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4  Studie 1:
Die Freisetzung von TNF-α aus LPS exponierten Monozyten nach Vorbehandlung mit Kalziumhydroxid

4.1 Zielstellung

Das Ziel einer Wurzelkanalbehandlung ist die Prävention oder Ausheilung einer apikalen Parodontitis. Da der wichtigste ätiologische Faktor für periapikale Parodontitiden die Präsenz von Mikroorganismen ist (17, 75), konzentriert sich der klinische Behandlungsablauf auf die Desinfektion des Wurzelkanalsystems durch chemomechanische Reinigung. Hierzu wird häufig Kalziumhydroxid (Ca(OH)2) als medikamentöse Zwischeneinlage verwendet. Obwohl seine antimikrobielle Wirkung mehrfach untersucht und bewiesen werden konnte, ist der genaue Mechanismus, über den diese Wirkung erzielt wird, nicht exakt geklärt. Es ist denkbar, dass Ca(OH)2 nicht nur durch seine antimikrobiellen Eigenschaften eine Ausheilung der periapikalen Gewebe begünstigt, sondern auch durch seinen Einfluss auf Lipopolysaccharide (LPS). Es ist bekannt, dass sich im infizierten Wurzelkanalsystem große Zahlen gramnegativer anaerober Spezies finden (125), die in ihrer äußeren Zellwand Endotoxin enthalten (485). Diese Endotoxine oder LPS werden während der Zellteilung und nach dem Zelltod freigesetzt (191). Nach der Freisetzung, können die LPS bioaktive entzündliche Mediatoren stimulieren, wie z.B. Produkte des Cyclooxygenase-Stoffwechsels, Lipooxygenase-Produkte, Thrombozyten-aktivierende Faktoren, Interleukine und den Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α) (486-490). Dahlén platzierte LPS in die Pulpakammern von Ratten und konnte nach drei Wochen einen signifikanten Anstieg des Antikörper-Titers im Serum dieser Tiere nachweisen (491). In einem weiteren Experiment führten Dahlén et al. bakterielle LPS in die Wurzelkanäle von Affen ein (190). Nach drei bzw. sieben Monaten wurden die Tiere geopfert und die periapikale Region wurde radiologisch und histologisch untersucht. Die Autoren fanden Knochenverlust sowie resorptive und entzündliche Veränderungen am Apex aller experimentellen Zähne. Ebenso wurde eine signifikante Korrelation zwischen der intrakanalären Endotoxin-Menge, spezieller klinischer Symptomatik der Pulpa und der periapikalen Gewebe demonstriert (492, 493). Andere Autoren konnten zeigen, dass LPS für die [Seite 63↓]Initiierung und Aufrechterhaltung periapikaler Prozesse verantwortlich sind (494-497).

Gegenwärtig konzentriert sich der therapeutische Ansatz einer Wurzelkanalbehandlung auf die chemomechanische Elimination von Bakterien aus dem Wurzelkanalsystem. Trotz Abtötung von Bakterien kann mutmaßlich aufgrund der Präsenz von LPS eine apikale Parodontits fortbestehen. Obwohl Ca(OH)2 ein gut untersuchtes intrakanaläres Medikament ist, wurden über seine Fähigkeit, LPS zu neutralisieren noch nicht viele Studien publiziert. Da eine Methode der Neutralisierung von LPS deren Exposition mit alkalischen Substanzen ist (meistens NaOH) (498), ist es denkbar, dass das stark alkalische Ca(OH)2 einen ähnlichen Effekt aufweist. Das Ziel dieser Studie war es daher, zu untersuchen, ob Ca(OH)2 die Fähigkeit besitzt, die biologische Aktivität von Escherichia coli LPS zu neutralisieren.

4.2 Material und Methoden

Das lyophilisierte Pulver von Eschericia coli LPS (Serotyp 055:B5 lot 64H41; Sigma Chemical, St. Louis MO, USA) wurde in pyrogenfreiem Wasser in verschiedenen Konzentrationen aufgelöst (Abb. 11). Sie betrugen 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml oder 1000ng/ml und wurden je zweimal angesetzt. Jeweils 1ml der Lösungen wurden 25mg Ca(OH)2-Pulver (Sigma Chemical, St. Loius, MO, USA) zugegeben, wodurch eine gesättigte Lösung entstand. Zwei Proben ohne Endotoxin dienten als Kontrollen, davon eine nur mit Wasser, die andere mit Wasser und Ca(OH)2. Alle Proben wurden für 20 Sekunden auf einem Vortex-Gerät gemischt, anschließend für eine Woche bei 37°C unter konstanter Bewegung inkubiert. Nach Inkubation wurden die Proben für fünf Minuten zentrifugiert, wodurch das unlösliche Ca(OH)2 von der Flüssigkeit getrennt wurde. Das pelletierte Ca(OH)2 wurde verworfen, der Überstand für das weitere Experiment verwendet.

