen hin . Andere Studien bei Erwachsenen zweifelten am diagnostischen Wert nach herzchirurgischen Eingriffen wegen möglicher Kontamination der gemessenen Werte mit Protein S-100 aus anderen Quellen, wie Fettzellen, wenn das abgesaugte Blut aus dem Thoraxbereich in den Patienten reperfundiert wird .

Die klinischen und experimentellen Untersuchungen in dieser Arbeit dienten daher der Charakterisierung des Zeitverlaufs der Serumwerte nach EKZ, der Evaluierung von Einflussfaktoren und der Untersuchung der neurologischen Bedeutsamkeit der Bestimmung dieser Hirnmarker nach herzchirurgischen Eingriffen im Kleinkindesalter. Im experimentellen Teil werden die neuropathologischen und immunhistochemischen Zusammenhänge mit dem Nachweis des Proteins S-100B im Serum untersucht.

5.1.2 Methode

An einem größeren Patientenkollektiv sollte im Rahmen der Bestimmung des Proteins S-100B als Screeningmarker für eventuelle zerebrale Schädigung nach den herzchirurgischen Eingriffen das Verlaufsmuster untersucht und definiert werden. In bestimmten Untergruppen von Kindern wurde der EinFluss von Medikamenten, intraoperativen Maßnahmen, und der Zusammenhang zur Veränderung in der zerebralen Perfusion und Oxygenation untersucht.


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Tabelle 5.1.1:

In diese Studie wurden 165 Kinder eingeschlossen. Die Patienten wurden nach den vorgesehenen chirurgischen Maßnahmen in sieben homogene Gruppen unterteilt ( Tabelle 5.1.1: ). Alle Patienten, mit Ausnahme der Gruppe mit hypoplastischem Linksherzsyndrom, wurden ohne Kreislaufstillstand mit Hilfe der EKZ operiert ( Tabelle 5.1.1: ). Vierzehn Kinder mit geplanter Korrekturoperation einer Isthmusstenose der Aorta ohne Einsatz der EKZ dienten als Kontrollgruppe ( Tabelle 5.1.1: ).

Zwölf Kinder entwickelten während der postoperativen Phase neurologische Komplikationen im Zusammenhang mit dem chirurgischen Procedere unterschiedlicher Art und wurden in eine separate.Gruppe eingeschlossen ( Tabelle 5.1.1 ). Bei diesen Kindern sollte das Verlaufsmuster des Proteins S-100B in Gegenüberstellung zu dem der Kinder ohne neurologische Komplikationen verglichen werden. Die Blutentnahmen erfolgten vor der Operation, 2, 24, 48, 72 Stunden nach Ende der EKZ. Das Serumprotein S-100B wurde mit Hilfe eines LIA Kitts (Byk-Sangtec®, Dietzenbach, Deutschland) gemessen. Alle Kinder wurden, mit Ausnahme der Säuglinge mit einer ISTA, mit Hilfe der extrakorporalen Zirkulation in tiefer Hypothermie bis Normothermie je nach Alter und Art des angeborenen Herzfehlers operiert ( Tabelle 5.1.1 ). Die Regulation des Säure-Basen-Haushaltes erfolgte nach der Alpha-Stat-Methode, bei der pCO2 und pH unkorrigiert für die absinkende Temperatur während der extrakorporalen Zirkulation gehalten werden.


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5.1.3 Ergebnisse

Die präoperativen Werte waren gewichts- (r= -0.46, p=0.007) und altersabhängig (r= -0.46, p=0.004). Im Gegensatz zur Kontrollgruppe mit einer Isthmusstenose zeigte sich bei allen Kindern nach Korrekturoperationen mit Hilfe der EKZ ein signifikanter Anstieg der S-100B-Konzentrationen unmittelbar nach Ende der Operation ( Abbildung 5.1.1 ). Die höchsten postoperativen Serumwerte des Proteins S-100B wurden bei Neonaten nach Korrekturoperationen komplexer Vitien wie der d-Transposition der großen Arterien und dem hypoplastischen Linksherzsyndrom, die längeren Bypasszeiten und tieferen Temperaturen unterzogen wurden, gefunden ( Abbildung 5.1.1 , Tabelle 5.1.1 ). Die postoperativen Werte korrelierten mit dem Alter (r=-0,55, p=0,0003), Gewicht (r=-0,54, p=0,0003), Bypasszeit (r=0,52, p00,0006) und der mit minimalen rektalen Temperatur während derEKZ (r=-0,63, p=0,0003).

