Bechmann, Ingo: Mechanismen des Immunprivilegs im Zentralen Nervensystem nach axonaler Läsion

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Kapitel 2. Mechanismen des Immunprivilegs im Zentralen Nervensystem nach axonaler Läsion

2.1 Das Modell der entorhinalen Läsion

Eine mechanische Diskonnektion des Hippocampus vom entorhinalen Cortex wird als stereotaktische, elektrolytische entorhinale Läsion tierexperimentell schon lange als Modell zur Untersuchung von De- und Regenerationsprozessen im Zentralen Nervensystem verwendet (Lynch et al. 1972, 1973; Matthews et al. 1976a, 1976b; Cotman und Nadler 1978; Steward und Vinsant 1983). Entorhinale Läsion führt zu anterograder Degeneration im Terminationsgebiet des Tractus perforans, nämlich in der mittleren (MML) und äußeren Molekularschicht (OML) des Gyrus dentatus (vom medialen entorhinalen Cortex projizieren die Axone in die MML, vom lateralen entorhinalen Cortex in die OML) und im Stratum lacunosum-moleculare von CA1 und CA3. Daraus resultiert ein Verlust von ca. 90 % der Synapsen der MML und OML der Fascia dentata ipsilateral zur Läsion (Steward und Vinsant 1983). Einen Überblick über die Verbindung von Hippocampus mit dem entorhinalen Cortex sowie die Hauptzone anterograder Degeneration gibt Abbildung 2.

Abbildung 2:

(a)Hippocampus und entorhinaler Cortex (EC) sind verbunden über den Tractus perforans. Der medialer EC (MEC) terminiert in der mittleren Molekularschicht (MML) des Gyrus dentatus (DG), der laterale (LEC) in der äußeren Molekular-schicht (OML).
(b)Der Fasertrakt kann durch Injektion einer Tracers dargestellt werden.
(c)Bei hoher Vergrößerung werden die einzelnen Fasern im Terminations-gebiet sichtbar.
(d)Nach entorhinaler Läsion kommt es zur anterograden Degenera-tion im Terminations-gebiet.
(e)Die Fasern zerfallen und werden von phagozytischen Zellen aufgenommen.


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Innerhalb von 30 Tagen nach Läsion werden die degenerierten Synapsen zu 70 % des Ausgangswertes durch Auswachsen nicht geschädigter Axone ersetzt (Steward und Vinsant 1983), ein Prozeß, der allgemein als reaktive Synaptogenese oder mit dem englischen Terminus als Sprouting, Aussprossen, bezeichnet wird (Raisman 1969). Nach klassischer Auffassung erweitern kommissurale- und Assoziationsfasern, die vorwiegend das innere Drittel der Molekularschicht innervieren, ihre Terminationszone in den denervierten äußeren Teil (Zimmer 1976). Eine aus dem kontralateralen entorhinalen Cortex kreuzende temporohippocampale Projektion in die äußeren zwei Drittel der Molekularschicht expandiert ebenfalls ihre Terminationszone im denervierten Bereich (Steward et al. 1976). Schließlich verdichtet noch eine septale, vorwiegend cholinerge Afferenz des Gyrus dentatus, die die äußeren drei Fünftel der Molekularschicht innerviert, ihre synaptische Dichte (Lynch et al 1972; Steward und Massenheimer 1978). In jüngerer Zeit konnte gezeigt werden, daß die bisher erarbeiteten Vorstellungen der anatomischen Organisation des entorhinal-hippocampalen Systems der Ratte (Deller et al. 1995a), insbesondere aber der am Sprouting-Prozeß beteiligten Neuronenpopulationen insofern korrekturbedürftig sind, als daß die reaktive Synaptogenese ganz im Gegensatz zur oben beschriebenen Auffassung eher von den verbleibenden Axonen der äußeren Molekularschicht auszugehen scheint, während Fasern der inneren Molekularschicht ihr Terminationsgebiet nicht expandieren (Deller et al. 1995b, 1996, Frotscher et al. 1997; Deller 1998), eventuell weil sie durch gliale Faktoren aktiv vom Einwachsen abgehalten werden (Deller et al. 1997). Diese Entdeckung führte zum Konzept der Schichtenspezifität der reaktiven Synaptogenese nach ECL. Damit wird der oben beschriebene Umstand bezeichnet, daß die Reinnveration der denervierten Dendriten der äußeren Molekularschichten zum größten Teil aus der „eigenen“ Schicht von den dort terminierenden durch die entorhinale Läsion nicht geschädigten Fasern ausgeht (Deller et al. 1995b, 1996; Frotscher et al. 1997; Deller et al. 1997; Deller 1998).

Der Prozeß des Wiedereinwachsens benachbarter Fasern in eine experimentell denervierte Zone wurde weithin als Beispiel für die Regenerationsfähigkeit des ZNS nach Schädigung angesehen (Lynch et al. 1973; Deadwyler et al. 1975; Cotman und Nieto-Sampedro 1985). In der Tat konnte gezeigt werden, daß ein nach unilateraler entorhinaler Läsion der Ratte zu beobachtendes verschlechtertes Lernverhalten sich zwei Wochen nach Läsion wieder normalisierte (Myhrer 1975), also dann, wenn die ursprüngliche synaptische Dichte nahezu wieder erreicht ist (Loesche und Steward 1977; Steward et al. 1977). Dennoch sind dauerhafte transsynaptische (Nitsch und Frotscher 1991, 1993; Nitsch 1993; Miehe et al. 1994; Diekmann und Nitsch 1996) und physiologische (Clusmann et al. 1994) Veränderungen beschrieben. In der Fascia dentata reagieren Parvalbumin (PARV)-positive Neurone, eine Subpopulation GABAerger Nervenzellen, auf entorhinale Läsion mit dauerhafter (bis mindestens ein Jahr nach Läsion beobachtbarer) Rarifizierung ihrer Dendriten aus der früheren Terminationszone des Tractus perforans (Nitsch und Frotscher 1991) und es konnte eine lang dauerhaft gestörte Balance zwischen Exzitation und Inhibition im deafferenzierten Gyrus dentatus auf elektrophysiologischer Ebene nachgewiesen werden. Die Fähigkeit von Körnerzellen, auf orthodrome Stimulation ihrer Afferenz mit Populationsspikes zu reagieren, ist nach Läsion stark reduziert (Clusmann et al. 1994).

