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2.  Einleitung

2.1. Die Temporallappenepilepsie

Die Epilepsien gehören mit einer Prävalenz von 0,5 bis 1% nach den zerebrovaskulären Erkrankungen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen (Annegers, 1997; Hauser, 1997; Olafsson und Hauser, 1999). Sie stellen eine heterogene Gruppe von Erkrankungen unterschiedlicher Ätiologie dar, deren gemeinsames Merkmal wiederholte, nicht provozierte epileptische Anfälle sind. Der epileptische Anfall ist die klinische Manifestation einer pathologisch synchronisierten, exzessiven Entladung von Nervenzellen. Die Semiologie eines epileptischen Anfalls wird durch die gestörte Funktion der beteiligten neuronalen Zellverbände bestimmt. Die Ursachen der paroxysmal auftretenden, exzessiven neuronalen Entladungen sind vielfältig: In Abhängigkeit vom Epilepsietyp treten Veränderungen sowohl auf Einzelzellebene als auch auf Netzwerkebene auf. Während auf zellulärer Ebene Veränderungen der Membraneigenschaften sowie der synaptischen Neurotransmission auftreten, wird im neuronalen Zellverband die Bildung pathologischer aberranter Konnektivitäten beobachtet. Zudem scheinen gliale Zellen durch eine veränderte Kontrolle des extrazellulären ionalen Mileaus an der Iktogenese beteiligt zu sein. Gemäß der internationalen Klassifikation epileptischer Anfälle werden diese hinsichtlich ihrer Pathogenese sowie klinischen und elektroenzephalographischen Befunden in fokale und primär generalisierte Anfälle unterschieden. Die Temporallappenepilepsie (TLE) ist mit 60-70% die häufigste Form der fokalen Epilepsien und repräsentiert mit ca. 40% die häufigste Epilepsie des Erwachsenenalters (Engel, Jr., 2001). Zwischen 80-90% der TLE haben im mesialen Anteil, d.h. in der Amygdala und der hippokampalen Formation ihren Ursprung. Das pathologisch-anatomische Substrat der mesialen TLE ist der selektive Zelluntergang in der hippokampalen Formation. Die pathogenetische Bedeutung dieser als Ammonshornsklerose bezeichneten morphologischen Veränderung ist allerdings unklar. Während zwei Drittel aller Patienten mit TLE gut bis befriedigend medikamentös behandelt werden können, zeigt sich bei ca. einem Drittel der Patienten eine Pharmakoresistenz (Wieser et al., 1993; Engel, Jr., 1996, 1997). Wenngleich diese Patienten derzeit mit teilweise sehr gutem Erfolg epilepsiechirurgisch behandelt werden können, konzentriert sich die experimentelle Epilepsieforschung insbesondere auf diese Epilepsieform, um die Grundlagen für alternative Behandlungsstrategien zu schaffen.


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2.2.  Die hippokampale Formation

Neuroanatomisch wird die mesiale TLE der Amygdala, der hippokampalen Formation sowie dem entorhinalen Kortex (EC) zugeordnet. Eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der mesialen TLE spielt eine pathologisch veränderte Neurotransmission innerhalb der hippokampalen Formation. Die hippokampale Formation wird in vier größere Regionen unterteilt: die Area dentata, die Area CA3, die Area CA1 sowie das Subikulum (Amaral und Witter, 1989; Amaral und Witter, 1995). Jede dieser Regionen ist durch ihre spezifischen synaptischen Ein- und Ausgänge sowie durch die intrinsischen Eigenschaften ihrer Neurone charakterisiert. Ein wesentliches Merkmal der hippokampalen Formation ist die im Vergleich zum Neokortex einfache synaptische Verschaltung (Abb. 1): Die Körnerzellen der Area dentata projizieren über die Moosfasern auf Area CA3 Pyramidenzellen, Axonverzweigungen dieser Zellen gehen über die Schaffer Kollateralen synaptische Verbindungen mit den Pyramidenzellen der Area CA1 Region ein, welche ihrerseits ihre Axone in das Subikulum senden. Das Subikulum schließlich projiziert hippokampale Information zu verschiedenen kortikalen und subkortikalen Hirnarealen (Andersen et al., 1971). Neben dieser trisynaptischen hippokampalen Schleife existieren weitere Verbindungen von den Pyramidenzellen der Area CA3 zum kontralateralen Hippokampus (Ishizuka et al., 1990), innerhalb der Area dentata (Ribak et al., 1985) sowie ein regionales Netz von inhibitorischen Interneuronen (Seress und Ribak, 1983).

