Abdul-Khaliq, Hashim: Untersuchungen zur Entwicklung neuroprotektiver Strategien bei operativer Behandlung angeborener Herzfehler

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Kapitel 7. Morphologie des Gehirns nach extrakorporaler Zirkulation und tief hypothermem Kreislaufstillstand

7.1 Histologie

Der Schädel wird eröffnet, das Gehirn sorgsam entfernt und sofort auf Eis gelegt. Die Hälfte des Gehirns wird in standardisierten repräsentativen koronaren Scheibchen geschnitten, mit Gelmedium umgeben und sofort auf Trockeneis für spätere molekulargenetische Untersuchungen bei -80 °C aufbewahrt. Die andere Hälfte wird nach Kühlung des Gehirns auf Eis für ca. 10 Minuten in einem Lösungsgemisch aus Paraformaldehyde, Glutaraldehyde 25% und Pikrinsäure mit einem neutralen pH (7,4) (SOMOGYI-Lösung) bei einer Temperatur von 4 °C bis zur Einbettung und immunhistochemischen Färbung sowie elektronenmikroskopischen Bearbeitung für 48 Stunden fixiert. Die Gewebeproben für Lichtmikroskopie werden in Paraffin eingebettet, von denen später 6 µm dünne Schnitte gefertigt und mit Haematoxylin und Eosin gefärbt werden.

Abbildung 7.1.1:

Für die Quantifizierung der hypoxischen und apoptotischen Neuronen wurden in 40facher Vergrößerung die einzelnen Sektoren des Ammonshorns (CA1-CA4) sowie des Gyrus Dentatus und Subiculum in einem Gitterfeld von 100 Quadraten beurteilt ( Abbildung 7.1.1 ).

In 10 Quadraten wurden mindestens 500-600 Neurone gezählt. Der Anteil der hypoxischen Neurone aus der Gesamtzahl der gezählten normalen Neuronen wurde in Prozent angegeben. Die Klassifizierung der hypoxischen Schädigung in jedem Sektor wurde nach einer Skala von 0-4 wie folgend beurteilt: 0; keine hypoxischen Neurone, 1; hypoxische Neurone <25%, 2; hypoxische Neurone 25-50%, 3; hypoxische Neurone 50-75%, 4; hypoxische Neurone >75%.


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7.1.1 Protein S-100B

Das Protein S-100B ist überwiegend in den Astrogliazellen und Schwannzellen lokalisiert . Die Astrozytenreaktivität wird immunhistochemisch mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen das Protein S-100B in fixierten und in Paraffin eingebetteten Schnitten nachgewiesen (DPC® Immustain, code CKS1S, DPC, Los Angeles, USA). Da das Protein S-100 wasserlöslich ist, findet sich nach dervEKZ eine Anfärbung nicht nur im Zytoplasma der Astrozyten sondern auch im extrazellulären Raum ( Abbildung 7.1.2 ).

Abbildung 7.1.2: Immunhistochemische Färbung der Astrozyten (A) im Hippocampus. Das Protein S-100B ist rot in den Atsrozyten und ihren Fortsätzen rot gefärbt (Pfeil). Die topographische Beziehung zwischen den Astrozyten und den Kapillaren könnte den Mechanismus der Freisetzung des S-100B aus den Astrozyten in die Blutbahn zum Teil erklären.

7.1.2 Neuronenspezifische Enolase (NSE)

Monoklonale Maus-anti-human-NSE-Antikörper wurden in Paraffinschnitten eingesetzt, um die Lokalisation der NSE in den Neuronen zu identifizieren (DAKO-NSE, H14, Code No.M 873 Lot No.120). Die Enolasen sind Homo- oder Heterodimere, bestehend aus 3 Subeinheiten. Die Gamma-Subeinheit ist nur in den Neuronen vorhanden. Gamma-Gamma kann auch in anderen Zellen, wie Thrombozyten oder Megakaryozyten, T-Zellen und glatter Muskulatur vorkommen . Verlust oder Verblassen der Immunfärbung wurde als neuronale Schädigung interpretiert.