Zusammengenommen entsteht der Eindruck, daß die Interpretation der beobachteten Sproutingprozesse als Fähigkeit des ZNS zur funktionellen Reorganisation nach Schädigungen verfrüht war. Zwar konnte reaktive Synaptogenese in verschiedenen experimentellen Läsionsmodellen provoziert und in ihrem Verlauf deskriptiv erfaßt werden. Die molekularen Mechanismen, die Sproutingprozesse initialisieren, steuern und beenden, sowie die biologische Funktion dieses Prozesses bleiben jedoch trotz intensiver Forschung unverstanden. Prinzipiell verschiedene Deutungen des Sprossungsphänomens stehen sich diametral gegenüber: Einerseits könnte die biologische Bedeutung im Wiederherstellen der ursprünglichen Funktion liegen (Myrer 1975), andererseits gibt es Evidenz, Sprouting als den Versuch zu betrachten, deafferenzierte Neurone zu inhibieren (z.B. Nitsch und Leranth 1994), etwa um damit epileptiforme Potentiale zu verhindern. Eine Aufklärung dieser Fragen ist derzeit nicht in Sicht, was insbesondere deswegen zu bedauern ist, weil ein Verständnis der Prozesse reaktiver Synaptogenese zur Hoffnung auf neue Ansätze in der Therapie der neurodegenerativen Erkrankungen, der epilepsiebedingten Schädigungen, aber auch der durch äußere Gewalt entstandenen Läsionen im ZNS Anlaß geben könnte, nämlich dann, wenn es gelänge, zielgerichtetes Wiederauswachsen zu induzieren bzw. zu transsynaptisch-degenerative Schadenskaskaden zu unterbinden.

Bisher wenig beachtet wurden die immunologischen Reaktionen, die durch entorhinale Läsion induziert werden. Dabei sind Veränderungen glialer Zellen, die anerkanntermaßen zur Interaktion mit dem spezifischen Immunsystem fähig sind (Übersichtsarbeit: Aloisi et al. 2000), lange bekannt.


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Übereinstimmend wird eine schon 24h nach Läsion deutlich sichtbare Veränderung der Morphologie und der Verteilung von Mikrogliazellen mit einer Reihe Parametern beschrieben (Gall et al. 1979; Gehrmann et al. 1991; Jensen et al. 1994; Bechmann und Nitsch 1997b; Hailer et al. 1997, Bechmann et al. 2000, Bechmann et al. 2001a, Übersichtsarbeiten: Bechmann und Nitsch 2000, Bechmann und Nitsch 2001). Der Fokus der im folgenden beschriebenen Experimente war deshalb, die immunologischen Reaktionen auf entorhinale Läsion vor dem Hintergrund des aufrechterhaltenen Immunprivilegs zu beschrieben.

2.2 Die Blut-Hirnschranke nach entorhinaler Läsion

Medawar vermutet, daß das Ausbleiben der Abstoßungsreaktion von allogenetischen Transplantaten im ZNS auf zwei morphologische Besonderheiten des ZNS zurückzuführen sei: Einerseits, so glaubte er, sei der efferente Schenkel des Immunsystems im ZNS inhibiert durch die besondere Architektur der Blutgefäße, die eine mechanische Blut-Hirnschranke errichteten, andererseits sei der afferente Schenkel inhibiert durch die Abwesenheit klassischer Lymphgefäße, so daß Antigene aus dem ZNS nicht in die lymphatischen Organe drainierten (Medawar 1948). In den Neunziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts wurde dann deutlich, daß beide Argumente der Hypothese zumindest unzureichend sind; denn zum einen wird selbst das intakte ZNS permanent von aktivierten T Zellen durchquert (Hickey et al. 1991; Wekerle 1993), zum anderen erreichen Antigene aus dem ZNS über die Perineuralscheiden und die Lamina cribrosa die zervikalen Lymphknoten (Cserr und Knopf 1992). Im Modell der entorhinalen Läsion wurde die Frage nach Invasion von Leukozyten nach entorhinaler Läsion bisher wenig beachtet. Fagan und Gage (1994) fanden nach ECL weder periphere Monozyten noch T-Helfer Zellen im Degenerationsgebiet und berichten, daß die Blut-Hirn-Schranke auch für den standartmäßig zur Überprüfung der Dichte der Schranke verwendeten Marker Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase; HRP) undurchdringbar blieb. Jedoch weißt diese Studie einige erhebliche Mängel auf: Zur Markierung von Monozyten wurde DiI-markiertes LDL in nur drei Tiere injiziert, die 24h und 72h nach ECL getötet wurden. Dabei bliebt unklar, ob die injizierte Anzahl an Zellen ausreichend war, da eine geeignete Positivkontrolle fehlte, so daß die wichtige Frage, ob periphere Monozyten/Makrophagen, die zur Antigenpräsentation befähigt sind, nach entorhinaler Läsion ins Gewebe eindringen, letztlich nicht beantwortet war. Da sich Makrophagen/Monozyten immunzytochemisch in situ nicht von lokaler Mikroglia unterscheiden lassen, verwendeten wir zur definitiven Beantwortung dieser Frage eine Maus, in die Grün-Fluoreszierendes Protein (GFP)-transfiziertes Knochenmark transplantatiert wurde (Kollaboration mit Dr. Priller, Prof. Dr. Dirnagl, Neurologische Klinik der Charité; für Details der Methode siehe Referenz 9 im Anhang). Zellen aus dem Blut lassen sich in diesen Chimären dann über Monate durch intensive Fluoreszenz erkennen. Dadurch werden neu eingewanderte Makrophagen von residenter Mikroglia unterscheidbar. Abbildung 3 zeigt die von uns mit dieser Methode gefunden Invasion von Makrophagen nach entorhinaler Läsion.

Wie schon in Abbildung 3 zu erkennen, transformierte sich die Morphologie der einwandernden Zellen von einer runden, für Leukozyten typische Form in die typische ramifizierte Gestalt von Mikrogliazellen. Dies ist in der folgenden Abbildung 4 noch deutlicher zu sehen.


