2 Zusammenfassung der eigenen Arbeiten im wissenschaftlichen Kontext

2.1  Das Immunsystem

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Das Immunsystem besteht aus einem komplexen Netzwerk verschiedener lymphatischer und nicht lymphatischer Zellpopulationen und humoraler Faktoren. Als Überwachungssystem ist seine wichtigste Aufgabe, Pathogene und andere Antigene zu erkennen, abzuwehren und zu eradizieren – also dem Organismus Immunität zu verleihen. Immunität kann grundsätzlich in angeborene und adaptive Reaktionen unterteilt werden. Angeborene Reaktionen werden durch Mastzellen, natürliche Killerzellen und mehr als 20 Serumglykoproteine, die auch als Komplementsystem bezeichnet werden, realisiert [35,36].

Angeborene Immunantworten werden über keimbahnkodierte Rezeptoren vermittelt. Da es im Genom nur eine begrenzte Zahl von Genen gibt, von denen nur ein Bruchteil zur Prägung des Immunsystems beiträgt, ist die Anzahl der so kodierten Rezeptoren sehr begrenzt. Mikroben dagegen sind sehr heterogen und mutieren schnell. Der dadurch scheinbar entstehende Mangel an Rezeptorvielfalt wird vom Organismus in sehr eleganter Weise kompensiert. Statt für jedes Antigen einen spezifischen Rezeptor vorzuhalten, erkennt das System grobe Muster von Pathogenen. Der angeborene Teil des Immunsystems kann also fremd und selbst durch Erkennung molekularer Muster sogenannte pathogen associated molecular pattern receptors (PAMP), die nur auf Mikroben und nicht dem Wirtsorganismus vorkommen, wie z.B. Lipopolysacchariden unterscheiden. Für chronische Entzündungsvorgänge, wie CED ist dabei der TLR-4 von besonderem Interesse, da über ihn NFκB, ein Schlüsselfaktor der Entzündung aktiviert werden kann [37,38,39].

Adaptive Immunantworten bedienen sich antigenspezifischer Rezeptoren auf T- und B-Zellen. Etwa 1014 bis 1018 B-Zell- und T-Zellrezeptoren werden somatisch kodiert und später rekombiniert, was dem adaptiven Teil des Immunsystems seine unglaubliche Vielfalt verleiht. Lymphozyten mit nützlichen Rezeptoren werden durch klonale Expansion nach Begegnung mit dem entsprechenden Antigen selektiert. Durch ihre zufällige genetische Rekombination besteht aber auch die Möglichkeit, daß Lymphozytenrezeptoren auch körpereigene Antigene oder Kommensalen fälschlich als fremd erkennen, was potentiell zu Autoimmunität und Entzündung führen kann.

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Während B-Zellen Antigene direkt erkennen und so aktiviert werden können, erfordern T-Zellen die Präsentation von Antigenen durch spezialisierte Zellen (APCs). Der T-Zell-Rezeptor (TCR) erkennt spezifische Antigenfragmente nur im Kontext mit Histokompatibiltätsmolekülen (MHC I und II) und Kostimulationsmolekülen (CD40, CD80, CD86), an die sie nach intrazellulärer Verarbeitung in den APCs gekoppelt sind. Da die Antigenmengen und die Anzahl spezifischer T-Zellen üblicherweise sehr gering sind, kommt antigenpräsentierenden Zellen hier eine wichtige Vermittlerrolle zu [40,41,42,43,44,45,46].

Angeborene und adaptive Immunantworten können nur stattfinden, wenn die entsprechenden Zellpopulationen an den Wirkort gelangen. Dies geschieht durch Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle. Diese Botenstoffe werden nach Kontakt mit Antigenen, u.a. auch Mikroben gebildet. Leukozyten, die Rezeptoren für diese Mediatoren besitzen, migrieren dann so zum Ort des Geschehens. Mediatoren regulieren auch die Expression von Adhäsionsmolekülen, so daß Leukozyten adhärent werden und in die Gewebe eindringen.

2.2 Das mukosale intestinale Immunsystem – Barrierefunktion und Toleranz (P1)

Die mukosale Oberfläche stellt den physischen Kontakt des Immunsystems mit der Außenwelt her. Der Darm stellt den größten Anteil des Mukosa assoziierten lymphatischen Systems im Organismus dar. In der Darmmukosa gibt es mehr Lymphozyten als in jedem anderen lymphatischen Organ im Körper. Das lymphatische Gewebe der Mukosa umfaßt T-Zellen, B-Zellen, Granulozyten, Mastzellen, Makrophagen und dendritische Zellen. Die T-Zellpopulation läßt sich in zwei Hauptgruppen unterteilen: intraepitheliale T-Zellen und Lamina propria T-Zellen. Die LP T-Zellen machen den größten Anteil aus und bestehen aus 95% αβ-T-Zellen, die wie im peripheren Blut auch in CD4+ und CD8+ T-Zellen untergliedert werden können. Intraepithelial dagegen finden sich vorwiegend γδ-CD8+ T-Zellen, die sich morphologisch und funktionell stark von den LP T-Zellen unterscheiden. Im Dünndarm gibt es Lymphozytencluster, die auch als Peyer’sche Plaques bezeichnet werden. Diesen Lymphozyten werden Antigene durch hochspezialisierte Epithelzellen, den sogenannten M-Zellen zugeführt und präsentiert [47,48].

