Abdul-Khaliq, Hashim: Untersuchungen zur Entwicklung neuroprotektiver Strategien bei operativer Behandlung angeborener Herzfehler

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Kapitel 8. Neuroprotektive Strategien durch Vorbehandlung mit verschiedenen Pharmaka an einem Schweinemodell

Neuroprotektive Strategien in der klinischen Praxis erfordern im Tiermodell eine Evaluierung pathophysiologischer Zusammenhänge, die zu einer neuronalen Schädigung führen .

Mehrere hämodynamische und pharmakologische Maßnahmen wurden in den letzten acht Jahren anhand klinischer und tierexperimenteller Untersuchungen erprobt und trugen zur Verbesserung der Perfusionsmethoden während herzchirurgischer Operationen bei Kindern und Säuglingen bei . Im Gegensatz zu den Zuständen mit hypoxisch-ischämischen Ereignissen, wo erst Stunden nach einem Ereignis die unmittelbaren und späteren Folgen behandelt werden, besteht bei Risikokindern mit einer geplanten Operation am offenen Herzen in tiefhypothermem Kreislaufstillstand, neben komplettem Monitoring der zerebralen Oxygenation und Perfusion zusätzlich die Möglichkeit, durch Vorbehandlung mit bestimmten Pharmaka die Entstehung möglicher zerebraler Schäden präoperativ entscheidend zu beeinflussen.

Dieses Versuchsmodell wurde mit dem Ziel einer Optimierung der Perfusionmethoden mit Minimierung zerebraler Schäden entwickelt. Viele Pharmaka, die vor und nach solchen extremen Situationen wie die hypotherme Perfusion oder der Kreislaufstillstand routinemäßig eingesetzt werden, sind auf ihre Wirkung im Zentralnervensystem nicht gänzlich untersucht.

8.1 Vorbehandlung mit hoch dosierten Steroiden

Die Rolle der Steroide zur Protektion neuronaler Schädigung und Vorbeugung und Behandlung von Permeabilitätstörungen und Ödembildung nach einem traumatischen Eingriff im Gehirn wird jedoch seit langem kontrovers diskutiert . Vor oder während der extrakorporalen Zirkulation ist die Vorbehandlung mit Steroiden eine routinemäßige Methode zur Prävention potentieller Hirnschwellung während Korrekturoperationen angeborener Herzfehler im Neugeborenalter . Kontrollierte klinische Studien hinsichtlich des neuroprotektiven Effektes fehlen.

Lodge und Mitarbeiter von der Duke-Universität in North Carolina berichteten vor kurzem über eine Reduktion der Immunantwort nach der Vorbehandlung mit hochdosierten Steroiden acht Stunden vor der EKZ in einem neonatalen Schweinemodell im Vergleich zu der herkömmlichen intraoperativen Applikation in die Primeflüssigkeit .

Die präoperative Applikation führte zu einer verbesserten Lungenfunktion durch verminderte pulmonale Wasserakkumulation. Zusätzlich zeigte die gleiche Arbeitsgruppe eine verbesserte


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Hirnperfusion und eine verbesserte zerebrale metabolische Rate für Sauerstoff in der Reperfusionsphase nach der Vorbehandlung mit hochdosierten Steroiden . Eine histopathologische Evaluierung der neuronalen Schädigung wurde jedoch nicht durchgeführt . Auf der anderen Seite haben interessanterweise die meisten klinischen Doppelblindstudien keinen klinischen Vorteil der Vorbehandlung mit Steroiden gezeigt .

An unserem Bypassmodell mit einer tiefhypothermen Ischämie in neonatalen Schweinen wurde der vermeintlich protektive Effekt der Vorbehandlung mit hochdosierten Steroiden auf die zerebrale Oxygenation, Perfusion und vor allem auf die morphologischen Veränderungen im Gehirn untersucht.

