Die metabolische Rate für den Sauerstoffumsatz im Gehirn wird während tiefer Hypothermie auf ein Niveau von ca. 20% des Ausgangswertes gesenkt und die Ischämietoleranz damit erhöht . Ein noch aktiver neuronaler Restmetabolismus stellt jedoch ein Risiko während der hypothermen Ischämie dar. Hinweise auf zusätzliche Schädigungen durch die Hypothermie in den kleinen zerebralen Gefäßen wurden gesucht . Der neuroprotektive Effekt der Hypothermie bedarf daher weiterhin einer genaueren Prüfung und einer kritischen Anwendung.

Widersprüchliche Angaben wurden in der Literatur hinsichtlich der Neuroprotektion durch Modifikation des pH-Status und des pCO2 im Blut während hypothermer EKZ berichtet . Bei der alpha-stat-Methode wird durch Verschiebung der CO2-Bindungskurve bei absinkender Temperatur eine Alkalisierung des bereits azidotischen intrazellulären Raumes erreicht . Als ein positiver Effekt der pH-stat-Methode wird hingegen eine Vasodilatation der kleinen Arteriolen während der Kühlung und in der Erwärmungsphase vermutet und damit eine Verbesserung der zerebralen Hämodynamik nach hypothermer Ischämie . Eine entscheidende Verbesserung im Sinne einer neuroprotektiven Strategie ließ sich jedoch allein durch Veränderung des Säurebasen-Haushaltes nicht erreichen . Ein protektiver Effekt ließe sich möglicherweise durch Kombination beider Methoden, nämlich dem Einsatz der alpha-stat-Methode während der Kühlung und der pH-stat-Methode während der Erwärmung erzielen. Klinische oder experimentelle Daten diesbezüglich sind nicht vorhanden.

Bei Erwachsenen wird der Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie bei Korrekturoperationen am Aortenbogen und bei Aneurysmen und Dissektionen der Aorta angewandt. Auch in dieser Altersgruppe stellt der Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie das höchste Risiko für die Entwicklung neuropsychomotorischer Komplikationen in der postoperativen Phase dar . Die 16 selektive antegrade Perfusion des Gehirns wird aufgrund der invasiven Kannülierung der Halsarterien und des Risikos einer Gefäßverletzung nicht häufig angewandt . Über die liegenden Kanülen in der oberen Hohlvene wird eine retrograde Perfusion des Gehirns mit hypothermem oxygenierten Perfusat durchgeführt . Die Ergebnisse hinsichtlich der Neuroprotektion sind hierbei allerdings kontrovers . Ye et al zeigten in einer experimentellen Untersuchung eine inhomogene Perfusion des Gehirns durch retrograde Perfusion ohne einen protektiven Effekt gegen die hypoxische Ischämie . Abgesehen davon ist diese Methode aufgrund der Größe der Halsgefäße bei Kindern im Neugeborenenalter kaum durchführbar.

Die Ultrafiltration von Flüssigkeit aus dem Kreislauf nach Ende der Operation stellt eine einfache Methode zur negativen Bilanzierung der Patienten bei eingeschränkter kardialer und renaler Leistung unmittelbar nach Ende der EKZ dar . Im Tiermodell wurde die zerebral-metabolische Rate für Sauerstoff durch MUF signifikant verbessert . In einer anderen experimentellen Untersuchung wurde keine signifikante Verbesserung der zerebralen intrazellulären Oxygenation oder der histologischen Veränderungen im Gehirn durch MUF erreicht . Es bleibt unklar, ob und inwieweit sich diese Maßnahme auf die zerebrale Oxygenation und Perfusion nach Korrekturoperationen im klinischen Alltag positiv auswirkt.

Obwohl beide Flussformen keinen wesentlichen Einfluss auf die zerebralen Perfusionsvolumina haben , wurden einige Vorteile hinsichtlich der Reduktion, der Gewebeazidose , der inflammatorischen Antwort und der Verbesserung der Mikrozirkulation in allen Organen bei Anwendung des pulsatilen Flusses gefunden . Vergleichende klinische Studien bei Kindern hinsichtlich eines möglicherweise neuroprotektiven Effekts durch pulsatilen Fluss während der EKZ fehlen dagegen.

In mehreren tierexperimentellen Studien scheint die moderate Hypothermie nach einer transienten Ischämie einen protektiven Effekt im Gehirn zu zeigen . Auch nach normothermer EKZ und Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie wurde eine Verbesserung der zerebralen Oxygenation und Verringerung der neuropathologischen Veränderungen bei neugeborenen Schweinen beobachtet .

Zusätzlich zur Modifikation der hämodynamischen Parameter wurden verschiedene Pharmaka eingesetzt, um die zerebrale Ischämie zu vermindern. Steroide werden seit längerer Zeit in der Herzchirurgie ohne nachweisbaren protektiven Effekt auf zerebraler Ebene als antiinflammatorisch und als Prophylaxe gegen das Ödem eingesetzt und weiterempfohlen . In verschiedenen experimentellen Arbeiten zur EKZ mit tiefhypothermem Kreislaufstillstand wurde die Blockierung von bestimmten Prozessen in der biochemischen und inflammatorischen Kaskade nach Ischämie und Reperfusion untersucht, wie die Blockade des Selektin-Adhesionmoleküls , des Thromboxane-A₂-Rezeptors , des NMDA-Rezeptors und die Antagonisierung der Glutamattransmission im Zentralnervensystem . Protamin (Aprotinin), welcher zur Neutralisierung des Heparins nach Ende der EKZ verabreicht wird, scheint durch protektive Mechanismen im Endothel die Erholung der zerebralen metabolischen Rate nach dem tiefhypothermen Kreislaufstillstand zu fördern . Der Einsatz von Antioxidantein (Alloporinol, Vit E) während herzchirurgischer Eingriffe mit Hilfe der EKZ scheint die oxidative Schädigung im Gewebe zu lindern .

Pharmakologische Interventionen, die mit Modulation der NO-Synthese und eines resultierenden vasodilatativen Effekts im zerebrovaskulären Bereich einhergehen, könnten die Erholung des zerebralen Metabolismus nach tiefhypothermen Kreislaufstillstand positiv beeinflussen .

Periventrikuläre Blutungen traten nur selten nach herzchirurgischen Eingriffen auf. Einzelne Fälle wurden jedoch im Zusammenhang mit postnatal verkannten Ductus-abhängigen Vitien nach Entlassung der Kinder und folgendem Ductusverschluss mit schweren hypoxischen Zuständen beobachtet. Dies unterstreicht die Notwendigkeit eines pränatalen Screenings Ductus-abhängiger Vitien im Sinne einer Neuroprotektion bei diesen Kindern.

Ein konventionelles, kommerziell verfügbares Ultraschallgerät der Firma Vingmed (Horten, Norwegen) mit mechanischen Schallköpfen wird mit einem Computer der Firma Tomtec (München), welcher aus den verschiedenen Schnittbildern dreidimensionale Rekonstruktionen errechnen kann, verbunden. Um vom Gehirn Datensätze zu erhalten, welche dreidimensional rekonstruiert werden können, ist es erforderlich, multiple Schnittebenen des Hirns sequentiell aufzunehmen. Ein 5 MHz Schallkopf wird von einem computergesteuerten Motor im Inneren eines offenen Zylinders um 180 Grad um seine vertikale Achse gedreht . Bei jeder Drehung um jeweils 1 Grad wird eine Schicht des Gehirns aufgenommen, so daß man 180 Schichten erhält, welche den dreidimensionalen Datensatz bilden. Nach der Aufnahme und Speicherung der Datensätze können diese am Computer analysiert werden.. Die jeweilige dreidimensional rekonstruierte Schnittebene des Datensatzes kann weiterhin um jede beliebige räumliche Achse gedreht werden.

Es wurden 32 Neugeborene und kleine Kinder untersucht, davon 11 mit kompletter Transposition der großen Gefäße, 6 mit komplettem atrioventrikulären Septumdefekt und jeweils eins mit Aortenisthmusstenose, 3 Pulmonalatresie mit Ventrikelsepetumdefekt und 3 Mitralatresie und 11 mit anderen angeborenen Vitien. Das mediane Alter zum Zeitpunkt der Untersuchung betrug 3 (1 bis18) Tage. Alle Neugeborenen waren beatmet und zum Zeitpunkt der Untersuchung hämodynamisch stabil.

Die Aufnahme der zur dreidimensionalen Rekonstruktion erforderlichen multiplen Querschnitte dauerte weniger als 45 Sekunden. Bei allen Patienten gelang es, Datensätze aufzunehmen, welche qualitativ so gut waren, daß sie später dreidimensional rekonstruiert werden konnten.

Eine Sedierung der Neugeborenen war in keinem Fall erforderlich. Es konnten sämtliche konventionelle Schnittebenen dreidimensional sowie neue Schnittebenen, welche bisher nicht 21 darstellbar waren, rekonstruiert werden. Die Rekonstruktion der einzelnen Schichten dauerte zwischen 2 und 33 Minuten, wobei die meiste Zeit für die Auswahl der optimalen Schnittebene im Datensatz, welche rekonstruiert werden sollte, benötigt wurde.

In den Abbildungen 2.2.3 ist dargestellt, wie diese neuen Schnittebenen aussehen und wie diese aus konventionellen 2-dimensionalen Daten rekonstruiert werden können. Neuropathologische Befunde wurden bei 2 Kindern diagnostiziert.

Ein Neugeborenes mit Mitralatresie und hypoplastischem Aortenbogen war im Alter von 10 Tagen klinisch mit einem Kreislaufkollaps und einer schweren Azidose auffällig geworden und

22 entwickelte präoperativ eine ausgedehnte periventrikuläre Blutung im temporoparietalen Hirnlappen mit den Zeichen eines schweren Hirnödems, welche als Kontraindikation für eine Herzoperation angesehen wurde.

Im Vergleich zur konventionellen Ultraschalluntersuchung kann man in der Rekonstruktion die Mittellinienverschiebung besser erkennen und eine genauere Aussage über die Ausdehnung der Blutung in kranialer Richtung machen, indem man das Gehirn in verschiedenen übereinander liegenden Schnittebenen rekonstruiert (Abbildung 2.2.1A und B).

Gehirne von 52 in der Zeit zwischen 1990 und 1999 verstorbenen Kindern im medianen Alter von 1,25 Jahren (1 Tag- 17 Jahren) wurden vollständig nachuntersucht. Von diesen Kindern wurden 47 kardiochirurgisch behandelt, hiervon 26 unter dem Einsatz der extrakorporalen Zirkulation (EKZ). Die Hauptdiagnosen der operierten Kinder waren hypoplastisches Linksherzsyndrom in 7, Transposition der großen Arterien (d-TGA) in 11 und komplexe kardiale Fehlbildungen in 8 Fällen.

23 Aus mit Paraffin eingebetteten Gehirnen wurden Standardschnitte für unterschiedliche histologische und immunhistochemische Färbung angefertigt. Der apoptotische neuronale Zelltod wurde nach der TUNEL-Methode (terminal transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling) (Boehringer, Mannheim, Germany) gefärbt.

Von 20 festgestellten ischämischen Nekrosen war nur ein Infarkt embolisch bedingt. Der häufigste makroskopische Befund waren Blutungen in 25 Fällen (subarachnoidal n=16, intraventrikulär n=9). Das Auftreten von intraventrikulären Blutungen korrelierte mit der Reduktion des Hirngewichtes (p<0,05) und der Diagnose d-TGA (p<0,05), jedoch nicht mit der Frühgeburtlichkeit oder mit dem Einsatz der EKZ.

25% der untersuchten Kindergehirne zeigten angeborene Malformationen mit Ausnahme der TGA-Gruppe. Retardierte Kortexarchitektur und Gefäßentwicklung wurde in 11 Fällen beobachtet. Das Hirngewicht lag in 33 Fällen unter der 10. Perzentile.

In unserem untersuchten Kollektiv unterscheidet sich das Läsionsmuster von früheren neuropathologischen Studien bei Kindern mit angeborenen Herzfehlern. Die zentralen Blutungen 24 haben sowohl an Häufigkeit als auch im Ausmaß zugenommen, Infarkte und Entzündungen traten seltener auf. Der Herz-Lungen-Maschine scheint kein spezifisches Schädigungsmuster zuzuordnen zu sein

20 Kinder zwischen 8 und 14 Jahren mit einer Fallot’schen Tetralogie und operativer Korrektur mit Hilfe der EKZ ohne Kreislaufstillstand wurden zur Erfassung der psychiatrischen Symptomatik mit dem kinderpsychiatrischen Interview (DIPS) sowie der Child Behavior Checklist (CBCL) in der Eltern- und Lehrerform untersucht. Zur Erfassung der kognitiven Leistungsfähigkeit führten wir den HAWIK III sowie den d2-Konzentrationstest durch. 20 gleichaltrige Kinder mit einem Vorhofseptumdefekt von Sekundum-Typ und interventionellem Verschluß des Defekts wurden als Kontrollgruppe den gleichen Tests unterzogen. Beim HAWIK-III handelt es sich um einen Intelligenztest für die Einzeluntersuchung von Kindern und Jugendlichen. Dieses Verfahren stellt die deutsch-sprachige Adaptation der Wechsler Intelligence Scale for Children-Third Edition (WISC-III; Wechsler,1991) dar und löste den 1983 erschienenen HAWIK-R ab .

Insgesamt lagen die kognitiven und psychomotorischen Leistungen bei den Kindern mit Fallot'scher Tetralogie bei über 85% des normalen Bereiches für normale Kinder in diesem Alter (Abb. 2.4.2-1). Beide Gruppen unterschieden sich nicht signifikant hinsichtlich Alter und Gewicht. Das jährliche Einkommen und Bildungsgrad der Eltern war in beiden Gruppen nicht signifikant unterschiedlich. Im 26 Vergleich mit der Kontrollgruppe zeigten die Kinder mit Fallot'scher Tetralogie einen niedrigeren Gesamt-IQ (p=0,06) und signifikant niedrigere Werte in einzelnen Untertests wie Handlungs-IQ (p=0,01) und Wahrnehmungsorganisation (p=0,006) (Abb. 2.4-1). Der Gesamt-IQ korrelierte nicht signifikant mit der Zahl der Operationen, des Dauer der EKZ, Grad der Hypothermie während der EKZ. Die Untersuchungen der psychiatrischen Ko-Morbidität zeigte keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu der Kontrollgruppe.

