Abdul-Khaliq, Hashim: Untersuchungen zur Entwicklung neuroprotektiver Strategien bei operativer Behandlung angeborener Herzfehler

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Kapitel 6. Neurophysiologische und neuropathologische Untersuchungen während der extrakorporalen Zirkulation mit tief hypothermem Kreislaufstillstand an einem Kleintiermodell

Zusätzlich zu den klinischen Studien zur Evaluierung zerebraler Affektionen und Veränderungen der zerebralen Oxygenation und Perfusion, schien es uns notwendig die Pathomechanismen der Hirnschädigung unter Einsatz der klinisch eingesetzten Methoden im tierexperimentellen Modell weiter zu untersuchen.

Abbildung 5.5.1: Versuchsaufbau in der tierexperimentellen Einrichtung der Charite

In diesem Modell wurden dann die gleichen aufwendigen Bedingungen einer extrakorporalen nicht pulsatilen Zirkulation, unter Einsatz des gleichen Typs der neonatalen Oxygenatoren und Kanülen, in der tier-experimentellen Einrichtung simuliert ( Abbildung 5.5.1 ).

Die umfassenden morphologischen, neurophysiologischen und hämodynamischen Erkenntnisse sollten dann bei der Erprobung und Implementierung neuroprotektiver Strategien herangezogen werden.


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6.1 Extrakorporale Zirkulation mit tief hypothermem Kreislaufstillstand an einem Kaninchenmodell

Das Modell einer extrakorporalen Zirkulation mit tief hypothermem Kreislaufstillstand wurde zuerst am Kaninchen der Rasse Weiße Neuseeländer im Alter von ca. drei Monaten entwickelt und weiter am neonatalen Schwein fortgesetzt. Die Kanülierung des kleinen Herzens und Führung der EKZ an einem Kleintier mit geringem Blutvolumen wurde erfolgreich erprobt. Mit Hilfe dieses Modells konnten neurophysiologische Veränderungen wie die zerebrale Oxygenation und der Modus der initialen Zellschädigung im Zentralnervensystem evaluiert werden. Aufgrund anatomischer und physiologischer Vorteile beim neugeborenen Schwein gegenüber dem Kaninchen wurde das Modell dann mit neugeborenen Schwein fortgesetzt .

6.1.1 Vorbereitung und Narkoseführung

Neugeborene Hausschweine im Alter von weniger als 10 Tagen und einem Gewicht zwischen 1,5-2,8 kg werden aus einem Ferkelzuchtbetrieb im Lande Brandenburg am Versuchstag in die tierexperimentelle Einrichtung eingeliefert und bis zum Aufbau des Versuchs unter einer Wärmelampe gehalten. Die Tiere werden dann mit einer intramuskulären Injektion von Ketanest (25 mg/kgKG) und Dormicum (1 mg/kgKG) zur Einleitung einer Narkose prämediziert. Nach Punktion einer Ohrvene wird die Narkose intravenös mit Fentanyl (50 µg/kgKG) und Midazolam (Dormicum, 0.2 mg/kgKG) bei Relaxierung durch Pancuronium (0.2 mg/kgKG) mit bedarfsadaptierter Supplementierung zur Sicherung einer guten chirurgischen Toleranz vertieft und fortgeführt. Die kontrollierte Beatmung erfolgt nach endotrachealer Intubation mit einem Sauerstoff-Luft-Gemisch (Baby-Log Ventilator, Dräger, Lübeck).

Die Ferkel werden unmittelbar nach der Intubation auf die Seite gelagert, und nach Desinfektion des gesamten Rückens wird eine Lumbalpunktion zur Gewinnung von ca. 0.5-0.8 ml Liquor durchgeführt. Zentrale arterielle und venöse Zugänge werden in die Arteria femoralis und in die Vena subclavia gelegt. Nach Freilegung der Vena jugularis interna wird ein feiner Katheter zur kontinuierlichen Registrierung des venösen Drucks und Entnahme von Blutproben zur Bestimmung des O2-Gehaltes, Glucosekonzentration sowie der verschiedenen Hirnmarker direkt aus dem zerebral venösen Rückstrom vorsichtig bis in den Bulbus jugularis hochgeschoben. Zur Überwachung der Ausscheidung und Urinmenge wird ein suprapubischer Blasen-Katheter gelegt und mit einem Flowmeter verbunden. Die Kerntemperatur wird mit einer rektalen und einer


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ösophagealen Sonde kontinuierlich überwacht. Die pulsoxymetrische Sättigung wird mit einem Lichtsensor am Schwanz ebenfalls kontinuierlich registriert.

