Aus der Klinik für Pädiatrie mit Schwerpunkt Pneumologie und Immunologie
Charité Campus Virchow-Klinikum

Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin
(Direktor: Professor Dr. med. Ulrich Wahn)

Exposition gegenüber Dioxinen und verwandten Substanzen
– ein Risiko für Säuglinge?

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Venia legendi für das Fach Pädiatrie
an der Charité, Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin

vorgelegt von
Dr. med. Klaus Abraham

Berlin 2002

Präsident: Prof. Dr. rer. Nat. J. Mlynek

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. H. Greim, München
2. Prof. Dr. med. K.E. von Mühlendahl, Osnabrück

Datum des öffentlich–wissenschaftlichen Vortrages: 28.01.2003

Inhaltsverzeichnis

• Hauptteil
  • 1.  Einleitung
    • 1.1 Der Seveso-Unfall
    • 1.2 Was sind Dioxine ?
    • 1.3 Probleme bei der Risiko-Abschätzung
    • 1.4 Eigene Forschungsarbeiten
  • 2.  Zusammenfassung der Projektergebnisse
• Anhang 1
  • 1.  Einleitung
    • 1.1 Säuglinge
    • 1.2 Studienziele
  • 2.  Studienkonzept
    • 2.1 Dosis-Wirkungs-Beziehungen
    • 2.2 Individuelle Exposition
    • 2.3 Confounder
    • 2.4 Biologische Parameter
    • 2.5 Fallzahl
    • 2.6  Auswahlkriterien
  • 3.  Probanden-Rekrutierung
    • 3.1 Nicht gestillte Kinder
    • 3.2 Gestillte Kinder in Berlin
    • 3.3  Gestillte Kinder mit höherer PCDD/PCDF-Exposition
      • 3.3.1 Untersuchungsämter der Länder
      • 3.3.2 Region Ilsenburg/Harz
  • 4.  Das Studienkollektiv
    • 4.1 Grundlegende Daten
    • 4.2 Nicht gestillte Kinder
    • 4.3 Gestillte Kinder
  • 5.  Untersuchungsmethoden
    • 5.1 Blutentnahme
      • 5.1.1 Wiederholungs-Untersuchungen
    • 5.2  Der ¹³C-Koffein-Atemtest
    • 5.3 Labormethoden
      • 5.3.1 EDTA-Blut
      • 5.3.2 Heparin-Vollblut
      • 5.3.3 Heparin-Plasma
      • 5.3.4 PBMCs und Granulozyten
      • 5.3.5 Weitere Methoden
      • 5.3.6 POP-Analytik (O. Päpke, ERGO Forschungsgesellschaft)
      • 5.3.7 Statistische Verfahren
  • 6.  Ergebnisse: Laborbestimmungen
    • 6.1 Der ¹³C-Koffein-Atemtest
    • 6.2 Erwähnenswerte Laborergebnisse (biologische Parameter)
      • 6.2.1  Leukozytose bei Streß
      • 6.2.2 Alkalische Phosphatase
      • 6.2.3 C-reaktives Protein (CrP)
      • 6.2.4  Eiweiß und Eisen-Versorgung gestillter Kinder
      • 6.2.5 Immunreaktionen auf Impfungen
      • 6.2.6 Gesamt-Cholesterin
      • 6.2.7 Ah-Rezeptor-Polymorphismus
      • 6.2.8 Schwermetalle
      • 6.2.9 Nitrat/Nitrit im Trinkwasser
      • 6.2.10 Kotinin im Urin
    • 6.3  Biologische Variation von Laborparametern
  • 7.  Ergebnisse: POP-Analysen
    • 7.1 Gestillte Kinder
    • 7.2  Nicht gestillte Kinder
    • 7.3  Vergleich gestillte – nicht gestillte Kinder
    • 7.4  Mütterliche POP-Werte