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Auf der anderen Seite findet sich im Darm die größte Population immunologisch äußerst diverser Mikroben (Kommensalen), unter ihnen mehr als 400 Bakterienspezies und andere luminale Antigene [49].

Der Kontrollmechanismus, der die im Normalfall kontrollierte Reaktion des Immunsystems auf luminale Antigene ermöglicht, d.h. eine kontinuierliche Entzündung im Darm verhindert, wird als (natürliche/orale) Toleranz bezeichnet [50]. Konzeptionell kann man ihn auch als intakte mukosale immunologische Barriere verstehen [51] .

Wir und andere Autoren haben gezeigt, daß Epithelzellen, T-Zellen und dendritische Zellen eine zentrale Rolle in diesem Prozeß spielen, und daß ein Zusammenbruch der Toleranz gegenüber der Darmflora ein entscheidender Schritt bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Entzündung im Darm ist [52].

2.3 Antigenpräsentation und T-Zellaktivierung – Schlüsselereignisse der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (P1, P2, P3)

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Erste experimentelle Hinweise auf eine direkte Rolle von T-Zellen bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kamen von Experimenten an Organkulturen von fetalen Jejunumsegmenten, in denen eine Aktivierung von T-Zellen zu einer ausgeprägten Gewebsschädigung führte [53,54]. Daran schlossen sich eine Reihe von Untersuchungen an Tiermodellen, insbesondere transgenen Mäusen an, in denen lymphozytenspezifische Gene ausgeschaltet wurden (knock outs) und die dann spontan intestinale Läsionen entwickelten [33,55].

Eines dieser Tiermodelle ist die IL-2 defiziente Maus, die, wenn unter konventionellen Bedingungen gehalten eine komplexe Erkrankung mit einer Anämie, Lymphozytenhyperplasie, B-Zellmangel und einer gestörten Hämatopoese entwickelt. Erkrankte Tiere, die die ersten 8 Wochen überleben entwickeln eine chronische, nicht granulomatöse Entzündung der Kolonmukosa, ähnlich der humanen Colitis ulcerosa [56].

Die Notwendigkeit von T-Zellen für die Entstehung entzündlicher Läsionen am Kolon von IL-2 defizienten Mäusen wurde durch Kreuzung mit immundefizienten Mäusen, denen alle Lymphozyten (RAG-2 defiziente Mäuse) oder B-Zellen fehlen (Ig heavy chain J segment (JH) defiziente Mäuse) durch andere Autoren gezeigt [57]. Die Tatsache, daß JH / IL-2 defiziente Mäuse Colitis ulcerosa ähnliche Veränderungen aufweisen und RAG-2 / IL-2 defiziente Mäuse keine CU ähnlichen Veränderungen haben zeigte, daß B-Zellen für die Pathogenese keine relevante Rolle spielen. Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen an der Darmmukosa der IL-2 defizienten Maus hatten Hinweise auf eine erhöhte zytotoxische Aktivität von Lamina propria T-Zellen erbracht. Ferner wurde in der Darmmukosa der IL-2 defizienten Maus und anderen CED Tiermodellen über eine vermehrte Expression von mRNA pro-inflammatorischer Zytokine, wie INFγ und TNFα, berichtet [55].

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Wir wollten daher klären, welche Zellen die pro-inflammatorischen Zytokine produzieren, wie T-Zellen und Mukosaepithelzellen interagieren und wie die Gewebsschädigung zustande kommt sowie den Einfluß der kommensalen luminalen Flora bei der Entstehung der Entzündung weitergehend definieren.

Um die Hypothese zu prüfen, daß die CU ähnliche entzündliche Darmerkrankung bei IL-2 defizienten Mäusen tatsächlich auf eine unkontrollierte T-Zellantwort durch luminale Antigene hervorgerufen wird, wurde eine Kolonie unter keimfreien Bedingungen angezüchtet. Die Keimfreiheit wurde durch serologische, histopathologische und mikrobiologische Untersuchungen überwacht. Nach 8 bis 12 Wochen, dem üblichen Zeitpunkt des Auftretens erster Erkrankungszeichen bei konventionell (SPF) gehaltenen IL-2 defizienten Mäusen, konnten wir zwar einen deutlichen Größen- und Gewichtsunterschied im Vergleich zu Wildtypvergleichstieren feststellen, jedoch keine entzündlichen Darmveränderungen. Auch mehr als sechs Monate keimfrei gehaltene Tiere entwickelten keine entzündlichen Veränderungen. Diese Beobachtungen wurden durch histopathologische Untersuchungen an den später autopsierten Mäusen bestätigt. Die Tiere entwickelten jedoch alle anderen bekannten immunologischen und hämatopoetischen Auffälligkeiten der IL-2 defizienten Maus.