Zur Regulierung der rektalen Temperatur wird eine Wärmelampe oberhalb des Tieres und eine Wärmematte auf dem OP-Tisch unterhalb des Tieres nach Bedarf während des Experiments ein- oder ausgeschaltet.

6.1.2 Extrakorporale Zirkulation

Die extrakorporale Zirkulation (EKZ) wird gewährleistet durch eine Rollerpumpe (Stöckert-München) und ein neonatales Oxygenatorensystem (SaveMicro, Polystan, Vaerlose, Dänemark). Die Primeflüssigkeit besteht aus frischem Schweinespenderblut (400-500 ml) mit einem Hämoglobinwert von mehr als 7 mg/dl.

Nach Thorakotomie und Eröffnung des Perikards werden die Aorta ascendens und das rechte Herzohr mit Doppel-U-Nähten (6.0 Prolene) versehen. Dann wird die Aorta mit einer neonaten Aortenkanüle (8 Fr) und der rechte Vorhof mit einer venösen Kanüle (14 Fr) an die EKZ angeschlossen. Nach Start der EKZ wird das Tier über einen Zeitraum von 20 Minuten mit vollem Fluss (200-250 ml/kg/mi) normotherm perfundiert (rektale Temperatur 38 °C) ( Abbildung 6.1.1 ).

Abbildung 6.1.1: Zeitlicher Verlauf der unterschiedlichen Phasen der experimentellen EKZ in Abängigkeit von der Temperatur. Während des gesamten Versuchs erfolgt ein Neuromonitoring mit Hilfe der Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS), der transkraniellen Dopplersonographie und der Mikrosphärenmethode zur Evaluierung der regionalen Hirnperfusion während der EKZ. Blutproben zur Bestimmung biochemischer Marker werden zu definierten Zeitpunkten abgenommen

Nach dieser Stabilisierungsphase von 20 Minuten wird das Tier mit Hilfe der EKZ systemisch innerhalb von 30 Minuten durch Kühlung des venösen Rückflusses auf eine rektale Temperatur von


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13-14°C abgekühlt (Flussrate 200-250 ml/kg/min) ( Abbildung 6.1.1 ). Im Anschluss daran wird ein totaler Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie für 60 bzw. 120 Minuten durch Abstellen der EKZ induziert. Nach langsamer Reperfusion mit kaltem Blut für 10 Minuten und folgender systemischer Erwärmung auf die normale rektale Temperatur von 38 °C über eine Dauer von 45 Minuten wird das Tier von der EKZ entwöhnt und postoperativ für weitere 6 Stunden intensiv-medizinisch überwacht (Abb. 6.2). Die rektale Temperatur wird durch Wärmelampe oberhalb und Wärmematte unterhalb des Tieres nach Bedarf reguliert und auf 37-38 °C gehalten. Der mittlere Perfusionsdruck wird über 60 mmHg gehalten. Die Beatmungsparameter werden nach Blutgasanalyse entsprechend des arteriellen pCO2 und des Säure-Basen-Haushaltes korrigiert.

Während des gesamten Versuchs erfolgt ein Neuromonitoring mit Hilfe der Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS), der transkraniellen Dopplersonographie und der Mikrosphärenmethode zur Evaluierung der regionalen Hirnperfusion während der EKZ. Blutproben zur Bestimmung biochemischer Marker werden zu definierten Zeitpunkten abgenommen ( Abbildung 6.1.1 ).

6.1.3 Neuromonitoring

Während des Experiments werden die bereits klinisch angewandten Neuromonitoring-Methoden wie transkranielle Dopplersonographie und Nahinfrarot-Spektroskopie eingesetzt. Zur Ermittlung der regionalen Hirnperfusion werden zusätzlich fünf unterschiedlich fluoreszierende Mikrosphären verwendet.

6.1.3.1 Transkranielle Dopplersonographie

Während des gesamten Versuchs wird die zerebrale Flussgeschwindigkeit in der Arteria cerebri media (ACM) mit transkranielle Dopplersonographie mit einer gepulsten 2 MHz Ultraschallsonde kontinuierlich registriert (DWL, Sipplingen, Deutschland). Die Sonde wird in der Temporalregion des Kopfes plaziert, das Sample Volume auf 15 mm eingestellt und die Tiefe standardisiert bei 32 mm gehalten. Dies erlaubt eine on-line-Aufnahme der mittleren Flussgeschwindigkeit (Vm) und des pulsatilen Index (PI) vor, während und nach EKZ. PI errechnet sich als:

PI = (Geschwindigkeit des Maximalflusses - Geschwindigkeit des enddiastolischen Flusses)
/ Geschwindigkeit des durchschnittlichen Flusses


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Ein Flussfilter wird verwendet, um die langsamen diastolischen Flussgeschwindigkeiten registrieren zu können. Die Durchschnittswerte von Vm und PI werden alle fünf Minuten in acht Herzzyklen erhoben, um eine repräsentative Tendenz der ursprünglich erhobenen Vm und PI zu ermitteln.