8.1.1 Methode

Achtzehn neugeborene Ferkel im Alter von weniger als einer Woche wurden um ca. 8:30 Uhr am Tag des Versuches in die tierexperimentelle Einrichtung der Charité, Campus-Virchow Klinikum, eingeliefert. Die Tiere wurden in eine Kontrollgruppe (n=8) und in eine Gruppe (n=5) mit systemischer Steroidvorbehandlung mit Methylprednisolon (Urbason Methylprednisolone-21-hydrogen Succinate, Hoechst) unterteilt. Bei den systemisch vorbehandelten Tieren wurde 24 Std. und 5 Std. vor dem Operationsbeginn 30mg/kg Methylprednisolon intraperitoneal verabreicht. Bei fünf Tieren wurde nach einer Lumbalpunktion und Gewinnung von 0,5 ml Liquor eine Methyprednisolongabe von 30 mg/kg in den intrathekalen Raum injiziert. Die Vorbereitung, Anästhesieeinleitung, Perfusion der EKZ, Neuromonitoring sowie histologische Bearbeitung erfolgte nach dem im Abschnitt 6.1 beschriebenen Protokoll.

8.1.2 Ergebnisse

8.1.2.1 Evaluierung der regionalen Hirnperfusion mittels Mikrosphären

In beiden Gruppen kam es während der Kühlungsphase zu einer signifikanten Reduktion der Hirnperfusion um 30-40% des Ausgangswertes. Nach dem tiefhypothermen Kreislaufstillstand (THKS) und einer Erwärmungsphase von 60 Minutendem normalisierte sich die Hirnperfusion zu den präoperativen Werten. In einigen Hirnregionen erreichte die regionale Perfusion jedoch noch höhere Werte als die Ausgangswerte (p<0,01) (Abb. 8.1.1).

Nach der Erwärmung und Reperfusion zeigte sich jedoch eine Hyperperfusion bei den mit Methylprednisolon intrathekal vorbehandelten Tieren um 250 % des Ausgangswertes (Abb. 8.1.1). Die vorbehandelten Tiere zeigten eine signifikant höhere zerebrale Perfusion im Vergleich mit der Kontrollgruppe.


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Abbildung 8.1.1: Der prozentuale Anteil der regionalen Hirnperfusion (ml/g/min) vom Ausgangswert nach einer hypothermen Kreislaufstillstandsphase von 120 Minuten. Die regionale Hirnperfusion war bei den intrathekal behandelten Tieren höher als bei den Kontroll- und den systemisch behandelten Tieren.

8.1.2.2 Evaluierung der regionalen Hirnperfusion mittels TCD

Die zerebrale Flussgeschwindigkeit wurde mittels transkranieller Dopplersonographie kontinuierlich registriert (siehe 3.1 und 6.1.3.1). Auch diese Methode zeigte einen ähnlichen Änderungstrend in der mittleren Flussgeschwindigkeit während der Kühlung und der Reperfusion nach dem Kreislaufstillstand (Abb. 8.1.2).

Abbildung 8.1.2: Die mittlere Flussgeschwindigkeit (Vm) in der A. cerebri media vor, während und nach dem Experiment. Die mittlere zerebrale Flussgeschwindigkeit fiel nach systemischer Kühlung in allen Gruppen signifikant ab. Vor und nach dem tiefhypothermen Kreislaufstillstand war die Vm in den intrathecal vorbehandelten Tieren signifikant höher als bei den Kontrolltieren.


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8.1.2.3 Zerebrale Oxygenation

Die Veränderungen von Konzentrationen des oxygenierten (HbO2) und desoxygenierten Hämoglobin (HHb) sowie der Cytochromoxydase aa3 (Cyt.Ox aa3) wurden mit einem Zerebraloxymeter (Criticon, Johnson&Johnson) online registriert.