In weiteren Untersuchungen haben wir eine ausführliche FACS Phänotypisierung und Quantifizierung der T-Zellen im Kolon der konventionell gehaltenen IL-2 defizienten Mäuse vorgenommen. Im Entzündungsinfiltrat der Lamina propria von nur leicht erkrankten Tieren zeigte sich schon eine vierfach erhöhte Anzahl von CD4+ T-Zellen, die bei stärker erkrankten Tieren bis auf das Dreißigfache im Vergleich zu Wildtypvergleichstieren zunahm. Ähnliche, aber quantitativ geringere Veränderungen wurden auch bei den intraepithelialen Lymphozyten sowie für CD8+ T-Zellen beobachtet. Der Anteil von CD4+CD8+ T-Zellen hingegen war bei erkrankten und Wildtyptieren gleich.

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Die zytotoxische Aktivität von T-Zellen aus dem entzündeten Kolon erkrankter IL-2 defizienter Mäuse als möglichen Mechanismus der Gewebsschädigung untersuchten wir in einem Standard CTL-Assay mit der etablierten Zielzellinie P815 bzw. frisch isolierten Kolonepithelzellen aus Wildtypvergleichstieren. Mit dem Nachweis zytolytischer Aktivität von T-Lymphozyten aus entzündeten Kolonabschnitten IL-2 defizienter Mäuse wurde ihr zytotoxisches Potential prinzipiell demonstriert. Im Anschluß wurden die Experimente mit frisch isolierten Kolonepithelzellen aus Wildtypmäusen wiederholt, um dies als möglichen Schädigungsmechanismus bei CED nachzuweisen oder auszuschließen. Weder eine T-Zellgesamtpopulation, noch einzelne Subpopulationen von CD4+ oder CD8+ T-Zellen aus entzündeten Darmabschnitten IL-2 defizienter Mäuse lysierten die Kolonepithelzellen. Damit konnten wir CTL-Aktivität als Schädigungsmechanismus sicher ausschließen.

Im nächsten Schritt wurde die Zytokinproduktion und -sekretion von T-Zellen mittels intrazellulärer Färbung und ELISA Messung in den Überständen untersucht. T-Zellen konnten hier als eindeutige Quelle der CED typischen Zytokine TNFα, IFNγ und IL-4 identifiziert werden. Bei den intraepithelialen Lymphozyten dominierten TNFα produzierende CD4+ und CD8+ T-Zellen, während in der Lamina propria alle Zytokine von CD4+ und CD8+ T-Zellen gebildet wurden. Es wurde eine schweregradabhängige Zunahme von TNFα, IFNγ und IL-4 Produktion und Sekretion dokumentiert. Im Gegensatz dazu war bei keimfrei gehaltenen IL-2 defizienten Mäusen keine Zytokinproduktion und Sekretion nachweisbar. Das unterstreicht erneut die Bedeutung enterischer, mikrobieller Antigene für die Entstehung und Aufrechterhaltung von intestinalen Entzündungsprozessen in diesem Tiermodell.

Um die Frage nach einer direkten Schädigung der Mukosaepithelzellen durch IFNγ und/oder TNFα zu beantworten, entwickelten wir ein neues Primärkultursystem mit dem ultimativ eine mehrwöchige Zellkultur von primären Kolonepithelzellen möglich wurde. Der epitheliale Ursprung der Zellen wurde durch Nachweis von Zytokeratin, Desmin sowie Muzin I und II bestätigt. Die Vitalität wurde durch Färbung mit Trypanblau, DUNTL-Assays und 3H-Thymidin Inkorporation geprüft. Die biochemische Integrität wurde mit der Bestimmung von zytoplasmatischen und Bürstensaumenzymen bestätigt, wie alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase. Schließlich wurde auch die Kontamination mit hämatopoetischen Zellen durch Färbung mit anti-CD45, anti-CD3 und B220 sowie mesenchymalen Zellen (Fibroblasten) mit anti-Vimentin evaluiert und Isolate mit mehr als 5% Verunreinigung durch nicht-epitheliale Zellen verworfen. Das System wurde später auch für Dünndarmepithelzellen adaptiert.

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In diesem System zeigten wir schließlich, daß sowohl TNFα, als auch IFNγ die Vitalität und metabolische Integrität von primär kultivierten Kolonepithelzellen nicht veränderte, jedoch bei der transformierten Kolonkarzinomzelllinie HT-29 Apoptose induzierten. Dieser von uns erstmalig beschriebene, wesentliche Unterschied zu bisherigen Arbeiten, in denen aufgrund der zytotoxischen Effekte beider Zytokine auf Tumorepithelzelllinien ein direkter gewebsschädigender Effekt dieser Zytokine postuliert wurde, unterstreicht die Problematik beim Arbeiten mit immortalen Zelllinien und der späteren Interpolation der Daten auf das humane System.

