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5  Studie 2:
Antimikrobielle Eigenschaften von Chlorhexidin und Kalziumhydroxid in unterschiedlichen Darreichungsformen.
Ein In-situ-Modell

5.1 Zielstellung

Mikroorganismen sind die Hauptursache für pathologisches Geschehen am Apex. Aus diesem Grunde ist die Wurzelkanalbehandlung auf die Elimination von Mikroorganismen ausgerichtet. Die rein mechanische Reinigung und Aufbereitung kann keine sichere Keimfreiheit in Wurzelkanälen erzielen (115). NaOCl als Zusatz zur mechanischen Aufbereitung kann in etwa 60% der Fälle zu bakterienfreien Wurzelkanälen führen (285, 174). Die besten Ergebnisse können erzielt werden, wenn eine medikamentöse Zwischeneinlage in Kombination mit chemomechanischer Aufbereitung appliziert wird (285, 174).

Die antimikrobiellen Eigenschaften von Kalziumhydroxid konnten ebenso nachgewiesen werden wie seine Wirkung gegen Endotoxine (285, 502). Um die Applizierbarkeit des Medikamentes zu vereinfachen, wurden kürzlich kalziumhydroxidhaltige Guttaperchaspitzen entwickelt. Trotz der gut untersuchten antimikrobiellen Eigenschaften existieren Studien, die von Spezies berichten, die mit therapieresistenten Fällen assoziiert sind und resistent gegen Kalziumhydroxid zu sein scheinen, wie z.B. Enterococcus faecalis oder Candida Spezies (146, 230, 102). Die Forschung konzentriert sich daher in jüngerer Zeit auf alternative Medikamente. Chlorhexidin vermag an Zahnhartsubstanzen zu adhärieren und zeigt eine gewisse Substantivität (216, 237). Es ist in der Lage, gramnegative und grampositive Bakterien-Spezies zu eliminieren (511). Bisher wurde Chlorhexidin in der Endodontie vor allen Dingen in Form einer Spüllösung als Zusatz zur mechanischen Aufbereitung verwendet. Da es gute antimikrobielle Eigenschaften besitzt, könnte es von Interesse sein, Chlorhexidin als medikamentöse Zwischeneinlage zu verwenden. Zu diesem Zweck muss ein adäquates Applikationssystem entwickelt werden. Kürzlich wurden - wie für Kalziumhydroxid - medikamentöse Guttaperchaspitzen entwickelt, die Chlorhexidin enthalten und ein leichtes Einbringen in den Kanal erlauben.


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Das Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, inwieweit frisch angemischte Kalziumhydroxidpaste, kalziumhydroxidhaltige Guttaperchastifte, ein experimentelles Chlorhexidin-Gel oder chlorhexidinhaltige Guttaperchastifte in der Lage sind, Bakterien im Wurzelkanal ohne zusätzliche chemomechanische Reinigung zu eliminieren. Als Testmethode sollte ein neues In-situ-Modell zur Anwendung kommen.


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5.2  Material und Methode

Abbildung 13: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs der Studie 2


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5.2.1  Vorbereitung der Zähne

Die Kronen von 75 einwurzligen, extrahierten menschlichen Zähnen, die für unterschiedliche Zeitintervalle in 20%igem Alkohol gelagert waren, wurden an der Schmelz-Zement-Grenze abgetrennt und verworfen (Abb. 13). Die Wurzeloberflächen wurden sorgfältig von Resten des parodontalen Ligamentes befreit. Die Wurzelkanäle wurden bis zu einer Masterfeile der ISO-Größe 60 bis 1mm vor den Apex aufbereitet. Um den Smearlayer von den Kanalwänden zu entfernen, wurden die Wurzeln für 20 Sekunden mit Ultraschall und 15%iger EDTA-Lösung behandelt. Die gesamten Wurzeloberflächen wurden anschließend geätzt, konditioniert und mit einem dünnfließenden, schwach gefüllten Kompsit (Optibond FL, Kerr, Karlsruhe, D) unter Aussparung des koronalen Zuganges versiegelt. In jeden Kanal wurde eine Papierspitze der ISO-Größe 50 eingebracht. Anschließend wurde der Kanaleingang vorsichtig mit Bonding verschlossen. Nach Sterilisation der Zähne wurden sie mit einer dünnen Wachsschicht überzogen, die als Isolation gegen das nachfolgend applizierte PMMA-Polymer fungierte.