Die Blutflussgeschwindigkeiten wurden mit transkranieller Dopplersonographie bestimmt (Multi-Dop-P. DWL-Sipplingen, Deutschland) . Die mittlere Flussgeschwindigkeit (V_m) bietet eine qualitative Information über die regionale Hirnperfusion . Der Pulsatilitätsindex (PI), errechnet nach der Formel: PI maximale Flussgeschwindigkeit - enddiastolische Flussgeschwindigkeit / mittlere Flussgeschwindigkeit, dient zur qualitativen Beurteilung des zerebrovaskulären Widerstands. Während der Korrekturoperationen wurde ein 2 MHz Schallkopf am linken Temporalfenster zur kontinuierlichen Messung der Flussgeschwindigkeit in der A. Cerebri Media (ACM) plaziert. Das akustisch und visuell beste Flussmuster wurde nach Einstellung von Messvolumen, Tiefe und Dopplerverstärkung erhalten. Das Messvolumen wurde bei 1,5 mm, die Tiefe bei 3.5-4,5 cm gehalten. Der mittlere Wert von PI und Vm in 8 Herzzyklen wurden zur weiteren Analyse errechnet und dokumentiert.

Die unterschiedlichen präoperativen Werte der mittleren Flussgeschwindigkeit (V_m) in der A. cerebri media (ACM) waren alters- und gewichtsabhängig (Abbildung 3.1.1). Die transkraniellen Dopplerparameter näherten sich mit Kanülierung und Beginn der EKZ bei den drei Patientengruppen einander an (Abbildung 3.1.1). Nach Abklemmen der Aorta war ein signifikanter Anstieg der V_m-Werte (p=0,01) bei den überwiegend nicht-zyanotischen Kindern in der normothermen Gruppe zu verzeichnen, während bei den Kindern in tiefer und moderater Hypothermie ein langsamer Abfall der V_m (p=0,02) auftrat (Abbildung 3.1.1).

Die Neugeborenen und Säuglinge in der tief-hypothermen Gruppe hatten die niedrigsten V_m-Werte während und nach Beendigung der EKZ und unterschieden sich signifikant von den Kindern in den beiden anderen Gruppen (Abbildung 3.1.1). Acht von zehn Kindern in der tief-hypothermen Gruppe hatten einen hämodynamisch wirksamen persistierenden Ductus, was mit einer Erniedrigung des enddiastolischen Flusses und daraus resultierend mit einem signifikant erhöhtem Pulsatilitätsindex vor der EKZ einherging (p<0.01) (Abbildung 3.1.1).

Die systolischen und diastolischen Flussgeschwindigkeiten glichen sich nach Abklemmen der Aorta an. Erst mit Beendigung der EKZ stieg der PI in allen Gruppen unterschiedlich stark an. Auch nach Ende der Operation bestätigte sich der Trend der erhöhten PI-Werte in der tief-hypothermen Gruppe (Abbildung 3.1.1).

29 Abbildung 3.1.1: Veränderung der mittleren Flussgeschwindig-keit (Vm) und des Pulsatilitätsindex (PI) in der A. cerebri media (ACM) in den 3 untersuchten Gruppen. Im Gegensatz zu der Gruppe mit normothermer Perfusion, fielen die Vm-Werte nach Anschluss an die EKZ und Abklemmung der Aorta in der Gruppe mit moderater und tiefer Hypothermie signifikant ab. Der PI war in der hypothermen Gruppe im Vergleich zu der normothermen Gruppe signifikant erhöht. Die Flussrate der EKZ (ml/kg/min) war in der hypothermen Gruppe niedriger als in den anderen Gruppen.

Die Werte der mittleren Flussgeschwindigkeiten (Vm) korrelierten während der unterschiedlichen Phasen der EKZ signifikant mit dem Alter und Gewicht der Kinder (Tabelle 3.1.1). Der Einfluss des Perfusiondruckes und der Körpertemperatur war ebenfalls während und nach Ende der EKZ unterschiedlich ausgeprägt (Tabelle 3.1.1).

Ein Zusammenhang der Vm mit dem Hämoglobinwert war auf die Phase nach Ende der EKZ begrenzt. Die Altersabhängigkeit der Veränderungen im Pulsatilitätsindex (PI) war weniger ausgeprägt.

Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie ist erforderlich um Malformationen am Herzen oder an den herznahen Gefäßen, insbesondere im Bereich des Aortenbogens zu korrigieren. Einige Studien bei Neugeborenen haben ein abnormes Flussmuster in Form eines retrograden diastolischen Flusses während der Reperfusionsphase nach dem tief hypothermen Stillstand in der Arteria cerebri media gezeigt . Diese abnorme zerebrale Flussveränderung war nicht zu beobachten, wenn eine kühle Reperfusion nach dem Kreislaufstillstand durchgeführt wurde . Ähnliche abnorme Flussmuster wurden nur bei einigen der untersuchten Kinder beobachtet (Abbildung 3.1.2).

.

Vier homogene Gruppen von Kindern (Tabelle 3.2.1) wurden seriell vor und bis 144 Stunden nach den Herzoperationen untersucht. Fünfzehn Neugeborene nach Korrekturoperation einer Isthmusstenose ohne den Einsatz der EKZ dienten als Kontrollgruppe. Bei allen Kindern zeigte sich ein Abfall der zerebralen Flussgeschwindigkeiten während der ersten postoperativen Stunden, welche sich erst 24 Stunden nach der Operation normalisierten. Die Flussgeschwindigkeiten waren gewichts- und altersabhängig. Im Gegensatz zu den Gruppen von Kindern mit d-Transposition der großen Arterien (d-TGA), Ventrikelseptumdefekt (VSD), und atrioventrikulärer Septumdefekt 32 (AVSD) waren die zerebralen Flussgeschwindigkeiten bei den Kindern nach Korrektur einer Isthmusstenose (ISTA) ohne den Einsatz der EKZ nicht signifikant erniedrigt.

Sichtbare Hirnläsionen traten am häufigsten in Form von intraventrikulärer Plexusblutung bei Neugeborenen nach Switch-Operationen mit linksventrikulärer Funktionsstörung auf (Tabelle 3.2.2). Die simultane serielle Untersuchung des Schädel-Ultraschalls und der Flussgeschwindigkeit in der Arteria cerebri anterior und der Arteria carotis interna bei einer homogenen Gruppe von Neugeborenen vor und nach der Switch-Operation zeigte einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten intraventrikulärer Blutungen und Veränderungen des zerebralen diastolischen Flussmusters. Neugeborene, die eine intraventrikuläre Blutung entwickelten, hatten eine erhöhte enddiastolische Flussgeschwindigkeit vor dem sonographischen Nachweis der intraventrikulären Blutung (Abbildung 3.2.2 ). Nach diesem Ereignis war die enddiastolische Flussgeschwindigkeit bei den Neugeborenen mit intraventrikulärer Blutung niedriger als bei denjenigen ohne intraventrikuläre Blutung.

34 Abbildung 3.2.2: Veränderung des zerebralen Flussmusters (Flow Velocity Intergrtal FVI) in der Arteria cerebri anterior (ACA) und carotis interna (ICA) bei den Neugeborenen mit und ohne intraventrikulären Hämorrhagien (IVH) nach Swichoperationen. Die initialen postoperativen FVI-Werte waren signifikant höher in der Gruppe mit IVH (3.2.2 A). In der Gruppe mit IVH fiel der Resistanzindex (RI) während der ersten 8 Stunden postoperativ signifikant ab und stieg 48 Stunden nach der Operation erneut an (3.2.2 A). Diese Veränderung in dem RI war durch Schwankungen in der enddiastolischen Flussgeschwindigkeit bedingt (Abb. 3.2.2.B).

Wir untersuchten in dieser Studie, ob die Verwendung der Nahinfrarot-Spektroskopie (NIRS) in dem Somanetics-Zerebraloxymeter eine kontinuierliche und zuverlässige nichtinvasive transkranielle Überwachung der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung (rSO₂) in Relation zur jugularvenösen Sauerstoffsättigung (SjvO₂) ermöglicht .

Während Korrekturoperationen mit Hilfe der EKZ sollte die Veränderung in der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung (rSO2) kontinuierlich online registriert werden und die erfassten Veränderungen abhängig von der Art des Vitiums, dem Alter, dem Perfusionsmodus sowie dem Grad der Hypothermie untersucht werden. Zur statistischen Auswertung der Veränderungen in rSO2 sowie in den simultan erhobenen hämodynamischen Parametern, wie rektale Temperatur, mittlerer arterieller Druck, und Hämoglobinkonzentration, wurden charakteristische OP-Phasen während der extrakorporalen Zirkulation (EKZ) ausgewählt und durch repräsentative Werte dargestellt. Für jede der charakteristischen OP-Phasen wurde der Mittelwert einer 5-minütigen kontinuierlichen Registrierung zur weiteren statistischen Auswertung ermittelt. Der minimale Wert in der Verlaufskurve der rSO2 wurde nach Abklemmen der Aorta während der EKZ als Trendwert definiert (Abbildung 4.1.3).

Nach Beginn der EKZ war ein signifikanter prompter Anstieg (p=0,018) der rSO2 bei den überwiegend zyanotischen Kindern und Neugeborenen zu verzeichnen, während sie bei den nicht-zyanotischen Kindern langsamer, aber stetig abfiel (p=0,007) (Abbildung 4.1.3). Nach Abklemmen der Aorta näherten sich die Werte der rSO2 in den drei Patientengruppen einander an, so dass sich in dieser Operationsphase kein statistisch nachweisbarer Unterschied feststellen ließ (Abbildung 4.1.3). Diese Parameter fielen im Verlauf der EKZ bei allen Gruppen auf niedrigere Sättigungswerte ab (Abbildung 4.1.3). Bei tief bis moderat hypothermer EKZ hatten die Neugeborenen und Säuglinge mit 48% den niedrigsten Trendwert und unterschieden sich signifikant von den älteren Kindern, die überwiegend normotherm operiert wurden Während der Reperfusion stieg die rSO2 in den Gruppen unterschiedlich stark an und es zeigte sich nach Beendigung der EKZ ein persistierender signifikant niedriger Trend in der Gruppe der Neugeborenen, die tief-hypotherm operiert worden waren.

Die modifizierte Ultrafiltration wurde nach der von Naik und Elliot eingeführten Methode gehandhabt und diente dem Entzug von möglichst viel überflüssigem Wasser aus dem Systemkreislauf nach Ende der Operation . Der Einfluss des Entzugs von akkumulierten Wasser auf rSO2 unmittelbar nach der Operation ist unklar.

Es wurden 75 Kinder, davon 24 Neugeborene (medianes Alter 8 (3-21) Tage) und 51 Kleinkinder (medianes Alter 15,5 (1-63) Monate) mit zyanotischen und nicht-zyanotischen Herzfehlern in den ersten 72 Stunden nach der operativen Korrektur durch eine kontinuierliche Registrierung der rSO2 mit Hilfe des Zerebraloxyemeters INVOS 3100A (INVOS 3100A^®, Somanetics Corp., Troy, MI, 41 USA) untersucht. Die üblichen hämodynamischen Parameter und arteriellen Blutgase wurden simultan dokumentiert. Alle herzchirurgischen Eingriffe wurden mit Hilfe einer EKZ in tiefer bis moderater Hypothermie vorgenommen.

Es wurden signifikant erniedrigte rSO2-Werte bei allen Kindern während der ersten 24 Stunden postoperativ gefunden. Neugeborene zeigten niedrigere Werte (rSO2: 45,2 ±12,8) als ältere Kinder (rSO2: 50±9,8). Die rSO2-Werte stiegen während der ersten 8 bzw. 24 Stunden bei allen Kindern signifikant an (Abbildung 4.2.1). Die rSO2-Werte korrelierten mit der simultan seriell gemessenen venösen Sättigung im rechten Atrium (r=0,46, p=0,0001).

Zusätzlich zur Erfassung von Veränderungen in der Oxygenation auf zerebral-intravaskulärer Ebene ist die Evaluierung von Veränderungen im Sauerstoffmetabolismus auf zellulärer mitochondrialer Ebene von klinischer Bedeutung. Ein intrazelluläres Chromophob, das im Zusammenhang mit dem Sauerstoffmetabolimus steht, ist die Cytochromoxydase aa3 (Cyt.Ox aa3), das lezte Enzym der mitochondrialen Atmungskette . Das zweite eingesetzte Gerät in unseren Studien (Criticon 2020, Johnson-Johnson, England) hat eine erweiterte Funktion und ist in der Lage, Veränderungen im Oxidations- bzw. Reduktionszustand der Cyt.Ox aa3 auf zellulärer Ebene zu erfassen. Veränderungen im Redoxzustand der Cyt.Ox aa3, macht zu ca 90% der zelluläre Sauerstoffutilisation im aeroben Sauerstoffmetabolismus.

Eine enge signifikante Korrelation fand sich zwischen dem Abfall des Cyt.Ox aa3-Signals und dem simultanen Verlust des Signals der Energieträger Adenosintriphosphat (ATP) und Phosphocreatinin (PC), gemessen mit 31P-labeled magnetic resonance spectroscopy in einem Hypoxiemodell am neonatalen Schwein .

Das eingesezte Criticon-Zerebraloxymeter besteht aus einem HochleistungsProzessor, welcher die Lichtquelle kontrolliert, und 4 Laser-Dioden, die das Licht mit 4 Wellenlängen von 776.5, 819.0, 871.4 und 908.7 nm durch Haut, Knochen und Hirngewebe transportieren. Neben der kontinuierlichen Registrierung der regionalen Hämoglobinsättigung und der einzelnen Verläufe des oxygenierten (HbO2) und des deoxygenierten Hämoglobins (Hb) kann eine Abweichung im Redoxzustand der mitochondrialen Cyt.Ox aa3 von einer geeichten Nullinie kontinuierlich gemessen werden.

Die Zuverlässigkeit der Erfassung von Veränderungen in der zellulären Oxygenation mittels kontinuierlicher Messung des Cyt.Ox aa3-Signals mit NIRS in physiologischen und nicht-physiologischen Zuständen wurde bereits von der Arbeitsgruppe um Delpy und Wyatt in London durch mehrere experimentelle und klinische Arbeiten eingehend validisiert .

Durch intakte zerebrovaskuläre Autoregulation ist die Versorgung der Hirnzellen mit Sauerstoff, trotz einer gewissen intravaskulären Schwankung in Blutvolumen und Perfusiondruck, gewährleistet . Hirnzellhypoxie ist daher anzunehmen, wenn die Sauerstoffverfügbarkeit auf zellulärer Ebene signifikant beeinträchtigt ist .

43 Das Ausmaß der abnehmenden Veränderung in der intravaskulären Oxygenation während Korrekturoperationen mit Hilfe der EKZ, das mit einer signifikanten Abnahme des Sauerstoffs auf zellulärer Ebene einhergeht, ist unklar. Daher untersuchten wir in einer Gruppe von 78 Kindern die Zusammenhänge zwischen den Veränderungen in den intrazellulären und intravaskulären Oxygenationsparametern mit Hilfe des Zerebraloxymeters Criticon 2020.