Zusammenfassend haben wir mit unseren Experimenten am IL-2 defizienten Mausmodell der Colitis ulcerosa gezeigt, daß T-Zellen eine zentrale Rolle beim mukosalen Entzündungsprozeß bei CED und insbesondere bei CU spielen. Sie sind in der Lage, die Erkrankung auf gesunde Wildtyptiere zu übertragen. T-Zellen gehören zu den wichtigsten Produzenten pro-inflammatorischer Zytokine in der erkrankten Mukosa. Die Zytokin-(Über)-Produktion erfordert die Präsenz der kommensalen Flora. Das Ausbleiben der Darmentzündung bei keimfrei gehaltenen IL-2 defizienten Mäusen stützt die Hypothese einer Fehlaktivierung von T-Zellen durch luminale Antigene. Während mukosale T-Zellen von IL-2 defizienten Mäusen zytolytisches Potential besitzen, spielt ihre CTL-Aktivität als Schädigungsmechanismus für Mukosaepithelzellen keine Rolle. Die Zytokine IFNγ und TNFα führen zu keiner direkten Schädigung des Mukosaepithels [58,59,60,61].

2.3.1  Rolle von mukosalen Epithelzellen als atypische antigenpräsentierende Zellen bei der T-Zellaktivierung (P1, P4, P5, P6)

Nachdem wir in unseren vorangegangenen Arbeiten die Schlüsselrolle der CD4+ T-Zellen für die Pathogenese der CED demonstriert hatten, interessierte uns die Frage, ob möglicherweise eine (fehlerhafte) Aktivierung durch atypische antigenpräsentierende Zellen, wie zum Beispiel Mukosaepithelzellen, die wie wir und andere zeigen konnten klassische und atypische MHC-II Moleküle exprimieren, ursächlich zugrunde liegt [62,63]. Dabei kam unser neu entwickeltes Modell zur Primärkultur von murinen mukosalen Epithelzellen erneut zum Einsatz.

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Es war zunächst unser Ziel, die Fähigkeit von Dünn- und Dickdarmepithelzellen zur Antigenaufnahme, Antigenpräsentation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen am Modell der IL-2 defizienten Maus und ihrem Wildtypäquivalent (C57/BL6) näher zu untersuchen.

Die Fähigkeit von Mukosaepithelzellen lösliche Proteinantigene aufzunehmen wurde mit dem Modellantigen Eialbumin (OVA) untersucht. Dafür wurden frisch isolierte Kolonepithelzellen mit FITC-markiertem OVA inkubiert. Das Färbemuster wurde mittels UV Mikroskopie und Bestimmung der mittleren Fluoreszenzintensität (MEI) in der Flußzytometrie (FACS) untersucht.

Wir konnten demonstrieren, daß metabolisch und morphologisch intakte Dünn- und Dickdarmepithelzellen in der Lage waren das Modellantigen OVA aufzunehmen. In weiterführenden Vergleichsstudien wurde das Antigenaufnahmeverhalten von Dünn- und Dickdarmepithelzellen, die aus den gleichen Tieren isoliert wurden, verglichen. Dabei zeigte sich ein deutlicher quantitativer Unterschied zugunsten der Dickdarmepithelzellen im Vergleich zu den Dünndarmepithelzellen.

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Danach wurden die gleichen Experimente an den IL-2 defizienten Mäusen wiederholt. Die Kolonepithelzellen dieser erkrankten Tiere zeigten eine deutlich höhere Antigenaufnahme als die ihrer gesunden Artgenossen. Das gleiche Phänomen wurde interessanterweise am nicht entzündlich veränderten Dünndarm der erkrankten Tiere beobachtet.

Die Fähigkeit von mukosalen Epithelzellen zur MHC-II restringierten Präsentation eines Peptidantigens zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen wurde mit Hilfe des hochsensitiven NFAT-lacZ-induzierbaren OVA-spezifischen Hybridoms KZO im nächsten Schritt untersucht. Mit diesem experimentellen Ansatz und anschließenden funktionellen Untersuchungen, konnten wir eine dosisabhängige, MHC-II restringierte CD4+ T-Zellaktivierung durch Dünn- und Dickdarmepithelzellen zeigen. In ihrer Potenz sind sie jedoch professionellen APC, wie mit einer Milzzellmischpopulation gezeigt, unterlegen. Im Einklang mit der zuvor dokumentierten effizienteren Antigenaufnahme durch Dickdarmepithelzellen aktivierten diese auch die CD4+ T-Zellen auf ein höheres Niveau als Dünndarmepithelzellen. Die stärkste CD4+ T-Zellaktivierung konnte für Dickdarmepithelzellen aus dem entzündeten Colon der IL-2 defizienten Mäuse gezeigt werden.