In allen 3 Gruppen wurde ein Veränderungsmuster der intravaskulären und intrazellulären Oxygenationsparameter entsprechend der Kühlung und Unterbrechung der Zirkulation im tiefhypothermen Kreislaufstillstand festgestellt. Die intravaskulären und intrazellulären Oxygenationssignale der zerebralen Oxygenation unterschieden sich jedoch während der systemischen Kühlung und vor allem während des tiefhypothermen Kreislaufstillstandes, entsprechend des Modus der Steroidapplikation signifikant von der Kontrollgruppe (Abb. 8.1.3). Das Cyt.Ox aa3-Signal der intrazellulären Oxygenation in den intrathekal vorbehandelten Tieren fiel langsammer und signifikant weniger ab als in der Kontrollgruppe und den systemisch vorbehandelten Tieren, sowohl während als auch nach dem tief hypothermen Kreislaufstillstand (THKS) (Abb. 8.1.3).

Die systemisch vorbehandelten Tiere hatten im Vergleich mit der Kontroll- und Intrathekalgruppe eher signifikant schlechtere intrazelluläre Oxygenationsparameter während und nach dem tiefhypothermen Kreislaufstillstand. Während das intravaskuläre oxygenierte Hämoglobin den Ausgangwert vor der EKZ erreichte, blieb das intrazelluläre Cyt.Ox aa3-Signal in den systemisch vorbehandelten und in den Kontrolltieren signifikant unter den präoperativen Werten (Abb. 8.1.3).

Abbildung 8.1.3: : Zerebrale Oxy-genationsparamter gemessen mit der Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS) in den Kontrolltieren und in den sytemisch und intrathekal mit Methylprednisolon (MP) vorbehandelten Tieren. Die intravaskuläre und intrazelluläre Oxygenation in der systemisch vorbehandelten Gruppe fiel während und nach dem tief hypothermen Kreislaufstillstand (THKS) signifikant tiefer ab als bei der Kontroll- und Intrathekalgruppe


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8.1.2.4 Biochemische Marker

In allen Versuchstieren wurde nach dem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie ein signifikanter Anstieg des astroglialen Zellproteins S-100B im Serum gemessen ( Abbildung 8.1.4 -). Bereits nach Anschluss an die EKZ zeigte sich eine Erhöhung des Protein S-100B im Serum in beiden Gruppen. Der maximale Wert wurde wie in den vorausgegangenen Untersuchungen nach Ende der EKZ erreicht. Während sich bei den Kontrolltieren die Serumwerte des S-100B sich denen der Ausgangswerte vor der EKZ anglichen, zeigte sich in den steroidvorbehandelten Tieren ein noch persistierender Anstieg der S-100-Werte ( Abbildung 8.1.4 ). Die Serumkonzentrationen der NSE fielen ab und unterschieden sich nicht signifikant untereinander ( Abbildung 8.1.4 ). Der Abfall nach dem verlängerten Kreislaufstillstand ist möglicherweise Ausdruck einer Verdünnung der vorhandenen Konzentrationen ohne weitere Freisetzung aus dem Gehirn.

Die Konzentrationen des astroglialen Proteins S-100B im gewonnenen Liquor aus der hinteren Schädelgrube unmittelbar nach Öffnung des Schädels waren jedoch signifikant geringer nur in den intrathekal vorbehandelten Tieren ( Abbildung 8.1.4 ).

Abbildung 8.1.4: Liquorkonzentrationen des Proteins S-100B in der systemisch und intrathekal mit Methylprednisolon vorbehandelten Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe vor und nach der tiefhypothermen Kreislaufstillstandsphase (THKS) von 120 Minuten. Die Konzentration des S-100B im Liquor war signifikant niedriger in den intrathekal vorbehandelten Tieren.

Die Konzentrationen der neuronalen Marker im Serum waren nicht signifikant angestiegen. Im Gegesatz stieg die Konzentrationen der neuronalen Marker NSE und Calretinin im Liquor signifikant an. Die Konzentrationen in den Kontrolltieren und in den systemisch und intrathekal mit Methylprednisolon behandelten Tieren zeigten jedoch keinen signifikanten Unterschied.