Die frühzeitige Erkennung von zerebralen Schädigungen durch einen zusätzlichen spezifischen biochemischen Hirnzellmarker könnte von besonderer diagnostischer und prognostischer Bedeutung sein. Mehrere klinische Studien bei Erwachsenen und Kindern wiesen bereits auf die Spezifität und den neurologisch prädiktiven Wert des Protein S-100B nach herzchirurgischen Eingriffen hin . Andere Studien bei Erwachsenen zweifelten am diagnostischen Wert nach herzchirurgischen Eingriffen wegen möglicher Kontamination der gemessenen Werte mit Protein S-100 aus anderen Quellen, wie Fettzellen, wenn das abgesaugte Blut aus dem Thoraxbereich in den Patienten reperfundiert wird .

Die klinischen und experimentellen Untersuchungen in dieser Arbeit dienten daher der Charakterisierung des Zeitverlaufs der Serumwerte nach EKZ, der Evaluierung von Einflussfaktoren und der Untersuchung der neurologischen Bedeutsamkeit der Bestimmung dieser Hirnmarker nach herzchirurgischen Eingriffen im Kleinkindesalter. Im experimentellen Teil werden die neuropathologischen und immunhistochemischen Zusammenhänge mit dem Nachweis des Proteins S-100B im Serum untersucht.

An einem größeren Patientenkollektiv sollte im Rahmen der Bestimmung des Proteins S-100B als Screeningmarker für eventuelle zerebrale Schädigung nach den herzchirurgischen Eingriffen das Verlaufsmuster untersucht und definiert werden. In bestimmten Untergruppen von Kindern wurde der EinFluss von Medikamenten, intraoperativen Maßnahmen, und der Zusammenhang zur Veränderung in der zerebralen Perfusion und Oxygenation untersucht.

In diese Studie wurden 165 Kinder eingeschlossen. Die Patienten wurden nach den vorgesehenen chirurgischen Maßnahmen in sieben homogene Gruppen unterteilt (Tabelle 5.1.1:). Alle Patienten, mit Ausnahme der Gruppe mit hypoplastischem Linksherzsyndrom, wurden ohne Kreislaufstillstand mit Hilfe der EKZ operiert (Tabelle 5.1.1:). Vierzehn Kinder mit geplanter Korrekturoperation einer Isthmusstenose der Aorta ohne Einsatz der EKZ dienten als Kontrollgruppe (Tabelle 5.1.1:).

Zwölf Kinder entwickelten während der postoperativen Phase neurologische Komplikationen im Zusammenhang mit dem chirurgischen Procedere unterschiedlicher Art und wurden in eine separate.Gruppe eingeschlossen (Tabelle 5.1.1). Bei diesen Kindern sollte das Verlaufsmuster des Proteins S-100B in Gegenüberstellung zu dem der Kinder ohne neurologische Komplikationen verglichen werden. Die Blutentnahmen erfolgten vor der Operation, 2, 24, 48, 72 Stunden nach Ende der EKZ. Das Serumprotein S-100B wurde mit Hilfe eines LIA Kitts (Byk-Sangtec^®, Dietzenbach, Deutschland) gemessen. Alle Kinder wurden, mit Ausnahme der Säuglinge mit einer ISTA, mit Hilfe der extrakorporalen Zirkulation in tiefer Hypothermie bis Normothermie je nach Alter und Art des angeborenen Herzfehlers operiert (Tabelle 5.1.1). Die Regulation des Säure-Basen-Haushaltes erfolgte nach der Alpha-Stat-Methode, bei der pCO₂ und pH unkorrigiert für die absinkende Temperatur während der extrakorporalen Zirkulation gehalten werden.

Die präoperativen Werte waren gewichts- (r= -0.46, p=0.007) und altersabhängig (r= -0.46, p=0.004). Im Gegensatz zur Kontrollgruppe mit einer Isthmusstenose zeigte sich bei allen Kindern nach Korrekturoperationen mit Hilfe der EKZ ein signifikanter Anstieg der S-100B-Konzentrationen unmittelbar nach Ende der Operation (Abbildung 5.1.1). Die höchsten postoperativen Serumwerte des Proteins S-100B wurden bei Neonaten nach Korrekturoperationen komplexer Vitien wie der d-Transposition der großen Arterien und dem hypoplastischen Linksherzsyndrom, die längeren Bypasszeiten und tieferen Temperaturen unterzogen wurden, gefunden (Abbildung 5.1.1, Tabelle 5.1.1). Die postoperativen Werte korrelierten mit dem Alter (r=-0,55, p=0,0003), Gewicht (r=-0,54, p=0,0003), Bypasszeit (r=0,52, p00,0006) und der mit minimalen rektalen Temperatur während derEKZ (r=-0,63, p=0,0003).

49 Die Multiregressionsanalyse identifizierte jedoch die minimale rektale Temperatur während der EKZ als den größten unabhängigen Faktor, der die postoperative Serumkonzentration signifikant beeinflusst (p<0.001). Abnorm höhere postoperative Serumwerte des Proteins S-100B wurden bei Kindern mit nachgewiesenen neurologischen und hämodynamischen Komplikationen im Zusammenhang mit der Operation und dem Anschluß an der EKZ gefunden (Abbildung 5.1.2).

In dieser Studie wurden 63 Kinder im Alter von 0,2 bis 216 Monaten untersucht und entsprechend dem Operationsalter in drei Gruppen unterteilt (Tabelle 5.2.1). Die kontinuierliche Registrierung der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung wurde mit einem Zerebraloxymeter (INVOS 3100A, Somanetics^®, USA) vorgenommen. Bei allen Kindern wurden intraoperativ nach der Einleitung der Narkose, vor dem Start und nach Beendigung der extrakorporalen Zirkulation, am Ende der Operation Blutproben entnommen und unmittelbar danach zentrifugiert und eingefroren.

Bei allen Kindern konnte schon vor dem Start der extrakorporalen Zirkulation S-100 im Serum nachgewiesen werden (Tabelle 5.2.1). Nach der Operation stiegen die S-100-Serumwerte um zwei Standardabweichungen vom präoperativen Wert signifikant an. Der Spearman-Rank-Korrelationstest zeigte einen statistischen Zusammenhang zwischen den postoperativ erhöhten S-100-Serumwerten und der Erniedrigung der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung in der Reperfusionsphase (r=-0,37, p=0,02) und am Ende der extrakorporalen Zirkulation (r=-0,42, p=0,008) (Abb. 5.2-1). Die statistische Beziehung zum Abfall der zerebralen Oxygenation am Ende der Operation war nicht signifikant (r=-29, p=0.08). Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den maximal postoperativen S-100B-Werten und der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung in den übrigen Phasen der extrakorporalen Zirkulation war nicht nachweisbar.

Bei 56 Kindern (Neugeborene n=7, Säuglinge n=16, und Kleinkinder n=23) wurden serielle Blutproben über einen Jugularis-Katheter zu bestimmten Zeitpunkten der EKZ entnommen und sofort bei 2 °C mit einer Kühlzentrifuge im Operationssaal zentrifugiert und bei -70 °C eingefroren. Die Kinder wurden alle mit Hilfe der EKZ (140-200/kg/min) in tiefer bis moderater Hypothermie (15-34 °C) operiert. Für die Bestimmung von Malondialdehyd werden 100 &mgr;l Serum, 750 &mgr;l von 150 &mgr;M Phosphorsäure, 250 &mgr;l von 42 &mgr;M Thiobarbitalsäure und 400 &mgr;l gereinigtes Wasser zusammengegeben und für eine Stunde im Wasserbad gekocht. Die Reaktion wird durch 52 Überführen der Proben auf Eis gestoppt. Direkt im Anschluss wird die Malondialdehyd-Konzentration durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie bestimmt (Fluorometric Detector RF-10A, Column Supercosil 150x4 mm LC-18-S; Shimadzu, Duisburg, Germany).

Es zeigte sich eine kontinuierliche parallele Erhöhung beider Marker während der EKZ. Der größte relative Anstieg von S-100 (67%) und MDA (85%) fand jedoch nach Öffnung der Aorta in der Reperfusionsphase und nach Ende der EKZ (P<0.001) statt (Abbildung 5.3.1)

Die Abklemmzeit der Aorta (r=0,46, p=0,004) und der Grad der Hypothermie (r=-0,42, p=0,007) hatten den größten Einfluss auf die maximalen MDA-Werte. Die maximalen S-100-Werte korrelierten signifikant zur Bypasszeit (r=0,70, p=0,0007), Abklemmzeit der Aorta (r=0,57, p=0,002), Tiefe der Hypothermie (r=-58, p=0,004) und waren signifikant alters- und gewichtsabhängig(p<0,001).

201 Kinder mit angeborenen Herzfehlern wurden vor einem herzchirurgischen Eingriff in zwei Gruppen (mit und ohne Behandlung mit Natrium Nitroprussid) randomisiert. Eine Natrium-Nitroprussid-Infusion wurde bei der behandelten Gruppe (n=99) vor dem Start der EKZ mit geringer Dosierung begonnen und kontinuierlich nach adaptierter Dosierung bis 48 Stunden postoperativ fortgeführt. Das Protein S-100B wurde vor der Operation, 2 Stunden postoperativ und weiterhin täglich bis zum 3. postoperativen Tag bestimmt.

Wie in der vorherigen Studie zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Serumwerte des Proteins S-100Bzwei Stunden nach Ende der EKZ. 24 Stunden nach Ende der EKZ fielen die Serumwerte in beiden Gruppen ab. Diese späteren Werte waren jedoch bei den mit Natrium Nitroprussid behandelten Kindern signifikant niedriger (p<0.001) (Abbildung 5.4.1).

Bei 137 Kinder mit medianem Alter von 4,2 (0,1-70) Monate, und medianem Gewicht von 4,8 (2,5-18,8) Kg wurden nach korrektiven Operationen mit der EKZ in einer Guppe mit (n=62) und ohne MUF (n=75) eingeschlossen. Das Protein S-100B wurde vor der MUF, 2 Stunden nach Ende sowie täglich bis zum 3 postoperativen.Tag bestimmt (Byk-Sangtec® Dietzenbach-Deutschland).

Wie bei allen Untersuchungen stieg die Serumkonzentration des S-100B 2 Stunden nach Ende der EKZ signifikant in beiden Gruppen mit und ohne MUF an (Abbildung 5.5.1). Die Konzentrationen des Proteins S-100B 24 Stunden nach Ende der EKZ bzw. nach Ende der MUF waren jedoch bei den Kindern mit MUF signifikant niedriger (p<0.001) (Abbildung 5.5.1).

Das ultrafiltrierte Volumen ml/kg KG korrelierte mit der postoperativen Serumkonzentration des S-100B 2 Stunden (r= - 0.32, p=0.006), 24 Stunden (r= - 0.46, p=0.001) und 48 Stunden nach der MUF (r= - 0.44, p=0.01).

Beide Gruppen mit und ohne MUF unterschieden sich nicht signifikant hinsichtlich Alter, Gewicht und Bypasszeit und der Medikation mit Suprarenin oder Natrium Nitroprussid.

Neugeborene Hausschweine im Alter von weniger als 10 Tagen und einem Gewicht zwischen 1,5-2,8 kg werden aus einem Ferkelzuchtbetrieb im Lande Brandenburg am Versuchstag in die tierexperimentelle Einrichtung eingeliefert und bis zum Aufbau des Versuchs unter einer Wärmelampe gehalten. Die Tiere werden dann mit einer intramuskulären Injektion von Ketanest (25 mg/kgKG) und Dormicum (1 mg/kgKG) zur Einleitung einer Narkose prämediziert. Nach Punktion einer Ohrvene wird die Narkose intravenös mit Fentanyl (50 &mgr;g/kgKG) und Midazolam (Dormicum, 0.2 mg/kgKG) bei Relaxierung durch Pancuronium (0.2 mg/kgKG) mit bedarfsadaptierter Supplementierung zur Sicherung einer guten chirurgischen Toleranz vertieft und fortgeführt. Die kontrollierte Beatmung erfolgt nach endotrachealer Intubation mit einem Sauerstoff-Luft-Gemisch (Baby-Log Ventilator, Dräger, Lübeck).

Die Ferkel werden unmittelbar nach der Intubation auf die Seite gelagert, und nach Desinfektion des gesamten Rückens wird eine Lumbalpunktion zur Gewinnung von ca. 0.5-0.8 ml Liquor durchgeführt. Zentrale arterielle und venöse Zugänge werden in die Arteria femoralis und in die Vena subclavia gelegt. Nach Freilegung der Vena jugularis interna wird ein feiner Katheter zur kontinuierlichen Registrierung des venösen Drucks und Entnahme von Blutproben zur Bestimmung des O₂-Gehaltes, Glucosekonzentration sowie der verschiedenen Hirnmarker direkt aus dem zerebral venösen Rückstrom vorsichtig bis in den Bulbus jugularis hochgeschoben. Zur Überwachung der Ausscheidung und Urinmenge wird ein suprapubischer Blasen-Katheter gelegt und mit einem Flowmeter verbunden. Die Kerntemperatur wird mit einer rektalen und einer 59 ösophagealen Sonde kontinuierlich überwacht. Die pulsoxymetrische Sättigung wird mit einem Lichtsensor am Schwanz ebenfalls kontinuierlich registriert.

Zur Regulierung der rektalen Temperatur wird eine Wärmelampe oberhalb des Tieres und eine Wärmematte auf dem OP-Tisch unterhalb des Tieres nach Bedarf während des Experiments ein- oder ausgeschaltet.

Die extrakorporale Zirkulation (EKZ) wird gewährleistet durch eine Rollerpumpe (Stöckert-München) und ein neonatales Oxygenatorensystem (SaveMicro, Polystan, Vaerlose, Dänemark). Die Primeflüssigkeit besteht aus frischem Schweinespenderblut (400-500 ml) mit einem Hämoglobinwert von mehr als 7 mg/dl.

Nach Thorakotomie und Eröffnung des Perikards werden die Aorta ascendens und das rechte Herzohr mit Doppel-U-Nähten (6.0 Prolene) versehen. Dann wird die Aorta mit einer neonaten Aortenkanüle (8 Fr) und der rechte Vorhof mit einer venösen Kanüle (14 Fr) an die EKZ angeschlossen. Nach Start der EKZ wird das Tier über einen Zeitraum von 20 Minuten mit vollem Fluss (200-250 ml/kg/mi) normotherm perfundiert (rektale Temperatur 38 °C) (Abbildung 6.1.1).