Im Anschluß galt es nun zu klären, ob die prinzipielle Fähigkeit von Kolonepithelzellen Antigene zu präsentieren auch zu einer vermehrten CD4+ T-Zellaktivierung oder aber, wie für andere Epithelzellpopulationen gezeigt, zu einer Anergie von CD4+ T-Zellen, d.h. zur Induktion von T-Zelltoleranz führt.

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Um diese Frage zu beantworten, kamen erneut C57BL6 Mäuse und jetzt auch transgene BALB/C-DO11.10 Mäuse, die einen OVA spezifischen T-Zellrezeptor überexprimieren zur Gewinnung antigenspezifischer CD4+ T-Zellen zum Einsatz. Damit sollte u. a. auch die Limitation der KZO CD4+ Hybridom-T-Zelllinie überwunden werden, die zu ihrer Aktivierung keine kostimulatorischen Signale benötigt, um die Rolle kostimulatorischer Moleküle auf Darmepithelzellen besser definieren zu können.

Zunächst wurde der Einfluß von atypischen APC (Kolonepithelzellen) im Vergleich zu professionellen APC (Makrophagen) auf die mitogeninduzierte Aktivierung CD4+ T-Zellen aus der Lamina propria und der Milz von C57BL6 Mäusen untersucht. Während Makrophagen erwartungsgemäß eine kräftige CD4+ T-Zellstimulation von sowohl LPT, als auch Milz CD4+ T-Zellen hervorrief, war diese Reaktion bei Kokultur mit den Kolonepithelzellen deutlich abgeschwächt. Außerdem war auch die Produktion und Konzentration von Zytokinen, wie IL-10, IL-5, IL-4, IFN-γ, und TNFα, wie mit intrazellulärer Färbung und direkter Messung in den Zellkulturüberständen gemessen, deutlich vermindert bzw. nicht nachweisbar.

Mit Hilfe der DO11.10 TCR transgenen Mäuse wurde im weiteren die antigenspezifische CD4+ T-Zellaktivierung untersucht. Im Gegensatz zu professionellen APC waren Kolonepithelzellen nicht in der Lage, DO11.10 CD4+ T-Zellen in der Gegenwart des spezifischen Antigens (OVA) zu aktivieren.

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Da Kolonepithelzellen, wie oben ausgeführt, kostimulationsfrei die KZO CD4+ Hybridom-T-Ziellzellinie OVA spezifisch aktivieren konnten, vermuten wir, daß dies auf eine fehlende Expression von Kostimulationsmolekülen, wie bei anderen Epithelzellen beobachtet, zurückzuführen sei. Daher wurde eine Phänotypisierung der Kolonepithelzellen bezüglich der Expression von Kostimulationsmolekülen angeschlossen. Hier konnten wir auf Kolonepithelzellen ein vergleichbares Expressionsniveau für CD40 und CD80 sowie eine geringere Expression von CD86 und CD54 im Vergleich zu professionellen APC nachweisen. Die CD80 und CD86 Expression wurde zusätzlich durch RT-PCR und Southern Blot Analyse verifiziert.

Auch die exogene Zugabe von IL-2 oder die Kreuzvernetzung von CD28, mit denen sich bei professionellen APC eine induzierte Anergie durchbrechen läßt, konnten keine CD4+ T-Zellaktivierung durch Kolonepithelzellen herbeiführen. Kolonepithelzellen waren darüber hinaus sogar in der Lage, in Gegenwart professioneller APC deren CD4+ T-Zellaktivierung zu hemmen.

Die Hemmung der CD4+ T-Zellhemmung wird nicht durch humorale Faktoren vermittelt, da Zellüberstände von Kolonepithelzellen die Aktivierung durch professionelle APC nicht hemmen konnten. Auch läßt sich dieser Effekt nicht durch die Produktion suppressiver Zytokine, wie IL-10, die Wirkung von CTLA-4 oder TGFβ oder die fehlende Expression von Kostimulationsmolekülen, wie CD80, CD86 oder MHC II erklären, wie wir in weiteren funktionellen Experimenten demonstrierten.

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Abschließend wollten wir herausfinden, ob es sich bei der nun ausführlich dokumentierten Hemmung der CD4+ T-Zellaktivierung durch Kolonepithelzellen um ein reversibles Ereignis handelt. Hierfür wurden CD4+ T-Zellen aus Kokulturen mit Kolonepithelzellen oder professionellen APC gewonnen und erneut mit frisch isolierten professionellen APC durch PMA/Ionomycin oder anti-CD3 restimuliert. Dabei zeigten die aus Kolonepithelzellkokulturen wiedergewonnenen CD4+ T-Zellen eine kräftigere Antwort, als jene aus den Kokulturen mit professionellen APC. Die Induktion von Zelltod oder Apoptose in CD4+ T-Zellen wurde durch Annexin V und PI Färbung als Mechanismus ausgeschlossen. Auch die antigenspezifische CD4+ T-Zellsuppression war reversibel. Hierbei zeigten auch die aus Kolonepithelzellkokulturen wiedergewonnenen OVA spezifischen DO11.10 CD4+ T-Zellen die bereits für die nicht spezifischen CD4+ T-Zellen gefundene kräftigere Antwort im Vergleich zu jenen aus den Kokulturen mit professionellen APC.