Den wesentlichen kortikalen Eingang erhält die hippokampale Formation über neuronale Zellen der Schicht II des EC, welcher eine Schlüsselposition zwischen kortikalen Strukturen und der hippokampalen Formation einnimmt. Diese Zellen projizieren über den Tractus perforans zu den Körnerzellen und den inhibitorischen Interneuronen der Area dentata. Der entorhinale Eingang wird in zwei Anteile unterteilt: Ein Faserbündel nimmt im medialen Anteil des EC seinen Ausgang und projiziert in das mittlere Drittel des Stratum moleculare (Dendritenschicht der Körnerzellen), ein weiteres Faserbündel entspringt im lateralen Anteil des EC und projiziert in das äußere Drittel des Stratum moleculare. Neben dieser Projektion vom EC zum Hippokampus existiert ein weiterer entorhinaler Eingang, welcher monosynaptische Kontakte mit Pyramidenzellen der Area CA1 und des Subikulums sowie regionalen Subpopulationen von inhibitorischen Interneuronen eingeht (Witter, 1993; Lacaille und Schwartzkroin, 1988). Dieses, als temporoammonische Projektion bezeichnetes Faserbündel entspringt in der Schicht III des EC und stellt somit einen der trisynaptischen [Seite 12↓] Schleife entgegengesetzten Eingang dar (Wyss, 1981; Tamamaki und Nojyo, 1995). Dessen physiologische und pathophysiologische Bedeutung ist bislang unklar.

Abb. 1 : Schematische Darstellung der wichtigsten Verbindungen im neuronalen Schaltkreis der entorhinal-hippokampalen Formation.

Efferenzen aus der Schicht II des EC erregen einerseits die Körnerzellen der Area Dentata (AD), andererseits projizieren Zellen der Schicht III in das Subikulum (SUB) und die Area CA1, wo sie vorwiegend auf inhibitorische Interneurone verschaltet sind. Die Projektionszellen der tiefen Schichten des EC (IV/ V) bilden eine zusätzliche Projektion zur AD. Aus der AD wird die Erregung über die Moosfasern zu den Pyramidenzellen der Area CA3 und von dort über die Schaffer Kollateralen zur Area CA1 geleitet. Die Pyramidenzellen der Area CA1 projizieren über das Subikulum in die tiefen Schichten des EC, womit sich der Schaltkreis schließt. Der EC steht über den perirhinalen Kortex (PRC) mit kortikalen Neuronen in Verbindung.


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Neben diesen kortikalen Eingängen erhält die hippokampale Formation verschiedenste subkortikale Afferenzen: Von wesentlicher Bedeutung ist neben dem cholinergen septalen Eingang (Wyss et al., 1979; Lewis und Shute, 1967) die monoaminerge Projektion des Hirnstamms mit noradrenergen Fasern aus dem Locus coeruleus (Lindvall und Bjorklund, 1974), serotonergen Fasern aus dem Raphe Kern (Moore und Halaris, 1975) sowie dopaminergen Fasern aus verschiedenen Hirnstammkernen (Descarries et al., 1987; Gasbarri et al., 1994; Verney et al., 1985). Diese aminergen Projektionen haben einen bedeutenden modulatorischen Einfluß auf die Neurotransmission hippokampaler Neurone und somit auch auf die Iktogenese und das Ausbreitungsverhalten mesialer Temporallappenanfälle.

Die wesentliche kortikale Efferenz der hippokampalen Formation geht von der Area CA1 sowie von dem Subikulum aus und projiziert in die tiefen Schichten des EC (Witter et al., 1989). Über die Verschaltung der tiefen Schichten des EC mit dessen oberflächlichen Schichten (Amaral, 1993; Gloveli et al., 1999), welche ihrerseits über die Area dentata in den Hippokampus projizieren, wird die entorhinal-hippokampale Schleife geschlossen. Darüber hinaus entsenden die Area CA1 und das Subikulum Fasern in verschiedene Areale des präfrontalen Kortex (White et al., 1990; Jay und Witter, 1991). Die subkortikalen Efferenzen der hippokampalen Formation umfassen Projektion der Area CA1 und des Subikulums zu septalen Kernen (Witter et al., 1989) sowie Fasern des Subikulums zum Nucleus accumbens, zum Thalamus, zur Amygdala sowie zum Hypothalamus (Canteras und Swanson, 1992; Herman et al., 1992).