    • 7.5 Akkumulation von POPs in Abhängigkeit von der Stilldauer
    • 7.6 Vergleich von I-TEq-Konzentrationen in Muttermilch und -blut
  • 8.  Ergebnisse: Veränderungen biologischer Parameter durch POPs ?
    • 8.1 Körper- und Zahnentwicklung, anamnestische Angaben
    • 8.2 Biologische Parameter
      • 8.2.1 Klinische Chemie
      • 8.2.2 Schilddrüsenhormone
      • 8.2.3 Humorales Immunsystem
      • 8.2.4  Zelluläres Immunsystem
  • 9.  Abschließende Diskussion und Bewertung
    • 9.1 Studienkonzept und dessen Umsetzung
    • 9.2 Gemessene biologische Parameter
    • 9.3 POP-Kinetik während des Stillens
    • 9.4 POP-Wirkungen auf biologische Parameter ?
  • 10.  Literatur
  • 11.  Danksagung
  • 12.  Zusammenfassung
• Anhang 2
  • 1.  Einleitung
  • 2.  Hintergründe, Studienziele und Studienkonzept
    • 2.1 Immunsystem
    • 2.2  Cytochrom P450-Induktion der Leber (CYP1A2)
  • 3.  Untersuchte Personen
    • 3.1 TCDD-exponierten Personen aus Wien
    • 3.2 Kontroll-Kollektiv
  • 4.  Untersuchungsmethoden
    • 4.1 Immunsystem
    • 4.2 Cytochrom P450-Aktivität der Leber (CYP1A2)
  • 5.  Ergebnisse
    • 5.1 Immunsystem
    • 5.2  Cytochrom P450-Aktivität der Leber (CYP1A2)
  • 6.  Diskussion
    • 6.1 Immunsystem
    • 6.2 Cytochrom P450-Aktivität der Leber (CYP1A2)
  • 7.  Literatur
  • 8.  Verwendete Abkürzungen
  • 9.  Danksagung
• Literatur
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 4.a: Grundlegende Daten der Personen in den untersuchten Hauptgruppen. Angegeben sind Mittelwert (Standard-Abweichung) bzw. Häufigkeit (Prozentsatz). Gruppen-unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney bzw. dem Chi-Qudrat-Test auf Signifikanz überprüft.
• Tabelle 4.b: Grundlegende Daten der Personen in den untersuchten Hauptgruppen bei den gestillten Kindern. Angegeben sind Mittelwert (Standard-Abweichung) bzw. Häufigkeit (Prozentsatz). Gruppen-unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney bzw. dem Chi-Qudrat-Test auf Signifikanz überprüft. Berlin+: inklusive der Kinder aus Zeitz und Crailsheim.
• Tabelle 6.a: Intraindividuelle Reproduzierbarkeit der Werte einzelner Labor-Parameter innerhalb weniger Wochen.
• Tabelle 7.a: Gemessene POP-Konzentrationen (pg bzw. ng pro g Blutfett) der 80 gestillten Kinder (Minimum, 25. Perzentile, Median, 75. Perzentile, Maximum).
• Tabelle 7.b: Korrelation der verschiedenen POP-Verbindungen untereinander bei den gestillten Kindern (n=80). Angegeben sind die Korrelations-Koeffizienten (Spearman zweiseitig).
• Tabelle 7.c: POP-Konzentrationen im Blutfett von gepoolten Proben von nicht gestillten Kindern und deren Müttern, die entweder in der DDR (n=4, Ost) oder der alten BRD (n=12, West) geboren und aufgewachsen waren. Angegeben ist ferner jeweils das Verhältnis von kindlichen und mütterlichen Werten (K/M).
