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Methodologie

In diesem Kapitel werden allgemeine Aspekte der Methodik, insbesondere der Schlaf- EEG Untersuchungen und der Statistik, sowie die Auswahl der Probanden und Patienten beschrieben.

2.1 Ethische Aspekte

Alle in den nachfolgenden Kapiteln beschriebenen interventionellen Untersuchungen wurden eingereicht bei und genehmigt von der Ethikkommission für Humanexperimente des Max Planck Instituts für Psychiatrie in München bzw. der Ludwigs-Maximilians-Universität.

Patienten und Probanden wurden über Merkblätter ausführlich über Sinn und Risiken der jeweilige Studie informiert, sowie darüber, dass sie jederzeit und ohne Angabe von Gründen und ohne daraus resultierende Nachteile ihr Einverständnis widerrufen können. Patienten und Probanden konnten erst nach Erklärung ihres Einverständnisses (in schriftlicher Form für alle interventionellen Studien) an einer Studie teilnehmen. Alle Patienten befanden sich auf freiwilliger Basis in stationärer (oder ambulanter) Behandlung des Max Planck Instituts für Psychiatrie. Die Patienten erhielten keine Aufwandsentschädigung für ihre Teilnahme. Die Probanden wurden durch Zeitungsanzeigen angeworben. Die Teilnahme von Probanden wurde in Abhängigkeit des zeitlichen Umfanges finanziell entschädigt.

2.1.1 Patienten und Probanden

Patienten und Probanden im Alter zwischen 19 und 76 Jahre wurden in die Studien einbezogen. Für einige Studien wurden lediglich junge Probanden im Alter zwischen 19 – 35 Jahren rekrutiert. Für einen Vergleich mit einer Patientengruppe wurden Probanden eingeschlossen, die hinsichtlich Geschlecht und Alter den Patienten entsprachen, eingeschlossen.

Alle Patienten und Probanden mussten sich vor ihrer Teilnahme einer ausführlichen körperlichen und psychiatrischen Untersuchung unterziehen. Weiterhin wurde bei allen Teilnehmern ein Blutuntersuchung (mit Bestimmungen der Parameter der Hämatologie, klinischen Chemie, Virologie, Endokrinologie) durchgeführt sowie ein EEG und ein EKG. Weiterhin wurde ausgeschlossen, dass die Teilnehmer einen transmeridianen Flug in den letzten 3 Monaten unternommen hatten oder im Schichtdienst arbeiteten. Ebenfalls wurde von den Teilnehmern bestätigt, dass sie einen Schlaf-Wach-Rhythmus einhielten, der maximal 1.5 Stunden von den Schlafzeiten im Schlaflabor (Schlafzeit: 2300 – 0700 h) [Seite 43↓]abwich. Erst nach unauffälliger Beurteilung aller oben genannten Untersuchungen, sowie dem Ausschluss einer Drogeneinnahme, einer regelmäßigen Medikamenteneinnahme und eines übermäßigen Alkohol- (>25g pro Tag), Koffein (>500 ml pro Tag) oder Nikotinkonsums, wurden die Patienten und Probanden eingeschlossen.

Alle Patienten waren zumindest zum Zeitpunkt der ersten Schlafuntersuchung stationär im Max Planck Institut für Psychiatrie aufgenommen. Für die Patienten mit Major Depression wurde die Diagnose von einem erfahrenen Psychiater gestellt und die Patienten mussten mindestens einen Score von 16 auf der Hamilton Depressionsskala (HAMD; 21-item) aufweisen. Weitere psychiatrischen Diagnosen wurden ebenfalls ausgeschlossen. Zusätzlich wurde sicher gestellt, dass sie in den letzten 8 Wochen nicht mit Depotneuroleptika, Fluoxetin oder irreversiblen Monoamine-Oxidase-Hemmern (MAOI) behandelt worden waren. Weiterhin waren alle psychiatrischen Patienten entweder psychopharmakologisch unbehandelt oder hatten eine einwöchige Auswaschphase durchgemacht.

Für Patienten mit Multiple Sklerose (MS) erfolgte die stationäre Aufnahme aufgrund eines akuten Schubes entweder bei bereits vorbekannter MS oder bei dringendem Verdacht auf MS, der sich im Rahmen der stationären Behandlung bestätigte. Ähnlich wie bei Patienten mit Major Depression, wurde zusätzliche andere Erkrankungen (auch psychiatrischer oder neurologischer Art) ausgeschlossen.

Bei Patientinnen und Probandinnen wurde entweder die Zyklusphase bei der ersten Schlafuntersuchung oder der Zeitpunkt der Menopause erfasst. Eine Beschränkung auf eine Zyklusphase wurde nicht vorgenommen, da bei den Patientinnen eine weitere Verzögerung der Untersuchung und damit der Behandlung nicht gerechtfertigt erschien.