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8.1.2.5 Hyperglykämie

Die Glucosekonzentration im Serum stieg bei allen Tieren mit Beginn der EKZ an. Beiden Gruppen, die mit systemischer und die mit intrathekaler Vorbehandlung mit MP zeigten signifikant höhere Glucosewerte im Blut als die Kontrollgruppe, sowohl vor als auch nach dem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie. Die Hyperglykämie persistierte jedoch während der postoperativen Phase nur in den systemisch mit MP vorbehandelten Tieren ( Abbildung 8.1.5 ).

Abbildung 8.1.5: : Glukosewerte im Blut in der systemisch und intrathekal mit Methylprednisolon vorbehandelten Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe vor und nach der tiefhypothermen Kreislauf-stillstandsphase (THKS) von 120 Minuten. Hyperglykämie trat in den beiden mit Methylprednisolon vorbehandelten Gruppen auf, diese persistierte jedoch stärker in der Gruppe mit systemischer Steroid-vorbehandlung.

8.1.2.6 Auswertung der hypoxisch und apoptotischen neuronalen Zellschädigung

Die quantitative Auswertung der hypoxisch-nekrotischen neuronalen Zellschädigung und Ausmaß der Verminderung dieser Schädigung durch die Vorbehandlung mit MP wurde in allen Regionen des Hippocampus sowie immm frontalen Gyrus cinguli durchgeführt. Es zeigte sich keinerlei Verbesserung der hypoxischen Zellschädigung in allen Hippocampusregionen ( Abbildung 8.1.6 ). Der Grad der hypoxischen Schädigung war sogar signifikant höher in CA1 im Vergleich zu den Tieren ohne Vorbehandlung (p=0,02). Die intrathekale Vorbehandlung mit MP, unter Umgehung der Blut-Hirnschranke, zeigte eine signifikante Reduktion der hypoxisch-ischämischen Neuronen in den Hippocampusregionen CA1 und CA4 ( Abbildung 8.1.6 ). Die Abnahme der ischämischen Schädigung in den anderen Hippocampusregionen und im Gyrus cinguli des frontalen Hirns erreichte jedoch keine statistisch signifikante Besserung.


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Abbildung 8.1.6: : Die quantitativen neuropathologischen Veränderungen in Hippocampus-regionen bei den mit Methyl-prednisolon vorbehandelten Tieren. Die intrathekale und nicht die sytsemische Vorbehandlung mit MP scheint einen neuroprotektiven Effekt nach einer hypothermen Kreislaufstillstandsphase von 120 Minuten im Hippocampus zu enfalten.

Abbildung 8.1.7: Paraffinschnitt in CA4 zeigt eine signifikante Reduktion der hypoxisch nekrotischen Neuronen in CA4 des Hippocampus. Der hypoxisch bedingte nekrotische Zelltod ist lichtmikroskopisch charakterisiert durch Eosinophilie des Zytoplasmas, Zellschrumpfung und Kernveränderungen in Form von Kernpyknose und Kernbasophilie (Pfeil ). Perivaskuläres und perineuronales Ödem wurde in allen Tieren mit und ohne Vorbehandlung gleichermaßen beobachtet (e Pfeil).

Apoptotische Neurone wurden in allen Regionen vereinzelt beobachtet. Für die Auswertung der Apoptose wurden sowohl HE- als auch TUNEL-gefärbte Schnitte ausgewertet ( Abbildung 8.1.7 ).


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Die morphologischen Aspekte der Apoptose wie Chromatin-Kondensation wurden weiter in Semi-dünnschnitten bestätigt ( Abbildung 8.1.8 ). Apoptotische und TUNEL-positive Neurone wurden in großer Zahl überwiegend im Gyrus dentatus des Hippocampus gefunden. Die Anzahl apoptotisch veränderter und TUNEL-positiver Neurone war in den beiden mit MP vorbehandelten Gruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe ( Abbildung 8.1.8 ).