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Abbildung 3:
(a, c) Im unlädierten Zustand fanden sich lediglich neu eingewanderte Makrophagen in den perivaskulären Räumen (Referenz 9). (b, d) Im lädierten entorhinalen Cortex sowie im denervierten Hippocampus kam es dagegen zur massiven Infiltration innerhalb der ersten 24h nach Läsion. Die Makrophagen transformierten innerhalb von 72h ihre Morphologie zur typischen Gestalt von Mikroglia.

Diese Experimente machen deutlich, daß die sogenannte Blut-Hirn-Schranke kein Hindernis für infiltrierende Leukozyten nach entorhinaler Läsion darstellt. Damit wird zumindest für Bedingungen mechanischer Verletzung deutlich, daß die Vorstellung von Gewebebarrieren als wichtiger Mechanismus des Immunprivilegs (Medawar 1948) unzutreffend ist. Dagegen entwickeln einwandernde Makrophagen die wesentlichen morphologischen Charakteristika ruhender Mikroglia, was auf eine lokale, Zytokin-induzierte Deaktvierung immunkompetenter Zellen als Mechanismus des Immunprivilegs hinweist (Hailer et al. 1998).


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Abbildung 4:
(a)In der Läsionszone finden sich zahlreiche runde, fluoreszierende Zellen 24h nach Läsion.(b)Ihre Morphologie entspricht 72h nach Läsion der typischen ramifizierten Gestalt von Mikroglia, wie es bei hoher Vergrößerung in (c) klar zu erkennen ist.

2.3 Die Rolle von Todesliganden für das Immunprivileg im ZNS

2.3.1 Das CD95/CD95L System (Referenzen 1-3)

Entscheidende Hinweise zur Beteiligung sogenannter Todesliganden an der Regulation des Immunprivilegs kamen aus Untersuchungen des Hodens (Bellgrau et al. 1995) und der vorderen Augenkammer (Griffith and Ferguson 1997), die zeigten, daß deren Immunprivileg steht und fällt mit der Expression des Todesliganden CD95L (FasL, Apo1L). CD95L gehört zur Tumor Nekrose Faktor (TNF)-Superfamilie, einer Gruppe von Genen, die für Apoptose-induzierende Liganden codieren. Die Bindung von CD95L an seinen Rezeptor CD95 (Fas, Apo1) induzierte Apoptose der CD95 exprimierenden Zellen. Für T Zellen ist dieser Mechanismus entscheidend für die Homöostase des Zellpools. Nach Aktivierung kommt es auf proliferierenden Zellen zur Hochregulation von Fas und FasL, die gefolgt wird von suizidaler und fratrizidaler Apoptose (Owen-Schaub et al., 1992; Miyawaki et al., 1992). Defekte im Fas- und im FasL-Gen führen daher zur ungehinderten T Zell Proliferation und zur Ausbildung Lupus-ähnlicher autoimmuner Erkrankungen, wie es in Fas- bzw. FasL-defizienten lpr- und gld-Mäusen illustriert wird (Nagata und Suda 1995).


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Um die Rolle von CD95L für das Immunprivileg des ZNS zu evaluieren, haben wir zunächst die Expression mit Hilfe von reverser Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-pcr) zur Detektion der mRNA und mit Western-Blots und Immunzytochemie zum Nachweis und zur zellulären Lokalisation des Proteins untersucht (Bechmann et al. 1999; Bechmann und Nitsch 2001). Wir fanden CD95L im intakten ZNS von Maus, Ratte und Mensch exprimiert auf Neuronen, Mikrogliazellen der weisen Substanz sowie auf Astrozyten der Glia limitans. Diese um Blutgefäße des ZNS gelegene Schicht astrozytärer Fortsätze stellt die erste Struktur des ZNS Parenchyms dar, die von infiltrierenden T Zellen erreicht wird. Nach mechanischen Läsionen kam es zur Hochregulation von CD95L auf Astrozyten, in deren Nähe sich apoptotische Leukozyten fanden, die den CD95 Rezeptor exprimierten. Da solche FasL-positiven Astrozyten auch in vitro in der Lage waren, die Fas-sensitive, humane Jurkat-Zelllinie zu lysieren, interpretierten wir das Vorliegen von FasL auf der Glia limitans als eine Immunologische Blut-Hirn-Schranke (IBB: Immunologic Brain Barrier; Bechmann et al. 1999, Referenz 1).

Um zu untersuchen, ob CD95L auch an der Aufrechterhaltung des Immunprivilegs nach axonaler Degeneration beteiligt ist, untersuchten wir die Expression nach entorhinaler Läsion der Ratte. Wir fanden, daß reaktive Astrozyten in der Zone anterograder Degeneration zwischen Tag 5 und 10 nach Läsion verstärkt sowohl Fas als auch FasL exprimieren, selbst aber nicht apoptotisch werden. In der Nähe der FasL-positiven Astrozyten fanden sich häufig Leukozyten mit fragmentierten Kernen, was als Hinweis auf die funktionelle Relevanz von astrozytischen CD95L gedeutet werden kann. (Bechmann et al. 2000, Referenz 2).

Da all diese Befunde nur nahelegen, aber nicht beweisen, daß CD95L exprimiert auf Zellen des ZNS an der Regulation des Immunprivilegs beteiligt sind, führten wir Kokultur-Experimente durch, um die Fähigkeit von CD95L-defizienten Astrozyten, Apoptose von T Zellen zu induzieren, mit derjenigen CD95-positiver Astrozyten zu vergleichen. Der methodische Ansatz wird illustriert in Abbildung 5.

Abbildung 5


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Diese Experimente belegen eindeutig, daß der CD95/CD95L Weg eine entscheidende Rolle bei der Induktion von T Zell Apoptose durch Astrozyten spielt (Bechmann et al., eingereicht, Referenz 3).

Zusammengenommen unterstützen diese Befunde unsere Hypothese, daß durch die Expression von FasL, die durch entorhinale Läsion noch hochreguliert wird, eine Immunologische Schranke für aktivierte, infiltrierende T Lymphozyten besteht, was eine weitere Aktivierung und damit eine autoreaktive Immunantwort unterdrücken könnte. Dies wird modellhaft in Abbildung 6 illustriert:

Abbildung 6:

Wie unter 2.2. gezeigt, stellt die Blut-Hirn-Schranke (BBB) keine Barriere für infiltrierende Leukozyten nach Läsion im ZNS dar. Einwanderende, voraktivierte und deshalb Fas-exprimierende T Zellen können jedoch schon an der Glia limitans durch FasL-positive Astrozyten ein Apoptose-Signal bekommen, womit eine Immunologische Hirn-Schranke (IBB) besteht. Antigen-spezifische Aktivierung durch lokale Antigenpräsentierende Zellen führt ebenfalls zur Hochregulation von Fas auf T Zellen, womit deren Empfänglichkeit für das FasL-Signal ansteigt. Schließlich können auch Neurone, durch deren FasL-Expression T Zell-Apoptose induzieren, was nun auch experimentell bestätigt wurde (Flügel et al. 2000).