Die hippokampale Formation ist somit auf vielfältige Weise in kortikale und subkortikale Schaltkreise eingebunden. Zudem existiert ein enge reziproke Verschaltung zwischen EC und hippokampaler Formation. Da diese Hirnregionen als die wesentlichen anfallsauslösende Strukturen der mesialen TLE angesehen werden, ist deren Interaktion von wesentlicher Bedeutung sowohl für die Generierung als auch die Ausbreitung mesialer Temporallappenanfälle. Insbesondere dem Subikulum kommt aufgrund seiner vielfältigen kortikalen und subkortikalen Efferenzen eine wesentliche Rolle in der Ausbreitung hippokampaler Anfälle zu.


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2.3.  Der entorhinale Kortex

Der EC besetzt eine Schlüsselposition im limbischen System. Er spielt eine wesentliche Rolle in der Verarbeitung neokortikaler Informationen und deren Weiterleitung zum Hippokampus, aber auch zum frontalen Kortex. Es wird angenommen, das der EC eine wichtige Funktion für das Kurzzeitgedächtnis sowie die Übertragung von Informationen in das Langzeitgedächtnis besitzt (Suzuki, 1999; Eichenbaum et al., 1994). Im Rahmen der TLE kommt dem EC eine wesentliche Bedeutung zu. Diese Region zeigt sowohl beim Patienten mit TLE als auch in verschiedenen TLE-Modell des Tieres eine erhöhte Anfallsbereitschaft (Spencer und Spencer, 1994; Rutecki et al., 1989; Collins et al., 1983; Dasheiff und McNamara, 1982). Neuroradiologische und neuropathologische Untersuchungen bei Patienten mit TLE haben Atrophien sowie Zelluntergänge im Bereich des EC beschrieben (Bernasconi et al., 1999; Bernasconi et al., 2001; Du et al., 1993). Des weiteren wurde gezeigt, daß raumfordernde Prozesse in der extrahippokampalen Region bei Patienten ohne Ammonshornsklerose ebenfalls Temporallappenanfälle verursachen können (Spencer, 1994; Lévesque et al., 1991; Kim et al., 1990). Darüber hinaus haben klinische Untersuchungen eine Beteiligung des EC am Anfallsleiden ergeben (Rutecki et al., 1989; Wilson et al., 1990).

Der EC besteht im Gegensatz zum Hippokampus aus sechs Schichten, die vereinfacht in oberflächliche und tiefe Schichten unterteilt werden. Zum einen projizieren die tiefen Schichten des EC zu dessen oberflächlichen Schichten. Zum anderen existieren in der Schicht V rekurrente erregende Verbindungen, welche mit der erhöhten Anfallsneigung des EC in Verbindung gebracht werden. Sowohl die oberflächlichen als auch die tiefen Schichten des EC besitzen Glutamatrezeptoren vom NMDA- und non-NMDA-Typ, wobei eine hochfrequente, repetitive synaptische Stimulation zur Aktivierung NMDA-Rezeptoren führt, welche zu einer gesteigerten Erregbarkeit führt (Heinemann et al., 1993). Elektrophysiologische in vitro Untersuchungen haben die Beteiligung des EC an epileptiformen Anfallsereignissen (Jones und Heinemann, 1988; Jones und Lambert, 1990a; Paré et al., 1992; Behr et al., 1996a; Bertram et al., 1998; Scharfman, 1996) unterstrichen. Sie zeigen, daß die epileptiforme Aktivität vorwiegend in den tiefen Schichten des EC generiert wird (Walther et al., 1986; Jones und Heinemann, 1988; Jones et al., 1992) und synchronisierte Entladungen in den oberflächlichen Schichten induziert (Jones und Lambert, 1990a; Jones und Lambert, 1990b).