• Tabelle 7.d: Parameter der e-Funktionen (y=y₀e^kx, y: POP-Verhältnis Kind/Mutter, x: äquivalente Vollstilldauer in Wochen) sowie das R ² als beste Regression für die verschiedenen POPs. Angegeben ist ferner das aus diesen Funktionen berechnete POP-Verhältnis bei einer Vollstilldauer von 6 Monaten und die erforderliche Vollstilldauer zum Erreichen gleich hoher Werte bei Mutter und Kind (jeweils zum Untersuchungszeitpunkt von 11,6 Monaten). In der letzten Spalte ist die Rangfolge der Akkumulation der einzelnen Verbindungen angegeben.
• Tabelle 8.a: Koeffizienten (oben) und p-Werte (unten) der Korrelations-Analyse (Spearman zweiseitig) von POP-Verbindungen bzw. -Verbindungsgruppen und Parametern der Körper- und Zahnentwicklung sowie anamnestischen Angaben zu Hautproblemen und Infekten (jeweils n=80). Signifikante Korrelationen (p<0,05) sind grau unterlegt.
• Tabelle 8.b: Koeffizienten (oben) und p-Werte (unten) der Korrelations-Analyse (Spearman zweiseitig) von POP-Verbindungen bzw. -Verbindungsgruppen und den wichtigsten gemessenen biologischen Parametern (jeweils n=80, nur bei Chemilumineszenz n=77). Signifikante Korrelationen (p<0,05) sind grau unterlegt.
• Tabelle 1: Wesentliche Daten der TCDD-exponierten Personen 1,2 und 3, sowie die der Kontrollgruppe.
• Tabelle 2: Ergebnisse der immunologischen Parameter für die Kontrollgruppe (n=50, angegeben sind Minimum, 5. Perzentile, Mittelwert, Median, 95. Perzentile und Maximum) und die TCDD-exponierten Personen 1, 2 und 3. Statistische Unterschiede zwischen den Untergruppen der Nichtraucher (n=30) und der Raucher (n=20) wurden mit Hilfe des Mann-Withney-Tests ermittelt, der p-Wert ist in der 3. Spalte angegeben. Im Fall eines signifikanten Unterschiedes (p<0,05) sind die Daten der Untergruppen zusätzlich angegeben (kursive Darstellung). Werte der Personen 1, 2 und 3 unterhalb der 5. oder oberhalb der 95. Perzentile sind grau unterlegt.
• Tabelle 3: Spearman Rang-Korrelations-Koeffizienten für 10 Parameter der Koffein-Demethylierung (n=50, TCDD-exponierte Personen nicht eingeschlossen). Werte ≥ 0,7 sind fett markiert, soweit sie verschiedene Testprinzipien betreffen). Zusätzlich sind die Spearman Rang-Korrelations-Koeffizienten für die Korrelation der 10 Parameter mit der Anzahl der pro Tag gerauchten Zigaretten angegeben (Nichtraucher eingeschlossen).
• Tabelle 4: Ergebnisse für Parameter der Koffein-Demethylierung (Abkürzungen: siehe Tabelle 3), die mit verschiedenen Methoden gemessen wurde: bei 30 Nichtrauchern und 20 Rauchern (jeweils Mittelwert, MW; Standardabweichung; SD, Minimum, Min; Maximum, Max; 95 Perzentile), sowie bei den TCDD-exponierten Personen 1, 2 und 3 (Einzelmessungen zu verschiedenen Zeitpunkten).