Abbildung 5.1.1: : Serum Konzentrationen des Proteins S-100B (Mittelwerte±SE) bei Kindern ohne neurologische oder kardiorespiratorische Komplikationen vor und nach Korrekturoperationen verschiedener Herzfehler mit Hilfe der extrakorporalen Zirkulation (EKZ) im Vergleich mit einer Kontrollgruppe mit einer Aortenisthmusstenose (ISTA) ohne EKZ. Bei allen Gruppen, mit Ausnahme der Säuglinge mit ISTA, stieg das S-100B nach der Operation signifikant an. Die Serum Konzentrationen waren sowohl vor als auch nach der Operation alters- und gewichtsabhängig. Die höchsten postoperativen Serumkonzentrationen wurden bei den Neugeborenen und Säuglingen nach Korrekturoperatioen komplexer Vitien wie das d-TGA und das HLHS mit Hilfe hypothermer EKZ gemessen.


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Die Multiregressionsanalyse identifizierte jedoch die minimale rektale Temperatur während der EKZ als den größten unabhängigen Faktor, der die postoperative Serumkonzentration signifikant beeinflusst (p<0.001). Abnorm höhere postoperative Serumwerte des Proteins S-100B wurden bei Kindern mit nachgewiesenen neurologischen und hämodynamischen Komplikationen im Zusammenhang mit der Operation und dem Anschluß an der EKZ gefunden ( Abbildung 5.1.2 ).

Abbildung 5.1.2: Im Vergleich mit allen Kinder ohne Komplikationen waren die postoperativen S-100B-Werte bei Kindern mit neuro-logischen oder hämody-namischen Kompli-kationen jenseits der unmittelbaren 2 Stunden nach der EKZ weiterhin abnorm erhöht


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5.2 Zusammenhang zur Veränderung der zerebralen Oxygenation

Der Pathomechanismus neurologischer Morbidität und Beeinträchtigung der psychomotorischen Entwicklung nach herzchirurgischen Eingriffen bei Kindern scheint multifaktoriell zu sein und überwiegend auf globalen oder fokalen hypoxisch-ischämischen Ereignissen während und nach der extrakorporalen Zirkulation zu beruhen . Alterationen des Sauerstoffmetabolismus auf intravaskulärer und interzellulärer zerebraler Ebene scheinen zu diesen Schädigungen beizutragen.

Daher war das Ziel dieser Studie, Zusammenhänge zwischen Konzentration des postoperativen Serumprotein S-100 und möglichen Alterationen der zerebralen Oxygenation während verschiedener Operationsphasen herzchirurgischer Eingriffe im Kindesalter zu untersuchen.

5.2.1 Patienten und Methoden

In dieser Studie wurden 63 Kinder im Alter von 0,2 bis 216 Monaten untersucht und entsprechend dem Operationsalter in drei Gruppen unterteilt ( Tabelle 5.2.1 ). Die kontinuierliche Registrierung der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung wurde mit einem Zerebraloxymeter (INVOS 3100A, Somanetics®, USA) vorgenommen. Bei allen Kindern wurden intraoperativ nach der Einleitung der Narkose, vor dem Start und nach Beendigung der extrakorporalen Zirkulation, am Ende der Operation Blutproben entnommen und unmittelbar danach zentrifugiert und eingefroren.