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2.4.  Die Area dentata

Bisherige Untersuchungen zur Interaktion zwischen EC und hippokampaler Formation haben sich vornehmlich mit der Projektion des EC zur Area dentata sowie mit intrinsischen Veränderungen der Area dentata befaßt (Schwartzkroin, Ribak et al. 1993, 1992). Die Area dentata besteht aus drei Schichten: Die äußere Schicht, das Stratum moleculare, wird von den apikalen Dendriten der Körnerzellen gebildet. In den äußeren zwei Drittel dieser Schicht enden die Axone der oberflächlichen Zellen des EC (Amaral und Witter, 1995). Das innere Drittel des Stratum moleculare wird vorwiegend von kommissuralen, assoziativen und septalen Fasern innerviert und erhält zudem Eingänge der tiefen Schichten des EC (Deller et al., 1996; Gloveli et al., 2001). Die mittlere Schicht, das Stratum granulosum, wird von den Somata der Körnerzellen gebildet. Das Stratum granulosum umgibt die innere Schicht der Area dentata, welche als Hilus bezeichnet wird und eine Vielzahl polymorpher exzitatorischer und inhibitorischer Zellen enthält. Aufgrund einer hohen Erregungsschwelle wird der Area dentata eine Filterfunktion zugesprochen, welche die Ausbreitung hochfrequenter bzw. epileptischer Aktivität vom EC zum Hippokampus unterbindet (Alger und Teyler, 1976; McNaughton et al., 1981; Heinemann et al., 1992; Lothman et al., 1992; Finnerty et al., 2001). Neben den spezifischen Membraneigenschaften der Körnerzellen scheint insbesondere die Aktivierung inhibitorischer Regelkreise für die geringe Erregbarkeit verantwortlich zu sein (Lothman, 1994). Im Rahmen der Ammonshornsklerose ist die Area dentata nur wenig von Zelluntergängen betroffen (Sloviter, 1994). Sowohl bei der TLE des Menschen (Babb et al., 1991; De Lanerolle et al., 1989; Houser et al., 1990; Sutula et al., 1989) als auch in verschiedenen TLE-Tiermodellen (Nadler et al., 1980; Cronin und Dudek, 1988; Mathern et al., 1992; Mathern et al., 1993; Okazaki et al., 1995; Isokawa et al., 1993) bilden die von den Körnerzellen der Area dentata ausgehenden Moosfasern Axonkollateralen, welche neue synaptische Kontakte in der inneren Molekularschicht der Area dentata bilden. Tauck und Nadler (Tauck und Nadler, 1985) konnten durch den Nachweis einer Doppelpuls Potenzierung erstmals zeigen, daß das Sprossen von Moosfasern mit einer erhöhten Erregbarkeit der Area dentata einhergeht. Seitdem wurden verschiedenste in vitro und in vivo Untersuchungen durchgeführt, welche ebenfalls einen pathophysiologischen Zusammenhang zwischen dem Moosfasersprossen (MFS) und der erhöhten Erregbarkeit der Area dentata bzw. der erhöhten Bereitschaft zu spontanen limbischen Anfällen zeigen (McNamara, 1994; Dudek und Spitz, 1997; Cronin und Dudek, 1988; Wuarin und Dudek, 1996; Golarai und Sutula, 1996; Patrylo und Dudek, 1998; Lynch und Sutula, 2000; Molnar und Nadler, 1999). Diese Daten sind von besonderer klinischer Bedeutung, da auch in humanen Hippokampi von [Seite 16↓] Patienten mit TLE vergleichbare morphologische Befunde und eine gesteigerte Erregbarkeit der Area dentata gefunden wurden (Isokawa et al., 1991; Masukawa et al., 1992). Die Hypothese, daß MFS limbische Anfälle fördert wird allerdings von einigen Autoren in Frage gestellt (Ribak und Peterson, 1991; Sloviter, 1992). So konnte in TLE-Tiermodellen gezeigt werden, daß eine anfänglich verminderte GABAerge Inhibition im Bereich der Area dentata mit Bildung von MFS kontinuierlich wieder zunimmt und schließlich sogar verstärkt sein kann (Nusser et al., 1998; Buhl et al., 1996; Buckmaster und Dudek, 1997). Zudem ist bekannt, daß bei mit Pilokarpin bzw. Kainat behandelten Tieren spontane Anfälle bereits vor der MFS auftreten, nicht jedes Tier mit MFS Anfälle zeigt und schließlich selbst bei Tieren, bei denen MFS mit Hilfe eines Proteinsynthesehemmers unterdrückt wurde epileptische Anfälle auftreten (Longo und Mello, 1997; Longo und Mello, 1998). Diese Befunde sprechen dafür, daß MFS eher einen kompensatorischen Mechanismus darstellt.

Neben den beschriebenen Veränderungen auf Netzwerkebene treten Veränderungen auf zellulärer Ebene auf (McNamara, 1994; McNamara, 1995). Diese betreffen insbesondere die Rezeptoreigenschaften des exzitatorischen glutamatergen und des inhibitorischen GABAergen Systems. Einen besonderen Stellenwert nehmen Veränderungen der NMDA-Rezeptoren ein. So konnte in der Area dentata des TLE-Tiermodells eine deutliche Hochregulation und erhöhte Sensitivität des NMDA-Rezeptors gezeigt werden (Mody und Heinemann, 1987; Köhr und Mody, 1994; Mody et al., 1988; Köhr et al., 1993; Mody und Lieberman, 1998). Diese Befunde tragen erheblich zu der gesteigerten Erregbarkeit im epileptischen Gewebe bei.