Abbildung 6.1.1: Zeitlicher Verlauf der unterschiedlichen Phasen der experimentellen EKZ in Abängigkeit von der Temperatur. Während des gesamten Versuchs erfolgt ein Neuromonitoring mit Hilfe der Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS), der transkraniellen Dopplersonographie und der Mikrosphärenmethode zur Evaluierung der regionalen Hirnperfusion während der EKZ. Blutproben zur Bestimmung biochemischer Marker werden zu definierten Zeitpunkten abgenommen

Nach dieser Stabilisierungsphase von 20 Minuten wird das Tier mit Hilfe der EKZ systemisch innerhalb von 30 Minuten durch Kühlung des venösen Rückflusses auf eine rektale Temperatur von 60 13-14°C abgekühlt (Flussrate 200-250 ml/kg/min) (Abbildung 6.1.1). Im Anschluss daran wird ein totaler Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie für 60 bzw. 120 Minuten durch Abstellen der EKZ induziert. Nach langsamer Reperfusion mit kaltem Blut für 10 Minuten und folgender systemischer Erwärmung auf die normale rektale Temperatur von 38 °C über eine Dauer von 45 Minuten wird das Tier von der EKZ entwöhnt und postoperativ für weitere 6 Stunden intensiv-medizinisch überwacht (Abb. 6.2). Die rektale Temperatur wird durch Wärmelampe oberhalb und Wärmematte unterhalb des Tieres nach Bedarf reguliert und auf 37-38 °C gehalten. Der mittlere Perfusionsdruck wird über 60 mmHg gehalten. Die Beatmungsparameter werden nach Blutgasanalyse entsprechend des arteriellen pCO2 und des Säure-Basen-Haushaltes korrigiert.

Während des gesamten Versuchs erfolgt ein Neuromonitoring mit Hilfe der Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS), der transkraniellen Dopplersonographie und der Mikrosphärenmethode zur Evaluierung der regionalen Hirnperfusion während der EKZ. Blutproben zur Bestimmung biochemischer Marker werden zu definierten Zeitpunkten abgenommen (Abbildung 6.1.1).

Während des Experiments werden die bereits klinisch angewandten Neuromonitoring-Methoden wie transkranielle Dopplersonographie und Nahinfrarot-Spektroskopie eingesetzt. Zur Ermittlung der regionalen Hirnperfusion werden zusätzlich fünf unterschiedlich fluoreszierende Mikrosphären verwendet.

Die regionale intravaskuläre und intrazelluläre Oxygenation wird mit Hilfe der Nahinfrarot-Spektroskopie kontinuierlich überwacht und auf einem Rechner gespeichert (Criticon 2020, Johnson-Johnson, England).

Zur statistischen Auswertung der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung, der simultan erhobenen hämodynamischen Parameter “mittlerer arterieller Druck” und Hämoglobinkonzentration sowie der rektalen Temperatur wurden charakteristische OP-Phasen während der extrakorporalen Zirkulation ausgewählt und durch repräsentative Werte dargestellt. Für jede der charakteristischen OP-Phasen wurde der Mittelwert einer fünfminütigen kontinuierlichen Registrierung zur weiteren statistischen Auswertung ermittelt .

Die Mikrosphärentechnik kann verwendet werden zur Bestimmung des regionalen Blutflusses, zur Messung von Flussunterschieden im Körper und zur Messung der Auswurfleistung des Herzens. In unserem Falle diente sie der Messung des regionalen Blutflusses im Gehirn. Die Mikrosphären sind kleine runde Partikel (Durchmesser 15 &mgr;m ± 0,1 &mgr;m SD) aus Polystyren. Sie besitzen eine Dichte von 1,05 g/ml und entsprechen in dieser Eigenschaft in etwa den Blutzellen (1,10 g/ml). Die Mikrosphären werden in 0,15 molarer NaCl-Lösung mit 0,02-0,05% Tween 20 und 0,02% Thimerosal aufbewahrt. Zur Injektion wird circa 1 ml dieser Suspension auf einige ml NaCl-Lösung aufgezogen. Nach intravasaler Gabe werden die Mikrosphären mit dem Blutstrom bis in das Kapillarbett getragen und bleiben dort aufgrund ihrer Größe stecken. Diese Art der Mikroembolisation wird bei den im Versuch verabreichten Mengen strömungstechnisch nicht relevant, macht es jedoch möglich, nach Entnahme des Organs die Mikrosphärenanzahl pro Volumeneinheit Gewebe zu ermitteln. Diese spiegelt die regionale Durchblutung zum Applikationszeitpunkt wieder. Es gibt verschiedene Arten von Mikrosphären, nämlich radioaktiv markierte, gefärbte und fluoreszierende.

62 Fünf unterschiedlich fluoreszierende Mikrosphären (FluoSpheres, Molecular Probes Inc., Leiden, Holland) wurden im vorliegenden Falle zur quantitativen Evaluierung der globalen und regionalen Hirnperfusion in den Hauptphasen der EKZ eingesetzt. Die Injektion von 1 ml Mikrosphärensuspension enthält 1,0x10⁶ fluoreszierende Mikrosphären. Die Mikrosphärensuspension wird über fünf Minuten in einem Ultraschallbad vernebelt und danach in die aortale Kanüle über 30 Sekunden injiziert. Gleichzeitig wird eine Blutprobe zur Bestimmung der Referenzwerte der Mikrosphären im arteriellen Blut mit Hilfe eine Absaugpumpe in einem konstanten Fluss von 12 ml/min über zwei Minuten entnommen. Hämodynamische Parameter wie Perfusionsdruck, Flussraten der EKZ und Temperatur werden simultan registriert. Nach Ende des Akutversuchs werden Proben aus den unterschiedlichen Hirnarealen entnommen, zugeschnitten und für die Extraktion und Messung der regionalen Konzentration der unterschiedlichen Mikrosphären für die unterschiedlichen Phasen der EKZ durch Tiefgefrieren bei -75°C konserviert.

Zum Aufarbeiten wird jede Hirnprobe in ein mit Natronlauge (NaOH) gefülltes Reagenzglas gegeben und über Nacht unter einem Abzug bei 45°C inkubiert. Dies führt durch Auflösung des Gewebes zur Bildung einer filtrierbaren Suspension. Nach beendeter Mazeration werden die verdauten Proben mit Hilfe einer Millipore-Vakuum-Pumpe unter Verwendung von Filterpapieren mit einer Porengröße von 10 &mgr;m von den Mikrosphären getrennt. Die Sphären tragenden Filterpapiere werden vorsichtig zweimal in der Mitte gefaltet, so dass die Mikrosphären innen liegen, und in ein kubisch zulaufendes Reagenzglas gegeben. In einem Trockenschrank trocknen sie daraufhin 15 Minuten lang bei 50°C. Dann wird auf jedes Filterpapier gleichmäßig eine genau definierte Menge Lösungsmittel (100 &mgr;l 2-Ethoxyäthyl-Acetat oder Xylen) gegeben und das Reagenzglas für 30 Sekunden auf einem Vortexgerät geschüttelt. Danach wird der gesamte Inhalt fünf Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert und der Überstand wiederum in ein Reagenzglas abpipettiert. Um sicherzugehen, dass die Lösung aus Dye (Farbstoff) und Lösungsmittel gänzlich von Partikeln befreit wird, zentrifugiert man noch einmal drei Minuten lang bei einer Beschleunigung von 2000 g. Der Überstand wird in eine 100 &mgr;l-Quarzküvette pipettiert. Dieses Vorgehen führt zu einem kompletten Lösen des Farbstoffs aus den Mikrosphären. Das überstehende Lösungsmittel mit dem gelösten Farbstoff wird abpipettiert und das Extinktionsspektrum der Flüssigkeit im Spektrometer gemessen.

Zur Messung der Extinktionsspektra kann nahezu jedes Fluoreszensspektrometer verwendet werden, das im Wellenlängenbereich von 350 - 750 nm misst. Wir verwendeten das Luminiszenz-Spektrometer LS 50 B (Perkin Elmer). Bei Messung der Proben erhält man ein aus den verschiedenen einzelnen Spektra der in der Gehirnprobe enthaltenen Mikrosphären ein 63 zusammengesetztes Spektrum (Composit-Spektrum). In dem von uns genutzten Gerät haben wir ein Softwareprogramm installiert, das ein Composit-Spektrum in die einzelnen Spektra auseinanderdividieren kann. Weiterhin kann die Absaugrate der Blutproben (7,8 ml/min) eingegeben werden. Aus der Absaug-Rate (R), dem Spektrum der Blutprobe (S ref) und dem Composit-Spektrum (S i) kann so der Blutfluss zu der betreffenden Hirnprobe (F i) errechnet werden:

F i = (S i) (R) / (S ref) [ml/min]. Durch Eingabe des Gewichts der Gewebeproben wird der regionale Blutfluss (RBF [ml/min*g]) berechnet.

Blutproben werden aus dem zerebralvenösen Rückstrom zu definierten Zeitpunkten durch die sondierte Vena jugularis interna aus dem Bulbus jugularis entnommen (Abb. 6.2). Die Blutproben werden zentrifugiert und sofort bei -75 °C gelagert. Das Astrogliazellprotein S-100B und die neurale spezifische Enolase (NSE) werden im Serum und Liquor mit Hilfe eines LIA Kitts bestimmt (Byk-Sangtec, Dietzenbach, Deutschland). Die neuralen Marker Parvalbumin und Calretinin, die spezifisch in Subpopulationen einiger Neurone im Gehirn vorkommen, werden durch neuentwickelte Antikörper in Zusammenarbeit mit Prof. Marco Celio von der Universität Fribourg in der Schweiz bestimmt. Der Sauerstoffradikalmetabolismus wird anhand der Bestimmung der Konzentrationen von Malondialdehyd im Serum und Liquor bestimmt (siehe 5.3). Verfügbare immunologische Parameter für Schweine sind Interleukin 8 (IL-8) und der Tumor-Nekrosefaktor-Alpha (TNF-&agr;). Diese Cytokine werden mit Hilfe eines Elisa Kitts (CytoScreen, Biosource, Solingen, Deutschland) in dem immunologischen Labor des Instituts für klinische Immunologie der Charité bestimmt.

Das Protein S-100B ist überwiegend in den Astrogliazellen und Schwannzellen lokalisiert . Die Astrozytenreaktivität wird immunhistochemisch mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen das Protein S-100B in fixierten und in Paraffin eingebetteten Schnitten nachgewiesen (DPC^® Immustain, code CKS1S, DPC, Los Angeles, USA). Da das Protein S-100 wasserlöslich ist, findet sich nach dervEKZ eine Anfärbung nicht nur im Zytoplasma der Astrozyten sondern auch im extrazellulären Raum (Abbildung 7.1.2).

Monoklonale Maus-anti-human-NSE-Antikörper wurden in Paraffinschnitten eingesetzt, um die Lokalisation der NSE in den Neuronen zu identifizieren (DAKO-NSE, H14, Code No.M 873 Lot No.120). Die Enolasen sind Homo- oder Heterodimere, bestehend aus 3 Subeinheiten. Die Gamma-Subeinheit ist nur in den Neuronen vorhanden. Gamma-Gamma kann auch in anderen Zellen, wie Thrombozyten oder Megakaryozyten, T-Zellen und glatter Muskulatur vorkommen . Verlust oder Verblassen der Immunfärbung wurde als neuronale Schädigung interpretiert.

Das neuronale Ca⁺⁺-bindende Protein Parvalbumin wurde mit Hilfe monoklonaler Maus-Antikörper in Schnitten von fixiertem und in Paraffin eingebetteten Hirngewebe nachgewiesen (S. Want, Swiss antibodies, Bellinzona, Switzerland). Der monoklonale Antikörper Mouse IgG1 wird durch Hybridisierung von Myelomzellen mit Milzzellen aus Mäusen, die vorher mit Parvalbumin aus Karpfenmuskeln immuniziert wurden, gewonnen . Antikörper gegen das Parvalbumin reagieren spezifisch gegen die Ca-Bindungsstelle an dem Protein . Die Bindungsstelle kann dann indirekt durch Immunoperoxidase-Färbung sichtbar gemacht werden.

Ähnlich wie bei NSE wurde ein Verlust oder Verblassen der Immunfärbung in den angefertigten Schnitten als Zellschädigung interpretiert.

Die Ischämie ist definiert als ein Abfall der zerebralen Perfusion unter einem kritischen Punkt, an dem der Energiebedarf zur Erhaltung einer funktionellen und strukturellen Integrität der Hirnzellen nicht gewährleistet werden kann. Die Manifestation der hypoxisch-ischämischen Schädigung in den neuronalen und astroglialen Zellen kann sofort oder verzögert, nach Stunden oder Tagen, auftreten . Die Mechanismen der Hirnzellschädigung und der Neuronenverlust nach einem hypoxisch-ischämischen Ereignis sind multifaktoriell. Einströme von Ca⁺⁺-Ionen in die Zelle oder erhöhte intrazelluläre Freisetzung von Ca⁺⁺-Ionen wird als eine auslösende Ursache des frühen und verzögerten Zelltodes angesehen . Die vermehrten Ca^++-Ionen in den Zellen oder Zellorganellen führen zu einer enzymatischen Aktivierung von Lipasen, Proteasen und Endonucleasen, durch die es wiederum zum Abbau von Membranlipiden, des Zytoskeletts und zur Zerstörung der DNA kommt . Zusätzlich führt die ischämie-bedingte Hyperkalzämie zur Supression der Proteinsynthese und damit insgesamt zu einer Beschleunigung des Zelltodes .

Die hypoxisch nekrotisch veränderten Neurone werden in Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung ausgewertet. Die hypoxischen Neurone werden quantitativ morphometrisch in der Region des Hippocampus, Großhirns und der Stammganglien erfasst. Es werden pro Region 500 Neurone hinsichtlich nekrotischer Veränderungen gezählt und beurteilt.

Der hypoxisch bedingte nekrotische Zelltod ist lichtmikroskopisch charakterisiert durch Eosinophilie des Zytoplasmas, Zellschrumpfung und Kernveränderungen in Form von Kernpyknose und Kernbasophilie (Abb. 7.3.1). Ultrastrukturell wurde eine Schwellung und Dilatation der Mitochondrien und anderen Zellorganellen sowie eine Zellmembranruptur beobachtet.