2.2 Studiendesign

Da verschiedene Studiendesigns verwendet wurden, werden hier nur allgemein gültige Vorgehen beschrieben, während die studienspezifischen Besonderheiten in den jeweiligen Kapiteln aufgeführt sind. Alle Patienten und Probanden verbrachten die Nacht vor einer Schlafableitung bereits im Schlaflabor (sogenannte Adaptationsnacht). Dabei wurde zwar der gesamte Elektrodensatz angeklebt, allerdings wurde nur mittels weniger Elektroden ein Schlaf EEG abgeleitet, das am nächsten Morgen auf Hinweise für Schlaf-Apnoe oder ein Restless-legs-Syndrom untersucht wurde (besonders sorgfältig wurde bei Teilnehmern über 50 Jahre auf das Vorliegen solcher Hinweise geachtet). Sofern ein Verdacht für eine schlaf-assoziierte Störung bestand, wurde eine weitere diagnostische Schlafuntersuchung durchgeführt und der Teilnehmer wurde von der Studie [Seite 44↓]ausgeschlossen. Erhärtete sich der Verdacht, erhielt der Teilnehmer entsprechende weiterführende Informationen und ein Behandlungsangebot.

Bei Patienten, die drei aufeinanderfolgende Nächte (Adaptationsnacht gefolgt von zwei Untersuchungsnächten) im Schlaflabor verbrachten, wurde die Gabe von GHRH in einer der Untersuchungsnächte randomisiert. Patientinnen mit MS verbrachten normalerweise die ersten vier Nächte im Schlaflabor, da die ersten Untersuchungsnacht (nach einer Eingewöhnungsnacht) meist unmittelbar vor der ersten morgendlichen Glukokortikoidgabe stattfand, dann eine weitere Adaptationsnacht und anschließend die zweite Untersuchungsnacht (Nacht nach der zweiten Glukokortikoidgabe) folgte.

Patienten und Probanden kamen in den Untersuchungsnächten gegen 1900 h in das Schlaflabor, ein schallisolierter Raum der mit einer Infrarot-Videokamera ausgestattet war. Um 1930 h wurde eine intravenöser Zugang gelegt, der mit geringen Mengen heparinisierter isotonischer Kochsalzlösung (0.9% NaCl; maximal 0.25 Liter pro Nacht) während der Nacht durchgängig gehalten wurde. Um 2000h erfolgte die erste Blutabnahme, bis 2200 h in 30-minütigen Intervallen zur Kontrolle möglicher Stressreaktionen auf den intravenösen Zugang und/oder das Kleben der Elektroden. Von 2200 – 0700 h erfolgten die Blutabnahmen in 20-minütigen Intervallen. Die Abnahmen erfolgten über einen Infusionsschlauch, der durch ein kleines Loch in der Wand in den Nebenraum reichte, so dass die Patienten und Probanden nicht durch das Hantieren mit den Blutproben gestört wurden. Zwischen 21:00 h und 22:00 h wurden die Elektroden aufgeklebt, um 2200 h wurde eine Kalibrierung durchgeführt und um 23:00 h wurde das Licht ausgeschaltet und die polysomnographische Aufzeichnung begann. Vor 23:00 h war es den Patienten und Probanden nicht erlaubt zu schlafen. Die Aufzeichnung des Schlaf EEG endete um 07:00 h des nächsten Tages. Die Patienten und Probanden wurden während der ganzen Nacht über einen Monitor im Nebenraum, der an die Infrarot-Videokamera angeschlossen war, im Nebenraum von einer Pflege- oder Pflegehilfskraft beobachtet, die während der gesamten Untersuchung den einen Patienten oder Probanden betreute. Aufstehen während der Nacht war jederzeit möglich; die entstandene Pause sowie der Grund dafür wurden im Logbuch vermerkt. Sofern Testsubstanzen injiziert wurden, erfolgte dies in randomisierter Reihenfolge. Die Auswerter des Schlaf EEG, sowie die Patienten und Probanden waren hinsichtlich der Behandlung verblindet. Die Verabreichung der Testsubstanz erfolgte aus dem Nebenraum über den Infusionsschlauch.


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2.3  Behandlungen

2.3.1 CRH

Humanes Corticotropin Releasing Hormon (hCRH), bestehend aus 41 Aminosäuren, wurde von Clinalfa (Clinalfa AG, Läufelfingen, Schweiz) bezogen. Eine Ampulle mit 100 µg hCRH wurde in 10 ml 0.9%-iger NaCl aufgelöst und 5 ml davon wurden in einer Untersuchung (siehe Kapitel 3) sofort injiziert, der Rest wurde verworfen.