Da auch Zellen des ZNS den CD95 Rezeptor exprimieren, kann CD95L Apoptose intrinischer Zellen des Gehirns, z.B. von Oligodendrozyten induzieren (D´Souza et al. 1996) und spielt somit eine duale Rolle als Effektor- (Entfernen von T Zellen durch Zellen im Gehirn) und Target- (Schädigung von Zellen des Gehirns durch T Zellen) Mechanismus bei Entzündungen im ZNS (Sabelko-Downes et al. 1998). So entwickeln Fas- und FasL-defiziente Mäuse nur eine milde Form der EAE: Zwar werden durch das Fehlen von FasL im ZNS hochsignifikant weniger T Zellen durch die Induktion von Apoptose entfernt, durch den Ausfall des CD95/CD95L-Systems richten diese Zellen aber gleichzeitig geringeren Schaden an (Waldner et al. 1997; Sabelko et al. 1997). Mithilfe von Maus-Chimären und DNA-Vaccination konnte die Bedeutung der Expression von CD95L auf Zellen des Gehirns für die Entfernung von T Zellen und damit der Termination inflammatorischer


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Prozesse jedoch mittlerweile eindeutig belegt werden (Sabelko-Downes et al. 1999, Wildbaum et al. 2000). Diese und ähnliche Befunde (Flügel et al. 2000) bestätigten unsere Auffassung der Expression von CD95L im ZNS als eine für die Aufrechterhaltung des Immunprivilegs wichtige Immunologische Hirnschranke (IBB, Bechmann et al. 1999).

2.3.2 Das TRAIL System (Referenz 4)

Ähnlich wie CD95L ist TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) ein zur TNF-Familie gehörendes Protein, das über zwei Rezeptoren, TRAIL-R1 (Pan et al. 1997) und TRAIL-R2 (Sheridan et al. 1997, Walczak et al. 1997), Apoptose induziert. TRAIL-R3 (Sheridan et al. 1997; Degli-Esposti et al. 1997a, Pan et al. 1997) besitzt keine, TRAIL-R4 eine unvollständige intrazelluläre Todesdomäne. Daher werden TRAIL-R3 und R4 als sogenannte Decoy Rezeptoren angesehen, die durch ihre Bindung von TRAIL Apoptose inhibieren (Marsters et al. 1997, Pan et al. 1997, Degli-Esposti et al. 1997b).

Da wir weder TRAIL mRNA, noch TRAIL Protein im intakten ZNS finden konnten, scheint eine Rolle dieses Todesliganden bei der Regulation des Immunprivilegs im ZNS unwahrscheinlich (Dörr et al., eingereicht). Es ließen sich jedoch sowohl Apoptose-induzierende als auch Apoptose-blockierende Rezeptoren im humanen ZNS nachweisen (Abbildung 7), so daß wir die Rolle von TRAIL als Induktor von Apoptose intrinsischer Zellen des ZNS evaluiert haben.

Abbildung 7:

Immunzytochemie für TRAIL und TRAIL Rezep- toren im humanen ZNS. Kontrolle (a), TRAIL (b) und TRAIL-R1 (c) ergeben keine eindeutige Färbung. TRAIL-R2 (d) scheint vorwiegend auf glialen Zellen, TRAIL-R3 (e, f) und TRAIL-R4 (g, h) auch auf Neuronen erxprimiert zu sein.
Verwendet wurden monoklonale Mausanti- körper der Firma Immumex (von Dr. H. Walczak, DKFZ Heidelberg)
Aufgrund methodischer Probleme konnte keine Dppelfloureszenz-immuno-zytochemie zur Identifi-kation der Zelltypen durchgeführt werden. Die funktionelle Charakteri- sierung erfolgte deshalb wie oben beschrieben (Nitsch et al. 2000, Referenz 4)


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Dazu kultivierten wir akute humane Hirnschnitte von Epilepsie-Patienten, die wir dann mit TRAIL behandelten. Wir fanden, daß TRAIL Apoptose von Neuronen, Astrozyten, Mikrogliazellen und Oligodendrozyten induzieren kann. Da TRAIL von aktivierten, autoimmunen T Zellen exprimiert wird, kann dieser Todesligand ein wichtiges Kandidatenmoleküle bei Schadensmechanismen im entzündeten ZNS darstellen (Nitsch et al. 2000, Bechmann und Nitsch 2001). Da autoimmune T Zellen selbst nicht sensibel für TRAIL-induzierte Apoptose sind (Wendling et al. 2000), scheint TRAIL -im Gegensatz zum CD95-System- lediglich eine Rolle für Schädigung des entzündeten ZNS, nicht als Mechanismus des Immunprivilegs zu spielen. Daher kann die pharmakologische Blockade von TRAIL ein neuer Ansatz zum Schutz des ZNS während neuroinflammatorischer Erkrankungen sein (Nitsch et al. 2000; Dörr et al., eingereicht).

In Mäusen galt TRAIL als spezifischer Induktor von Apoptose in Tumorzellen (Roth et al. 1999; Walczak et al. 1999), weshalb klinische Versuche mit TRAIL zur Tumortherapie vorgesehen waren. Erste Zweifel an der Spezifität von TRAIL für Tumorzellapoptose entstanden durch Befunde, die die Induktion von Apoptose normaler humaner Hepatozyten zeigten (Jo et al. 2000). Unsere Daten unterstreichen diese Befunde und erweitern sie in der Weise, daß offenbar auch Nicht-Tumor-Zellen des Gehirns sensibel für TRAIL induzierte Apoptose sind. Daher verbietet sich auch die Anwendung von TRAIL als lokal injiziertes Therapeutikum von Gliomen (Nitsch et al. 2000, Referenz 4).