Der Begriff Apoptose "griechisch, Herabfallen" wurde erstmal von Kerr und seinen Mitarbeitern als Bezeichnung für eine aktive Form des Zellunterganges neben der Nekrose geprägt . Im Gegensatz zum passiven nekrotischen Zelluntergang ist die Apoptose ein aktiver energieabhängiger Prozess der Zellzerstörung, welcher unter anderem auch physiologisch im gesunden Gewebe vorkommt . Morphologisch ist Apoptose im Gegesatz zur Nekrose durch Genomfragmentation, Zellschrumpfung und initialen Erhalt der Zellorganellen und der Zellmembran charakterisiert . Der apoptotische Zelltod bzw. der verzögert-genetisch programmierte Zelltod wird durch die mitochondriale Dysfunktion und Freisetzung des Apoptose-induzierten Faktors Cytochrom c aus den geschwollenen Mitochondrien getriggert . 68 Wenn die Mitochondrien nach einer Ischämie-Reperfusions-Phase einer Akkumulation von Ca++-Ionen oder oxidativem Stress durch Sauerstoffradikale ausgesetzt sind, öffnen sich in der mitochondrialen Membran die sogenannten Ca++-Poren (mitochondrial permeability transition pore MPT), die zum Kollaps des Membranpotentials, zum Abbruch der ATP-Synthese und zur Freisetzung von Cytochrom c führen . Cytochrom c aktiviert eine Reihe von Enzymen des Transkriptionsfaktors, die zur Zerstückelung und Auflösung der DNA führen .

Es wird vermutet, dass die mitochondriale Membranfunktion zum Teil durch die antiapoptotischen Gene der Bcl-₂ Familie kontrolliert wird . Hemmung der Expression dieser antiapoptotischen Gene wie BcL-₂ und Bcl-X_L zugunsten der pro-apoptotischen Gene Bax und FAS führt demnach zur Induktion der Apoptose in den Hirnzellen .

Die morphologischen Aspekte des apoptotischen Zelltodes umfassen lichtmikroskopisch die Kriterien der Zellschrumpfung unter Erhalt der Zellmembran mit charakteristischen Kernveränderungen in Form von Heterochromatisation (DNA-Fragmentation) . Der fragmentierte Kerninhalt erscheint als Chromatin-Körperchen oder apoptotic bodies . Bei der Apoptose liegen neben der Zellschrumpfung auch Oberflächenveränderungen vor, wobei Materialien, die aus der Zelle stammen, an der Oberfläche präsentiert werden.

Der apoptotische neuronale Zelltod wird nach der TUNEL-Methode (terminal transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling) (Boehringer, Mannheim, Germany) gefärbt. Die morphologischen Aspekte der Apoptose werden in Semi-Dünnschnitten weiter beurteilt und bestätigt.

Die Veränderungen von Konzentrationen des oxygenierten (HbO2) und deoxygenierten Hämoglobin (deoxy.Hb), der regionalen Hämoglobinsättigung (rSO2) sowie der intrazellulären Cytochromoxydase (Cyt.Ox.aa3) wurden mit einem Zerebraloxymeter (Criticon, Johnson&Johnson) online registriert. (s. 4.3) In beiden Gruppen wurde ein ähnliches Veränderungsmuster der intravaskulären und intrazellulären Oxygenationsparameter während der EKZ und des tiefhypothermen Kreislaufstillstand (THKS) festgestellt (Abbildung 7.4.2). In allen Tieren wurde ein initialer Anstieg von HbO2, rSO2 und ein Abfall von deoxy. Hb während der Kühlungsphase auf 14°C beobachtet (p=0.01). In dieser Phase kam es ebenfalls zu einem geringen Abfall von Cyt.Ox.aa3. (Abbildung 7.4.2Trotz der größeren Schwankungen der intravaskulären Hämoglobinparameter zeigte das intrazelluläre Cyt.Ox.aa3-Signal einen signfikanten Abfall erst nach Unterbrechung der Zirkulation während der tiefhypothermen Stillstandsphase .

Nach Beginn des THKS in tiefer Hypothermie kam es zunächst zu einem signifikanten kontinuierlichen Abfall von HbO2 und Cyt.Ox.aa3 (p=0.0001) sowie einem Anstieg von des deoxy.Hb (p=0.01). Der kontinuierliche Abfall der Cyt.Ox.aa₃ korrelierte mit der Dauer des Kreislaufstillstandes während der ersten 45 Minuten. Nach ca. 45 Minuten wurde eine Plateauphase ohne weiteren signifikanten Abfall erreicht. In der anschließenden Phase der Reperfusion und Erwärmung stellte sich größtenteils eine Erholung der Cyt.Ox.aa3 Werte ein. Der Ausgangszustand der verschiedenen Parameter wurde jedoch in der postoperativen Phase nach Ende der EKZ erreicht (Abb. 7.2.1).

Die regionale Hämoglobinsättigung (rSO₂) repräsentiert die gemischt-venöse Sättigung im zerebral venösen Blut. Wie bei den klinischen Ergebnissen zur Validisierung der transkraniell gemessenen rSO2 mit NIRS fanden wir auch in diesem experimentellen Teil mit nicht-physiologischen Situationen während der EKZ und tiefhypothermem Kreislaufstillstand einen engen Zusammenhang zwischen der Veränderung in der rSO₂ und der oxymetrisch gemessenen Sättigung des venösen Blutes im Bulbus jugularis (Abb. 7.4.1-4) .

Mit Hilfe einer Multiregression zeigte sich ein signifikant unabhängiger Einfluss des MAD unter 35 mmHg (p<0,01) und der Abnahme der Hämatokritkonzentration unter 22% (p<=0,01) auf der Reduktion der rSO₂ . Eine signifikante Abnahme der rSO₂, definiert als Abfall um 10% des Ausgangswertes für die Dauer von drei Minuten, war ebenfalls mit einer entsprechenden Abnahme der Cyt.Ox aa3 verbunden (Abbildung 7.4.1).

Die zerebrale Perfusion wurde qualitativ mit Hilfe der transkraniellen Dopplersonographie und quantitativ mit der Mikrospärentechnik beurteilt.

Die Serumkonzentration des S-100B wurde zu neun standardisierten Zeitpunkten während des gesamten Experiments gemessen. Tierexperimentell zeigte sich eine ähnliche Kinetik der Serumwerte wie bei den Neugeborenen während der Herzoperationen mit EKZ (s. Abschnitt 5.3). Unmittelbar nach extrakorporaler Perfusion und systemischer Kühlung stieg die Serumkonzentration schon vor dem Kreislaufstillstand in allen Tieren signifikant an (Abbildung 7.4.4). Der Hauptanstieg der Serumkonzentration fand jedoch während und nach der Reperfusion statt. Die Serumkonzentrationen waren nach Ende der Kühlung am Bypass und nach dem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie in der Gruppe von Tieren mit 120minütigem tiefhypothermen Kreislaufstillstand signifikant höher als die mit 60minütigem Kreislaufstillstand (Abbildung 7.4.4).

Bei sieben Tieren traten feststellbare kardiorespiratorische Komplikationen in Form von Kammerflimmern, Fehlintubation mit inadequater Oxygenation und Blutdruckabfall bei akuter Blutung vor oder unmittelbar nach dem Anschluss an die EKZ auf. Um den Effekt dieser vermeintlichen Ischämiephasen ohne Hypothermie zu untersuchen, wurden diese Tiere weiterhin 74 entsprechend unseres Protokolls an der EKZ perfundiert und einem tiefhypothermen Kreislaufstillstand unterzogen. Die Messung des Protein S-100B im Serum zeigte einen unmittelbaren abnormen Anstieg, der mit dem abnormen Verlaufsmuster bei Kindern mit definitiven neurologischen und kardiorespiratorischen Komplikationen vergleichbar ist (Abbildung 7.4.5a).

Die meisten dieser Tiere (5/7) mit einem abnormen intraoperativen Verlauf konnten aus kardialen Gründen nicht von der EKZ entwöhnt werden und wurden daher nicht weiter postoperativ entsprechend des Protokolls überwacht. Um die Durchlässigkeit der Bluthirnschranke bei den abnormen Serumwerten des S-100B qualitativ zu beurteilen, wurde Evans-Blue 15 Minuten vor Ende des Experiments systemisch verabreicht. Im Vergleich mit den anderen Tieren zeigte sich bei den Tieren mit kardiorespiratorischen

Komplikationen und begleitendem abnormen Anstieg der Serumwerte des S-100B sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch eine deutliche inhomogene Extravasation des Farbstoffes im Cortex und Kleinhirnbereich (Abbildung 7.4.5b). Der Austritt von Evans-Blue in den extravasalen Raum weist somit auf eine signifikante erhöhte Permeabilität der Blut-Hirnschranke hin.

Um die Wertigkeit des Serumwertes des S-100B bei den Tieren mit längerer Überlebensdauer weiter zu beurteilen, wurden die maximalen postoperativen Serumwerte mit dem Grad der hypoxischen Schädigung im Gehirn korreliert. Die maximalen Serumwerte zwei Stunden nach Ende der EKZ korrelierten positiv mit der Zahl der hypoxischen Neuronen im CA4 des Hippocampus (r=0,64, p=0,02) (Abbildung 7.4.6). Nach einer Einteilung der hypoxischen Schädigung 75 entsprechend der Zahl der hypoxisch-nekrotischen Neuronen unterschied sich der maximale Wert des Proteins S-100B nicht zwischen milder und moderater Hypoxie, sondern nur zwischen moderater und schwerer Hypoxie. Der maximale Wert des S-100B im Serum konnte somit nur eine schwere hypoxische zerebrale Schädigung anzeigen (Abbildung 7.4.6).

Der Liquor konnte nur vor dem Experiment durch eine Lumbalpunktion und nach Ende des Experiments nach sofortiger Aspiration aus der hinteren Schädelgrube gewonnen werden. Die Ausgangskonzentration des S-100B im Liquor war signifikant höher als im Serum (p<0,001). Die postoperativen Liquorwerte waren erstaunlicher-weise um das hundertfache höher als die maximalen postoperativen Serumwerte.

Um den Einfluss der EKZ und des tiefhypothermen Kreislaufstillstands auf die Verteilung des S-100B im Hirnparenchym zu evaluieren, wurden verschiedene Hirnareale immunhistochemisch mit dem S-100B gefärbt. Es zeigte sich eine deutliche Vermehrung der S-100B-Färbung, sowohl in den Astrogliazellen als auch im extrazellulären Raum. Im Vergleich mit den Kontrolltieren mit Scheinoperation zeigte sich die S-100B-Färbung in allen Tieren nach EKZ und tiefhypothermen Kreislaufstillstand diffus in allen Hirnarealen vermehrt (Abb. 7.4.7).

Insbesondere wurde die Färbung in den perivaskulären geschwollenen Anteilen der Astrozyten um die Venolen und Arteriolen des Hippocampus vermehrt gefunden (Abb. 7.4.7). Die Ependymzellen am Rande der Liquorräume waren ebenfalls mit S-100B intensiv gefärbt.

Zusätzlich zur Bestimmung des astroglialen Ca⁺⁺-bindenden Proteins S-100B wurden andere neuronale Ca⁺⁺-bindende Proteine wie Parvalbumin und Calretinin sowie die neurospezifische Enolase (NSE) im Serum und im Liquor bestimmt. Im Gegensatz zur Kinetik des Proteins S-100B im Serum waren die neuronalen Marker im Serum trotz des hypothermem Stillstands von zwei Stunden nicht angestiegen, sondern eher signifikant abgefallen (Abb. 7.4.8) . Diese Marker sind jedoch am Ende des Experiments im Liquor im Vergleich zu den Ausgangswerten massiv angestiegen (Abb. 7.4.9).

Der Nachweis dieser Marker im Serum war trotz des massiven Anstiegs im Liquor nicht möglich (Abb. 7.4.8). Die Konzentrationen dieser Marker waren im Vergleich mit denen von S-100B im Serum eher abgefallen, möglichweise durch Hämodilution der bereits vorhandennen Konzentrationen im Serum nach Beginn der EKZ mit Verdreifachung des zirkulierenden Blutvolumen im Tier und EKZ Kreislauf (Abb. 7.4.8). Der kontinuierliche Anstieg der Serumwerte des Astrogliazellproteins S-100B, im Gegensatz zu den neuronalen Markern NSE, 77 Parvalbumin und Calretinin, weist somit auf eine Durchlässigkeit der Bluthirnschranke für S-100B hin.

Die NSE, Parvalbumin und Calretinin wurden in verschiedenen nicht-hypoxischen Neuronen nachgewiesen. In den hypoxischen Neuronen war die immun-histochemische Färbung für Parvalbumin und NSE verblasst und nicht mehr im Zytoplasma der hypoxischen Neuronen nachweisbar (Abb. 7.4.10 ). Parvalbumin und Calretinin waren in einigen Subpopulationen von Kerngebieten außerhalb des Hippocampus vermehrt gefunden worden. Im Gegensatz zu der Immunfärbung von S-100B war die Färbung der neuralen Marker auf das Zytoplasma der Neuronen beschränkt. In den 3 Färbungen sind ausschließlich intakte Neurone mit Immunfärbung der Ca++bindenden Proteinen im Zytoplasma der Zellen dargestellt. In einigen Schnitten ist die astrozytäre Schwellung insbesondere in perivaskulären Regionen zu sehen (Abb.7.4.4).

Achtzehn neugeborene Ferkel im Alter von weniger als einer Woche wurden um ca. 8:30 Uhr am Tag des Versuches in die tierexperimentelle Einrichtung der Charité, Campus-Virchow Klinikum, eingeliefert. Die Tiere wurden in eine Kontrollgruppe (n=8) und in eine Gruppe (n=5) mit systemischer Steroidvorbehandlung mit Methylprednisolon (Urbason Methylprednisolone-21-hydrogen Succinate, Hoechst) unterteilt. Bei den systemisch vorbehandelten Tieren wurde 24 Std. und 5 Std. vor dem Operationsbeginn 30mg/kg Methylprednisolon intraperitoneal verabreicht. Bei fünf Tieren wurde nach einer Lumbalpunktion und Gewinnung von 0,5 ml Liquor eine Methyprednisolongabe von 30 mg/kg in den intrathekalen Raum injiziert. Die Vorbereitung, Anästhesieeinleitung, Perfusion der EKZ, Neuromonitoring sowie histologische Bearbeitung erfolgte nach dem im Abschnitt 6.1 beschriebenen Protokoll.

Um eine histologisch sichtbare Ischämie nach sechsstündiger Reperfusion zu erreichen, wurde die Kreislaufstillstandsphase in tiefer Hypothermie auf zwei Stunden ausgedehnt. Die Durchführung der Experimente erfolgte einheitlich nach unserem etablierten Modell der EKZ mit dem tiefhypothermem Kreislaufstillstand (siehe Abschnitt 6.1). Um mögliche protektive Effekte der pharmakologischen Vorbehandlung deutlich für die quantitative Evaluation einer Reduktion der Schädigung im Gehirn zu untersuchen, wurden höhere Dosen für die Vorbehandlung ausgewählt. Da Cyclosporin nicht leicht die Blut-Hirnschranke penetrieren kann, wurde ebenfalls eine höhere 92 Dosierung von 60mg/kg ausgewählt. Ein anderer Aspekt, der für die Erhöhung der Dosis spricht, ist die Verdreifachung des zirkulierenden Blutvolumens auf 400-450 ml, nach Anschluss der kleinen Tiere mit einem Körpergewicht von 2-2,5 Kg an die EKZ .