2.3.2 GHRH

Humanes Gonadotropin Releasing Hormon (hGHRH), bestehend aus 44 Aminosäuren, wurde von Clinalfa (Clinalfa AG, Läufelfingen, Schweiz) bezogen. Eine Ampulle mit 100 µg hGHRH, wurde in 10 ml 0.9%-iger NaCl aufgelöst und entweder auf zwei Dosen zu je 50 µg (und je 5 ml) verteilt oder wie in Kapitel 3 beschrieben als eine Dosis verabreicht. Im Falle einer Verabreichung von 50µg pro Injektion (siehe Kapitel 7 und 8) wurde die eine Hälfte (5 ml) sofort injiziert, die andere Hälfte (5 ml) im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt und eine Stunde später injiziert.

2.3.3 Kortikosteroide

Patientinnen mit einem akuten Schub bei bekannter MS oder dringendem Verdacht auf MS wurden mit hochdosierten Kortikoiden behandelt. Für 5 Tage wurde Methylprednisolone (Urbason®, Hoechst Marion Roussel, 500 mg/Tag) intravenös verabreicht. Das Ausschleichen erfolgte schrittweise über ca. 20 Tage mittels oraler Gabe von Prednison (Decortin®, Merck).

2.4 Schlaf-EEG Untersuchung

Nach den Standardkriterien von Rechtschaffen und Kales (Rechtschaffen and Kales 1968) wurde das EEG an zwei Positionen erfasst (C3-A2 und C4-A1; Zeitkonstante 0.3 Sekunden, Verstärkung 7µV; siehe auch Abbildung 2). Dabei werden für die Ableitung C3 und C4 die Elektroden zentral am Schädel angebrachte, und die entsprechenden Referenzelektroden (A1 und A2) am Mastoid. Zur Auswertung kamen bei unseren Untersuchungen primär die C3 Ableitung, und, sofern diese aufgrund technischer Probleme unzuverlässig war, die C4 Ableitung. Weiterhin wurden ein horizontales Elektrookulogramm (EOG), ein submentales Elektromyogramm (EMG) und ein Elektrokardiogramm (EKG) abgeleitet. Der Muskeltonus (EMG) wurde über zwei bilateral am Kinn befestigte Elektroden aufgezeichnet, die Augenbewegungen (EOG) anhand beidseitig lateral über den Augenhöhlen angebrachter Elektroden. Die Signale des EOG, [Seite 46↓]EMG und EEG wurden gefiltert (EEG: High-pass Filter 0.53 Hz, -3dB; Low-pass Filter 70 Hz, -3 dB; -12 dB Oktave, Band-stop zwischen 42 Hz und 62 Hz, -3dB) und mittels optischer Fasersysteme an den Polygraph übermittelt (Schwartzer, ED 24). Die visuelle Schlaf EEG Aufzeichnung wurde von trainierten Auswertern analysiert; die Auswerter wussten weder welche Behandlung der Teilnehmer erhalten hatte, noch ob es sich um einen Patienten oder einen Probanden handelte. Die Übereinstimmung der Auswerter lag aufgrund regelmäßiger Supervision bei über 90%.

Nach elektronischer Eingabe der Daten der visuellen Schlafstadien-Analyse wurden anhand vorbeschriebener Algorithmen die in Tabelle 3 aufgeführten Schlafkennwerte berechnet (Pollmächer and Lauer 1992).

Tabelle 3: Definition der Schlafkennwerte

SPT

Schlafperioden Dauer

min

Sleep period time

Intervall zwischen Einschlafzeitpunkt und letztmali­gen Auftreten eines Schlafstadiums (Stadium I, II, III, IV, oder REM)

TST

Gesamt-Schlafzeit

min

Total sleep time

SPT minus der intermittierenden Wachzeit

Schlafgüte Index

%

Verhältnis von TST zu der Gesamtzeit der Registrierung

Einschlaf Latenz

min

Intervall zwischen Registrierungsbeginn (2300 h ‘Licht aus’) und erstmaligen Auftreten von Schlaf­stadium II

intermittierende Wachzeit

min

Wachzeit innerhalb von SPT

Absoluter und relativer (in % SPT) Anteil der Schlafstadien [Stadium I, II, III, IV, Tiefschlaf (Stadium III+IV) und REM Schlaf

REM Latenz

min

Intervall zwischen Einschlafzeitpunkt und erst­maligen Auftreten von REM Schlaf

REM Dichte

Index

Anzahl von 3-Sekunden Mini-Epochen REM Schlaf mit schnellen Augenbewegung pro Minute REM Schlaf

Zyklusdauer

min

Intervall zwischen Beginn einer NREM Periode und dem Ende der sich daran anschließenden REM Periode