2.4 Eine modifizierte Antigenpräsentation im ZNS nach axonaler Läsion

2.4.1 Immundeviation im Gehirn als Mechanismus von Immunprivileg

Die Interaktion zwischen einer Antigenpräsentierenden Zelle und einem T-Lymphozyten wird in ihrem Ergebnis von mehreren Faktoren beeinflußt (siehe S. 12). Die Art des Antigens, das lokale Zytokinmuster, sowie die differentielle Expression kostimulatorischer Moleküle sind entscheidend dafür, ob T Zell Anergie oder Aktivierung aus der Interaktion resultieren. Die Aktivierung selbst kann dabei in grundsätzlich verschiedene Richtungen, nämlich eine T-Helfer 1 oder T-Helfer 2 Antwort laufen. Zusätzlich können regulatorische T Zellen entstehen, die z.B. modulatorisch-suppressiv auf nachfolgende Aktivierung wirken können. In der vorderen Augenkammer wurde als erstem immunprivilegierten Organ beschrieben, daß die Injektion eines Antigens zwar eine systemische Immunantwort induziert, diese allerdings nicht einer Typ IV-Antwort, sondern einer Form von Toleranz entspricht (Kaplan und Streilein 1977). Ähnliches wurde in jüngster Zeit auch nach Antigenexposition im ZNS beschrieben (Wenkel et al. 2000; Brabb et al. 2000). Die zellulären Mitspieler sowie die molekularen Mechanismen dieser Induktion von Toleranz waren jedoch weitgehend unklar. Es war deshalb notwendig, zunächst diejenigen Zellen zu identifizieren, die zur Phagozytose und Präsentation von Antigenen im ZNS fähig sind, um dann deren Interaktion mit Zellen des spezifischen Immunsystems zu beschreiben. Diese Untersuchungen wurden ebenfalls im Modell der entorhinalen Läsion durchgeführt und sind im folgenden beschrieben.

2.4.2 Identifikation phagozytierender Zellen nach entorhinaler Läsion (Referenzen 5-7)

Zur Identifikation phagozytierender Zellen wurde zunächst eine Methode Phagozytose-abhängiger Färbung etabliert, wie sie zuvor schon in Modellen retrograder Degeneration eingesetzt wurde. Die Methode beruht auf einer einfachen Idee: Neurone und ihre Fortsätze werden durch neuroanatomische Tracer markiert und nachfolgend geschädigt. Die Phagozy-tose des degenerierten, aber immer noch angefärbten Materials resultiert dann in einer Färbung der das Material aufnehmenden Zellen. Durch Gegenfärbung mittels Immunzytochemie oder Lektinbindung können nun die phagozytoseaktiven Zellen identifiziert werden. Eher zufällig entdeckten McBride et al. (1988) bei Studien zur Über-lebenszeit afferenter Rückenmarksneuronen nach Durchtrennung der Hinterwurzel, daß die Abnahme der Anzahl markierter Neurone begleitet wurde von einer Zunahme angefärbter Gliazellen. Die Autoren schlossen daraus, daß diese Gliafärbung durch Inkorporation des gefärbten, degenerierten Materials hervorgerufen wurde. Rinaman et al. (1991)


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identifizierten diese mit dem retrograden Tracer Fluoro-Gold gefüllten, nicht-neuronalen Zellen mittels Doppel-Fluoreszenzmikroskopie als Isolektin-B4- positive Makrophagen und/oder Mikrogliazellen. Systematisiert und erweitert im Hinblick auf die verwendeten Tracer und den Einsatz von Elektronenmikroskopie wurde die Methode des Phagozytose-abhängigen Färbens aber erst von Thanos und Mitarbeitern. In einem Modell retrograder Degeneration untersuchte Thanos (1991, 1992; Thanos et al. 1994) retinale Glia nach Absterben vormarkierter Ganglienzellen. In seinen Experimenten verwendete Thanos neben Fluoro-Gold vor allem die Carbocyanine DiI (Grundform: 1,1‘-Dioctadecyl-3,3,3‘,3‘-Tetramethylindo-Carbocyamin Perchlorat) und 4-Di-10-Aspartat [N-4-4-(4-Didecylaminostyrol)-N-Methylpyridiumiodid]. Diese Tracer haben den Vorteil einer sehr kräftigen und über Monate hinweg beständigen Fluoreszenz (Vidal-Sanz et al. 1988, Honig und Hume 1989; Thanos et al. 1993), so daß Zellen, die einmal phagozytiert haben, noch sehr lang identifizierbar bleiben. Die gefüllten Zellen identifizierte Thanos aufgrund morphologischer Kriterien als Mikrogliazellen. Damit wurden erstmals Untersuchung zur Chemotaxis amoeboider Mikroglia durch degenerierende Neurone in der Retina möglich (Thanos 1992). Weiterhin gelang der Nachweis, daß Mikrogliazellen aus der ruhenden Form mehrfach zu einer phagozytierenden Form aktiviert und anschließend wieder deaktiviert werden können (Thanos 1992). Nachdem Thanos die Verwendbarkeit von Carbocyaninen und Fluoro-Gold zur Untersuchung mikroglialer Phagozytose etabliert hatte, wurde sein Ansatz von einer Reihe anderer Arbeitsgruppen verwendet, um Phagozyten nach retrograder Degeneration im ZNS zu studieren. So haben Streit und Graeber (1993) und Angelov et al. (1995, 1996) ähnliche Experimente zur Identifikation von Neuron-phagozytierenden Zellen im Nucleus nervi facialis nach peripherer Läsion des VII. Hirnnerven durchgeführt. Sorensen und Mitarbeitern (1996) zeigten die Inkorporation Fluoro-Gold-markierter Neurone im Hypothalamus durch Mikroglia nach Aspiration des sensomotorische Cortex. Hollerbach und andere beschrieben Phagozytose von retrograd geschädigten Neuronen durch Mikroglia im Septum nach Fimbria-Fornix Transsektion (Hollerbach et al. 1998). Die Verwendung sowohl von Fluoro-Gold als auch von Carbocyaninen bringt jedoch einige methodische Schwierigkeiten mit sich. Von beiden ist bekannt, daß sie aus Zellen auslaufen und somit zu unspezifischer transzellulärer Anfärbung führen können (McBride 1988; Fritzsch und Wilm 1990). Von den hochlipophilen und daher membrangebundenen Carbocyaninen wurde berichtet, daß sie zumindest im fixierten Gewebe durch Kontakt von gefärbten Zellmembranen ins Plasmalemm benachbarter zellulärer Strukturen diffundieren können, so daß eine Phagozytose-unabhängige transzelluläre Anfärbung möglich ist (Kageyama und Robertson 1993). Fluoro-Gold wirkt darüber hinaus neurotoxisch (Illert et al. 1982), so daß die Verwendung für Experimente, die längere Überlebenszeiten der Tiere nach Injektion des Farbstoffes intendieren, problematisch ist. Ebenfalls von Nachteil ist, daß die Fluoreszenz sowohl von Fluoro-Gold als auch der Carbocyanine ein sehr weites Anregungs- und Emissionsspektrum besitzen, so daß die Identifikation der Phagozytose-abhängig gefärbten Zellen durch Gegenfärbung mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff erschwert ist. Daher wird die elektronenmikroskopische Untersuchung bei Verwendung dieser Tracer unerläßlich. Zum einen kann dabei auf morphologischer Grundlage deutlicher zwischen Astrozyten, Mikroglia und Neuronen unterschieden werden als es aufgrund der Morphologie in der Fluoreszenzmikroskopie möglich ist, zum anderen kann durch elektronendichte Konversion mittels DAB für DiI (von Bartheld 1990, Gansmüller et al. 1992, Lübke 1993) und durch Immunzytochemie für Fluoro-Gold (Chang 1990, Van-Bockstaele 1994) entschieden werden, ob der Tracer innerhalb von Phagosomen oder diffus an Membranen gebunden vorliegt (Thanos et al. 1994).