Die Blutmonozyten wurden nach der Methode von Thorsby und Bratlie isoliert (499). Für ihre Gewinnung wurden 20ml peripheres Blut von einem gesunden männlichen Spender entnommen, es wurde ohne Zusätze für 40 Minuten bei 25°C gelagert, anschließend für weitere 30 Minuten auf Eis platziert. Der entstandene [Seite 64↓]Blutkuchen wurde durch Zentrifugieren pelletiert, das Serum wurde abgenommen, durch einen 0,2µ-Filter gefiltert und bei 4°C aufbewahrt.

120ml Blut desselben Spenders wurden in vier 30ml Spritzen aufgezogen, in denen sich je 3,5ml Natriumcitrat befand (0,038mg/ml). In vier 50ml Röhrchen wurden je 300µg 0,5 molaren EDTAs zu 10ml Plasmagel gegeben (Cellular Products, Buffalo, NY, USA), zu jedem wurden 30ml Blut addiert. Die Flüssigkeiten wurden leicht gemischt und für 40 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. Anschließend wurde das Plasma gesammelt und je 9ml wurden vorsichtig auf 3ml Lymphoprep geschichtet (Nycomed Pharma, AS, Oslo, Norwegen). Die Flüssigkeiten wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 1000rpm zentrifugiert. Das Monozyten-Band wurde aus jedem Röhrchen entnommen und die gewonnenen Flüssigkeiten wurden dreimal in HBBS mit 10ml 0,1 molarem EGTA und 500ml Gentamycin/500ml gewaschen. Nach dem letzten Durchgang wurde das Zellpellet vorsichtig durch leichtes Klopfen von der Gefäßwand gelöst und in 5ml Zellkultur-Medium 199 mit 0,1% autologem Serum resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 4x106 Zellen/ml Medium für 1 Stunde bei 37°C mit 5% CO2-Begasung inkubiert, um eine Zelladhäsion zu erlauben. Die nichtadhärenten Zellen wurden anschließend mit serum-freien Medium abgewaschen.

Die gewonnenen Zellen wurden für vier Tage in M199 Medium mit 10% autologem Serum in einem Inkubator unter 37°C und CO2-Begasung kultiviert. Am fünften Tag wurden die Zellen mit frischem Medium gewaschen. Zu 2ml Medium wurden je 1µl der vorab fertiggestellten Endotoxin-Lösungen gegeben und in doppelter Ausführung in die Wells mit den Monozyten pipettiert. Die Zellen wurden mit den zugegebenen Lösungen für weitere vier Stunden inkubiert. Danach wurden die Überstände gesammelt und codiert. Die TNF-α-Konzentrationen wurden mittels eines kommerziell erhältlichen Testkits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) in der Abteilung für Immunologie des Center for Gastrointestinal Biology and Disease at the University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA bestimmt. Das gesamte Experiment wurde nach einem Vorversuch zweifach durchgeführt.

Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA mit dem Programm StatView 4.02 (Abacus Concepts, Berkely, CA, USA) auf Apple Macintosh durchgeführt.


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Abbildung 11: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs der Studie 1

4.3 Ergebnisse

Die Kontrollgruppen, bei denen keine LPS zugegeben worden waren, zeigten TNF-α-Konzentrationen zwischen 1 und 12pg/ml (Abb. 12). Bei Exposition mit den verschiedenen LPS-Lösungen ohne vorherige Ca(OH)2-Behandlung stellten sich TNF-α-Konzentrationen zwischen 500 und 1800pg/ml ein. Waren die LPS mit Ca(OH)2 [Seite 66↓]vorbehandelt worden, so fanden sich die TNF-α-Konzentrationen zwischen 1–19 pg/ml. Zwischen den Kontrollgruppen und den mit Ca(OH)2 vorbehandelten Gruppen zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied, beide Gruppen unterschieden sich jedoch hochsignifikant von der Ca(OH)2-freien LPS-Gruppe (p<0,001).

Abbildung 12: Median der TNF-α- Konzentrationen pro Gruppe nach Exposition der Monozyten mit E. coli LPS, die entweder mit Ca(OH)2 vorbehandelt oder unbehandelt waren

4.4 Diskussion

Bakterielle Endotoxine initiieren die Freisetzung verschiedener entzündungsprovozierender Mediatoren in Monozyten, u.a. auch das lösliche Zytokin TNF-α. Daher wird die TNF-α-Konzentration nach Stimulation menschlicher Monozten durch LPS als Indikator für die Monozyten-Aktivität verwendet (500, 501).


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In dieser Studie wurden LPS-Konzentrationen zwischen 1 und 1000ng/ml eingesetzt, da ähnliche Konzentrationen bei nekrotischem Endodont mit assoziierter periapikaler Parodontitis gefunden wurden (492, 493). Ebenso wurden diese LPS für eine Woche mit Ca(OH)2 vorbehandelt, da dieser Zeitraum als klinisch relevant und für die Wurzelkanalbehandlung als ausreichend befunden wurde (285). Zwischen den mit Ca(OH)2-vorbehandelten LPS und den LPS-freien Kontrollgruppen fand sich kein signifikanter Unterschied der resultierenden TNF-α-Konzentration. Im Gegensatz dazu zeigten die nicht vorbehandelten LPS-Gruppen hochsignifikant höhere TNF-α-Konzentrationen. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Ca(OH)2 in der Lage ist, LPS hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität zu detoxifizieren.