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7.1.3 Parvalbumin

Das neuronale Ca++-bindende Protein Parvalbumin wurde mit Hilfe monoklonaler Maus-Antikörper in Schnitten von fixiertem und in Paraffin eingebetteten Hirngewebe nachgewiesen (S. Want, Swiss antibodies, Bellinzona, Switzerland). Der monoklonale Antikörper Mouse IgG1 wird durch Hybridisierung von Myelomzellen mit Milzzellen aus Mäusen, die vorher mit Parvalbumin aus Karpfenmuskeln immuniziert wurden, gewonnen . Antikörper gegen das Parvalbumin reagieren spezifisch gegen die Ca-Bindungsstelle an dem Protein . Die Bindungsstelle kann dann indirekt durch Immunoperoxidase-Färbung sichtbar gemacht werden.

Ähnlich wie bei NSE wurde ein Verlust oder Verblassen der Immunfärbung in den angefertigten Schnitten als Zellschädigung interpretiert.

7.2 Elektronenmikroskopie

Für die Elektronenmikroskopie werden standardisierte Regionen im Hippocampus, Gyrus cinguli, Stammganglien und Kleinhirn zugeschnitten, dehydriert und dann in Araldite eingebettet. Anschließend werden Semi-Dünnschnitte angefertigt und mit Toluidinblau angefärbt. Ultradünnschnitte werden aus ausgewählten Regionen angefertigt, im EM 10 mikroskopiert und dokumentiert.

7.3 Modus der neuronalen Zellschädigung nach extrakorporaler Zirkulation und tief hypothermem Kreislaufstillstand

Die neuronale Zellschädigung nach der extrakorporalen Zirkulation mit ausreichendem Fluss und normalem Perfusionsdruck ist als minimal anzusehen und nach einer Überlebenssdauer von sechs Stunden nicht sicher zu beurteilen. Signifikante neuronale Schädigungen treten dann auf, wenn die zerebrale Perfusion fokal oder global während der EKZ gestört ist. Daher war es notwendig, das Zentralnervensystem während standardisierter Perioden von extremen Situationen wie Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie zu untersuchen. Dieser Kreislaufstillstand wird weiterhin bei der operativen Korrektur komplexer Vitien wie hypoplastischem Linksherzsyndrom und totaler Lungenvenenfehleinmündung eingesetzt.


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7.3.1 Nekrose

Die Ischämie ist definiert als ein Abfall der zerebralen Perfusion unter einem kritischen Punkt, an dem der Energiebedarf zur Erhaltung einer funktionellen und strukturellen Integrität der Hirnzellen nicht gewährleistet werden kann. Die Manifestation der hypoxisch-ischämischen Schädigung in den neuronalen und astroglialen Zellen kann sofort oder verzögert, nach Stunden oder Tagen, auftreten . Die Mechanismen der Hirnzellschädigung und der Neuronenverlust nach einem hypoxisch-ischämischen Ereignis sind multifaktoriell. Einströme von Ca++-Ionen in die Zelle oder erhöhte intrazelluläre Freisetzung von Ca++-Ionen wird als eine auslösende Ursache des frühen und verzögerten Zelltodes angesehen . Die vermehrten Ca++-Ionen in den Zellen oder Zellorganellen führen zu einer enzymatischen Aktivierung von Lipasen, Proteasen und Endonucleasen, durch die es wiederum zum Abbau von Membranlipiden, des Zytoskeletts und zur Zerstörung der DNA kommt . Zusätzlich führt die ischämie-bedingte Hyperkalzämie zur Supression der Proteinsynthese und damit insgesamt zu einer Beschleunigung des Zelltodes .

Die hypoxisch nekrotisch veränderten Neurone werden in Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung ausgewertet. Die hypoxischen Neurone werden quantitativ morphometrisch in der Region des Hippocampus, Großhirns und der Stammganglien erfasst. Es werden pro Region 500 Neurone hinsichtlich nekrotischer Veränderungen gezählt und beurteilt.