Tabelle 5.2.1: Demographische Daten

 

tiefe Hypothermie
(n = 10 )

moderate Hypothermie (n= 40)

Normothermie
(n=18 )

Alter (Monaten)

1 (0.2-5)
1.9±1

4 (0.14-207)
60±150

4.5 (1-238)
79±159

Gewicht (Kg)

4.8±2.4

6.2±3.3

9±5

Bypasszeit (Minuten)

229±111

113±64

50±34

Minimale rektale Temperatur (°C)

17.8±3.6

29.1±2

35.6±0.6

Aortenklemmzeit (Minuten)

87±32

54 ±21

17±9

Präoperative SO2 (%)

85±9

92±7

95±8


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5.2.2 Ergebnisse

Bei allen Kindern konnte schon vor dem Start der extrakorporalen Zirkulation S-100 im Serum nachgewiesen werden ( Tabelle 5.2.1 ). Nach der Operation stiegen die S-100-Serumwerte um zwei Standardabweichungen vom präoperativen Wert signifikant an. Der Spearman-Rank-Korrelationstest zeigte einen statistischen Zusammenhang zwischen den postoperativ erhöhten S-100-Serumwerten und der Erniedrigung der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung in der Reperfusionsphase (r=-0,37, p=0,02) und am Ende der extrakorporalen Zirkulation (r=-0,42, p=0,008) (Abb. 5.2-1). Die statistische Beziehung zum Abfall der zerebralen Oxygenation am Ende der Operation war nicht signifikant (r=-29, p=0.08). Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den maximal postoperativen S-100B-Werten und der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung in den übrigen Phasen der extrakorporalen Zirkulation war nicht nachweisbar.

5.3 Zusammenhang zum Sauerstoffradikalmetabolismus

Der Anschluss des Kreislaufs an die EKZ mit Schwankungen in der systemischen Oxygenation und Perfusion führt zur globalen Sauerstoffradikalinduzierten Lipidperoxidation im Gewebe und zum Verbrauch der eigenen antioxidativen Reserven . Die resultierenden nicht-physiologischen Veränderungen in der zerebralen Perfusion und Oxygenation könnten ebenfalls eine Lipidperoxidation auf zerebral-vaskulärer Ebene begünstigen . Ob die Freisetzung des Astrogliazell-Proteinmarkers S-100B durch Membranschädigung des astroglialen Zellkomplexes, der die Blut-Hirnschranke bildet, zustandekommt, ist unklar. Malondialdehyd (MDA) ist ein Abbauendprodukt der O2-Radikal-induzierten Phospholipidperoxidation in der Zellmembran und kann im Serum bestimmt werden. In dieser Studie wurde die Kinetik des MDA in Beziehung zum Serumspiegel des Proteins S-100 in dem zerebral-venösen Blut aus der Vena jugularis interna während und nach EKZ untersucht .

5.3.1 Methode

Bei 56 Kindern (Neugeborene n=7, Säuglinge n=16, und Kleinkinder n=23) wurden serielle Blutproben über einen Jugularis-Katheter zu bestimmten Zeitpunkten der EKZ entnommen und sofort bei 2 °C mit einer Kühlzentrifuge im Operationssaal zentrifugiert und bei -70 °C eingefroren. Die Kinder wurden alle mit Hilfe der EKZ (140-200/kg/min) in tiefer bis moderater Hypothermie (15-34 °C) operiert. Für die Bestimmung von Malondialdehyd werden 100 µl Serum, 750 µl von 150 µM Phosphorsäure, 250 µl von 42 µM Thiobarbitalsäure und 400 µl gereinigtes Wasser zusammengegeben und für eine Stunde im Wasserbad gekocht. Die Reaktion wird durch


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Überführen der Proben auf Eis gestoppt. Direkt im Anschluss wird die Malondialdehyd-Konzentration durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie bestimmt (Fluorometric Detector RF-10A, Column Supercosil 150x4 mm LC-18-S; Shimadzu, Duisburg, Germany).

5.3.2 Ergebnisse

Abbildung 5.3.1: Serumkonzentrationen des astroglialen Proteins S-100B und der simultan gemessenen Konzentrationen des Malondialdehydes (MDA) im Serum während verschiedener Phasen der extrakorporalen Zirkulation (EKZ). Der gleichzeitige Anstieg des Lipidperoxidation-endproduktes MDA und des Proteins S-100B in der Reperfusionsphase weist auf eine O2-Radikalinduzierte Zellmembranschädigung der Astrozyten auf zerebraler Ebene hin

Es zeigte sich eine kontinuierliche parallele Erhöhung beider Marker während der EKZ. Der größte relative Anstieg von S-100 (67%) und MDA (85%) fand jedoch nach Öffnung der Aorta in der Reperfusionsphase und nach Ende der EKZ (P<0.001) statt ( Abbildung 5.3.1 )

Die Abklemmzeit der Aorta (r=0,46, p=0,004) und der Grad der Hypothermie (r=-0,42, p=0,007) hatten den größten Einfluss auf die maximalen MDA-Werte. Die maximalen S-100-Werte korrelierten signifikant zur Bypasszeit (r=0,70, p=0,0007), Abklemmzeit der Aorta (r=0,57, p=0,002), Tiefe der Hypothermie (r=-58, p=0,004) und waren signifikant alters- und gewichtsabhängig(p<0,001).