Abbildung 8.1.8: Anteil apoptotischer Neurone im Gyrus dentatus bei den Methylprednisolon vorbehandelten Tieren und bei den Kontrolltieren. Apoptotischer Zelltod trat überwiegend im Gyrus dentatus des Hippocampus in signifikant höhes Zahl auf, sowohl nach systemischer als auch nach intrathekaler Vorbehandlung

Abbildung 8.1.9 Die Apoptose fand sich überwiegend regional im Gyrus dentatus des Hippocampus. Ein Parraffinschnitt des Gyrus dentatus zeigt lichtmikroskopisch neben den normalen (Pfeil n), und den hypoxisch nekrotischen Neuronen (Pfeil), apoptotische Neurone charakterisiert durch Kondensation des nuklearen Chromations by gleichzeitiger Erhaltung des Zellkörpers (Pfeilkopf). Haematoxylin und Eosin (HE, 40X).


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Abbildung 8.1.10: Die Apoptose in den Neuronen wurde ebenfalls nach der TUNEL-Methode (terminal transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling) gefärbt und bestätigt. Der fragmentierte DNA-Kerninhalt erscheint als dunkle Chromatin-Körperchen oder apoptotic bodies

Abbildung 8.1.11: Die Morphologie der Apoptose wurde zusätzlich in Semi-Dünnschnitten beurteilt und bestätigt. Die apoptotischen Neurone zeigten Zellschrumpfung unter Erhalt der Zellmembran, mit charakteristischen Kernveränderungen in Form von Heterochromatisation bzw. Kondensation des Kerninhalts (DNA-Fragmentation) (Pfeilkopf). Im Vergleich ist daneben ein gut erhaltener benachbarter Neuron zu sehen (Pfeil n).


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8.2 Die Rolle des Cyclosporins und des FK506 im Zentralnervensystem

Cyclosporin A (CsA) und FK506 sind immunsupressive Medikamente, welche seit der Aera der Organtransplantation in der klinischen Praxis eine breite Anwendung finden. Beide Medikamente haben im Immunsystem eine antimitotische Wirkung, um die Vermehrung der T-Zellen und damit die Immunantwort auf körperfremde Antigene zu hemmen . Cyclosporin A und FK506 entfalten ihre Wirkung durch die Bindung an intrazelluläre kleine Rezeptorproteine, den Immunophilinen, die auch als Cyclophiline oder FK-Bindungsproteine, für FK 506 das Protein12 (FKBP-12), bekannt sind (Abb. 8.2-1).

Abbildung 8.2.1:

Lui et al, Friedman und Weissman identifizierten das Zielimmunophilin von CsA und FK506 und zeigten dass die Komplexe CsA-Cyclopholin A und FK506-FK-BP eine Wechselwirkung mit Calcineurin, einer Ca-Calmodulin abhängigen Proteinphosphatase, haben . Eine der Wirkungsziele des Calcineurins ist die phosphorylierte Form eines Transkriptionsfaktors, die nuclear factor of activated T cells (NF-AT), welche die Transkription verschiedener Gene einschließlich IL-2 im Nucleus der T Zellen aktivieren (Abb. 8.2-1).

Um in den Nucleus der T-Zelle einzudringen und die IL-2 Transkription zu beeinflussen, muss das NF-AT de-phosphoryliert werden. Eine Bindung der Komplexe CsA-Cyclophilin oder FK506-


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FKBP-12 mit dem Calcineurin inhibiert seine Phosphataseaktivität . Dies führt dann zu einer fehlenden Dephosphorylierung des NF-AT, welches in dieser Form nicht in den Nucleus eindringen kann, wodurch dort eine Gentraskription von proinflammatorischen Interleukinen ausbleibt .