Für unsere Untersuchungen axonaler Degeneration mußte zunächst ein anterograder Tracer gefunden werden, der die entorhinal-hippocampale Projektion stabil für licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen markiert. Dazu wurde das 10 kD schwere Biotin- und Rhodamin gekoppelte Dextranamin Mini Ruby (MR) verwendet. Mini Ruby ist nicht neurotoxisch (Gimlich und Braun 1985). Das an die Dextranamin-Ketten gekoppelte Rhodamin erzeugt unter Grünanregung eine starke und dauerhafte Fluoreszenz. Durch die gleichzeitige Biotinylierung ist eine DAB-Entwicklung und damit eine deutliche elektronendichte Konversion für ultrastrukturelle Untersuchungen möglich. Auf Grund seiner ausgeprägten Hydrophilie diffundiert MR im Gegensatz zu der Carbocyaninen nicht durch Membranen und läßt sich fixieren, so daß eine transzelluläre und damit unspezifische Anfärbung im nicht geschädigten Gewebe unwahrscheinlich ist (Fritzsch und Wilm 1990; Fritzsch 1993). Innerhalb der Zelle diffundiert es im Zytoplasma und führt so zu einer retrograden und anterograden Anfüllung auch feiner Zellfortsätze. Durch stereotaktische Applikation einiger Kristalle MR mit Hilfe einer speziell präparierten Spinalnadel in den medialen entorhinalen Cortex wurden die Axone des Tractus perforans angefärbt und durch nachfolgende stereotaktische entorhinale Läsion deren anterograde Degeneration induziert. In ihrem


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Terminationsgebiet im Gyrus dentatus konnten dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach entorhinaler Läsion MR-positive (also phagozytierende) Zellen durch Immunzytochemie und Lektinfärbung auf licht,- konfokal- und elektronenmikroskopischer Ebene identifiziert werden (Bechmann und Nitsch 1997a; Referenz 5; Köberts et al. 2000; Referenz 6). Die Etablierung einer im Prinzip gleichen Methode gelang uns auch im Modell der organotypischen Hirnschnittkultur (Kluge et al. 1998).

Mit Hilfe dieser Methode gelang uns der Nachweis, daß degeneriertes Myelin nach entorhinaler Läsion von Mikrogliazellen und Astrozyten phagozytiert wird. Phagozytische Mikrogliazellen waren schon am ersten Tag nach Läsion im Lichtmikroskop zu erkennen. Sie hatten die typische Morphologie amoeboider Mikroglia und ihre Umverteilung in die Zone anterograder Degeneration legte eine Invasion aus umliegenden Arealen nahe. Am Ende der ersten Woche zeigte die Mikroglia wieder die ramifizierte Morphologie "ruhender" Zellen. Phagozytische Astrozyten wurden im Lichtmikroskop um den Tag 6 nach Läsion sichtbar. In beiden Zelltypen fanden sich im Elektronenmikroskop mit Mini Ruby gefüllte myelinisierte Fasern (Bechmann und Nitsch 1997b; Referenz 7).

2.4.3 Identifikation Antigenpräsentierender Zellen nach entorhinaler Läsion (Referenz 8)

Da Astrozyten und Mikroglia als Myelin-phagozytierende Zellen identifiziert wurden, entstand die Frage, welche Zelltyp nachfolgend zur Antigenpräsentation fähig ist. Hierzu untersuchten wir die Expression von Adhäsionsmolekülen mit Hilfe Phagozytose-abhängiger Färbung nach entorhinaler Läsion. Solche Moleküle der Immunglobulin-Superfamilie und der heterodimären Integrine sind unter anderem für die Bindung zwischen Antigenpräsentierenden Zellen und T Zellen und deren Kostimulation (siehe 2.4.5.) wichtig. Wir fanden, daß phagozytische Mikroglia, aber nicht Astrozyten die Adhäsionsmoleküle ICAM-1, LFA-1 und VLA-4 exprimierten. Dieser Befund unterstützt zahlreiche in vitro-Daten, die nahelegen, daß Mikroglia, aber nicht Astrozyten effektive Antigenpräsentierende Zellen sind (etwa Aloisi et al. 1998; Übersichtsarbeit: Aloisi et al. 2000). Weiterhin zeigen unsere Ergebnisse, daß axonale Degeneration ein ausreichender Stimulus ist, die Expression der zur Antigenpräsentation wichtigen Adhäsionsmoleküle auf Mikroglia, nicht aber auf Astrozyten zu induzieren. (Hailer et al. 1997, Referenz 8).