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Tabelle 5.3.1:

 

Neugeborene
(n = 11 )

Säuglinge
(n= 37)

Kinder >1Jahr
(n=15 )

Alter (Monaten) Median,
Mittelwert ±SD

0,3 (0.2-5)
0,38±0,27

4,0 (1,5-12)
4,8±2,6

34 (12-216)
89±104

Zeit zum Erreichen der minimalen regionalen Hämoglobinsättigung (Minute)

131±112

38±32

23±20

Bypasszeit (Minute)

204±143

113±64

78±34

Minimale rektale Temperature (°C)

23±5,6

29,7±5,7

35.6±0.6

Aortenklemmzeit(Minute)

74±34

52 ±28

17±9

Präoperative SO2 (%)

87±5

93±8

98±5

Präop. Protein S-100 (µg/L)

1,1±0,7

0,65±0,4

0,33±0,14

Postop. Protein S-100 (µg/L)

3,7±1,7

2,1±1,18

1,4±0,75

Diagnosen

d-TGA (n=7), TAPVD (n=2)
IAA (n=2)

AVSD (n=7)
VSD (n=6)
PA (n=5)
TOF (n=4)
d-TGA (n=3)
TAC (n=2)
DORV (n=2)
andere (n=8)

PAPVD (n=2)
TOF (n=5)
ASD (n=4)
DORV (n=1)
andere (n=3)

*. d-TGA = Transposition der großen Arterien in d-Stellung
*. PA = Pulmonalatresie
*. TAPVD = Totale Lungenvenenfehleinmündung
*. AVSD = Atrioventrikulärer Septumdefekt
*. TOF = Fallotsche Tetralogie
*. VSD = Ventrikelseptumdefekt
*. PAPVD= Partielle Lungenvenenfehleinmündung
*. DORV= Double Outlet Right Ventricle
*. ASD= Vorhofseptumdefekt
*. IAA= Unterbrochener Aortenbogen


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5.4 Einfluss der intraoperativen Medikation mit Natrium Nitroprussid auf die postoperativen Serumwerte des S-100B

Die Bildung von Sauerstoffradikalen und die folgende radikalinduzierte Membranzellschädigung ist möglicherweise eine von mehreren Pathomechanismen, die die Integrität der Astrozyten und Endothelzellen nach EKZ beeinflussen . Die Membranzellschädigung des Endothel und der astrozytären Zellen, welche die anatomische und funktionelle Schranke zwischen Blut und Hirnzellen bilden, könnte den Nachweis des Proteins S-100B im Serum erklären .

Natrium Nitroprussid ist ein NO-Spender, der durch Entfaltung seiner Wirkung in den Endothelzellen zu einer Vasodilatation in den Arteriolen und somit zur Verbesserung der Gewebeperfusion führt. Es wird häufig während und nach der EKZ als Nachlastsenker auch bei Neugeborenen eingesezt. In experimentellen Arbeiten wurde ein direkter protektiver Effekt des Natrium-Nitroprussids auf die Astrozyten und Endothelzellen nach Ischämie-Reperfusion nachgewiesen . In diesem Zusammenhang führten wir eine prospektive Studie zur Evaluierung des Effektes einer intra- und postoperativen kontinuierlichen Gabe von Natrium-Nitroprussid auf zerebraler Ebene durch eine serielle Bestimmung des astroglialen Proteins S-100B im Serum durch

5.4.1 Methode

201 Kinder mit angeborenen Herzfehlern wurden vor einem herzchirurgischen Eingriff in zwei Gruppen (mit und ohne Behandlung mit Natrium Nitroprussid) randomisiert. Eine Natrium-Nitroprussid-Infusion wurde bei der behandelten Gruppe (n=99) vor dem Start der EKZ mit geringer Dosierung begonnen und kontinuierlich nach adaptierter Dosierung bis 48 Stunden postoperativ fortgeführt. Das Protein S-100B wurde vor der Operation, 2 Stunden postoperativ und weiterhin täglich bis zum 3. postoperativen Tag bestimmt.