Für FK506 wurde eine intravenöse Dosis von 0,2 mg/kg, für Cyclosporin 60mg/kg auf 20 ml NaCl 0,9% als Kurzinfusion langsam über eine Stunde von vier bis fünf Stunden vor Beginn der EKZ perfundiert.

Die Tiere wurden standardisiert vorbereitet und dann nach einem einheitlichen Perfusionsprotokoll perfundiert (Abb. 6.1.2). Auch hier wurde beachtet, dass die Tiere eine Überwachungsphase nach dem Abgang von der EKZ von mindestens 5 Stunden ohne jegliche kardiopulmonalen Komplikation überlebten.

Die Alterationen der zerebralen Sauerstoffoxygenierung könnte eine auslösende Ursache für unterschiedliche Formen der zerebralen Zellschädigung während und nach der EKZ sein . Das Absinken der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung, die in engem Zusammenhang mit der venösen Blutsättigung im Bulbus jugularis steht, könnte möglicherweise auf eine Alteration der globalen zerebralen Sauerstoffsättigung während der Reperfusionsphase und am Ende der EKZ hinweisen .

Während der extrakorporalen Zirkulation könnten multiple physiologische Faktoren zu den Veränderungen in der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung wie Temperatur, Hämodilution und Perfusionsdruck beitragen (Abb. 5.1) . Unmittelbar nach Anschluss an die Herzlungenmaschine ist die Angleichung der zerebralen Sättigungswerte in allen Gruppen durch die Versorgung des Gehirns mit vollgesättigtem Blut zu erklären. Der nachfolgende unterschiedliche Abfall der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung trotz konstanter Flussraten deutet jedoch auf einen anhaltenden Sauerstoffverbrauch und ein Missverhältnis zwischen Angebot und Bedarf des Hirngewebes auch in moderater und tiefer Hypothermie hin. Andere Faktoren wie der präoperative Ausgangwert der arteriellen Blutsättigung der Hämatokritwert, der Perfusionsdruck und der Säure-Basen-Haushalt können in unterschiedlichem Maße zu den Veränderungen der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung beitragen .

Weiterhin kam es zu unterschiedlichen Veränderungen der regionalen zerebralen Hämoglobinsättigung während der Erwärmung und nach Ende der extrakorporalen Zirkulation. Ein vermehrter Sauerstoffverbrauch wurde nach hypothermer Perfusion bei herzchirurgischen Eingriffen in klinischen und tierexperimentellen Studien beobachtet . Zusätzlich zur erhöhten Ausschöpfung im Gehirn ist das Sauerstoffangebot durch einen gestörten kardialen Auswurf in dieser Phase vermindert. Alterationen der zerebralen Oxygenation und Perfusion könnten somit für die neuronale Zellschädigung in dieser Phase teilweise verantwortlich sein . Nollert et al. fanden eine signifikante Verminderung der neuronalen Schädigung durch eine hyperoxygenierte Reperfusion im Gegensatz zur normal oxygenierten Reperfusion nach tief hypothermem Kreislaufstillstand in einem tierexperimentellen Schweinemodell .

Die Limitierung der neurologischen Aussage solcher intra- und unmittelbar postoperativen Beobachtungen in der Kinderherzchirurgie besteht darin, daß neurologische 104 Langzeituntersuchungen unter Einbeziehung dieser neurophysiologischen Monitoring-Methoden fehlen .

Die kontinuierliche transkranielle Messung der regionalen Hämoglobinsättigung (rSO₂) spiegelt die Veränderung in der gemischt-venösen intrakraniellen Blutsättigung wider (Abb. 9.3.1) . Die signifikant erniedrigten rSO2-Werte in der frühen postoperativen Phase könnten auf eine erhöhte zelluläre Utilisation von Sauerstoff durch die Hirnzellen und/oder ein vermindertes Angebot an Sauerstoff durch niedriges Herzzeitvolumen hinweisen . Diese Veränderungen waren bei Neugeborenen mit einer insgesamt instabileren Hämodynamik und längeren Operationszeiten bei komplexeren Vitien noch ausgeprägter (Abb. 9.3.1) .

Die signifikante positive Korrelation zwischen der niedrigeren frühpostoperativen rSO₂ und der zentralvenösen Sättigung weist auf eine hämodynamisch bedingte Erklärung dieser Beobachtung hin . Eine Optimierung und Anpassung der Ventilation und der Hämodynamik sowie Optimierung des Sauerstoffangebots und Herzzeitvolumens während dieser vulnerablen Phase ist daher notwendig, um eine optimale zerebrale Oxygenation zu erreichen. Die Veränderung in der rSO₂ in diesem Bereich scheint eher hämodynamisch bedingt und möglicherweise nicht notwendigerweise mit einer signifikanten Alteration der Verfügbarkeit von Sauerstoff auf intrazellulärer Ebene assoziiert zu sein . Signifikante Veränderung des pO2, des mittleren arteriellen Druckes oder des Hämoglobingehaltes im Blut waren während der Erhebung der zerebralen Hämoglobinsättigung auf der Intensivstation nicht aufgetreten. Daher bietet die kontinuierliche Registrierung der rSO₂ mit dem INVOS-Zerebraloxymeter mehr eine Überwachung 105 von Veränderungen der regionalen intravaskulären Hämoglobinsättigung und weniger eine direkte Erfassung von Veränderungen des Sauerstoffmetabolismus auf zellulärer Ebene.

Sowohl klinisch als auch tierexperimentell zeigten sich große Schwankungen des oxygenierten und deoxygenierten Hämoglobins als Ausdruck von Veränderungen in Perfusionsdruck, Flussraten, Sauerstoffgehalt oder Temperatur . Ein signifikanter Abfall des Cyt.Ox aa_3-Signals war nur bei Stillstand der Zirkulation oder während einer signifikanten Hämodilution oder bei Druckabfall zu beobachten . Die Abnahme des Cyt.Ox.aa₃, als Indikator für Veränderungen im Sauerstoffmetabolismus auf intrazellulärer bzw. mitochondrialer Ebene tritt möglicherweise nur auf, wenn der Sauerstofftransport aus den Kapillaren ins Gewebe signifikant deprimiert ist . Daher eignet sich die kontinuierliche Registrierung des Cyt.Ox aa3Signals besonders für die Überwachung der intrazellulären Oxygenation während extremer Phasen der EKZ wie Hämodilution, tiefer Kühlung oder des Kreislaufstillstands in tiefer Hypothermie . In tierexperimentellen Studien korrelierte der Abfall des Cyt.Ox aa3 während des tief hypothermen Kreislaufstillstandes mit der Reduktion des intrazellulären Energieträgers ATP und ermöglichte die Vorhersage über das Ausmaß der neuronalen Zellschädigung . Inwieweit die Veränderungen im Cyt.Ox aa3 während der EKZ ohne Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie eine diagnostische oder prognostische Bedeutung haben, ist bis jetzt unklar.

Die trankranielle Quantifizierung des Oxydations- und Redoxzustandes der Cyt.Ox aa3 ist auch mit Limitationen behaftet . Die genaue Eindringstiefe des Lichtes im Hirnparanchym mit dieser Wellenlänge ist nicht gänzlich bekannt . Extrazerebrale Faktoren wie Liquor, die Gyrierung der kortikalen Schicht und ein mögliches Ödem nach der EKZ könnten die Penetration, die Streuung und das Absorbieren des Lichtes im Gewebe beeinflussen . Auf der anderen Seite wurde die Zuverlässigkeit der NIRS-Messung zur Erfassung des Zustandes der mitochondrialen Oxygenation durch selektive Blockierung der Cytochromoxydase mit Zyanid unter Beibehaltung der intravaskulärten Hämoglobinsättigung in experimentellen Arbeiten bestätigt . Der Zusammenhang zwischen dem Abfall des intrazellulären NIRS-Signal Cyt.Ox aa3 und der Reduktion der Energieträger ATP während der zerebralen Ischämie wurde in mehreren tierexperimentellen Untersuchungen demonstriert .

Die Bestimmung der Serumwerte des astroglialen Proteins S-100B vor und nach der EKZ zeigte einen signifikanten abrupten Anstieg, welcher im Zusammenhang mit dem unmittelbaren Anschluss an die EKZ steht . Die postoperativen maximalen Werte waren von Alter, Gewicht und Dauer der EKZ abhängig . Neurologische Affektionen waren nach herzchirurgischen Eingriffen mit abnorm hohen Serumwerten im Serum assoziiert . Daher war es wichtig, erstmals anhand einer großer Zahl von Kindern ´´normale´´ und abnormale Serumwerte nach Korrekturoperationen definierter Gruppen angeborener Herzfehler zu beschreiben .

Die Funktion einer erhöhten Synthese und /oder Freisetzung des Ca⁺⁺ -bindenden Proteins S-100B aus den Astrozyten unter dem Einfluss der extrakorporalen Zirkulation ist unklar. Die Ca⁺⁺_- Hömöostase spielt nach einer Ischämie und Reperfusion eine wesentliche Rolle bei dem neuronalen Zelltod . Protektive und trophische Funktionen wurden der erhöhten Expression des Ca⁺⁺-bindenden Proteins S-100B nach neuronaler Schädigung zugeschrieben . Daher ist eine protektive oder trophische Rolle des S-100B in Zusammenhang mit hypothermer Perfusion der EKZ nicht auszuschließen . Tierexperimentell wurde immunhistochemisch eine diffuse Ausbreitung des S-100B-Färbung im gesamten Hirnareal nach EKZ und tief hypothermem Kreislaufstillstand beobachtet . Insbesondere wurde die Immunfärbung des S-100B in perivaskulären ödematösen Prozessen der Astrozyten vermehrt gefunden .

Die Astrozyten grenzen mit ihren Fortsätzen unmittelbar an die Endothelzellen der Kapillaren (Abb. 9.2). Bei Hypoxie werden diese Fortsätze beschädigt. Der gleichzeitige Anstieg des Lipidperoxidationsendproduktes MDA und des Astroglialzell-markers in der Reperfusionsphase während der EKZ weist möglicherweise auf eine O2-Radikalinduzierte Zellmembranschädigung in diesen Fortsätzen auf zerebraler Ebene hin . Da das Protein S-100B ein astrozytäres und nicht-neuronales Zellprotein ist, erscheint eine früh-postoperative Aussage über das Ausmaß einer neuronalen Schädigung anhand des transienten Anstiegs des astroglialen Proteins S-100B im Serum nicht sicher möglich . Eine frühe morphologische Manifestation einer Ischämie-Reperfusion-Zellschädigung ließ sich in den Astrozyten und nicht in den Neuronen feststellen . Eine primäre Schädigung der Astrogliazellen, die ca. 50-60% der Hirnmasse ausmachen und eine vitale Rolle im 107 Transmittermetabolismus und im nutritiven Transport des Zentralnervensystems spielen, scheint jedoch für eine spätere sekundäre Schädigung der Neuronen von Bedeutung zu sein (Abb. 9.4.1) .

Das Protein S-100B kommt global in allen Hirnarealen in den Astrogliazellen vor und ist nicht auf eine regionale Zellpopulation begrenzt. Dies unterstreicht den diagnostischen Wert eines signifikanten Anstieges des astrozytären Proteins S-100B als Frühmarker für globale Ischämie in den Astrogliazellen und als prognostischen Marker für mögliche sekundäre Zellschädigungen der Neuronen. Ein persistierender abnormer Anstieg des S-100B im Serum für weitere 24 Stunden nach der EKZ ist möglicherweise auch hinweisend auf eine neuronale Zellschädigung und somit von frühdiagnostischer Bedeutung . Dies wurde bei Kindern mit manifesten neurologischen Abnormalitäten, wie postoperativen generalisierten Krämpfen, oder nachweisbaren Hirnparanchymläsionen beobachtet .

Die neurologische Signifikanz des passageren Anstieges um zwei Standardabweichungen des Ausgangswertes ist unklar. Viele Follow-up-Untersuchungen bei Erwachsenen nach herzchirurgischen Eingriffen zeigten einen prädiktiven Wert des S-100B im Serum hinsichtlich abnormer psychologischer Befunde . Im Gegensatz zeigten Nachuntersuchungen der psychomotorischen und neurologischen Entwicklung bei Kindern ohne feststellbare postoperative zerebrale Affektionen keine signifikanten Korrelationen zwischen dem erhöhten postoperativen Wert und der psychomotorischen Entwicklung im Alter von 1-2 Jahren . Möglicherweise ist die Erhöhung dieser Serumwerte in diesem Bereich ein Ausdruck latenter struktureller Schädigungen der Astrogliazellen und weniger der Neuronen , die nicht notwendigerweise mit den eingesetzten Untersuchungsmethoden der psychomotorischen Entwicklung zu erfassen sind . Ähnliche Studien bei Neugeborenen mit einer perinatalen Asphyxie bestätigten die Annahme, dass nur abnorme Werte des S-100B einen signifikanten prädiktiven Wert haben, um auf spätere Defizite in der psychomotorischen Entwicklung der Kinder hinzuweisen .

Wir konnten klinisch zeigen, dass abnorm erhöhte Serumkonzentrationen eine definitive zerebrale Affektion wie Blutung und Krämpfe und damit eine signifikante Schädigung des Zentralnervensystems anzeigen . Ähnliche Beobachtungen wurden bei der perinatalen Asphyxie unterschiedlicher Schweregrade gemacht, wobei nur abnorm erhöhte Werte eine schwere bis moderate Asphyxie mit einem hohen prädiktiven Wert anzeigen konnten . Tierexperimentell waren bei den Tieren mit hohen S-100B Spiegeln kardiorespiratorische Komplikationen augetreten, die mit einer signifikanten Störung der systemischen Perfusion und Oxygenation vor und nach Beginn der EKZ einhergingen, und mit Komplikationen im klinischen Alltag vergleichbar sind. Bei diesen Tieren wurde frühzeitig unmittelbar nach dem Ereignis ein abnormer Anstieg des S-100B im Serum gemessen. Makroskopisch wurde semiquantitativ durch Gabe als Marker verwendeten Vitalfarbstoffes eine Öffnung der Blut-Hirnschranke festgestellt. Eine diffuse Öffnung der Blut-Hirnschranke, wie es anhand der großflächigen Extravasation des Farbstoffes Evans-Blue im Cortexbereich nachzuweisen war, verbirgt in sich ein fatales Risiko für das Hirngewebe bei längerer Reperfusion. Viele toxische Substanzen, Sauerstoffradikale und andere Metaboliten können unkontrolliert durch die nicht-intakte Schranke ins Hirngewebe passieren und die Neuronen schädigen . Die meisten dieser Tiere waren zusätzlich kardial so beeinträchtigt, dass sie nicht von der EKZ zu entwöhnen waren. Der abnorme Anstieg des S-100B ist möglicherweise auch ein Ausdruck globaler Ischämie, die mit einer signifikanten Schädigung anderer Organe wie das Herz assoziiert ist, und hat damit einen zusätzlichen prädiktiven Wert im Hinblick auf die Gesamtprognose des Patienten . In der klinischen Studie starben 11 von 15 Kindern mit abnormen Werten nach herzchirurgischen Eingriffen im postoperativen Verlauf . S-100Ü ist unter anderen im Herzmuskulator vorhanden . Eine Kreuzreaktion durch den LIA-Test für S-100B ist unwahrscheinlich. Eine mögliche Konamination der Serumwerte des S-100B durch Freisetzung aus anderem Gewebe wie Fettzellen ist möglich. Die Konzentration des S-100B in diesen Zellen ist jedoch im Vergleich mit der S-100B Konzentration in den Astrozyten eher gering . Der massiveAnstieg der Konzentration des S-100B im Liquor spricht für eine signifikante zerebrale Beteiligung.