Der hypoxisch bedingte nekrotische Zelltod ist lichtmikroskopisch charakterisiert durch Eosinophilie des Zytoplasmas, Zellschrumpfung und Kernveränderungen in Form von Kernpyknose und Kernbasophilie (Abb. 7.3.1). Ultrastrukturell wurde eine Schwellung und Dilatation der Mitochondrien und anderen Zellorganellen sowie eine Zellmembranruptur beobachtet.

7.3.2 Apoptose

Der Begriff Apoptose "griechisch, Herabfallen" wurde erstmal von Kerr und seinen Mitarbeitern als Bezeichnung für eine aktive Form des Zellunterganges neben der Nekrose geprägt . Im Gegensatz zum passiven nekrotischen Zelluntergang ist die Apoptose ein aktiver energieabhängiger Prozess der Zellzerstörung, welcher unter anderem auch physiologisch im gesunden Gewebe vorkommt . Morphologisch ist Apoptose im Gegesatz zur Nekrose durch Genomfragmentation, Zellschrumpfung und initialen Erhalt der Zellorganellen und der Zellmembran charakterisiert . Der apoptotische Zelltod bzw. der verzögert-genetisch programmierte Zelltod wird durch die mitochondriale Dysfunktion und Freisetzung des Apoptose-induzierten Faktors Cytochrom c aus den geschwollenen Mitochondrien getriggert .


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Wenn die Mitochondrien nach einer Ischämie-Reperfusions-Phase einer Akkumulation von Ca++-Ionen oder oxidativem Stress durch Sauerstoffradikale ausgesetzt sind, öffnen sich in der mitochondrialen Membran die sogenannten Ca++-Poren (mitochondrial permeability transition pore MPT), die zum Kollaps des Membranpotentials, zum Abbruch der ATP-Synthese und zur Freisetzung von Cytochrom c führen . Cytochrom c aktiviert eine Reihe von Enzymen des Transkriptionsfaktors, die zur Zerstückelung und Auflösung der DNA führen .

Es wird vermutet, dass die mitochondriale Membranfunktion zum Teil durch die antiapoptotischen Gene der Bcl-2 Familie kontrolliert wird . Hemmung der Expression dieser antiapoptotischen Gene wie BcL-2 und Bcl-XL zugunsten der pro-apoptotischen Gene Bax und FAS führt demnach zur Induktion der Apoptose in den Hirnzellen .

Die morphologischen Aspekte des apoptotischen Zelltodes umfassen lichtmikroskopisch die Kriterien der Zellschrumpfung unter Erhalt der Zellmembran mit charakteristischen Kernveränderungen in Form von Heterochromatisation (DNA-Fragmentation) . Der fragmentierte Kerninhalt erscheint als Chromatin-Körperchen oder apoptotic bodies . Bei der Apoptose liegen neben der Zellschrumpfung auch Oberflächenveränderungen vor, wobei Materialien, die aus der Zelle stammen, an der Oberfläche präsentiert werden.

Der apoptotische neuronale Zelltod wird nach der TUNEL-Methode (terminal transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling) (Boehringer, Mannheim, Germany) gefärbt. Die morphologischen Aspekte der Apoptose werden in Semi-Dünnschnitten weiter beurteilt und bestätigt.


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7.4 Ergebnisse

7.4.1 Schädigungsmuster im Zentralnervensystem nach EKZ und tief hypothermem Kreislaufstillstand

7.4.1.1 Morphologische Aspekte nach EKZ

Bei den untersuchten Tieren ohne hämodynamische oder respiratorische Komplikationen wurde, außer einer mässig diffusen Schwellung in den astrozytären Zellanteilen im perivaskulären Regionen, keine signifikante neuronale Zellschädigung in den untersuchten Hirnregionen festgestellt.