Während der EKZ wurde nur die mittlere Flussgeschwindigkeit zur qualitativen Beurteilung der zerebralen Perfusion herangezogen. Der PI zur Beurteilung der zerebralen Pulsatilität (PI) ist nur bei ausreichender Pulsatilität ohne EKZ-Fluss von Bedeutung.

6.1.4 Nahinfrarot-Spektroskopie (NIRS)

Die regionale intravaskuläre und intrazelluläre Oxygenation wird mit Hilfe der Nahinfrarot-Spektroskopie kontinuierlich überwacht und auf einem Rechner gespeichert (Criticon 2020, Johnson-Johnson, England).

Zur statistischen Auswertung der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung, der simultan erhobenen hämodynamischen Parameter „mittlerer arterieller Druck“ und Hämoglobinkonzentration sowie der rektalen Temperatur wurden charakteristische OP-Phasen während der extrakorporalen Zirkulation ausgewählt und durch repräsentative Werte dargestellt. Für jede der charakteristischen OP-Phasen wurde der Mittelwert einer fünfminütigen kontinuierlichen Registrierung zur weiteren statistischen Auswertung ermittelt .

6.1.5 Evaluierung der regionalen Hirnperfusion mittels Mikrosphären

Die Mikrosphärentechnik kann verwendet werden zur Bestimmung des regionalen Blutflusses, zur Messung von Flussunterschieden im Körper und zur Messung der Auswurfleistung des Herzens. In unserem Falle diente sie der Messung des regionalen Blutflusses im Gehirn. Die Mikrosphären sind kleine runde Partikel (Durchmesser 15 µm ± 0,1 µm SD) aus Polystyren. Sie besitzen eine Dichte von 1,05 g/ml und entsprechen in dieser Eigenschaft in etwa den Blutzellen (1,10 g/ml). Die Mikrosphären werden in 0,15 molarer NaCl-Lösung mit 0,02-0,05% Tween 20 und 0,02% Thimerosal aufbewahrt. Zur Injektion wird circa 1 ml dieser Suspension auf einige ml NaCl-Lösung aufgezogen. Nach intravasaler Gabe werden die Mikrosphären mit dem Blutstrom bis in das Kapillarbett getragen und bleiben dort aufgrund ihrer Größe stecken. Diese Art der Mikroembolisation wird bei den im Versuch verabreichten Mengen strömungstechnisch nicht relevant, macht es jedoch möglich, nach Entnahme des Organs die Mikrosphärenanzahl pro Volumeneinheit Gewebe zu ermitteln. Diese spiegelt die regionale Durchblutung zum Applikationszeitpunkt wieder. Es gibt verschiedene Arten von Mikrosphären, nämlich radioaktiv markierte, gefärbte und fluoreszierende.


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Fünf unterschiedlich fluoreszierende Mikrosphären (FluoSpheres, Molecular Probes Inc., Leiden, Holland) wurden im vorliegenden Falle zur quantitativen Evaluierung der globalen und regionalen Hirnperfusion in den Hauptphasen der EKZ eingesetzt. Die Injektion von 1 ml Mikrosphärensuspension enthält 1,0x106 fluoreszierende Mikrosphären. Die Mikrosphärensuspension wird über fünf Minuten in einem Ultraschallbad vernebelt und danach in die aortale Kanüle über 30 Sekunden injiziert. Gleichzeitig wird eine Blutprobe zur Bestimmung der Referenzwerte der Mikrosphären im arteriellen Blut mit Hilfe eine Absaugpumpe in einem konstanten Fluss von 12 ml/min über zwei Minuten entnommen. Hämodynamische Parameter wie Perfusionsdruck, Flussraten der EKZ und Temperatur werden simultan registriert. Nach Ende des Akutversuchs werden Proben aus den unterschiedlichen Hirnarealen entnommen, zugeschnitten und für die Extraktion und Messung der regionalen Konzentration der unterschiedlichen Mikrosphären für die unterschiedlichen Phasen der EKZ durch Tiefgefrieren bei -75°C konserviert.