2.5. Das Subikulum

Das Subikulum ist die wesentliche Ausgangsstruktur der hippokampalen Formation und leitet neuronale Information der Area CA1 in verschiedene kortikale und subkortikale Hirnregionen (Hampson et al., 2000). Darüber hinaus erhält es temporoammonische Afferenzen aus der Schicht III des EC (Witter et al., 1989). Das Subikulum besteht aus drei Schichten: Die Molekularschicht, welche aus den Dendriten der subikulären Pyramidenzellen besteht, entspricht dem Stratum lacunosum moleculare sowie dem Stratum radiatum der Area CA1. Das Stratum pyramidale besteht aus einem breiten Zellband von Pyramidenzellen. Die oberflächliche Schicht, dem Alveus angrenzend, besteht schließlich aus polymorphen Zellen. Darüber hinaus liegen, zwischen den Pyramidenzellen verteilt, kleinere Zellen, welche als Interneurone angesehen werden. Die Rolle des Subikulums in der TLE ist bislang unklar. Allerdings konnte gezeigt werden, daß im Rahmen der Ammonshornsklerose im Subikulum [Seite 17↓] nur wenig Zelltod auftritt (Babb et al., 1984; Babb und Pretorius, 1993; Pitkänen et al., 1995; Sloviter, 1994) während die Area CA1 aufgrund der Zelluntergänge teilweise nicht mehr nachweisbar ist. Da die hippokampale Formation eine wesentliche Struktur in der Ictogenese ist, scheint das Subikulum somit als verbleibende Struktur eine Schlüsselposition in der Anfallsgenerierung zu besitzen.

2.6. Pathophysiologie der Epilepsien

In einer vereinfachten Betrachtungsweise ist die Entstehung fokaler epileptischer Aktivität auf eine Störung des Gleichgewicht zwischen neuronaler Erregung und Hemmung zurückzuführen. Dieses Gleichgewicht kann auf zwei verschiedenen Ebenen betroffen sein: zum einen auf der intrinsischen Ebene, zum anderen auf der synaptischen Ebene (Heinemann und Eder, 1997). Die intrinsische Erregbarkeit der Zelle wird durch hemmende K+ - und Cl- -Kanäle sowie erregende Na+ - und Ca2+ -Kanäle bestimmt. Veränderungen der Leitfähigkeit dieser Kanäle wie auch Veränderungen des extrazellulären Ionenmileaus können deswegen zu einer Erregbarkeitssteigerung der Zelle führen.

Die synaptische Erregbarkeit der Zelle wird durch die Aktivierung hemmender und erregender Rezeptoren bestimmt. Der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter des Gehirns ist Gamma-Amino-Buttersäure (GABA). Derzeit werden zwei GABA Rezeptoren unterschieden, der GABAA - und der GABAB -Rezeptor. Zudem wird eine Isoform des GABAA -Rezeptors als GABAC -Rezeptor bezeichnet (Cutting et al., 1991). Der GABAA -Rezeptor ist ein ligandengesteuerter Ionenkanal, der vorwiegend für Cl- Anionen, in geringerem Umfang allerdings auch für HCO3- -Ionen durchlässig ist. Der GABAB -Rezeptor gehört zu der Klasse der metabotropen Rezeptoren. Neben einer postsynaptischen Erhöhung der K+ -Leitfähigkeit vermittelt er präsynaptisch eine Autoinhibition durch eine Verminderung der Freisetzungswahrscheinlichkeit GABAerger Vesikel (Misgeld et al., 1995).

Der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter des Gehirns ist Glutamat. Glutamat Rezeptoren lassen sich in vier Klassen unterteilen: die ligandengesteuerten ionotropen NMDA-, AMPA- und Kainat-Kanäle sowie die metabotropen Glutamat-Rezeptoren. Der NMDA-Rezeptor läßt sich aufgrund seiner besonderen Eigenschaften von den anderen Rezeptorklassen abgrenzen (Collingridge und Watkins, 1994; McBain und Mayer, 1994): Zum einen ist der Rezeptorkanal bei Membranpotentialen nahe dem Ruhemembranpotential durch Mg2+ blockiert. Durch Depolarisierung wird der Kanal geöffnet und für Ca2+ durchlässig. Die sekundäre Aktivierung biochemischer Kaskaden führt zu lang andauernden Veränderungen der Erregbarkeit der Zelle. Zudem scheint der Rezeptor an der Induktion [Seite 18↓] synaptischer Plastizität beteiligt zu sein. Aufgrund dieser Eigenschaften wird diesem Rezeptor eine bedeutende Rolle in der Epileptogenese zugeschrieben.