5.4.2 Ergebnisse

Wie in der vorherigen Studie zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Serumwerte des Proteins S-100Bzwei Stunden nach Ende der EKZ. 24 Stunden nach Ende der EKZ fielen die Serumwerte in beiden Gruppen ab. Diese späteren Werte waren jedoch bei den mit Natrium Nitroprussid behandelten Kindern signifikant niedriger (p<0.001) ( Abbildung 5.4.1 ).


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Abbildung 5.4.1: Die kontinuierliche Behandlung mit niedrig konzentrierter Infusion Natrium Nitroprussid (SNP) (1-5 µg/kg/min) scheint die Freisetzung des Proteins S-100B aus den Astrozyten zu hemmen. Eine protektiver Effekt an den Astrozyten-Endothelzellkomplex der Blut-Hirnschranke ist anzunehmen

5.5 Einfluss der modifizierten Ultrafiltration auf die postoperativen Werte des S-100B

Die Vorteile der modifizierten Ultrafiltration (MUF) am Ende der extrakorporalen Zirkulation nach herzchirugischen Eingriffen bei Kindern und Erwachsenen wird neun Jahre nach Einführung der Methode kontrovers diskutiert . Zusätzlich zum Entzug von akkumuliertem Wasser im Gewebe durch die MUF werden inflammatorische Mediatoren und verschiedene Noxen, die während der EKZ freigesetzt werden, eliminiert . Wie bereits im Abschnitt 4.1.2 gezeigt wurde, haben wir keinen unmittelbaren Einfluss der MUF auf die zerebrale Perfusion und Oxygenation festgestellt. Ein hämodynamischer und respiratorischer positiver Effekt wurde innerhalb der postoperativen Intensivphase beobachtet . In dieser Studie sollte der Einfluss der MUF auf die Kinetik des Proteins S-100 untersucht werden.

5.5.1 Modifizierte Ultrafiltration (siehe 4.1.2)

Bei 137 Kinder mit medianem Alter von 4,2 (0,1-70) Monate, und medianem Gewicht von 4,8 (2,5-18,8) Kg wurden nach korrektiven Operationen mit der EKZ in einer Guppe mit (n=62) und ohne MUF (n=75) eingeschlossen. Das Protein S-100B wurde vor der MUF, 2 Stunden nach Ende sowie täglich bis zum 3 postoperativen.Tag bestimmt (Byk-Sangtec® Dietzenbach-Deutschland).


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5.5.2 Ergebnisse

Wie bei allen Untersuchungen stieg die Serumkonzentration des S-100B 2 Stunden nach Ende der EKZ signifikant in beiden Gruppen mit und ohne MUF an ( Abbildung 5.5.1 ). Die Konzentrationen des Proteins S-100B 24 Stunden nach Ende der EKZ bzw. nach Ende der MUF waren jedoch bei den Kindern mit MUF signifikant niedriger (p<0.001) ( Abbildung 5.5.1 ).

Abbildung 5.5.1: Die Serumkonzentrationen des Proteins S-100B vor und nach der modifizierten Ultrafiltration (MUF). Die späteren Serumkonzentration 24 Stunden nach der EKZ waren bei den Kindern mit MUF signifikant niedriger.

Das ultrafiltrierte Volumen ml/kg KG korrelierte mit der postoperativen Serumkonzentration des S-100B 2 Stunden (r= - 0.32, p=0.006), 24 Stunden (r= - 0.46, p=0.001) und 48 Stunden nach der MUF (r= - 0.44, p=0.01).

Beide Gruppen mit und ohne MUF unterschieden sich nicht signifikant hinsichtlich Alter, Gewicht und Bypasszeit und der Medikation mit Suprarenin oder Natrium Nitroprussid.


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