Die überwiegende Mehrheit der Forschung mit den Immunphilinen und ihren Rezeptoren beschäftigte sich mit den Immunophilinen im Lymphozyten des Immunsystems . Überraschende Ergebnisse Anfang und Mitte der neunziger Jahre zeigten jedoch, das die Konzentrationen der Immunophiline Cyclophilin und FKBP-12 im neuronalen Gewebe fünfzigfach höher sind als im Immunsystem . Die zunehmenden Ergebnisse über das reichliche Vorkommen von Immunphilinen im Zentralnervensystem lenkte das Interesse auf die Funktion und die Rolle der Immunophiline in den Neuronen des Zentralnervensystems .

Mit der zunehmenden Anwendung von Cyclosporin und FK506 häufen sich auch Berichte über assoziierte zerebrale Nebeneffekte wie Enzephalopathien, Krämpfe und kognitive Veränderungen nach Organtransplantation . Seit Mitte der neunziger Jahre haben auf der anderen Seite mehrere experimentelle Studien die Rolle von FK506 und CsA in unterschiedlichen Modellen zur zerebralen Ischämie und Reperfusion untersucht und überwiegend einen protektiven Effekt gegen der ischämischen neuronalen nekrotischen Schädigung festgestellt . Aufgrund der Multimorbidität und der unterschiedlichen Risikofaktoren ist die Ursache der neurologischen und kognitiven Veränderungen bei Kindern und Erwachsenen nach Organtransplatation multifaktoriell und nicht alleine auf die Medikation mit Cyclosporin und FK506 zurückzuführen .

Obwohl die Penetration und Passage von Cyclosporin durch die Blut-Hirnschranke limitiert ist , zeigte sich eine pharmakologisch wirksame intrazerebrale Konzentration im Gehirn durch Erhöhung der systemisch verabreichten Dosis .

Deswegen wurde eine höhere Dosierung einer Einzeldosis von 60 mg/kg in unserem neonatalen Schweinemodell verabreicht, um einen möglichen protektiven Effekt histologisch nachzuweisen .

FK506 hemmt, durch die Bindung an seinen Ligenden FKBP-12, die De-phosphorylierung der NO-Synthetase und damit die Umwandlung in ihre aktive Form . Damit wird eine Neurotoxizität durch neu gebildetes NO verhindert (Abb. 8.2-2).


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Abbildung 8.2.2:

Auch FK506 selbst als ein Ca2+/Calmodulin-abhängiger Phosphatase-2B-Inhibitor scheint bei der Glutamat-Neurotoxizität und NMDA-Rezeptorenaktivierung nach einer vorausgegangenen Ischämie eine protektive Rolle zu spielen . Außerdem zeigte FK506 eine Erhaltung -Bindungskapazität für cAMP und damit eine Erhaltung der intrazellulären Signaltransduktion .

Aufgrund dieser Untersuchungen soll die Wirkung der zwei zuvor beschriebenen Medikamente auf das Zentralnervensystem bei kardiochirurgischen Eingriffen an neugeborenen Ferkeln unter Verwendung der EKZ mit tiefhypothermem Kreislaufstillstand evaluiert werden.

8.2.1 Methode

Um eine histologisch sichtbare Ischämie nach sechsstündiger Reperfusion zu erreichen, wurde die Kreislaufstillstandsphase in tiefer Hypothermie auf zwei Stunden ausgedehnt. Die Durchführung der Experimente erfolgte einheitlich nach unserem etablierten Modell der EKZ mit dem tiefhypothermem Kreislaufstillstand (siehe Abschnitt 6.1). Um mögliche protektive Effekte der pharmakologischen Vorbehandlung deutlich für die quantitative Evaluation einer Reduktion der Schädigung im Gehirn zu untersuchen, wurden höhere Dosen für die Vorbehandlung ausgewählt. Da Cyclosporin nicht leicht die Blut-Hirnschranke penetrieren kann, wurde ebenfalls eine höhere


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Dosierung von 60mg/kg ausgewählt. Ein anderer Aspekt, der für die Erhöhung der Dosis spricht, ist die Verdreifachung des zirkulierenden Blutvolumens auf 400-450 ml, nach Anschluss der kleinen Tiere mit einem Körpergewicht von 2-2,5 Kg an die EKZ .