7.4.1.2 Morphologische Aspekte nach tief hypothermem Kreislaufstillstand

Nach der Induktion einer Stillstandsphase der gesamten Zirkulation von 60 Minuten in tiefer Hypothermie war eine signifikante neuronale Zellschädigung zu erwarten. Die quantitative Bewertung der neuropathologischen Aspekte in den untersuchten Regionen besonders im Hippocampus zeigte erstaunlicherweise keinen Hinweis auf signifikante hypoxische Schädigung der Neuronen nach unkomplizierten Experimenten mit einem tief hypothermen Kreislaufstillstand von 60 Minuten . Der Anteil der hypoxisch-nekrotischen Neuronen betrug ca. 5%. Die neuropathologischen Veränderungen dominierten jedoch in den Astrogliazellen in Form von Schwellung der Astrozyten und ihrer Fortsätze im perivaskulären Bereich . Neuronale Zellnekrose oder Apoptose trat nur vereinzelt auf.


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Abbildung 7.4.1: : Morphologische Veränderung in den Neuronen der CA1- Region des Hippocampus bei einem Tier nach 60 bzw. 120 Minuten in tief hypothermem Kreislaufstillstand (THKS). Nach verlängertem Kreislaufstillstand von 120 Minuten ist hypoxisch bedingte nekrotische Zelltod lichtmikroskopisch, charakterisiert durch Eosinophilie des Zytoplasmas, Zellschrumpfung und Kernveränderungen, deutlich in den meisten Neuronen sichtbar.

Der Anteil der neuronalen Zellnekrose stieg jedoch nach Verlängerung des Kreislaufstillstandes in CA4 des Hippocampus von 5% auf 80%. Zusätzlich war der Anteil von apoptotischen Neuronen im Gyrus dyntatus deutlich sichtbar . Embolische Infarkte fanden sich weder makroskopisch noch mikroskopisch in den untersuchten Hirnarealen. Eine inflammatorische Reaktion der Mikroglia wurde unabhängig von der Ischämiedauer nicht festgestellt.

7.4.2 Zerebrale Oxygenation

Die Veränderungen von Konzentrationen des oxygenierten (HbO2) und deoxygenierten Hämoglobin (deoxy.Hb), der regionalen Hämoglobinsättigung (rSO2) sowie der intrazellulären Cytochromoxydase (Cyt.Ox.aa3) wurden mit einem Zerebraloxymeter (Criticon, Johnson&Johnson) online registriert. (s. 4.3) In beiden Gruppen wurde ein ähnliches Veränderungsmuster der intravaskulären und intrazellulären Oxygenationsparameter während der EKZ und des tiefhypothermen Kreislaufstillstand (THKS) festgestellt ( Abbildung 7.4.2 ). In allen Tieren wurde ein initialer Anstieg von HbO2, rSO2 und ein Abfall von deoxy. Hb während der Kühlungsphase auf 14°C beobachtet (p=0.01). In dieser Phase kam es ebenfalls zu einem geringen Abfall von Cyt.Ox.aa3. ( Abbildung 7.4.2 Trotz der größeren Schwankungen der intravaskulären Hämoglobinparameter zeigte das intrazelluläre Cyt.Ox.aa3-Signal einen signfikanten Abfall erst nach Unterbrechung der Zirkulation während der tiefhypothermen Stillstandsphase .


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Abbildung 7.4.2: Veränderungsmuster in den intravaskulären zerebralen Oxygenationsparametern des oxygen. (HbO2) und deoxyg. Hämoglobins (deoxy.Hb), der regionalen Hämoglobinsättigung (rSO2) sowie der intrazellulären Cytochromoxydase aa3 (Cyt.Ox.aa3). Eine charakteristische Veränderung vom Ausgangswert wurde entsprechend der Hypothermie und Unterbrechung der Zirkulation während des tief hypothermen Kreislaufstillstandes (THKS) gefunden