2.4.4 Invasion von perivaskulären Zellen (Referenzen 9, 10)

Eine weitere Population von Zellen, die nach allgemeiner Auffassung an Antigenpräsentation im ZNS beteiligt ist (Graeber und Streit 1990; Hickey et al. 1992; Kösel et al. 1997; Angelov et al. 1998), sind die perivaskulären Makrophagen. Diese in den Virchow-Robin´schen Räumen gelegenen Zellen haben eine hohe phagozytische Kapazität (Mato et al. 1985; Bechmann und Nitsch 1997b, Bechmann et al. 2001) und exprimieren MHC-II Moleküle (Streit et al. 1989). Ihre strategisch wichtige Position zwischen Blut-Kompartment und Parenchym des Gehirns (siehe Abbildung 8) suggeriert eine Rolle als wichtige Regulatorzellen bei der Induktion von Immunantworten (Übersichtsarbeit: Angelov et al. 1998).


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Abbildung 8:
Perivaskuläre Zelle (PC) liegen im perivaskulären Raum (PS) zwischen der zweiten, die Perizyten umgebenden, und der auf der Glia limitans gelegenen dritten Basalmembran. Die Glia limitans ist mit GFAP markiert (Pfeile). Eine erste Basalmembran ist um die Endothelzelle (E) zu erkennen. Die offenen Pfeile markieren Fortsätze des perivaskulären Makrophagen, die das Gefäß umgreifen.

Abbildung 9:
Die hohe phagozytische Kapazität dieser Zellen wird deutlich nach Injektion hydrophiler Tracer, die entlang der perivaskulären Räume diffundieren. Der phagozytierte Farbstoff wird in deutlich sichtbaren Granula gespeichert, die den Phagosomen in Abbildung 5 entsprechen

Nach axonaler Läsion fand sich Myelin in den perivaskulären Makrophagen (Kösel et al. 1997), was die Frage nach deren Bedeutung als mögliche Antigenpräsentierende Zellen noch wichtiger macht. Da die perivaskulären Räume mit dem nicht immunprivilegierten subpialen/subarachnoidalen Liquorraum in Verbindung stehen, ist denkbar, daß perivaskuläre Zellen als Träger von Antigenen in der Peripherie agieren können. Dagegen spricht die Ansicht, daß es sich bei der Population der perivaskulären Makrophagen um residente Zellen handelt (Kida et al. 1993). Aus diesem Grund haben wir den Turnover dieser Zellpopulation im intakten ZNS untersucht.

Als erstes Paradigma verwendeten wir die unter 2.2. schon angesprochene GFP-transfizierte Maus-Chimäre (von Dr. med. J. Priller und Prof. Dr. med. U. Dirnagl., Neurologie der Charité). Durch immunzytochemische Untersuchungen sowie durch Tracing-Studien evaluierten wir den Influx GFP-transfizierter Blutzellen in die perivaskulären Räume über die Zeit. Der Aufbau der


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Studie ist in Abbildung 10 erklärt:

Abbildung 10:
Mäuse wurden bestrahlt und erhielten ein GFP-transfiziertes Knochenmarkstransplantat. Nach drei Monaten wurden alle perivaskulären Makrophagen durch Injektion von Mini Ruby markiert. Des Verhältnis aller perivaskulären zu GFP-positiven perivaskulären Makrophagen entspricht nach Angleichung an die Transfektionsrate dem Turnover (neu eingewanderte/alle perivaskuläre Makrophagen).

Wir fanden, daß nach drei Monaten zwischen 80 und 100% der perivaskulären Makrophagen aus dem Transplantat stammten. Damit war - zumindest für die Bedingungen einer Maus-Chimäre - die Behauptung von Kida et al. (1993) widerlegt, daß perivaskuläre Makrophagen resident sind (Bechmann et al., eingereicht; Referenz 9).

Um auszuschließen, daß der Turnover perivaskulärer Makrophagen durch die Bestrahlung oder die Knochenmarkstransplantation beeinflußt wurde, untersuchten wir die Einwanderung von Blutmakrophagen in die perivaskulären Räume in normalen, adulten Ratten mit zwei weiteren Methoden, die durch die folgenden Abbildungen 11 und 12 illustriert werden.

Abbildung 11:
Aus der Schwanzvene adulter Ratten wurde Blut entnommen und Makrophagen isoliert. Diese wurden dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und zurück in die Tiere gespritzt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Tiere dann getötet und die injizierten Makrophagen in den perivaskulären Räumen identifiziert. Mit Hilfe von Immunzytochemie wurde gezeigt, daß es sich bei den ex vivo isolierten und reinjizierten Zellen tatsächlich um Makrophagen handelte.


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Abbildung 12:
Um eine quantitative Aussage über den Turnover zu machen, wurden die perivaskulären Makrophagen durch Injektion eines rot-fluoreszierenden Tracers in die Seitenventrikel markiert und vier Wochen später ein grün-fluoreszierender Tracer injiziert. Zellen die nach der ersten Injektion in die perivaskulären Räume eingewandert waren, färbten sich nur mit dem zweiten Tracer an. Das Verhältnis einfach-positiver zu doppel-positiven Zellen erlaubte die Kalkulation der Einwanderung. Mehrere Kontrollen validierten die Methode (siehe Referenz 10).

Wir fanden, daß innerhalb von vier Wochen etwa 6% der perivaskulären Zellen neu eingewandert waren. Dieses Ergebnis ist deutlich niedriger als das in den knochenmarkstransplantierten GFP-Mäusen beobachtete, zeigt aber ebenfalls, daß die Population der perivaskulären Makrophagen keineswegs resident ist. Damit wird deutlich, daß eine permanente Einwanderung in die perivaskulären Räume besteht, auch wenn noch unklar ist, ob die Makrophagen von dort aus die lymphatischen Organe erreichen. Dies wird gegenwärtig von uns untersucht.

Im Gegensatz zu Ergebnissen in Maus-Chimären (Kennedy und Abkowitz 1997), ergab sich in diesen Experimenten keinerlei Anhalt für die Transformation von Blutmakrophagen/ perivaskulären Makrophagen in Mikrogliazellen (Bechmann und Nitsch 1997b); Bechmann et al., im Druck, Referenz 10).