In der vorliegenden Studie wurden LPS von Escherichia coli verwendet. Es gibt viele gramnegative Spezies mit jeweils individuellen LPS. Möglicherweise reagieren die LPS anderer Bakterienspezies anders auf Ca(OH)2 als die von E. coli. Safavi und Nichols führten jedoch ein ähnliches Experiment durch, bei dem sie LPS von Salmonella typhimurium oder Prevotella intermedia verwendeten (502). Als biologisch aktiven Indikator setzen die Autoren ebenfalls Monozyten ein, jedoch bestimmten sie nicht die Freisetzung von TNF-α sondern von PGE2, einem Zytokin, das bei der Resorption von Knochen eine wichtige Rolle spielt (503). Olsen et al. untersuchten, inwiefern Ca(OH)2 LPS von Pseudomonas aeruginosa zu deaktivieren vermag, arbeiteten jedoch mit IL-1β als Marker (504). In beiden Studien waren die Resultate denjenigen der vorliegenden Studie vergleichbar. Der Einsatz verschiedener LPS in den diversen Studien mit ähnlichen Ergebnissen legt die Vermutung nahe, dass Ca(OH)2 nicht nur die LPS einer Spezies neutralisiert.

Es wurde festgestellt, dass die Lipid-A-Komponente der LPS der Hauptauslöser für die entzündlichen Abläufe ist (505). Aus dieser Studie ist nicht zu ersehen, ob die Inaktiverung der LPS durch Ca(OH)2 reversibel ist, d.h., ob die LPS nach Entfernung des Ca(OH)2 wieder ihren entzündungsauslösenden Effekt erhalten. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die Deaktivierung irreversibel ist, da im kommerziellen Bereich eine Endotoxin-Deaktivierung verschiedenster LPS durch Alkali-Behandlung mit NaOH durchgeführt wird, welches die pathogene Lipid-A-Komponente der LPS hydrolysiert und gleichzeitig Fettsäuren freisetzt, die ebenfalls [Seite 68↓]Bestandteile der LPS sind (498). Dies ist auch der Mechanismus, durch den das Ca(OH)2 die LPS inaktiviert, wie durch Safavi und Nichols gezeigt werden konnte (506). Mit Ca(OH)2 vorbehandelte LPS zeigen bereits nach einer Stunde eine inhibitorische Wirkung auf die NFκB-Aktivität (507). NFκB ist ein Faktor, der bei der Transkription bei einigen im Entzündungsgeschehen involvierten Genen regulierend tätig ist. Die Autoren schließen aus ihrer Studie, dass die Fähigkeit von Ca(OH)2, die LPS-Stimulation einiger Entzündungsmediatoren zu inhibieren, auf der Ebene der Transkription stattfindet und dass Ca(OH)2 neben seinen antibakteriellen Eigenschaften auch Eigenschaften besitzt, die entzündungsfördernde Vorgänge inhibieren.

Da LPS an mineralisierte Komponenten des Knochens binden können (508, 509) ist es denkbar, dass LPS ebenfalls an Ca(OH)2 bindet. Obwohl der basische pH-Wert des Ca(OH)2 aller Wahrscheinlichkeit nach die Hauptursache für die Deaktivierung der biologischen LPS-Aktivität ist, ist es denkbar, dass LPS über den Weg der Bindung durch die physische Präsenz und anschließende Ausräumung des Ca(OH)2 aus dem Wurzelkanalsystem beseitigt werden. Dies konnte in der vorliegenden Studie nicht untersucht werden, da das Ca(OH)2-Pellet verworfen und nur die gesättigte Lösung verwendet wurde.

Nach Untersuchung des Effektes von Ca(OH)2 auf Zellwandbestandteile gramnegativer Mikroorganismen stellt sich die Frage, ob auch die Zellwandbestandteile grampositiver Mikroorganismen, Lipoteichonsäuren (LTA), durch das Medikament neutralisiert werden können. Die biologische Aktivität von LTA, die zu einem Entzündungsgeschehen führen kann, wurde von Monefeldt gezeigt (510).

4.5 Schlussfolgerungen

Die TNF-α-Freisetzung von LPS-exponierten humaner Monozyten nach Vorbehandlung der LPS mit Ca(OH)2 resultierte in ähnlich niedrigen Konzentrationen wie in den Kontrollgruppen, die keine LPS enthielten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Ca(OH)2 in der Lage ist, LPS - zumindest in den in dieser Studie [Seite 69↓]verwendeten Konzentrationen - zu neutralisieren und damit einen Beitrag zur Vermeidung oder der Ausheilung periapikaler Entzündungen zu leisten.


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23.06.2005