Zusammenfassend haben wir mit diesen Experimenten den Beweis erbracht, daß primäre mukosale Epithelzellen über ihre Barriererolle hinaus direkt in Immunregulationsvorgänge in der Darmmukosa involviert sind. Obgleich sie das Potential zur Antigenpräsentation besitzen, besteht ihre Funktion offenbar in der aktiven, reversiblen Hemmung von CD4+ T-Zellantworten. Da sie in unmittelbarem Kontakt mit den luminalen Antigenen stehen, kommt ihnen zumindest im Kolon eine regulatorische, tolerogene Rolle zu, in der sie die Aktivierung von LP T-Zellen durch enterische Antigene verhindern. Eine Störung dieses Prozesses trägt möglicherweise zur Ausbildung und Aufrechterhaltung unkontrollierter Entzündung bei CED und insbesondere bei CU bei [59,62,64,65].

2.3.2  Rolle von dendritischen Zellen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC) bei der T-Zellaktivierung (P1, P7)

Dendritische Zellen sind die am längsten bekannten und potentesten APC [66]. Sie patrouillieren den Organismus praktisch ubiquitär, wobei sie begünstigt durch ihre Morphologie und damit verbundene große Zelloberfläche ständig Antigene „aufsammeln“ und migrieren „beladen“ schließlich zu lymphatischen Organen, wie Lymphknoten oder Milz, wo sie T-Zellen mit spezifischen TCR begegnen [67].

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Unreife dendritische Zellen sind nach Meinung führender Autoren in der Lage, reaktive T-Zellklone auszulöschen und die Differenzierung naiver T-Zellen in regulatorische T-Zellen (TR) zu begünstigen, die wiederum anti-inflammatorische Zytokine wie TGFβ und IL-10 produzieren, welche antigenspezifische T-Zellen deaktivieren [68,69,70,71,72,73,74].

Im Gegensatz dazu führt die Reifung dendritischer Zellen nach Kontakt mit Mikroben oder pro-inflammatorischen Zytokinen, wie TNFα und IFNγ zu einem aktivierten Phänotyp mit erhöhter Expression kostimulatorischer Moleküle, wie CD80, CD86, CD40, CD83 und MHC-II, die die Proliferation antigenspezifischer T-Zellen und Immunität begünstigen [46,66,75,76,77].

Während zahlreiche Daten aus in vitro Experimenten und Tiermodellen zu einer Involvierung dendritischer Zellen in die Pathogenese von CED vorliegen, gibt es zu humanen DC bei CED nur sehr wenige Informationen [78,79,80,81]. Wir entschlossen uns daher zunächst alle drei derzeit bekannten zirkulierenden dendritischen Zellreihen (PDC, MDC-1 und MDC-2) zu charakterisieren. Dazu untersuchten wir Blutproben von 106 CED Patienten (57 CU n=57, MC n=49) und 19 gesunden Probanden.

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Es wurde eine Phänotypisierung und Quantifizierung von PDC, MDC-1 und MDC-2 aus PBMC hinsichtlich bekannter Reifungs-, Aktivierungs- und Migrationsmarker mittels FACS vorgenommen. Die dabei erhobenen Daten wurden mit etablierten CED Erkrankungsindizes, wie dem Truelove-Witts Index für CU und dem Harvey-Bradshaw Index für MC in einer statistischen Regressionsanalyse korreliert. Unsere Ergebnisse zeigten, daß bereits CED Patienten in Remission weniger zirkulierende DC aufweisen als gesunde Probanden. Im akuten Schub kommt es zu einem sehr starken Abfall der zirkulierenden DC Populationen, die sehr eng mit Erkrankungsindizes korreliert. Zirkulierende DC zeigen einen unreifen Phänotyp und exprimieren Migrationsmarker, wie α4β7-Integrin und CD62L.