Nach Beginn des THKS in tiefer Hypothermie kam es zunächst zu einem signifikanten kontinuierlichen Abfall von HbO2 und Cyt.Ox.aa3 (p=0.0001) sowie einem Anstieg von des deoxy.Hb (p=0.01). Der kontinuierliche Abfall der Cyt.Ox.aa3 korrelierte mit der Dauer des Kreislaufstillstandes während der ersten 45 Minuten. Nach ca. 45 Minuten wurde eine Plateauphase ohne weiteren signifikanten Abfall erreicht. In der anschließenden Phase der Reperfusion und Erwärmung stellte sich größtenteils eine Erholung der Cyt.Ox.aa3 Werte ein. Der Ausgangszustand der verschiedenen Parameter wurde jedoch in der postoperativen Phase nach Ende der EKZ erreicht (Abb. 7.2.1).

Die regionale Hämoglobinsättigung (rSO2) repräsentiert die gemischt-venöse Sättigung im zerebral venösen Blut. Wie bei den klinischen Ergebnissen zur Validisierung der transkraniell gemessenen rSO2 mit NIRS fanden wir auch in diesem experimentellen Teil mit nicht-physiologischen Situationen während der EKZ und tiefhypothermem Kreislaufstillstand einen engen Zusammenhang zwischen der Veränderung in der rSO2 und der oxymetrisch gemessenen Sättigung des venösen Blutes im Bulbus jugularis (Abb. 7.4.1-4) .

Mit Hilfe einer Multiregression zeigte sich ein signifikant unabhängiger Einfluss des MAD unter 35 mmHg (p<0,01) und der Abnahme der Hämatokritkonzentration unter 22% (p<=0,01) auf der Reduktion der rSO2 . Eine signifikante Abnahme der rSO2, definiert als Abfall um 10% des Ausgangswertes für die Dauer von drei Minuten, war ebenfalls mit einer entsprechenden Abnahme der Cyt.Ox aa3 verbunden ( Abbildung 7.4.1 ).


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7.4.3 Zerebrale Perfusion

Die zerebrale Perfusion wurde qualitativ mit Hilfe der transkraniellen Dopplersonographie und quantitativ mit der Mikrospärentechnik beurteilt.

7.4.3.1 Beurteilung der zerebralen Flussgeschwindigkeiten mit transkranieller Dopplersonographie (TCD)

Die TCD liefert nur Informationen über die Blutgeschwindigkeit in einem Gefäßabschnitt der basalen zerebralen Gefäße. Die erhobenen Daten anhand serieller Messungen der mittleren Flussgeschwindigkeit (Vm) in der Arteria cerebri media zeigten jedoch einen repräsentativen Verlauf entsprechend der Veränderung in der regionalen und globalen zerebralen Perfusion ( Abbildung 7.4.1 ).

Die allmähliche Abnahme der mittleren Flussgeschwindigkeit in der Arteria cerebri media, trotz einer konstanten EKZ-Flussrate und eines Perfusiondrucks während der systemischen Kühlung, spiegelt möglicherweise eine Reduktion des zerebralen Metabolismus durch die Hypothermie wieder. Die kontinuierliche Registrierung des Flussmusters mit dem TCD während der Kannülierung und der anderen unterschiedlichen Phasen der EKZ konnte jegliche Störung im jeweiligen Flussgebiet der Arteria cerebri media sofort und online anzeigen.

7.4.3.2 Beurteilung der regionalen zerebralen Perfusion mit Mikrosphären

Zur Beurteilung der quantitativen regionalen zerebralen Perfusion wurden unterschiedliche Mikrosphären zu den charakteristischen Phasen der EKZ injiziert. Hier zeigte sich eine signifikante Abnahme der zerebralen Perfusion in allen Hirnregionen nach der systemischen Kühlung. Unmittelbar nach der Reperfusion und Erwärmung zeigte sich ein transienter Anstieg der regionalen Hirnperfusion, der sich nach einer Stunde durch Erreichen der Ausgangswerte vor der EKZ normalisierte ( Abbildung 7.4.3 . ).