Mittels eines PC wurden die EEG Signale auch über einen acht-bit Analog-zu-Digital Konvertierer mit einer ‘sampling rate’ von 100 Hz aufgezeichnet, auf einer Diskette gespeichert und später spektralanalytisch aufgearbeitet. Die Berechnung des [Seite 47↓]Powerspektrums im Frequenzbereich zwischen 0 und 20 Hz erfolgte mittels einer Fast-Hartley-Transformation, in Anlehnung an eine Fast-Fourier-Transformation. Das Powerspektrum wurden ermittelt für 2.56 Sekunden Intervalle, woraus sich eine Auflösung von 0.39 Hz ergibt (Friess et al. 1995). Die statistische Auswertung erfolgte im Frequenzbereich von 0.6 – 20 Hz. Das Frequenzspektrum wurde eingeteilt in folgende Frequenzbänder: Delta (0.5 – 4.5 Hz), Theta (4.5 – 8 Hz), Alpha (8 – 12 Hz), Sigma (12 – 16 Hz) und Beta (16 – 20 Hz). Der hohe Alpha und Sigma Frequenzbereich wurde bei manchen Untersuchungen weiter unterteilt und als Sigma 10 – 12 Hz, 12 – 14 Hz und 14 – 16 Hz bezeichnet. Nur die NREM Schlafstadien 2, 3 und 4 wurden spektralanalytisch ausgewertet. Um Artefakte auszuschließen, wurden alle 30-Sekunden Epochen auf Artefakte hin untersucht und gegebenenfalls ausgeschlossen. Im Mittel wurden 3-5 Artefakte für jede 8-Stunden Ableitung entfernt, wobei nie mehr als ein Artefakt pro Stunde beobachtet und entfernt wurde.

2.5 Hormonmessungen

Blutproben zur Bestimmung von Kortisol, ACTH und GH wurden von 2000 – 2200 h in 30-minütigen Abständen und von 2200 – 0700 h in 20-minütigen Abständen abgenommen. Die Blutproben wurden sofort auf Eis gekühlt, bei 4°C zentrifugiert, und das Serum bei –20°C bis zur Bestimmung der Hormone eingefroren.

Die Bestimmung von Östradiol, Progesteron, LH und FSH erfolgte aus stündlichen Blutabnahmen. Die Konzentrationen von ACTH, Kortisol und GH wurde mittels kommerzieller Radioimmunoassays bestimmt, die Konzentrationen von Östradiol, Progesteron, LH und FSH mittels kommerzieller ELISA. Alle Blutproben eines Patienten oder Probanden wurden in einem Assay bestimmt. Die Intra-Assay und Inter-Assay Variationen lagen unter 9%. Die Hormonkonzentrationen wurden anhand des Mittelwertes der Gesamtnacht oder der ersten und zweiten Nachthälfte für die verschiedenen Gruppen verglichen.

2.6  Statistische Methoden

Alle statistischen Berechnungen erfolgten unter Verwendung von SPSS für Windows, Versionen 6.0-10.0®. Zur Testung auf Unterschiede der Mittelwerte wurden inferenzstatistische parameterische Verfahren eingesetzt (multivariate bzw. univariate Varianzanalyse (MANOVA, ANOVA) und Kovarianzanalyse (MANCOVA, ANCOVA), sowie Varianzanalysen mit Messwiederholungen. Für alle MANOVA bzw. MANCOVA Testungen musste zunächst der Hauptgruppen-Effekt signifikant sein, bevor univariate F-[Seite 48↓]Tests berechnet wurden, um diejenigen Parameter zu identifizieren, die zu dem jeweiligen Haupteffekt beigetragen haben.

Korrelation wurde mittels des Pearson-Produkt-Moment-Korrelationsanalyse geprüft und berechnet (für alle Stichproben wurde die Werteverteilung visuell überprüft). Fanden sich ‘Ausreißer’, wurde zusätzlich der Spearman-Rang-Korrelationskoeffizient errechnet, um die Robustheit signifikanter Korrelationen zu überprüfen.

Alle statistischen Tests wurden zweiseitig durchgeführt. Das Signifikanzniveau für alle Testungen wurde auf p<0.05 festgesetzt. Da bei multipler Testung die Wahrscheinlichkeit für einen Fehler Typ I ansteigt, galt für die F-Tests ein reduziertes α—Niveau (α—Korrektur nach Bonferroni). Für ein Signifikanzniveau p>0.05 aber p<0.1 wurden die Daten als auf einen Trend zur Signifikanz hinweisend angesehen. Als Maße der deskriptiven Statistik dienten in der Arbeit Mittelwert und Standardabweichung oder Standardfehler (vor allem in den Graphiken).


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02.06.2005