Im nächsten Schritt wurden aus dem Blut unbehandelter CED Patienten in Remission und im Schub hochreine PDC und MDC Populationen durch magnetische Zellsortierung gewonnen. Die dendritischen Zellen wurden danach kultiviert und mit mikrobiellen Modellstimuli der kommensalen Flora, wie LPS, das über TLR-4 mit MDC interagiert und CpG-ODN 2006, das über TLR-9 mit PDC interagiert, stimuliert [37,82]. So wollten wir die bei CED wahrscheinliche Interaktion dendritischer Zellen mit luminalen Mikrobiota simulieren, um daraus Rückschlüsse für die Reaktion der DC und ihren möglichen Einfluß auf die T-Zellaktivierung und Differenzierung zu gewinnen. Es wurde eine weiterreichende FACS Phänotypisierung der kultivierten Zellen und Analyse der in Kultur durch sie sezernierten Zytokine mittels CBA Multiplexanalyse vorgenommen. Wir fanden eine erhöhte Expression kostimulatorischer Moleküle bei unbehandelten CED Patienten im Schub, die nach Stimulation schneller und auf ein höheres Niveau anstieg, als bei gesunden Probanden. Darüber hinaus fand sich eine vermehrte Produktion pro-inflammatorischer Zytokine, wie IL-6, IL-8 und TNFα bei MDC, die von CED Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden isoliert wurden. MDC von CED Patienten zeigten bereits eine deutlich höhere Zytokinproduktion als gesunde Kontrollen, die im Schub weiter anstieg. Am ausgeprägtesten waren die Unterschiede bei CU Patienten.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, daß bei CED Patienten in Remission bereits ein Mangel an zirkulierenden unreifen, d.h. potentiell tolerogenen dendritischen Zellen besteht, der bei akuten Schüben stark zunimmt. Die Expression von Migrationsmarkern deutet auf eine Migration in den Darm hin, was mit den Tierdaten anderer Autoren und unseren eigenen, vorläufigen Daten vereinbar ist. Weiterhin reagieren dendritische Zellen von CED Patienten auf mikrobielle Modellstimuli im Gegensatz zu gesunden DC mit der Ausbildung eines aktivierten Phänotyps und der Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine. Die bisher vorliegenden Daten lassen vermuten, daß die normalerweise tolerogene Rolle von DC bei CED Patienten gestört ist und sie möglicherweise aktiv zum Entzündungsgeschehen durch eine Fehlreaktion auf die kommensale Flora beitragen. Weitere Arbeiten in unserem Labor werden sich der Klärung dieser Frage widmen [90].

2.3.3  Klinische Beeinflussung der T-Zellaktivierung bei CED Patienten durch Tacrolimus und andere neue Immunmodulatoren und Biologika (P8, P9, P10)

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Etwa zwanzig Prozent aller Patienten mit schwerer Colitis ulcerosa sprechen nicht auf eine konventionelle Steroidtherapie an. Derzeitiger Therapiestandard für diese Patienten ist eine intravenöse Ciclosporin Behandlung, mit der sich in fünfzig bis neunzig Prozent der Fälle eine Remission erreichen läßt [84]. Langfristig sprechen 40 – 60% der Patienten auf diese Behandlung mit einer prolongierten Remission an [85]. Hypertonus, Nierenschäden, Hirsutismus sowie opportunistische Infektion sind häufige Nebenwirkungen einer solchen Behandlung [86]. Ein anderer Nachteil der Ciclosporin Behandlung ist die Notwendigkeit einer intravenösen Applikation, um aufgrund seiner variablen intestinalen Resorption zuverlässige Serumspiegel zu gewährleisten. Bei der neu auf den Markt gekommenen Mikroemulsion soll dieses Problem nicht mehr bestehen, jedoch gibt es erst wenige Daten dazu [87,88].

Wie oben ausführlich dargestellt, spielt die CD4+ T-Zellaktivierung eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen [7,59], so daß uns interessierte, einen anderen potenten T-Zellaktivierungshemmer auf seine Eignung zur Behandlung refraktärer CED Fälle zu untersuchen.

1987 haben Kino und Mitarbeiter erstmals Tacrolimus (FK506) aus Streptomyces tsukubaensis isoliert [89,90,91]. Es erinnert strukturell an Makrolide, wie Rapamycin, und stellte sich als potentes Immunsuppressivum heraus. Obwohl Tacrolimus sich strukturell komplett von Ciclosporin unterscheidet, ist es auch ein potenter Kalzineurin- Hemmer. Mögliche Angriffspunkte stellen Schlüsseltranskriptionsfaktoren der Entzündung, wie nuclear factor of activated T cells (NFAT) und nuclear factor kappa B (NF-κB) dar [92,93]. So kommt es zur Transkriptionshemmung des IL-2 Genes, welches für die T Zell Aktivierung notwendig ist.

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Bis auf die Daten aus Tiermodellen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen, wie der Peptidoglycan / Polysaccharid (PG/PS) induzierten Kolitis [94], der Dextransulfat (DSS) induzierten Colitis [95] und der Trinitrobenzensulfonsäure induzierten Kolitis [96,97], gab es nur sporadische Kasuistiken und Studien mit kleiner Fallzahl zur Anwendung von Tacrolimus bei Patienten mit therapierefraktären chronisch entzündlichen Darmerkrankungen [98,99,100,101,102,103]. Ein Teil dieser Berichte beschreibt die erfolgreiche Anwendung von Tacrolimus bei Morbus Crohn Patienten, für die es aber schon eine Vielzahl innovativer, neuer Therapien, wie z.B. Infliximab gibt [104]. Das Medikament wurde außerdem fast immer intravenös angewendet (insbesondere bei florider CU), was eine ambulante Betreuung der Patienten praktisch ausschließt.