In einigen prospektiven klinischen Studien wurde das Protein S-100B seriell im Serum bestimmt, um den Einfluss pharmakologischer oder intraoperativer Maßnahmen auf die Serumkonzentrationen zu untersuchen . In diesen Studien wurde der Einfluss der kontinuierlichen Behandlung mit 109 Nitruprussid Natrium und der Einsatz der modifizierten Ultrafiltration auf die Serumwerte des astroglialen S-100B Proteins untersucht. Wie in allen Untersuchungen stieg die Serumkonzentration des S-100B unmittelbar nach der EKZ in beiden Gruppen signifikant an . Bei den behandelten Kindern und Neugeborenen wurden signifikant niedrigere Serumkonzentrationen nicht unmittelbar, sondern 24 Stunden nach Ende der EKZ festgestellt. Da die Halbwertzeit des S-100B im Serum weniger als zwei Stunden beträgt, sollten die Serumwerte 24 Stunden nach der Operation normalisiert sein . Im Vergleich zu den Kindern mit Niprussidbehandlung blieben die Serumwerte des S-100B in den nicht-behandelten Kindern signifikant höher als die präoperativen Werte . Im Hinblick auf eine mögliche Kontamination der initial erhöhten Werte im Serum aus extrazerebralen Quellen scheint der verspätete Anstieg eine bessere Aussage über eine mögliche Weiterfreisetzung aus dem Gehirn zu liefern.

Aufgrund des potenten vasodilatativen Effektes des NO-Spenders Natrium Nitroprussids (Nipruss) wurde ein protektiver Effekt in verschiedenen Modellen der Ischämie und Reperfusion in vitro und in vivo festgestellt Gemäß vielen Ergebnissen in vitro wurde ein direkter antioxidativer Effekt von Nipruss in den Astrozyten . und in den Endothelzellen gefunden. Wenn man annimmt, dass das gemessene S-100B im Serum aus geschädigten Astrozyten stammt, könnte die spätere Reduktion und schnellere Normalisierung der Serumwerte durch Nipruss als ein protektiver Effekt im Bereich der Blut-Hirnschranke gedeutet werden

Inwieweit diese Beobachtung einen signifikanten protektiven Wert im Zentralnervensystem darstellt, ist jedoch aufgrund fehlender anderer neurophysiologischer und Follow-up-Daten bei diesen Kindern eher limitiert. Viele experimentelle Ergebnisse in Tiermodellen lassen trotzdem auf einen gewissen vorteilhaften Effekt durch die kontinuierliche intra- und postoperative Behandlung mit Nipruss in niedriger Dosierung schließen.

Seit der Einführung der modifizierten Ultrafiltration (MUF) in der Kinderherzchirurgie werden die klinischen Vorteile durch Entzug von Wasser und inflammatorischen Mediatoren im Gewebe nach der EKZ kontrovers diskutiert Ein protektiver Effekt durch Entzug von akkumuliertem Wasser auf zerebraler Ebene ist unklar . Auch in diesem Zusammenhang wurde die Bestimmung des Astrozytären Ca⁺⁺bindenden Protein S-100B als ein Marker eines möglichen Effektes eingesetzt. Hier zeigte sich, ähnlich wie nach der Behandlung mit Nipruss, bei den Kindern mit MUF eine signifikante spätere und nicht eine unmittelbare Abnahme der Serumkonzentrationen des S-100B nach EKZ. Aufgrund einer möglichen Kontamination der maximalen Werte des S-100B unmittelbar nach EKZ und der kurzen Halbwertzeit durch renale Elimination würde eine 110 persistierende Freisetzung und Serumerhöhung das Ausmass der Schädigung bzw. einer protektiven Antwort nach Intervention wie in diesem Zusammenhang wiederspiegeln . Die Verbesserung in der gesamthämodynamischen Situation durch den Entzug von akkumuliertem Wasser im Gewebe nach MUF wurde möglicherweise auch in einer Verbesserung der zerebralen Perfusion und Oxygention resultieren . Morphologische Veränderungen im Gehirn manifestierten sich initial nach hypothermer EKZ in den Astrogliazellen in Form von Schwellung der perivaskulären Astrozytenfüßchen, was möglicherweise ein Ausschwemmen vom löslichen Protein S-100B bewirken könnte . Die zusätzliche Rolle der Inflammation bei der endothelialen Schädigung nach normothermer und moderat-hypothermer EKZ wird vermutet . Auch ein Zusammenhang zwischen dem Anstieg der Cytokine IL-8, IL 6 und des S-100B wurde bei pädiatrischen Patienten nach EKZ gefunden . Durch die MUF sollen viele inflammatorische Mediatoren aus dem Kreislauf am Ende der EKZ eliminiert werden . Inwieweit der schnelle spätere Abfall des S-100B im Serum im Zusammenhang mit einer Reduktion der inflammatorischen Antwort durch MUF steht, bleibt unklar . Cytokine wurden bei diesen Patienten nicht gemessen.

Zusätzlich zur Bestimmung des astrozytären Proteins S-100B wurden andere neuronale Ca⁺⁺-bindende Proteine wie Parvalbumin und Calretinin sowie die neurospezifische Enolase (NSE) im Serum und im Liquor bestimmt. Diese Marker sind in unterschiedlichen Subpopulationen von Neuronen vorhanden und werden bei Membranschädigung oder Zelluntergang freigesetzt. Im Gegensatz zur Kinetik des Proteins S-100B im Serum waren die neuronalen Marker, NSE, Parvalbumin und Calretinin im Serum trotz des hypothermem Stillstands von zwei Stunden Dauer nicht angestiegen, sondern eher signifikant abgefallen. Diese Marker sind jedoch am Ende des Experiments im Liquor im Vergleich zu den Ausgangswerten um mehr als das Hundertfache angestiegen (Abb. 7.4.6). Da die neuronalen Marker Parvalbumin, Calretinin und NSE ein viel größeres Molekulargewicht als das Protein S-100B aufweisen (20000 vs. 76.000 KD), ist ihre Passage durch eine intakte Blut-Hirnschranke eher limitiert. Der Nachweis dieser neuronalen Marker im Serum war trotz des massiven Anstiegs im Liquor nicht möglich (Abb. 7.4.6-2). Der Abfall der Serumkonzentration der neuronalen Marker nach dem Anschluß an der EKZ ist möglicherweise durch Hämodilution der vorhandenen Konzentrationen ohne weitere Freisetzung aus dem Zentralnervensystem bedingt.

Das zirkulierende Blutvolumen wird mit Anschluß an der EKZ um das Dreifache vergrößert. Die Messung der neuronalen Marker im Liquor und nicht im Serum ist für die Evaluation möglicher zerebraler Schädigungen nach EKZ eher geeignet. Der signifikante Anstieg der 111 Serumkonzentrationen des Proteins S-100B, trotz des Missverhältnisses zwischen dem Liquor und Serumvolumen, weist auf eine signifikante Passage vom Gehirn in die Blutbahn hin. Das freigesetzte S-100B wird in ein viel größeres Medium verteilt (Liquor ca 3 ml, Blut 160 ml bei 2 kg Ferkel), was möglicherweise die niedrigere Konzentrationen im Serum im Vergleich mit dem Liquor erklärt.

Obwohl in der letzten Zeit Erkenntnisse über eine Kontamination des gemessenen S-100B im Serum aus anderen Quellen wie Fettzellen publiziert wurden , zeigen unsere Ergebnisse einer massiven Erhöhung des S-100B eine spezifische Schädigung auf zerebraler Ebene im Zusammenhang mit der EKZ und dem tief hypothermen Kreislaufstillstand. Der signifikante Anstieg der Konzentrationen des S-100B sowohl im Liquor als auch im Serum, trotz des Missverhältnisses der Konzentrationen in beiden Medien, weist auf einen zerebralen Ursprung der gemessenen Werte hin. Sicherlich ist die Gewinnung von Liquorproben in der klinischen Praxis bei kleinen Kindern nach herzchirurgischen Eingriffen nicht einfach durchzuführen. Die abnorm erhöhten Werte im Serum konnten sowohl klinisch also auch tierexperimentell eine Hirnschädigung anzeigen. Daher eignet sich das Astrogliazellprotein S-100B, und weniger die neuronalen Proteine, als Marker der globalen Zellschädigung . Zusätzlich kommt das Astrogliazellprotein S-100B in allen Hirnregionen vor, und eignet sich somit als Marker einer globalen und fokalen ischämischen Schädigung. Im Hinblick auf eine mögliche Kontamination aus anderem Gewebe nach EKZ sollten nicht nur einmalige sondern serielle Messungen während des postoperativen Verlaufs erfolgen. Eine Neusynthese vom protein S-100B in den Astrozyten sollte mit gezielten Studien künftig untersucht werden.

Der Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie ist eine der ältesten Methoden, die ein blutfreies Feld bei der Korrektur komplexer Malformationen des Herzens und der herznahen Gefäße ermöglichte . In den letzten 50 Jahren unterlag der Einsatz der Ganzkörperkühlung während herzchirurgischer Maßnahmen einer Reihe von Modifikationen und Verbesserungen. Während die ersten Operationen am offenen Herzen eine Oberflächen-Kühlung des gesamten Körpers in einem Eisbad erforderte , gelingt heute eine systemische Blutkühlung in verschiedenen Graden und Geschwindigkeiten, dank vieler Verbesserungen der EKZ, problemlos.

Der Einsatz der Hypothermie wird in verschiedenen Institutionen jedoch sehr unterschiedlich gehandhabt, was die unterschiedlichen Ergebnisse der Neuroprotektion erklärt . Während einige Kliniken eine systemische Kühlung mit niedrigem Fluss bevorzugen, werden die Patienten in anderen Kliniken mit viel höheren Flussraten perfundiert und diese bis zum Ende der Kühlung fortgesetzt. Auch die Regulation des Säurebasen-Haushaltes während der Kühlung an der EKZ ist für die Gewebeperfusion von Bedeutung . Während einige Institutionen die Kühlung mit der Alpha-Stat-Methode (unkorrigierte pCO2 und pH-Werte für die absinkende Temperatur) durchführen, bevorzugen andere die Korrektur des Säurebasen-Haushaltes entsprechend der Kühlung (pH-Stat Methode) .

Die Ergebnisse unserer Untersuchung sowohl am Kaninchen als auch bei den neonatalen Schweinen zeigten keine signifikante neuronale Schädigung nach 60 minütigem Kreislaufstillstand, wenn die systemische Kühlung am Bypass mit höheren Flussraten und höheren Perfusionsdrucken 113 sowie einem einheitlichen Einsatz der Alpha-Stat Methode erfolgte. Sicherlich war eine signifikante neuronale Schädigung nach Verdopplung der Kreislaufstillstandszeit zu erwarten. Die Stillstandzeit wurde in den nächsten Versuchsreihen verlängert, um bewusst histologisch eine hypoxische Schädigung zu provozieren. Anhand weiterer phramakologischer Interventionen sollte es dann der protektive Effekt in repräsentativen Regionen des Hippocampus quantitativ evaluiert werden . Auch nach zweistündlichem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie war es trotzdem erstaunlich, wie viele intakte Neurone noch zu finden waren. Diese Befunde unterstreichen die Rolle der systemischen Kühlung mit hohen Flussraten und hohem Perfusionsdruck, um eine effektive Gewebekühlung im Gehirn vor dem Stillstand zu erreichen .

Die systemische Vorbehandlung mit hochdosierten Steroiden zeigte tierexperimentell nicht den erhofften protektiven Effekt. Die intrathekale Applikation unter Umgehung der Blut-Hirnschranke konnte jedoch die Zahl der hypoxisch-nekrotischen Neurone im Hippocampus signifikant reduzieren .

Langley et al untersuchten in einem ähnlichen Modell den Einfluss der Vorbehandlung mit Steroiden in gleicher Dosierung auf die zerebrale Perfusion und Oxygenation und fanden eine verbesserte regionale und globale Perfusion bei den vorbehandelten Tieren . Aufgrund dieser Ergebnisse schlussfolgerten sie einen protektiven Effekt, ohne jedoch eine morphologische Bearbeitung des Gehirns durchzuführen . Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Langley et al. fanden wir in unserer Studie nur bei den intrathekal vorbehandelten Tieren einen signifikanten Anstieg der regionalen zerebralen Perfusion. Diese Diskrepanz ist möglicherweise durch die unterschiedlichen Methoden zur Quantifizierung der zerebralen Perfusion bedingt. Die morphologische Quantifizierung der hypoxischen Schädigung im Hippocampus, Gyrus cinguli und Nucleus caudatus zeigte keine Reduktion der hypoxisch-nekrotischen Neurone durch systemische Vorbehandlung mit Methylprednisolon. Die intrathekale Gabe von Methylprednisolon vor dem hypothermen Kreislaufstillstand unter Umgehung der Blut-Hirnschranke bewirkte jedoch eine signifikante Reduktion der hypoxischen Schädigung. Mehrere Mechanismen gegen die Ischämie und die Schädigung während der Reperfusion wurden den Steroiden im Zentralnervensystem zugeschrieben, wie die abschwellende , die antioxidative , die antiinflammatorische sowie die antiexzitatorische Wirkung . Das systemisch verabreichte Steroid scheint jedoch nicht eine ausreichende Konzentration auf zerebraler Ebene zu erreichen, um diese o.g Wirkungen gegen die zerebrale Ischämie zu entfalten . Das Fehlen solcher protektiven Wirkung nach systemischer Gabe lässt auf eine geringe Penetration des Methylprednisolon durch die Blut-114 Hirnschranke vermuten . Systemisch verabreichte Steroide werden an spezifischen Steroidrezeptoren auf der Endothelseite der Blut-Hirnschranke gebunden und können nur in geringen Mengen die Blut-Hirnschranke passieren . Die Neuronen, insbesondere die unreifen, können ihre Selbstzerstörung durch Hochregulation von programmierten Prozessen (Apoptose) auslösen . In der Postnatalzeit ist die Apoptose besonders häufig im Subiculum und in den Zellkernen der Brücke nach einer Ischämie und Reperfusion zu finden . Dieses Läsionmuster wurde bei den untersuchten Gehirnen verstorbener Kinder mit angeborenen Herzfehler beobachtet . Dagegen wurden solche neuropathologischen Befunden nicht bei den Ferkeln nach tief hypothermem Kreislaufstillstand gefunden.