Bilder

• Molekularstruktur von 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin
• Abbildung 6.a: ¹³CO₂-Basisexhalation bei zwei 11 Monate alten Kindern. Dargestellt sind jeweils die delta-Werte über einen Tag.
• Abbildung 6.b: ¹³C-Koffein-Atemtest über 4 Stunden bei zwei 11 Monate alten Kindern Dargestellt sind jeweils die delta-Werte  Kind A: dunkle Symbole Kind B: helle Symbole, 3 Atemteste an verschiedenen Tagen innerhalb von 2 Monaten.
• Abbildung 6.c: Boxplot-Darstellung der Leukozyten-Zahlen in Abhängigkeit von der Unruhe während der Blutentnahme. Die Differenz zwischen der Gruppe der schreienden Kinder und den anderen beiden Gruppen ist signifikant (Mann-Whitney, p<0,05).
• Abbildung 6.d: Streudiagramm: Tetanus-Antikörper (spezifisches Gesamt-IgG) und seit der letzten Impfung vergangene Zeit, dargestellt für 3x (dunkle Symbole) und 2x (helle Symbole) geimpfte Kinder.
• Abbildung 7.a: I-TEq-Werte von 80 gestillten Kindern und deren Müttern in Berlin und in der Region Ilsenburg
• Abbildung 7.b: Kindliche I-TEq-Konzentrationen in Abhängigkeit von der äquivalenten Vollstilldauer. Helle Symbole: Region Ilsenburg (n=27).
• Abbildung 7.c: I-TEq-Konzentrationen aller Mütter mit Einzelanalysen (n=85) in Abhängigkeit vom Alter. Helle Symbole: Region Ilsenburg (n=27).
• Abbildung 7.d: Verhältnis der I-TEq-Werte von Kind und Mutter zum Zeitpunkt der Untersuchung (Kind ca. 11,6 Monate alt), oben in linearer, unten in halb logarithmischer Darstellung. Eingezeichnet ist als Regressionskurve eine e-Funktion mit Bestimmtheitsmaß (Pearson R²). Fallzahl: 80 gestillte und 7 (5+2) nicht gestillte Kinder; die beiden gepoolten Analysen nicht gestillter Kinder wurden wie einzelne Kinder behandelt.
• Abbildung 7.e: Korrelation von I-TEq-Werten in Muttermilch und mütterlichem Plasma. Die Muttermilch-Untersuchungen wurden im BgVV Berlin (dunkle Symbole, n=12), beim Lebensmitteluntersuchungsamt Oldenburg (helles Quadrat, n=1), sowie bei der Chemischen Landesuntersuchungsanstalt Freiburg (helles Dreieck, n=1) durchgeführt.
• Abbildung 7.f: Korrelation zwischen den aus den Kinderproben extrahierten/gewogenen Fettmengen und den erwarteten Fettmengen (nach Formel berechnet).
• Abbildung 7.g: Korrelation zwischen den aus den mütterlichen Plasmaproben extrahierten/gewogenen Fettmengen und den erwarteten Fettmengen (nach Formel berechnet).
• Abbildung 8.a: Streudiagramm von Gesamt-Thyroxin (T₄) und I-TEq-Werten. Neben den gestillten Kindern (dunkle Symbole) sind als zusätzliche Information auch die bei den statistischen Analysen nicht berücksichtigten nicht gestillten Kinder dargestellt (helle Symbole, bei Kindern ohne POP-Einzelanalyse wurden die I-TEq-Werte der Pool-Analyse verwendet).
• Abbildung 8.b: Streudiagramm von Thyroid-stimulierenden Hormon (TSH) und I-TEq-Werten. Neben den gestillten Kindern (dunkle Symbole) sind als zusätzliche Information auch die bei den statistischen Analysen nicht berücksichtigten nicht gestillten Kinder dargestellt (helle Symbole, bei Kindern ohne POP-Einzelanalyse wurden die I-TEq-Werte der Pool-Analyse verwendet).