2.4.5 Differentielle Expression kostimulatorischer Moleküle nach axonaler Läsion als Mechanismus des Immunprivilegs (Referenz 11)

Die im vorangegangenen dargestellten Ergebnisse zeigten, daß nach entorhinaler Läsion Myelin von Astrozyten und Mikrogliazellen phagozytiert wird (Bechmann et al. 1997, Referenz 7). Mikrogliazellen entwickeln dann den Immunphänotyp Antigenpräsentierender Zellen. Da die Blut-Hirn-Schranke keine Barriere für einwandernde Leukozyten bildet (siehe 2.2.), stellte sich erneut die Frage, warum die Präsentation von Myelin auf lokalen Antigenpräsentierenden Zellen nicht zu destruktiven Immunantworten führt. Dies mag durch die lokale Expression von Todesliganden erklärt werden, die aktivierte Fas-empfindliche T-Zellen in den apoptotischen Zelltod treiben. In der Tat fanden wir solche apoptotischen Zellen in der Läsionszone (Bechmann et al. 1999, Referenz 1; Bechmann et al. 2000, Referenz 2). Dies scheint aber nicht der einzige hier greifende Mechanismus zu sein, da zum einen auch FasL-defiziente Mäuse nach entorhinaler Läsion keine Autoimmunerkrankung entwickeln (eigene unpublizierte Beobachtungen), zum anderen Brabb et al. (2000) und Wenkel et al. (2000) eine Immundeviation nach Antigenpräsentation im ZNS beschreiben. Diese Befunde legen nahe, daß eine Antigen-spezifische Interaktion im Gehirn stattfindet, die allerdings keine destruktiven Immunantworten, sondern Toleranz induziert. Wie in Schema 1 (S.12) dargestellt, ist das Ergebnis Antigen-spezifischer Interaktion zwischen Antigenpräsentierenden Zellen und T Zellen abhängig von der Expression kostimulatorischer Moleküle. Neben ICAM-1 und LFA-1, deren Expression auf phagozytischer Mikroglia wir gezeigt haben (siehe 2.4.3., Hailer et al. 1997, Referenz 8), sind die B7-Moleküle hierbei von entscheidender Bedeutung. Dabei legen Blockade-Experimente im Modell der EAE nahe, daß Kostimulation über B7-1 destruktive, über B7-2 protektive Immunantworten induziert (Kuchroo et al.


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1995; Racke et al. 1995; Miller et al. 1995, Gallon et al. 1997). In der Tat wurde B7-1 Expression auf Mikroglia im humanen Gewebe von MS Patienten gefunden (Windhagen et al. 1995; De Simone et al. 1995). Kuchroo et al. (1995) erklären die Effekte differentieller B7-Blockade durch die Induktion von gefährlichen T-Helfer 1 Antworten durch B7-1 und die Induktion protektiver T-Helfer 2 Antworten durch B7-2. Diese Befunde sind in Abbildung13 zusammengefaßt.

Abbildung 13:
Die Aktivierung des Spezifischen Immun-systems beruht auf zwei wichtigen Schritten, nämlich der Phagozytose und Prozessierung von Antigenen, sowie der Antigen-spezifischen Interaktion mit T Zellen über MHC-II Moleküle. Ohne kostimulatorische Moleküle induziert diese Interaktion T Zell-Anergie. Im Gehirn scheint unter Bedingungen der EAE, einer Interaktion mit B7-2 eher protektive, eine Interaktion über B7-1 destruktive Immun-antworten zu induzieren.

Um die Interaktion von T Zellen mit Myelin-phagozytierender Mikroglia nach entorhinaler Läsion im Hinblick auf das Ausbleiben von Immunreaktionen zu verstehen, haben wir die Invasion von T Zellen, die Expression von MHC-II, sowie die Expression von B7-1 und B7-2 Molekülen in diesem Modell untersucht. Wir fanden, daß es zur Invasion von T Zellen und zu deren Verbleib in Zonen retrograder Degeneration nach entorhinaler Läsion kam, während Mikrogliazellen auch Wochen nach entorhinaler Läsion noch MHC-II positiv waren. Damit sind die Bedingungen für eine Antigen-spezifische Interaktion zwischen Mikroglia und eingewanderten Lymphozyten möglich, die aber in Anbetracht der in Schema 7 zusammengefaßten Befunde eine protektiven Immunantwort induzieren sollte, da die Mikroglia nach Läsion zwar B7-2, nicht aber B7-1 exprimierten (siehe Abbildung 14).


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Abbildung 14:
(a-d) In Zonen anterograder Degeneration fand sich kein B7-1 in Kontrollen und nach Läsion (Pfeile zeigen auf positive perivaskuläre Zellen und einzelne Makrophagen und Mikroglia in anderen Bereichen des ZNS).
(e-f) Dagegen zeigten Mikrogliazellen eine geringe Ruheexpression sowie eine rasche Hochregulation von B7-2 nach Läsion in der Terminationszone des lädierten Tractus perforans, der mittleren Molekularschicht (MML).

Diese Befunde wurden von uns interpretiert als ein entscheidender Mechanismus des Immunprivilegs im ZNS nach axonaler Läsion. Mikrogliazellen präsentieren Myelin lokal nicht im Kontext von MHC-II mit B7-1, wodurch destruktive Immunantworten unterbleiben. Dagegen kann die Interaktion von B7-2 Toleranz oder sogar protektive Effekte induzieren. Dieser Gedanke wird unterstützt durch den Befund, daß sich in Zonen retrograder Degeneration, in denen Projektionen liegen, die an Wachstums- und Reorganisations-prozessen nach entorhinaler Läsion beteiligt sind, sich auch Wochen nach Läsion noch T Zellen fanden, deren Anwesenheit aber keine Aktivierung


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von Mikrogliazellen induzierte. Diese T Zellen exprimierten ebenfalls B7-2, was eine negative Rückkopplung über den CTLA-4 Rezeptor erlaubt, die für eine Aktivierungsblockade verantwortlich sein könnte. (Bechmann et al., im Druck, Referenz 11). Diese Vorstellung wird zusammengefaßt in Abbildung 15:

Abbildung 15:
Mikrogliazellen präsentieren Antigene nach axonaler Degeneration über MHC-II im Kontext einer B7-2 Kostimulation, die nach gängiger Vorstellung neuroprotektive Antworten induziert. Durch gleichzeitig vorliegende Danger-Signale könnte eine B7-1 Expression auf Mikrogliazellen induziert und damit gefährliche Immunantworten induziert werden. So ließen sich kasuistisch auftretende Fälle von MS nach Trauma erklären (Goddin et al. 1999).


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