Für FK506 wurde eine intravenöse Dosis von 0,2 mg/kg, für Cyclosporin 60mg/kg auf 20 ml NaCl 0,9% als Kurzinfusion langsam über eine Stunde von vier bis fünf Stunden vor Beginn der EKZ perfundiert.

Die Tiere wurden standardisiert vorbereitet und dann nach einem einheitlichen Perfusionsprotokoll perfundiert (Abb. 6.1.2). Auch hier wurde beachtet, dass die Tiere eine Überwachungsphase nach dem Abgang von der EKZ von mindestens 5 Stunden ohne jegliche kardiopulmonalen Komplikation überlebten.

8.2.2 Ergebnisse

8.2.2.1 Zerebrale Perfusion

Die erhobenen Daten anhand serieller Messungen der mittleren Flussgeschwindigkeit (Vm) in der Arteria cerebri media zeigten jedoch einen repräsentativen Verlauf entsprechend der Veränderung in der regionalen und globalen zerebralen Perfusion ( Abbildung 7.4.1 ).

Es zeigte sich eine verlangsamte zerebrale Flussgeschwindigkeiten in der Art. cerebri media in den mit Cyclosporin vorbehandelten Tieren. Die allmähliche Abnahme der mittleren Flussgeschwindigkeit in der Arteria cerebri media, trotz einer konstanten EKZ-Flussrate und eines Perfusiondrucks während der systemischen Kühlung und Reperfusion nach dem tiefhypothermem Kreislaufstillstand, spiegelt möglicherweise einen vasokunstriktiven Effekt der Vorbehandlung mit Cyclosporins wider.


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Abbildung 8.2.3: Die mittlere Flussgeschwindigkeit (Vm) in der A. cerebri media vor, während und nach dem Experiment. Die mittlere zerebrale Flussgeschwindigkeit fiel nach systemischer Kühlung in allen Gruppen signifikant ab. Nach dem tief-hypothermen Kreislaufstillstand war die Vm in den mit Cyclosporin vorbehandelten Tieren signifikant niedriger als bei den Kontrolltieren.

8.2.2.2 Zerebrale Oxygenation

Es fand sich in allen Gruppen eine ähnliches Änderungsmuster in den intravaskulären und intrazellulären Oxygenationsparametern entsprechend der Kühlung und Erwärmung sowie ein kontinuierlicher langsamer Abfall des intrazellulären Cyt.Ox aa3 während des tiefhypothermen Kreislaufstillstandes (Abb. 8.2.4). Das Ausmaß der Reduktion des intrazellulären mitochondrialen Cyt.Ox.aa3-Signals während des tiefhypothermen Kreislaufstillstandes war jedoch insbesondere bei den mit Cyclosporin und FK506 vorbehandelten Tieren signifikant weniger als bei den Kontrolltieren (Abb. 8.2.4).

Abbildung 8.2.4: Zerebrale Oxygenationsparamter gemessen mit der Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS) in den Kontrolltieren und in den mit Cyclosporin und FK506 vorbehandelten Tieren. Die intrazelluläre Oxygenation in der Cyclosporin- und FK506 vorbehandelten Gruppe fiel während und nach dem tief hypothermen Kreislaufstillstand (THKS) signifikant weniger ab als bei der Kontrollgruppe.