In einer monozentrischen Studie untersuchten wir die Wirkung von Tacrolimus an 31 steroidabhängigen oder -refraktären CED Patienten. Als steroidabhängig wurden Patienten definiert, die mehr als 10 mg Prednisolon täglich oder dessen Äquivalentdosis zur Remissionserhaltung benötigten oder bei denen es innerhalb von sechs Monaten nicht gelang das Steroid auszuschleichen. Als steroidrefraktär wurden Patienten eingestuft, deren akute Erkrankungsphase auch mit systemischen Steroiddosen von mehr als 1 mg/kg Körpergewicht für mindestens 14 Tage nicht durchbrochen werden konnte. 28 Patienten (90.3%) sprachen auf die Behandlung an und 20 (64.5%) erreichten eine Remission. Lediglich drei Colitis ulcerosa Patienten (9.7%) mußten nach 1, 12 bzw. 24 Monaten kolektomiert werden. Mit der erstmals von uns verwendeten niedrigen Dosierung von 0.1 mg/kg KG lassen sich Serumzielspiegel zwischen 4 und 8 ng/ml erreichen, die zu deutlich weniger Nebenwirkungen (Kreatininanstieg (n=3, 9.7%), Tremor oder Parästhesien (n=3, 9.7%), Hyperkaliämie (n=1, 3.2%), Hypertonus (n=1, 3.2%) und opportunistische Infektion (n=1, 3.2%)) führen als in anderen Indikationen berichtet. In einer zweiten Studie konnten wir die Wirksamkeit von Tacrolimus bei refraktären extraintestinalen Komplikationen von CED demonstrieren. Mittlerweile haben wir mehr als 50 refraktäre CED Patienten mit niedrig dosiertem, oral applizierten Tacrolimus erfolgreich behandelt. Die Ansprechraten und Nebenwirkungen sind dabei unverändert geblieben [105,106].

Darüber hinaus gibt es eine Reihe weiterer therapeutischer Möglichkeiten zur Beeinflussung der T-Zellaktivierung und der aus ihr resultierenden Entzündung bei CED durch neue Immunmodulatoren und Biologika.

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Die T-Zellaktivierung kann dabei durch Antikörper gegen T-Zellen (cM-T412, BF-5, MAX.16H5, Visilizumab) direkt blockiert werden.

Eine indirekte Hemmung der T-Zellaktivierung ist durch Inhibitoren pro-inflammatorischer Zytokine (Infliximab, Adalimumab, CDP-571, CDP-870, Etanercept, Onercept, Semapimod, Thalidomid, Fontolizumab, anti-IL12, anti-IL18, Daclizumab, Basiliximab) möglich.

Auch rekombinante anti-inflammatorische Zytokine (IL-10, IL-11, IFNa-2a, IFNb-1a), Inhibitoren der Zelladhäsion (Natalizumab, MLN-02, Alicaforsen) können zur Hemmung der T-Zellaktivierung eingesetzt werden.

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Eine Beeinflussung der luminalen Flora durch Probiotika und Nahrungssupplemente (Escherichia coli Nissle 1917, Lactobacillus spp., Saccharomyces boulardii und Trichuris suis) beeinflußt die Antigenlast des Darminhaltes und somit indirekt auch die T-Zellaktivierung.

Wenn der Mukosaschaden bereits manifest ist, kann nur noch mit Wachstumsfaktoren (EGF, FGF-7, KGF-I und II, TFF Peptide, HGH, G-CSF, GM-CSF, Faktor XIII) die Restitution unterstützt werden.

Darüber hinaus gibt es noch andere Substanzen und Verfahren (CpG Oligodeoxynukleotide (ODN), Rosiglitazon, Zytapherese und Photopherese), die sich keiner der genannten Interventionsmöglichkeiten unterordnen lassen.

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Die Konzepte und aktuellen Daten zu diesen Wirkstoffen haben wir in einer Publikation umfassend zusammengestellt und diskutiert [107].

Zusammenfassend haben wir gezeigt, daß der T-Zellaktivierungshemmer Tacrolimus in niedriger oraler Dosierung zur überbrückenden Therapie refraktärer CED vor Einleitung einer definitiven Remissionserhaltungstherapie geeignet ist. Weiterhin demonstrierten wir seine Wirksamkeit bei refraktären extraintestinalen CED Komplikationen. Aktuelle Konzepte und Daten weiterer Biologika, die ebenfalls direkt oder indirekt auf die T-Zellaktivierung wirken, haben wir in einer ausführlichen Übersicht zusammengefaßt [105,106,107].


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29.08.2006