Auf der Netzwerkebene scheint eine nach Zelluntergängen induzierte Synaptogenese zu einer veränderten Erregbarkeit neuronaler Strukturen zu führen. Sowohl im Gewebe von Patienten mit chronischer TLE (Du et al., 1993; Babb und Brown, 1987; Babb et al., 1984) als auch in verschiedenen TLE-Modellen des Tieres (Ben-Ari et al., 1986; Du et al., 1995; Nadler et al., 1978) kommt es zu erheblichen Zellverlusten in der Hilusregion, der Area CA3 und CA1 sowie der Schicht III des EC. Diese Zelluntergänge gehen teilweise mit axonalem Sprossen einher, welches besonders auffällig im Bereich der Area dentata ist und für eine erhöhte Erregbarkeit der Struktur verantwortlich gemacht wird.

Die Entstehung und Ausbreitung epileptischer Aktivität ist somit die Folge einer Kombination von Veränderungen auf zellulärer Ebene und auf Netzwerkebene. Während die Erregbarkeit einer Zelle wesentlich durch ihre Membraneigenschaften sowie ihre exzitatorischen und inhibitorischen Rezeptoren bestimmt wird, ist für die Integration einer Zelle in ein synchronisiertes epileptiformes Entladungsmuster eine rekurrente Verschaltung wesentlich. Darüber hinaus spielen ephaptische Verbindungen zwischen den Zellen sowie die gliale Pufferung des extrazellulären K+ -Konzentration eine bedeutende Rolle in der Synchronisierung neuronaler Aktivität.

2.7.  Kindling: Ein in vivo Modell der Temporallappenepilepsie

Kindling ist ein Phänomen, bei dem die wiederholte Elektrostimulation einer umschriebenen Hirnregion zu einer zunehmenden Erregbarkeit des Gehirns mit nachfolgenden fokalen und sekundär generalisierten epileptischen Anfällen führt. Auch nach einjähriger Pause der Elektrostimulation führt eine erneute Stimulation zu einem erneuten Anfallsereignis. Dieser Effekt wurde erstmals von Delgado (Delgado und Sevillano, 1961) beobachtet und schließlich von Goddard (Goddard et al., 1969; Goddard, 1967) systematisch beschrieben. Kindling ist heute ein etabliertes Tiermodell für die Untersuchung neuronaler Plastizität. Die in diesem Modell zu beobachtende Plastizität ist nicht nur in der Epileptogenese von Relevanz, sondern gibt Auskunft über basale Mechanismen des Lernens und des Gedächtnisses. Wenngleich Kindling in verschiedenen Hirnregionen möglich ist (mit wenigen Ausnahme wie z.B. des Kleinhirns) sind das Amygdala- und Kommissurenfasern-Kindling die am häufigsten eingesetzten Methoden. In die Amygdala lassen sich aufgrund ihrer Größe die Stimulationselektroden leicht stereotaktisch implantieren. Zudem zeigt diese Struktur eine niedrige Erregungsschwelle und führt somit aufgrund ihrer anatomischen Lage schnell zu [Seite 19↓] standardisierten Temporallappenanfällen. Das Kindling der Kommissurenfasern bietet den Vorteil, daß das limbische System beidseitig stimuliert wird. Die in vitro Untersuchungen der entorhinal-hippokampalen Hirnschnitte gekindelter Tiere bieten einen Einblick in die zellulären Mechanismen der Generierung und Ausbreitung limbischer Anfälle.