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8.2.2.3 Biochemische Marker

Bei der Bestimmung der biochemischen Marker im Liquor fanden sich viele höhere Konzentrationen als im Serum. Die Marker im Liquor und nicht die im Serum, scheinen die Protektion und Verminderung der Schädigung durch die Vorbehandlung mit Cyclosporin und FK506 anzuzeigen. Die Konzentrationen des astrozytären Proteins S-100B waren niedriger in der FK506-Gruppe, erreichten jedoch nicht den statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich mit der Kontrollgruppe (Abb. 8.2.5). Die Konzentration des S-100B war jedoch in der mit Cyclosporin vorbehandelten Gruppe signifikant niedriger (p=0,02).

Abbildung 8.2.5: Liquorkonzentrationen des Proteins S-100B in den mit cyclosporin und FK506 vorbehandelten Tieren im Vergleich mit den Kontrolltieren ohne Behandlung vor und nach der tiefhypothermen Kreislaufstillstandsphase (THKS) von 120 Minuten. Die Konzentration des S-100B im Liquor war signifikant niedriger in den mit Cyclosporin vorbehandelten Tieren

8.2.2.4 Auswertung des hypoxischen und apoptotischen neuronalen Zellverlusts

Die quantitative Auswertung der hypoxisch-nekrotischen neuronalen Zellschädigung und das Ausmaß der Verminderung dieser Schädigung durch die Vorbehandlung mit einer einmaligen Cyclosporin- und FK506-Dosis wurde in allen Regionen des Hippocampus sowie in dem frontalen Gyrus cinguli durchgeführt. Es zeigte sich eine Verminderung der hypoxischen Zellschädigung in allen Hippocampusregionen CA1 bis CA4 durch systemische Vorbehandlung mit einer einmaligen Gabe von Cyclosporin und FK506 (Abb. 8.2.6). Die Verminderung der hypoxischen Schädigung war noch höher bei den Tieren mit Cyclosporinvorbehandlung. Die Reduktion der hypoxischen Zellschädigung in dem Gyrus denatatus des Hippocampus war jedoch in beiden vorbehandelten Gruppen nicht signifikant (Abb. 8.2.6). Die Abnahme der ischämischen Schädigung im Gyrus cinguli des frontalen Hirns erreichte nur in der Cyclosporingruppe eine statistisch signifikante Besserung (Abb. 8.26).


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Abbildung 8.2.6: Anteil apoptotischer Neurone im Gyrus dentatus bei den mit Cyclosporin, FK506 vorbehandelten Tieren und Kontrolltieren. Apoptotischer Zelltod trat überwiegend im Gyrus dentatus des Hippocampus in signifikant höherer Zahl in den mit FK506 vorbehandelten Tieren auf. Die Zahl der apoptotischen Neuronen war bei den mit Cyclosporin vorbehandelten Tieren nicht signifikant angestiegen

Apoptotische Neurone wurden in allen Regionen vereinzelt beobachtet. Für die Auswertung der Apoptose wurden sowohl HE- als auch TUNEL-gefärbte Schnitte benutzt. Die morphologischen Aspekte der Apoptose wie Chromatin-Kondensation wurden weiter in Semi-Dünnschnitten bestätigt. Apoptotische und TUNEL-positive Neurone wurden in großer Zahl überwiegend im Gyrus dentatus des Hippocampus gefunden. Die Anzahl apoptotisch-veränderter und TUNEL-positiver Neurone war in den beiden vorbehandelten Gruppen im Vergleich mit der Kontrollgruppe nicht signifikant vermindert (Abb. 8.2.7).

Abbildung 8.2.7: : Die quantitativen neuropathologischen Veränderungen in den Hippocampusregionen bei den mit FK506 und Cyclosporin-vorbehandelten Tieren. Beide Immunsuprisiva scheinen histologisch einen protektiven Effekt im Gehirn nach einem verlängerten Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie zu entfalten. Die Verminderung der Zahl der hypoxischen Neuronen war nach Cyclosporinvorbehandlung im Hippo-campus noch ausgeprägter.


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