Von zwei Freiwilligen wurden Abformungen des Oberkiefers genommen, aus denen Gipsmodelle hergestellt wurden. Auf diesen Modellen wurden im Seitenzahnbereich im Vestibulum kleine Prothesen angefertigt, die durch zwei Überwurfklammern zum Halten gebracht wurden. Die Prothesen wurden so installiert, dass sie unterhalb der Kauebene lagen und somit den Kauvorgang nicht stören konnten. In die Prothesenkörper wurden je fünf der vorbereiteten Wurzeln einpolymerisiert, wobei der koronale Teil der Wurzeln zur Mundhöhle offen blieb (Abb. 14 a und b).


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Abbildungen 14 a und b: Prothese mit einpolymerisierten Wurzeln auf dem Modell (Abb. 14 a) und im Munde (Abb. 14 b)

5.2.2 Probengewinnung

Insgesamt wurden 15 solcher Prothesen angefertigt. Jede wurde für eine Woche im Munde eines der Freiwilligen getragen. Bevor sie eingesetzt wurden, wurde der mit Bonding versehene Zugang zum Wurzelkanal geöffnet. Die Prothesen wurden Tag und Nacht getragen und nur während der Routine-Mundhygienemaßnahmen entfernt und in handwarmes Wasser gelegt.

Nach einer Woche wurde aus jeder Wurzel die Papierspitze entfernt und zügig in ein eigenes Behältnis mit 1ml Reduced Transfer Medium (RTF, hergestellt in der [Seite 75↓]Apotheke der Charité, Humboldt Universität zu Berlin, D) eingebracht. Anschließend wurden in jeden Kanal drei in RTF getauchte Papierspitzen für je 10 Sekunden eingebracht, um eventuell verbliebene Restbakterien zu sammeln. Diese drei Papierspitzen wurden jeweils zusammen mit der zuerst entnommenen Papierspitze aufbewahrt. Die so gewonnen Proben wurden als “S1” (=erste Probe) bezeichnet und innerhalb von vier Stunden weiter verarbeitet. Nach Herstellung von bis zu sieben Zehnfach-Verdünnungen wurden je 100µl der verdünnten Flüssigkeiten auf Columbia-Blut-Agar-Platten (hergestellt in der Nährboden-Küche der Charité, Humboldt Universität Berlin) ausgestrichen und unter Zugabe von Anaerogen (Oxoid, Basingstoke, GB) für fünf Tage bei 37°C im Anaerobentopf bebrütet. Nach Bebrütung der Agars wurden die Kolonien blind ausgezählt.

Nach Gewinnung der S1-Proben wurden die Wurzeln mit unterschiedlichen Medikamenten gefüllt, mit lichthärtendem Bonding verschlossen und in 1ml physiologischer Kochsalzlösung bei 37°C unter Sauerstoffausschluss für eine weitere Woche inkubiert.

Die Zähne wurden in sechs Gruppen geteilt: Die erste (=“CHX-Gel”) wurde mit einem experimentellen 5%igen Chlorhexidin-Gel gefüllt, die zweite Gruppe (=”CH-Paste”) mit frisch angemischter Kalziumhydroxid-Paste. In der dritten Gruppe (=“CHX-GP”) wurden chlorhexidinhaltige Guttaperchaspitzen mit 5% CHX-Anteil (activ point, Roeko, Langenau, D) zusammen mit einem Tropfen steriler Kochsalzlösung eingebracht. Die vierte Gruppe (=“CH-GP”) erhielt je eine kalziumhydroxidhaltige Guttaperchaspitze mit etwa 52% Ca(OH)2-Anteil (Calciumhydroxid Plus; Roeko, Langenau, D) zusammen mit einem Tropfen steriler Kochsalzlösung. Die fünfte Gruppe diente als positive Kontrollgruppe (=”Kontrolle”), in diese Wurzeln wurde je eine Papierspitze eingebracht, die in Thioglykolat (hergestellt in der Nährboden-Küche der Charité, Humboldt Universität Berlin) getränkt war. Alle eingesetzten Flüssigkeiten und Agars wurden vor Verwendung mit Anaerogen vorreduziert. Nach Einbringen der Medikamente wurden die Wurzeln wieder mit lichthärtendem Bonding verschlossen und in physiologischer Kochsalzlösung unter sauerstoffarmen Bedingungen bei 37°C gelagert.