Abbildung 7.4.3: Veränderung der regionalen Hirnperfusion während und nach hypothermer Perfusion. In allen Hirnregionen war ein signifikanter Abfall der Hirnperfusion während der Hypothermie festzustellen (p<0,01).


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Die Veränderung in der regionalen zerebralen Perfusion während der EKZ und der systemischen Kühlung war korrespondierend zu der Veränderung im zerebralen Flussmuster in der Arteria cerebri media.

Diese Beobachtung unterstreicht die Bedeutung der nicht-invasiven Überwachung der zerebralen Perfusion mit Hilfe der transkraniellen Dopplersonographie während Korrekturoperationen mit der EKZ..

7.4.4 Wertigkeit des zerebralen Markers S-100B im Serum als Marker einer Störung in der Bluthirn-Schranke.

Die Serumkonzentration des S-100B wurde zu neun standardisierten Zeitpunkten während des gesamten Experiments gemessen. Tierexperimentell zeigte sich eine ähnliche Kinetik der Serumwerte wie bei den Neugeborenen während der Herzoperationen mit EKZ (s. Abschnitt 5.3). Unmittelbar nach extrakorporaler Perfusion und systemischer Kühlung stieg die Serumkonzentration schon vor dem Kreislaufstillstand in allen Tieren signifikant an ( Abbildung 7.4.4 ). Der Hauptanstieg der Serumkonzentration fand jedoch während und nach der Reperfusion statt. Die Serumkonzentrationen waren nach Ende der Kühlung am Bypass und nach dem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie in der Gruppe von Tieren mit 120minütigem tiefhypothermen Kreislaufstillstand signifikant höher als die mit 60minütigem Kreislaufstillstand ( Abbildung 7.4.4 ).

Abbildung 7.4.4: Serumkonzentrationen des Proteins S-100B vor, während, und nach 60 bzw. 120 minütigem tief hypothermen Kreislaufstillstand (THKS)

Bei sieben Tieren traten feststellbare kardiorespiratorische Komplikationen in Form von Kammerflimmern, Fehlintubation mit inadequater Oxygenation und Blutdruckabfall bei akuter Blutung vor oder unmittelbar nach dem Anschluss an die EKZ auf. Um den Effekt dieser vermeintlichen Ischämiephasen ohne Hypothermie zu untersuchen, wurden diese Tiere weiterhin


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entsprechend unseres Protokolls an der EKZ perfundiert und einem tiefhypothermen Kreislaufstillstand unterzogen. Die Messung des Protein S-100B im Serum zeigte einen unmittelbaren abnormen Anstieg, der mit dem abnormen Verlaufsmuster bei Kindern mit definitiven neurologischen und kardiorespiratorischen Komplikationen vergleichbar ist ( Abbildung 7.4.5 a).

Abbildung 7.4.5: : Serumkonzentrationen des Proteins S-100B bei den Tieren mit und ohne Komplikationen vor der systemischen Kühlung (a). Der unmittelbar signifikante Anstieg des Proteins S-100B im Serum bei den Tieren mit hämodynamischen Komplikationen war mit einer positiven Extravasation des Farbstoffes Evans-Blue im Cortex assoziiert (b). Abnorm hohe Serumkonzentrationen des S-100B im Serum weisen auf eine Öffnung der Bluthirnschranke hin.

Die meisten dieser Tiere (5/7) mit einem abnormen intraoperativen Verlauf konnten aus kardialen Gründen nicht von der EKZ entwöhnt werden und wurden daher nicht weiter postoperativ entsprechend des Protokolls überwacht. Um die Durchlässigkeit der Bluthirnschranke bei den abnormen Serumwerten des S-100B qualitativ zu beurteilen, wurde Evans-Blue 15 Minuten vor Ende des Experiments systemisch verabreicht. Im Vergleich mit den anderen Tieren zeigte sich bei den Tieren mit kardiorespiratorischen

Komplikationen und begleitendem abnormen Anstieg der Serumwerte des S-100B sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch eine deutliche inhomogene Extravasation des Farbstoffes im Cortex und Kleinhirnbereich ( Abbildung 7.4.5 b). Der Austritt von Evans-Blue in den extravasalen Raum weist somit auf eine signifikante erhöhte Permeabilität der Blut-Hirnschranke hin.