2.8.  In vitro Epilepsiemodelle

Durch Veränderung des extrazellulären Ionenmileaus lassen sich in Hirnschnittpräparaten epileptiforme Entladungen induzieren. Sowohl die Erhöhung der K+ -Konzentration als auch die Erniedrigung der Ca2+ - oder Mg2+ -Konzentration führt zu epileptiformer Aktivität, welche elektrographisch den EEG-Aufzeichnungen eines epileptischen Anfalls beim Menschen ähnelt. Die Erhöhung der K+ -Konzentration führt über eine Veränderung des K+ -Gleichgewichtspotentials und Reduktion von K+ -Auswärtsströmen zu einer Verschiebung des Ruhemembranpotentials in depolarisierende Richtung, was eine erhöhte Erregbarkeit der Neurone bedingt. Die Abnahme der extrazellulären Mg2+ -Konzentration führt zu einer Negativierung des zellulären Oberflächenpotentials. Dadurch wird das transmembranöse Potential in depolarisierende Richtung verschoben. Zudem wird der Mg2+ -Block des NMDA Rezeptors aufgehoben und es tritt eine erleichterte Aktivierung von Ca2+ -Strömen sowie eine Zunahme der Transmitterfreisetzung auf (Hamon et al., 1987; Heinemann und Jones, 1990). Die im Niedrig-Mg2+ -Epilepsiemodell ausgelöste epileptiforme Aktivität zeigt sowohl hinsichtlich der Region als auch im zeitlichen Verlauf unterschiedliche Formen: Während in der Area CA3 und Area CA1 des adulten Hippokampus kurze rekurrente Entladungen auftreten, zeigen sich im Subikulum sowie im EC bis zu 60 Sekunden andauernde tonisch-klonische Entladungen (Walther et al., 1986; Jones und Heinemann, 1988; Dreier und Heinemann, 1991). Diese epileptiforme Aktivität geht nach ca. 30-60 min in kurze rekurrente Entladungen über, welche mit derzeit gebräuchlichen Antikonvulsiva nicht beeinflußbar sind (Dreier und Heinemann, 1990; Zhang et al., 1995). Neben den beschriebenen Veränderungen der extrazellulären Ionenkonzentrationen führt die Applikation von GABAA -Rezeptorantagonisten ebenfalls zu einer Steigerung der Erregbarkeit mit nachfolgenden epileptiformen Entladungen.


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2.9.  Fragestellungen

Die vorliegenden Arbeit geht der Frage nach, ob im chronisch epileptischen Gewebe Veränderungen der funktionellen Interaktion zwischen EC und Hippokampus auftreten, die für die Pathogenese der TLE wesentlich sind. Folgende konkrete Fragestellungen ergeben sich daraus:

  1. Breiten sich epileptiforme Anfallsereignisse des EC im chronisch epileptischen Gewebe (Kindling-Modell) über die Area dentata leichter in den Hippokampus aus als im Gewebe des gesunden Tieres.
  2. Wenn ja, welche Rolle spielen die exzitatorischen Glutamat-Rezeptoren (NMDA-R, AMPA-R, Kainat-R) in dem veränderten Ausbreitungsverhalten epileptiformer Aktivität.

Aufgrund funktionell anatomischer Gesichtspunkte ist das Subikulum als „Exit“ der hippokampalen Formation von wesentlicher Bedeutung für das Ausbreitungsverhalten hippokampaler Temporallappenanfälle. Folgende Fragestellungen wurden diesbezüglich behandelt:

  1. Verfügt das Subikulum über Membran- und Netzwerkeigenschaften, welche zu der Generierung epileptiformer Aktivität prädisponieren? Welche Veränderungen der Membraneigenschaften zeigen subikuläre Neurone im chronisch epileptischen Gewebe (Kindling-Modell)?
  2. Wie ist das Subikulum synaptisch in den entorhinal-hippokampalen Komplex eingebunden? Welche synaptischen Eigenschaften besitzt die temporoammonische Projektion des EC zum Subikulum? Ist der Informationstransfer vom EC zum Hippokampus über diese Projektion im chronisch epileptischen Tier verändert?
  3. Welchen modulatorischen Einfluß hat Dopamin auf die Membraneigenschaften sowie die synaptische Transmission subikulärer Zellen?


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2.10.  Methoden

2.10.1.  Hirnschnittpräparation und elektrophysiologische Ableittechniken

Die Experimente wurden an kombinierten entorhinal-hippokampalen Hirnschnitten der Wistar-Ratte durchgeführt. Die 400 µM dicken Hirnschnitte enthielten den Hippokampus einschließlich Subikulum, Prä- und Parasubiculum, den entorhinalen und perirhinalen Kortex sowie Anteile des temporalen Kortex. Die elektrophysiologischen Untersuchungen der Hirnschnitte wurden in einer Interface-Kammer durchgeführt, welche kontinuierlich begast (95% O2 – 5% CO2) und mit einer vorgewärmte (34oC) artifiziellen zerebrospinalen Flüssigkeit (ACSF) perfundiert wurde. Als Ableitungstechniken wurden Feldpotentialmessungen, intrazelluläre Einzelzellableitungen mit scharfen Mikroelektroden sowie Patch-clamp-Ableitungen eingesetzt. Die Feldpotentialmessungen dienten der Aufzeichnung epileptiformer Aktivität sowie durch Elektrostimulation ausgelöster transienter Feldpotentialänderungen. Intrazelluläre und Patch-clamp Ableitungen wurden zur Erfassung der intrinsischen Membraneigenschaften sowie der evozierten exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP bzw. IPSP) und Ströme (EPSC bzw. IPSC) einzelner Neurone eingesetzt. Während die intrazellulären Ableitungen sowohl im Brücken- und Strommklemm-Modus als auch im Spannungsklemm-Modus durchgeführt wurden, wurde die Patch-clamp Technik ausschließlich in der Spannungsklemme eingesetzt. Die Patch-clamp Technik wurde zudem für die Aufzeichnung spontaner Ca2+-abhängiger und Ca2+-unabhängiger (sog. Miniatur-EPSCs bzw. -IPSCs) postsynaptischer Ströme genutzt. Die Stimulation mittels Doppelreizung bzw. repetitiver Reizung diente der Erfassung des Potenzierungs- oder Habituierungsverhalten der synaptischen Potentiale.