Die Vorbehandlung mit Methylprednisolon scheint signifikant die Zahl der apoptotischen und TUNEL-positiven Neuronen im Gyrus dentatus des Hippocampus zu erhöhen . Da die Apoptose häufiger bei unreifen als unreifen Zellpopulationen vorkommt, könnte dies die regionale Vulnerabilität des Gyrus denatus für Apoptose, wo überwiegend unreife Kernzellen vorkommen, zum Teil erklären .

Die Ursache für die vermehrte Induktion apoptotischer Zellen im Zusammenhang mit Methylprednisolon ist nicht gänzlich geklärt. Alterationen des intrazellulären Ca⁺⁺-Haushaltes durch Einstrom von Ca⁺⁺-Ionen von außen oder die Erhöhung des intrazellären Ca⁺⁺-Spiegels können die Induktion des sekundären programmierten Zellsterbens auslösen . Intrazelluläres Kalzium führt zur enzymatischen Aktivierung von Lipasen, Proteasen und Endonucleasen, die eine Fragmentation der DNA und einen Zellabbau bewirken . Außerdem beeinflusst das Kalzium den phosphorylisierten Zustand vieler Proteine und stört damit die Aktivität von Enzymen, Rezeptoren und Genexpression, die eine Gegenregulation bewirken könnten . Die Aktivierung der Steroidrezeptoren, die nicht nur am Endothel, sondern auch an vielen Neuronen vorhanden sind, beeinflusst die Ca^++-Homöostase in den Astrozyten und anderen benachbarten Neuronen . Ob das Eingreifen in der Ca^++-Haemostase durch die Steroide die Zellnekrose und Apoptose nach der Ischämie begünstigt, ist nicht auszuschließen . Im normalen Zustand spielen eine Reihe von Genen und Proteinen der Bcl-2 Familie eine wichtige Rolle in der Signalübertragung und Regulierung der pro- und antiapoptotischen Prozesse . Neue Untersuchungen im Hippocampus der Ratte zeigten, dass die Aktivierung des Steroidrezeptors zu einem Missverhältniss von proapoptotischen gegen antiapoptotischen Molekülen führt . Daher könnten die Steroide eine wichtige Rolle bei der Apoptoseinduktion auf molekularer Ebene spielen. Hinweise auf die Rolle der Steroide in der Induktion von Apoptose in anderen Zellorganellen wurden in mehreren Studien dokumentiert . Die Apoptose ist im 115 Gegensatz zur Nekrose energieabhängig . Inwieweit die Hyperglykämie und die erhöhte Perfusion in einigen Hirnregionen eine Rolle bei er zusätzlichen Energiezufuhr und damit bei der Begünstigung apoptotischer Prozesse in den Neuronen spielt, ist unklar. Kurth et al. berichtete in einem ähnlichen Tiermodell über einen Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Apoptose und der Hyperglykämie während der EKZ .

Die Rolle der Steroide im Zentralnervensystem bei unreifen Neugeborenen und Feten wird zunehmend kontrovers diskutiert . Sowohl klinisch als auch tierexperimentell verdichten sich die Hinweise auf eine ernste Nebenwirkung der systemischen Behandlung mit Steroiden im unreifen Zentralnervensystem . Die Indikationsstellung zur Verabreichung von Steroiden im Neugeborenenalter wird in zunehmendem Maße vorsichtiger gestellt. Zwei neue Follow-up-Studien haben einen signifikanten negativen Einfluss der Steroide bei der Behandlung der bronchopulmonalen Dyplasie auf die psychomotorische Entwicklung im späteren Alter gezeigt .

Wir konnten mit dieser Studie zum ersten mal auf die signifikante Nebenwirkung eines Medikamentes hinweisen, welches routinemäßig in der Kinderherzchirugie eingesetzt wird. Die Wirkung und Nebenwirkung vieler kardialer und nicht-kardialer Medikamente im unreifen Zentralnervensystem nach solchen nicht-physiologischen Bedingungen der EKZ sind weiterhin nicht gänzlich geklärt und bedürfen einer ähnlichen Überprüfung im Tierexperiment.

Andere Medikamente, die im Zusammenhang mit der Herzchirurgie und der Organtransplantation eingesetzt werden und zunehmend nach neuen Erkenntnissen eine Rolle im Zentralnervensystem spielen, sind die Immunsuppressiva FK506 und Cyclosporin A. Daher wurden beide Präparate nach ihrer Wirkung im Zentralnervensystem im Zusammenhang mit der EKZ und tiefhypothermen Kreislaufstillstand in unserem Tiermodell überprüft.

Anhand der quantitativen histologischen Bearbeitung der Gehirne der mit FK506 vorbehandelten Tieren konnte festgestellt werden, dass eine signifikante Reduktion der hypoxisch-nekrotischen Zellen in den Hippocampus-Regionen CA1 und CA 4 vorlag. Wie in vielen experimentellen Studien gezeigt wurde, scheint die protektive Wirkung des FK506 auf einer Hemmung der neuronalen NO-Synthetase zu beruhen .

Mehrere experimentelle Studien haben einen neuroprotektiven Effekt des FK506 in verschiedenen Formen der Ischämie-Reperfusion des Gehirns und anderen Organen gezeigt . FK506 hemmt die 116 Neurotoxität der NMDA-Calcium-Kaskade in primären corticalen Zellkulturen und verhindert möglicherweise die Dephosphorylation der NO-Synthetase und damit die Bildung von NO .

In einem Insulin-induzierten Hypoglykämie-Modell zeigte sich ein protektiver Effekt auf die mitochondriale Schwellung nach Behandlung mit Cyclosporin und nicht mit FK506 . Außerdem zeigte FK506 eine Erhaltung der cAMP-Bindungskapazität und damit der intrazellulären Signaltransduktion trotz einer Ischämiephase von zwei Stunden .

Wie auch bei der pharmakologischen Intervention mit Methylprednisolon zeigte sich in unserem Modell eine signifikante Vermehrung apoptotischer und TUNEL-positiver Neuronen im Gyrus dentatus. Hinsichtlich der Wechselwirkung von FK506 mit der Induktion von Apoptose im Zentralnervensystem sind widersprüchliche Angaben in der Literatur vorhanden . Etablierte klinisch relevante Modelle zur Evaluation des Einflusses von verschiedenen Medikamenten im Zentralnervensystem während tiefhypothermem Kreislaufstillstand sind nicht vorhanden. Während Yardin et al eine antiapoptotische Wirkung in neuronalen Zellkulturen durch FK506 nachwiesen , fanden Koche et al eine vermehrte apoptotische Zellveränderung in Zellkulturen von Endothelzellen zerebraler Arteriolen und spekulierten damit auf eine Schädigung der Blut-Hirnschranke durch FK506 . Auch Asai et al fanden eine anti-apoptotische Wirkung in neuronaler Zellkultur, sowohl bei CsA als auch bei FK506 . Sicherlich liegt hier eine unterschiedliche Ischämieform und ein unterschiedliches Wirkungsziel von Zellkulturen vor, was die Diskrepanz der Ergebnisse in der Literatur erklärt . Von besonderem Interesse sind die Ergebnisse von Alexanian AR et al. hinsichtlich der Rolle von S-100B in den neuroprotektiven Mechanismen von CsA und FK506 in der zerebralen Ischämie und Reperfusion . Das Überleben der Neuronen im Frontalhirn eines Kükenembryos war von der Dosis des astroglialen Proteins S-100B abhängig . Sicherlich sind hier andere Konzentrationen wirksam als die gemessenen massiv erhöhten Konzentration des S-100B nach Zellschädigung vieler Astrozyten. Inwieweit ein Zusammenhang zwischen der erhöhten Konzentration von S-100B im Serum und Liquor und dem neuroprotektiven Effekt von CsA und FK506 besteht, ist bis jetzt unklar.

Auf der anderen Seite zeigten aktuelle Arbeiten eine erhöhte toxische Wirkung auf die Blut-Hirnschranke nach Behandlung mit Cyclosporin und nicht mit FK506 . Die vasokonstruktive Wirkung von Endothelin nach Ischämie-Reperfusion scheint eine wichtige Rolle bei der Beeinträchtigung der Mikrozirkulation zu spielen. Eine signifikante Hemmung der Endothelinexpression und damit die Erhaltung einer normalen Mikrozirkulation sowie eine bessere 117 Organprotektion wurde durch Vorbehandlung mit FK506 und nicht mit Cylosporin nach einer Ischämie-Reperfusion gefunden .

Neurologische Komplikationen wurden nach orthotoper Lebertransplantation und Behandlung mit FK506 und Prednisolon beobachtet . Leukoencephalopathie wurde bei organtransplantierten Kindern mit anschließender immunsuppressiver Behandlung durch FK506 gefunden . Der Pathomechanismus solcher Komplikationen nach invasiven chirurgischen Eingriffen ist sicher als multifaktoriell anzugeben, und kann nicht allein auf die immunsupressive Behandlung zurückgeführt werden. Die Gliatoxizität ist unter der besonderen Berücksichtigung der Oligodendroglia und der Myelinisierungsgliose des Großhirnmarklagers bei Neugeborenen in gesonderten Untersuchungen Rechnung zu tragen.

In dieser Versuchsreihe konnten wir auch eine signifikante Reduktion der hypoxischen Neuronen im Hippocampus und eine Verbesserung der zerebralen Oxygenation während und nach dem tief hypothermen Kreislaufstillstand durch eine einmalige Gabe von hochdosierten Cyclosporin A nachweisen.

Einer der wichtigsten Pathomechanismen der neuronalen Zellschädigung durch Ischämie-Reperfusion im Gehirn ist die Störung des Ca⁺⁺ -Haushaltes im intrazellulären Raum . Mehrere experimentelle Studien haben einen neuroprotektiven Effekt des Cyclosporins in verschieden Formen der Ischämie-Reperfusion des Gehirns und in anderen Organen gezeigt . Während des Kreislaufstillstandes mit Unterbrechung der Energiezufuhr können Alterationen der energieabhängigen Ionentransporter zur Störung der Ca⁺⁺-Homöostase führen . Insbesondere stellt der Einstrom von Kalzium in die Mitochondrien ein ernstes Risiko für die neuronale Zellintegrität dar . Der neuroprotektive Effekt von Cyclosporin-A beruht auf der Hemmung des Ca⁺⁺-Einstromes durch die sogenannten Membran-Permeabilitäts-Poren (membrane permeability transport pores, mtPTP) in die Mitochondrien .

Die kontinuierliche Registrierung der intrazellulären und intravaskulären Oxygenation mit NIRS zeigte einen signifikant langsameren Abfall des intrazellulären Cyt.Ox aa3-Signals als bei den Kontrolltieren insbesondere während der Ischämiephase. Da die Signalmessung der Cyt.Ox aa3 mit NIRS in enger Beziehung zum Energieträger Adenosintriphosphat (ATP) und Creatanin (Cr.) in den Mitochondrien steht , sind diese Veränderungen möglicherweise Ausdruck einer guten 118 Erhaltung der mitochondrialen Integrität und des mitochondrialen Energieträgers in der hypothermen Stillstandsphase zu interpretieren .

Aufgrund der unterschiedlichen experimentellen Ansätze in diesen Modellen wurden widersprüchliche Ergebnisse hinsichtlich der Reduktion der nekrotischen und apoptotischen Schädigung beider Immunsuppressiva nach Ischämie beobachtet . Im Hinblick auf die bedeutende Rolle von Ca++ in den verschiedenen Pathomechanismen der ischämischen Zellschädigung bietet die Wirkung von Cyclosporin durch die Erhaltung der funktionellen und strukturellen Integrität der Mitochondrien als Kraftwerke der Energiezufuhr eine attraktive protektive Rolle in den Neuronen an. Diese Wirkung könnte die dramatische protektive Wirkung im Zentralnervensystem gegen die Ischämie in unserem Modell und anderen experimentellen Modellen der Ischämie und Reperfusion zum Teil erklären .

Erstaunlicherweise, war das Verhalten des zerebralen Flussmusters bei den mit Cyclosporin vorbehandelten Tieren eher langsamer als bei den Kontrolltieren. Cyclosporin wirkt vasokonstruktiv in vielen Organen wie der Niere und ist auch für die oft beobachtete Hypertension nach Organtransplantation mitverantwortlich . In wie weit die regionale zerebrale Perfusion beeinträchtigt ist, ist unklar. Leider war eine komplette Messung der regionalen Hirnperfusion nicht bei allen Tieren gelungen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei der Steroidvorbehandlung, wo ein protektiver Effekt mit erhöhter zerebraler Perfusion festgestellt wurde, wurde bei den mit Cyclosporin vorbehandelten Tieren ein protektiver Effekt ohne erhöhte Perfusion gefunden. Diese Beobachtungen unterstreichen noch einmal, dass ein Anstieg der zerebralen Perfusion nach der Ischämie mit resultierendem statistisch signifikanten Unterschied nicht unbedingt mit einem protektiven Effekt der jeweiligen Intervention assoziiert ist . Bevor es zu einem klinischen Einsatz von Cyclosporin kommt, sind weitere Fragen wie Dosis, Evaluierung weiterer Nebenwirkungen und weitere Beurteilung des Immunstatus zu klären. Zusätzlich ist die Verfügbarkeit von pharmakologisch effektiven Dosen auf zerebraler Ebene bei den klinisch-therapeutischen Dosen durch die begrenzte Passage von Cyclosporins durch die Blut-Hirnschranke limitiert .

Eine signifikante Verminderung oder Vermehrung der Apoptose im Gyrus dentatus oder anderen Hirnregionen war durch Cyclospron in diesem Tiermodell nicht feststellbar. In anderen Studien wurde die Apoptose in den Oligodendrogliazellen vermehrt gefunden . Die Mylinisierung bei kleinen Kindern nach Herztransplantation in der frühen Postnatalzeit und Transplantaterhalt durch Cyclosporin sollte Aufschluss über die Langzeitfolgen der Glai-Apoptose geben.