Um die Wertigkeit des Serumwertes des S-100B bei den Tieren mit längerer Überlebensdauer weiter zu beurteilen, wurden die maximalen postoperativen Serumwerte mit dem Grad der hypoxischen Schädigung im Gehirn korreliert. Die maximalen Serumwerte zwei Stunden nach Ende der EKZ korrelierten positiv mit der Zahl der hypoxischen Neuronen im CA4 des Hippocampus (r=0,64, p=0,02) ( Abbildung 7.4.6 ). Nach einer Einteilung der hypoxischen Schädigung


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entsprechend der Zahl der hypoxisch-nekrotischen Neuronen unterschied sich der maximale Wert des Proteins S-100B nicht zwischen milder und moderater Hypoxie, sondern nur zwischen moderater und schwerer Hypoxie. Der maximale Wert des S-100B im Serum konnte somit nur eine schwere hypoxische zerebrale Schädigung anzeigen ( Abbildung 7.4.6 ).

Abbildung 7.4.6: : Die Serumkonzentration des Proteins S-100B in Anhängigkeit mit der hypoxisch-ischämischen neuronalen Zellschädigung in der Region CA4 des Hippocampus.

Der Liquor konnte nur vor dem Experiment durch eine Lumbalpunktion und nach Ende des Experiments nach sofortiger Aspiration aus der hinteren Schädelgrube gewonnen werden. Die Ausgangskonzentration des S-100B im Liquor war signifikant höher als im Serum (p<0,001). Die postoperativen Liquorwerte waren erstaunlicher-weise um das hundertfache höher als die maximalen postoperativen Serumwerte.

7.4.5 Immunhistochemische Veränderung des Proteins S-100B

Um den Einfluss der EKZ und des tiefhypothermen Kreislaufstillstands auf die Verteilung des S-100B im Hirnparenchym zu evaluieren, wurden verschiedene Hirnareale immunhistochemisch mit dem S-100B gefärbt. Es zeigte sich eine deutliche Vermehrung der S-100B-Färbung, sowohl in den Astrogliazellen als auch im extrazellulären Raum. Im Vergleich mit den Kontrolltieren mit Scheinoperation zeigte sich die S-100B-Färbung in allen Tieren nach EKZ und tiefhypothermen Kreislaufstillstand diffus in allen Hirnarealen vermehrt (Abb. 7.4.7).


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Abbildung 7.4.7: Immunhistochemische Färbung des S-100B in einem Kontrolltier mit einer Scheinoperation und einem Tier nach extrakorporaler Zirkulation und tief hypothermem Kreislaufstillstand

Insbesondere wurde die Färbung in den perivaskulären geschwollenen Anteilen der Astrozyten um die Venolen und Arteriolen des Hippocampus vermehrt gefunden (Abb. 7.4.7). Die Ependymzellen am Rande der Liquorräume waren ebenfalls mit S-100B intensiv gefärbt.

7.4.6 Messung der neuronalen Marker in Serum und Liquor

Zusätzlich zur Bestimmung des astroglialen Ca++-bindenden Proteins S-100B wurden andere neuronale Ca++-bindende Proteine wie Parvalbumin und Calretinin sowie die neurospezifische Enolase (NSE) im Serum und im Liquor bestimmt. Im Gegensatz zur Kinetik des Proteins S-100B im Serum waren die neuronalen Marker im Serum trotz des hypothermem Stillstands von zwei Stunden nicht angestiegen, sondern eher signifikant abgefallen (Abb. 7.4.8) . Diese Marker sind jedoch am Ende des Experiments im Liquor im Vergleich zu den Ausgangswerten massiv angestiegen (Abb. 7.4.9).