Danach wurden die Zähne wieder eröffnet, und die Medikamente wurden [Seite 76↓]neutralisiert. Für die Wurzeln, in denen sich Chlorhexidin befand, wurde eine spezielle Lösung verwendet, die die antimikrobiellen Eigenschaften des Chlorhexidins neutralisiert, ohne bakterielles Wachstum zu beeinflussen (512). Die Zähne, die Kalziumhydroxid enthielten, wurden mit 0,5%iger Zitronensäure neutralisiert (112). Danach wurden aus den einzelnen Zähnen wiederum durch Einbringen je dreier RTF-getränkter Papierspitzen für insgesamt 30 Sekunden Proben gewonnen, die in je 1ml RTF-Medium gesammelt wurden (=S2). Nach diesem Vorgang wurde in jeden Kanal eine in Thioglykolat getränkte Papierspitze eingebracht, die Zähne verschlossen und wie bereits beschrieben für eine weitere Woche aufbewahrt. Nach dieser Woche wurden alle Papierspitzen entfernt und in separate RTF-Behälter eingebracht. Wiederum wurden mit je drei RTF-getränkten Papierspitzen in jedem Kanal für insgesamt 30 Sekunden eventuell verbliebene bzw. nachgewachsene Mikroorganismen gesammelt und in die entsprechede Behälter eingebracht (=S3). Alle gewonnenen Proben wurden auf Wachstum anaerober Mikroorganismen untersucht und die CFU wurden ausgezählt. Eine Prothese (negative Kontrolle) mit fünf Wurzeln wurde nach Einlage steriler, in Thioglykolat getränkter Papierspitzen in verschlossenem Zustand für eine Woche getragen. Danach wurden die Papierspitzen entnommen und neue Papierspitzen eingebracht. Die Wurzeln wurden anschließend für eine weitere Woche bebrütet und die Papierspitzen danach entnommen. Nach Einbringen aller Papierspitzen in separate RTF-Behälter wurde durch anaerobe Bebrütung auf Columbia-Agar-Platten überprüft, ob bakterielles Wachstum auftrat. Hiermit sollte verifiziert werden, ob unter sterilen Bedingungen gearbeitet worden war und ob das System ausschließlich die gewollte bakterielle Besiedlung garantierte.

Eine statistische Analyse wurde mit StatView 5.0 (Abacus, CA, USA) unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Testes, des Mann-Whitney-U-Testes und des χ2–Testes auf Apple Macintosh durchgeführt.

5.3 Ergebnisse

In der negativen Kontrollgruppe konnte zu keinem Zeitpunkt bakterielles Wachstum nachgewiesen werden. Zwischen den S1-Proben der Test- und positiven [Seite 77↓]Kontrollgruppen konnten keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Bakterienzahl festgestellt werden. Für S2 und S3 kann der Median der Bakterienzahl pro Gruppe aus Abbildung 15 ersehen werden. Nach einwöchiger Applikation der medikamentösen Einlagen (=S2) zeigten alle Testgruppen signifikant weniger Bakterien als die positive Kontrollgruppe. Die mit CHX-Gel und Ca(OH)2-Paste behandelten Wurzeln waren den beiden Gruppen signifikant überlegen, in denen in die Wurzeln Ca(OH)2- bzw. CHX-Guttapercha eingelegt worden waren. Nachdem die Wurzeln für eine weitere Woche ohne Medikamente inkubiert worden waren (=S3), konnte in einigen Proben erneut Bakterienwachstum festgestellt werden. Nach dieser Woche fanden sich in den mit CHX-Gel oder Ca(OH)2-Paste behandelten Zähnen signifikant weniger Bakterien als in den Zähnen aller anderen Gruppen. Die Gruppen „CH-GP“ und „CHX-GP“ unterschieden sich diesmal nicht signifikant von der positiven Kontrollgruppe.