• Abbildung 8.c: Streudiagramm von Immunglobulin G (IgG) und pp-DDE-Werten. Neben den gestillten Kindern (dunkle und graue Rauten) sind als zusätzliche Information auch die bei den statistischen Analysen nicht berücksichtigten nicht gestillten Kinder dargestellt (helle Quadrate, bei Kindern ohne POP-Einzelanalyse wurden die pp-DDE-Werte der Pool-Analyse verwendet). Die gestillten Kinder sind zusätzlich unterteilt nach Geburtsort der Mutter: DDR (schwarz) und alte BRD (grau).
• Abbildung 8.d: Streudiagramm von CD4/CD8-Ratio und I-TEq-Werten. Neben den gestillten Kindern (dunkle Symbole) sind als zusätzliche Information auch die bei den statistischen Analysen nicht berücksichtigten nicht gestillten Kinder dargestellt (helle Symbole, bei Kindern ohne POP-Einzelanalyse wurden die I-TEq-Werte der Pool-Analyse verwendet).
• Abbildung 8.e: Streudiagramm von Tetanus-Proliferation in counts per minute (cpm) und pp-DDE-Werten. Neben den gestillten Kindern (dunkle Symbole) sind als zusätzliche Information auch die bei den statistischen Analysen nicht berücksichtigten nicht gestillten Kinder dargestellt (helle Symbole, bei Kindern ohne POP-Einzelanalyse wurden die pp-DDE-Werte der Pool-Analyse verwendet).
• Abbildung 8.f: Streudiagramm von Chemilumineszenz in emittierten Lichteinheiten pro Zeit und ß-HCH-Werten. Neben den gestillten Kindern (dunkle Symbole) sind als zusätzliche Information die bei den statistischen Analysen nicht berücksichtigten nicht gestillten Kinder dargestellt (helle Symbole, bei Kindern ohne POP-Einzelanalyse wurden die halbe Nachweisgrenze der Pool-Analyse verwendet).
• Abbildung 1: Klinisches Bild der Chlorakne in Person 1 (a-d) und 2 (e-f).
• Abbildung 2: Haupt-Metabolisierungswege von Koffein
• Abbildung 3: Impfreaktion 4 bis 6 Wochen nach Diphtherie-Auffrischimpfung bei Person 1 (schwarze Dreiecke) und Person 2 (schwarze Quadrate) sowie bei 14 Kontrollpersonen (leere Kreise), die alle mindestens 10 Jahre nicht geimpft wurden. Dargestellt ist links die Lymphozyten-Proliferation aus Vollblut (Mittelwerte der 3 verwendeten Konzentrationen; bei Person 1 und 2 liegen keine Ergebnisse von vor der Impfung vor) und rechts die im Serum gemessene spezifische Antikörper-Konzentration.
• Abbildung 4 a-d(Legende: übernächste Seite)
• Abbildung 4 e-h(Legende: nächste Seite)
• Abbildung 4 i-j
• Abbildung 5: Anstieg von ¹³CO₂ in Ausatemproben nach der Applikation von ¹³C-Koffein, dargestellt als delta-delta-Werte (gemessene Promille-Differenzen zu einem Standard-Gasgemisch abzüglich der Ausgangswerte): Ergebnisse der Untersuchungen im Herbst 2000 von Person 1 (schwarze Dreiecke) und Person 2 (schwarze Quadrate), sowie die der Nichtraucher (n=30, weiße Rauten) und der starken Raucher (n=20, weiße Rauten mit Kreuz), jeweils als Mittelwert und Standardabweichung. Person 3 ist nicht dargestellt, da die Werte nahe an den Mittelwerten der Raucher lagen. Zu beachten sind die unterschiedlichen Zeitskalen (nach 120 Minuten erfolgen die Messungen nur alle 30 Minuten).
• Abbildung 6: Kumulative 120 Minuten % Dosis im ¹³C-Atemtest (AT120), dargestellt in Abhängigkeit von den jeweils gemessenen TCDD-Konzentrationen (logarithmische Achse) für die je vier Messungen bei Person 1 (schwarze Dreiecke) und Person 2 (schwarze Quadrate) und die beiden Messungen bei Person 3 (graue Rauten). Zusätzlich sind Einzelwerte der Nichtraucher dargestellt, (n=30, einschließlich Median-Wert als “–"), mit einer angenommenen PCDD/PCDF-Konzentration im Blutfett von 15 ppt (Päpke 1998).