Der Nachweis dieser Marker im Serum war trotz des massiven Anstiegs im Liquor nicht möglich (Abb. 7.4.8). Die Konzentrationen dieser Marker waren im Vergleich mit denen von S-100B im Serum eher abgefallen, möglichweise durch Hämodilution der bereits vorhandennen Konzentrationen im Serum nach Beginn der EKZ mit Verdreifachung des zirkulierenden Blutvolumen im Tier und EKZ Kreislauf (Abb. 7.4.8). Der kontinuierliche Anstieg der Serumwerte des Astrogliazellproteins S-100B, im Gegensatz zu den neuronalen Markern NSE,


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Parvalbumin und Calretinin, weist somit auf eine Durchlässigkeit der Bluthirnschranke für S-100B hin.

Abbildung 7.4.8: Kinetik des Astrogliazellproteins S-100B und der Neurospezfischen Enolase (NSE) im Serum während und nach der EKZ mit einer Stillstandsphase in tiefer Hypothermie. Im Gegesatz zur NSE waren die Serumkonzentrationen des Proteins S-100 bereits nach dem Anschluß an der EKZ und dem Beginn der Kühlung signifikant angestiegen. Die höchsten Werte wurden in der Reperfusionsphase nach dem tief hypothermen Kreislaufstillstand gemessen. Die Serumwerte der NSE stiegen in dieser Phase ebenfalls signifikant an, blieben jedoch signifikant niedriger als die Ausgangswerte.


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Abbildung 7.4.9: Die Konzentrationen der Ca++-bindenden Proteinen und der neurospezifischen Enolase (NSE) im Liquor waren in allen Tieren nach der EKZ mit dem verlängertem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie im Vergleich zu den Ausgangswerten massiv angestiegen. Der massive Anstieg der astrozytären und neuronalen Marker weist auf eine signifikante Hirnzellschädigung hin. Das Missverhältniss zwischen den Konzentrationen im Serum und im Liquor zeigt eine limitierte Durchlässigkeit dieser Marker in die Blutbahn, möglicherweise durch eine intakte Blut-Hirnschranke.


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7.4.7 Immunhistochemischer Nachweis der neuronalen Marker im Zentralnervensystem

Abbildung 7.4.10: Immunhistochemische Färbung von neuronalen Ca++bindenden Proteinen in einigen Subpopulationen gut erhaltener Neurone 10x und 40x. Calretinin kommt im Kerngebiet hemmender Neuronen vor. Zusätzlich zur Immunfärbung des Zytoplasmas (braune Zellen) waren auch die Axonen dieser Neurone mit Calretinin positiv angefärbt. Die Immunfärbung der Neurospezifischen Enolase (NSE) und des Parvalbumins in intakten Neuronen ist als Rot gut darstellbar. In den Schnitten mit der NSE und Parvalbuminfärbung sind einige Astrozyten geschwollen dargestellt (Pfeil e) .

Die NSE, Parvalbumin und Calretinin wurden in verschiedenen nicht-hypoxischen Neuronen nachgewiesen. In den hypoxischen Neuronen war die immun-histochemische Färbung für Parvalbumin und NSE verblasst und nicht mehr im Zytoplasma der hypoxischen Neuronen nachweisbar (Abb. 7.4.10 ). Parvalbumin und Calretinin waren in einigen Subpopulationen von Kerngebieten außerhalb des Hippocampus vermehrt gefunden worden. Im Gegensatz zu der Immunfärbung von S-100B war die Färbung der neuralen Marker auf das Zytoplasma der Neuronen beschränkt. In den 3 Färbungen sind ausschließlich intakte Neurone mit Immunfärbung der Ca++bindenden Proteinen im Zytoplasma der Zellen dargestellt. In einigen Schnitten ist die astrozytäre Schwellung insbesondere in perivaskulären Regionen zu sehen (Abb.7.4.4).


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