Bei der Frage, in welchem Kanal nach medikamentöser Einlage gar keine Mikroorganismen mehr vorhanden waren, zeigten sich in der Gruppe „CHX-Gel“ 10 Proben ohne nachweisbare Bakterien (71%). In der Gruppe „CH-Paste“ traf dies für 12 Proben zu (86%), während in der Gruppe „CHX-GP“ nur drei Proben (21%) ohne nachweisbare Bakterien waren. In der Gruppe „CH-GP“ und in der positiven Kontrollgruppe fanden sich in allen Wurzeln Mikroorganismen. Nach der Woche ohne medikamentöse Einlage (S3) konnte in einigen keimfreien Wurzelkanälen erneut Bakterienwachstum festgestellt werden. Dies resultierte in je neun keimfreien Kanälen in den Gruppen „CHX-Gel“ und der „CH-Paste“ (je 64%), und drei in der Gruppe „CHX-GP“ (21%). In beiden Wochen (S2 und S3) waren die Gruppen „CHX-Gel“ und „CH-Paste“ allen anderen Gruppen signifikant überlegen und zwischen den Gruppen mit Guttapercha-Applikation und der positiven Kontrollgruppe fanden sich keine signifikanten Unterschiede (Abb. 16 und 17).


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Abbildung 15: Grafische Darstellung des Medians der Anzahl CFU pro Gruppe nach einer bzw. zwei Wochen


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Abbildung 16: Grafische Darstellung der Anzahl an Proben, die nach einer Woche positive Kulturen aufwiesen


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Abbildung 17: Grafische Darstellung der Anzahl an Proben, die nach zwei Wochen noch positive Kulturen aufwiesen


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5.4  Diskussion

Mit diesem selbst entwickelten In-situ-Versuchsdesign konnte das Bakterienwachstum in den Wurzelkanälen unter standardisierten Bedingungen stattfinden. Jede der Prothesen enthielt fünf Wurzeln, die während einer Woche identischen Bedingungen ausgesetzt waren. Je eine dieser fünf Wurzeln wurde einer Test- oder der positiven Kontrollgruppe zugeordnet. Da sich die meisten endodontischen Infektionen aus überwiegend anaeroben oder fakultativ anaeroben Spezies zusammensetzen (125), wurde in dieser Studie auf die Kultivierung aerober Bakterien verzichtet. Die Anzahl der Bakterien der S1-Proben entsprach den in In-vivo-Experimenten gefundenen Zahlen (102-108 CFU) (285), jedoch war in der vorliegenden Studie die Variationsbreite geringer (1,26-1,18). Dies ist möglicherweise auf die standardisierten Bedingungen zurückzuführen. Unter In-vivo-Bedingungen und bei entsprechender Standzeit des infizierten Zahnes ist die Flora im Wurzelkanal sicherlich anders als nach nur einwöchiger Besiedlung durch Mikroorganismen. So konnten Fabricius et al. feststellen, dass sich nach ca. sechs Monaten ein bestimmtes zahlenmäßiges Verhältnis der Mikroorganismen zueinander einstellt (103). Zusätzlich ist es wahrscheinlich, dass die Mikroorganismen innerhalb der einen Woche nicht sehr tief in die Dentintubuli eindringen konnten. Bei In-vivo-Situationen ist es denkbar, dass durch lange Besiedlungszeiten eine tiefe Penetration von Mikroorganismen in die Dentintubuli stattfindet. Es ist daher wahrscheinlich, dass die antimikrobielle Wirkung der hier untersuchten Medikamente in solchen Situationen weniger günstig ausfällt.