Zum Aufarbeiten wird jede Hirnprobe in ein mit Natronlauge (NaOH) gefülltes Reagenzglas gegeben und über Nacht unter einem Abzug bei 45°C inkubiert. Dies führt durch Auflösung des Gewebes zur Bildung einer filtrierbaren Suspension. Nach beendeter Mazeration werden die verdauten Proben mit Hilfe einer Millipore-Vakuum-Pumpe unter Verwendung von Filterpapieren mit einer Porengröße von 10 µm von den Mikrosphären getrennt. Die Sphären tragenden Filterpapiere werden vorsichtig zweimal in der Mitte gefaltet, so dass die Mikrosphären innen liegen, und in ein kubisch zulaufendes Reagenzglas gegeben. In einem Trockenschrank trocknen sie daraufhin 15 Minuten lang bei 50°C. Dann wird auf jedes Filterpapier gleichmäßig eine genau definierte Menge Lösungsmittel (100 µl 2-Ethoxyäthyl-Acetat oder Xylen) gegeben und das Reagenzglas für 30 Sekunden auf einem Vortexgerät geschüttelt. Danach wird der gesamte Inhalt fünf Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert und der Überstand wiederum in ein Reagenzglas abpipettiert. Um sicherzugehen, dass die Lösung aus Dye (Farbstoff) und Lösungsmittel gänzlich von Partikeln befreit wird, zentrifugiert man noch einmal drei Minuten lang bei einer Beschleunigung von 2000 g. Der Überstand wird in eine 100 µl-Quarzküvette pipettiert. Dieses Vorgehen führt zu einem kompletten Lösen des Farbstoffs aus den Mikrosphären. Das überstehende Lösungsmittel mit dem gelösten Farbstoff wird abpipettiert und das Extinktionsspektrum der Flüssigkeit im Spektrometer gemessen.

Zur Messung der Extinktionsspektra kann nahezu jedes Fluoreszensspektrometer verwendet werden, das im Wellenlängenbereich von 350 - 750 nm misst. Wir verwendeten das Luminiszenz-Spektrometer LS 50 B (Perkin Elmer). Bei Messung der Proben erhält man ein aus den verschiedenen einzelnen Spektra der in der Gehirnprobe enthaltenen Mikrosphären ein


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zusammengesetztes Spektrum (Composit-Spektrum). In dem von uns genutzten Gerät haben wir ein Softwareprogramm installiert, das ein Composit-Spektrum in die einzelnen Spektra auseinanderdividieren kann. Weiterhin kann die Absaugrate der Blutproben (7,8 ml/min) eingegeben werden. Aus der Absaug-Rate (R), dem Spektrum der Blutprobe (S ref) und dem Composit-Spektrum (S i) kann so der Blutfluss zu der betreffenden Hirnprobe (F i) errechnet werden:

F i = (S i) (R) / (S ref) [ml/min]. Durch Eingabe des Gewichts der Gewebeproben wird der regionale Blutfluss (RBF [ml/min*g]) berechnet.

6.1.6 Biochemische Marker für die zerebrale Ischämie

Blutproben werden aus dem zerebralvenösen Rückstrom zu definierten Zeitpunkten durch die sondierte Vena jugularis interna aus dem Bulbus jugularis entnommen (Abb. 6.2). Die Blutproben werden zentrifugiert und sofort bei -75 °C gelagert. Das Astrogliazellprotein S-100B und die neurale spezifische Enolase (NSE) werden im Serum und Liquor mit Hilfe eines LIA Kitts bestimmt (Byk-Sangtec, Dietzenbach, Deutschland). Die neuralen Marker Parvalbumin und Calretinin, die spezifisch in Subpopulationen einiger Neurone im Gehirn vorkommen, werden durch neuentwickelte Antikörper in Zusammenarbeit mit Prof. Marco Celio von der Universität Fribourg in der Schweiz bestimmt. Der Sauerstoffradikalmetabolismus wird anhand der Bestimmung der Konzentrationen von Malondialdehyd im Serum und Liquor bestimmt (siehe 5.3). Verfügbare immunologische Parameter für Schweine sind Interleukin 8 (IL-8) und der Tumor-Nekrosefaktor-Alpha (TNF-alpha). Diese Cytokine werden mit Hilfe eines Elisa Kitts (CytoScreen, Biosource, Solingen, Deutschland) in dem immunologischen Labor des Instituts für klinische Immunologie der Charité bestimmt.


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Thu Dec 12 10:42:55 2002