Nach der Woche, in der in den Testgruppen die medikamentösen Einlagen appliziert worden waren, zeigte sich auch in der positiven Kontrollgruppe bereits eine beträchtliche Reduktion der Bakterienzahl. Da hier nur die anaeroben/fakultativ anaeroben Spezies untersucht wurden, ist es denkbar, dass bereits durch den Austausch der Papierspitzen und den damit einhergehenden Sauerstoffzutritt viele Mirkroorganismen abgetötet wurden. Es könnte jedoch auch ein methodisches Problem für diese Reduktion verantwortlich sein: Die Wurzeln waren an ihrer Oberfläche durch Bonding so versiegelt, dass praktisch kein Austausch mit der Umgebung stattfinden konnte. Im Munde ist zumindest eine Diffusion von [Seite 82↓]Flüssigkeiten aus dem Gewebe in Zement und Dentin denkbar. Diese Flüssigkeit könnte eine Substratzufuhr für Mikroorganismen im Wurzelkanal darstellen, die im vorliegenden Experiment nicht gegeben war. Die Zähne der Testgruppen zeigten jedoch nach dieser Woche signifikant weniger Keime als diejenigen der positiven Kontrollgruppe, was als Hinweis auf die antimikrobielle Wirkung der Medikamente gewertet werden kann.

Aus Wurzeln, in die das 5%ige Chlorhexidin-Gel appliziert wurde, konnten anschließend in 71% der Fälle keine Bakterien mehr isoliert werden. Diese Art der Applikation scheint effektiver zu sein als das Einbringen chlorhexidinhaltiger Guttaperchastifte. Der Unterschied mag darauf zurückzuführen sein, dass sich das Gel besser an die eher unregelmäßigen Wände der Wurzelkanäle adaptieren lässt als die im Vergleich dazu eher harten Guttaperchastifte. Es ist jedoch auch denkbar, dass die Gesamtmenge an verfügbarem CHX im Falle der Gel-Applikation größer ist: Obwohl sowohl das Gel zu 5% aus CHX besteht als auch die Guttaperchaspitze einen 5%igen CHX-Anteil besitzt, ist durch das Gel das gesamte Lumen des Wurzelkanals ausgefüllt, durch die Guttaperchspitze nur ein Teil. Bei den drei Proben, in denen zum Zeitpunkt von S2 in der Gruppe „CHX-GP“ keine Bakterien nachgewiesen werden konnten, wurden auch nach einer zusätzlichen Woche ohne weitere Einlage keine Mikroorganismen mehr isoliert. In der Gruppe „CHX-Gel“ war nur in einem der zehn keimfreien Kanäle nach einer Woche wieder bakterielles Wachstum aufgetreten. Dies spricht für die Substantivität, die Chlorhexidin zugeschrieben wird (237, 233). In einer In-vivo-Studie untersuchten Klimm et al., inwieweit in Wurzelkanälen mit apikaler Parodontitis nach Aufbereitung und Spülung mit 0,5%iger CHX-Lösung noch Mikroorganismen nachweisbar waren (244). Die Autoren konnten in 88% der Fälle keine Keime isolieren. Im Gegensatz zu der vorliegenden Studie wurden jedoch nach einer Woche keine weiteren Untersuchungen bezüglich einer Re-Infektion mit Mikroorganismen vorgenommen. Huang et al. entwickelten ein Membran-kontrolliertes System auf Polymerbasis, das eine Freisetzung von Chlorhexidin über 24 Tage erlaubt (513). Es wäre interessant, dieses System mit den beiden hier getesteten Systemen zu vergleichen. Trotz der günstigen Ergebnisse für die Gruppen mit Chlorhexidin-Applikation (Gel oder Stifte) sollte in Betracht gezogen werden, dass Chlorhexidin - im Gegensatz zu [Seite 83↓]Kalziumhydroxid - nicht in der Lage zu sein scheint, bakterielle Endotoxine zu neutralisieren (249).

In der vorliegenden Studie wurden die Medikamente ohne vorherige chemomechanische Bearbeitung in infizierte Wurzelkanäle appliziert, um die eigenständige Wirkung der Medikamente bestimmen zu können. Eine ähnlichen Versuch führten Katebzadeh et al. durch, jedoch in vivo und an Hunden (80). Obwohl das Studiendesign stark von dem in der vorliegenden Studie abwich, wurden in beiden Studien ähnliche Ergebnisse gefunden. Katebzadeh et al. applizierten für eine Woche Kalziumhydroxidpaste in infizierte Wurzelkanäle, bevor sie diese mit Wurzelkanalfüllungen obturierten. Nach Opferung der Tiere wurden die apikalen Gewebe der entsprechenden Zähne histologisch untersucht. Im Vergleich zu den negativen (nicht infizierten) Kontrollen fanden die Autoren bei den mit Kalziumhydroxid vorbehandelten Zähnen signifikant mehr entzündete Areale, was zu der Vermutung führen könnte, dass das Medikament nicht vollständig erfolgreich in der Elimination von Bakterien war. Trotzdem fielen die Ergebnisse dieser Testgruppe signifikant besser aus als die der zweiten Testgruppe, in der vor Obturation der Wurzelkanäle kein Medikament appliziert worden war.

In der vorliegenden Studie zeigten die kalziumhydroxidhaltigen Guttaperchastifte die schlechtesten Ergebnisse. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe konnten jedoch aus den entprechenden Proben zumindest nach der ersten Woche (S2) signifikant weniger Bakterien isoliert werden. Bei den in der vorliegenden Studie verwendeten Guttaperchastiften handelte es sich nicht um die bisher erhältlichen Kalziumhydroxid-Guttaperchastifte, sondern um die jüngst auf den Markt gekommenen modifizerten Stifte, die im Vergleich zu den bisher erhältlichen eine höhere Konzentration (ca. 52%) an Ca(OH)2 enthalten. Alle bisherigen Studien, die sich mit den Eigenschaften kalziumhydroxidhaltiger Guttaperchastifte auseinandersetzten, können daher nicht mit der vorliegenden verglichen werden. Distler et al. konnten in vitro demonstrieren, dass der Hauptanteil des Kalziumhydroxids innerhalb der ersten 24 Stunden aus den Stiften freigesetzt wurde (306). Danach konnten keine nennenswerten Mengen des Medikamentes mehr nachgewiesen werden. Nerwich et al. zeigten, dass [Seite 84↓] Kalziumhydroxidpaste für mindestens eine Woche appliziert werden muss, um in allen Wurzelbereichen einen pH-Anstieg zu erzielen (286) . Die ungünstigen Ergebnisse nach Applikation der kalziumhydroxidhaltigen Guttaperchastifte könnten auf eine schnelle Freisetzung des gesamten Kalziumhydroxids und seine rasche Pufferung durch das Dentin zurückzuführen sein (514) . Da jedoch bereits alles verfügbare Kalziumhydroxid abgegeben wurde, kann kein weiterer Anstieg des pH-Wertes im Wurzeldentin hervorgerufen werden, was möglicherweise in einer ungenügenden antibakteriellen Wirkung resultiert . Ferguson et al. untersuchten die fungiziden Eigenschaften verschiedener Testlösungen (203) . Die Autoren stellten fest, dass Kalziumhydroxid nur dann fungizide Wirkung zeigte, wenn es als Paste appliziert wurde und wenn es in direktem Kontakt zu den Mikroorganismen stand . Die mangelhafte Adaptation an die Wurzelkanalwände könnte ein Grund für die ungünstigeren Ergebnisse in der Gruppe mit Applikation kalziumhydroxidhaltiger Guttaperchastifte sein .

5.5 Schlussfolgerungen

In der vorliegenden In-situ-Studie zeigten ein 5%iges Chlorhexidin-Gel und die frisch angemischte Kalziumhydroxidpaste die günstigsten Ergebnisse bezüglich der Reduktion von Mikroorganismen im Wurzelkanal. Aus dieser Sicht kann das 5%ige Chlorhexidin-Gel als zusätzliche medikamentöse Zwischeneinlage betrachtet werden. Kalziumhydroxidhaltige Guttaperchaspitzen zeigten die ungünstigsten Ergebnisse. Im übrigen erlaubt dieses In-situ-Modell die Untersuchung antimikrobieller Substanzen im Wurzelkanal unter standardisierten Bedingungen. In weiteren Studien sollte untersucht werden, ob CHX-Gel und Ca(OH)2-Paste möglicherweise unterschiedliche Keimspektren zum Ziel haben. Dann könnte eine alternierende Anwendung dieser Medikamente zu einem synergistischen Effekt führen.


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