2.10.2.  Pharmaka

Die pharmakologische Isolierung inhibitorischer und exzitatorischer postsynaptischer Potentiale erfolgte durch Einsatz folgender Antagonisten: Applikation des GABAA-Rezeptorantagonisten Bicuculline (BCM) (5-10 µM) und des GABAB-Rezeptorantagonisten CGP-55845A (2 µM) in Kombination mit dem NMDA-Rezeptorantagonisten 2-amino-5-phosphonovaleric acid (APV) (30-60 µM) oder dem Non-NMDA-Rezeptorantagonisten 6-nitro-7-sulphamoylbenzo(f)quinoxaline-2,3-dione (NBQX) (10 µM) ermöglichte die Charakterisierung der isolierten exzitatorischen AMPA- bzw. NMDA-Rezeptor-EPSPs/Cs. Stimulation in weniger als 0.2 mm Abstand von der abzuleitenden Zelle unter Perfusion des Hirnschnittes mit APV und NBQX diente der Isolierung monosynaptischer inhibitorischer Antworten. Zur isolierten Aktivierung der Kainat-Rezeptoren wurde statt des nicht selektiven [Seite 22↓]Non-NMDA-Rezeptorantagonisten NBQX der selektive AMPA-Rezeptorantagonist SYM2206 (100 µM) eingesetzt. Die Aufzeichnungen der spontanen postsynaptischen Potentiale erfolgte unter Applikation des Na+-Kanalblockers Tetrodotoxin (TTX, 1µM).

2.10.3.  In vitro Epilepsiemodelle

Die Versuche zur Untersuchung der Induktion und des Ausbreitungsverhaltens epileptiformer Aktivität wurden zum einen im Niedrig-Mg2+ Epielepsiemodell durchgeführt, welches nach einer Auswaschzeit von ca. 30 Minuten die Generierung elektrographischer Anfallsereignisse im Hirnschnittpräparat erlaubt. Zum anderen wurde mit Hilfe einer lokalen Perfusionseinrichtung ein epileptiformer Fokus im EC induziert. Diese Methode ermöglichte uns die elektrophysiologische Untersuchung von Projektionsarealen des EC ohne diese mit dem epileptogenen Agens zu perfundieren. Die Perfusion erfolgte mit Hilfe eines Thetaglases, über welches das disinhibierende Medium (50 µM BCM, 10 mM KCl gelöst in ACSF) lokal appliziert und gleichzeitig abgesogen wurde, so daß es zu keiner Ausschwemmung des Mediums in angrenzende Areale kam. Die Ausschwemmung wurde durch eine jedem Experiment vorausgehende lokale Perfusion des Glutamat-Rezeptorantagonisten Kynurinsäure (5 mM) ausgeschlossen. Kam es nach Applikation von Kynurinsäure nicht zu einer Veränderung der Feldpotentiale im Projektionsareal, so konnte eine Ausbreitung des applizierten Mediums ausgeschlossen werden.

2.10.4.  Kindling-Modell

Bipolare Elektroden wurden unter Barbituratnarkose in die linke Amygdala oder in die Kommissurenfasern implantiert. Nach einer postchirurgischen Erholungsphase von sieben bis acht Tagen wurden die Tiere täglich hochfrequent (60 Hz) über die Elektroden für eine Sekunde mit einem biphasischen Strompuls (150 µA) stimuliert. Die im Verlauf des Kindlings auftretenden Änderungen der Anfallssemiologie wurden gemäß der Skala nach Racine eingestuft (Racine, 1972). Die Tiere wurden täglich stimuliert bis mindestens 15 aufeinanderfolgende Anfälle des Stadiums 5 ausgelöst werden konnten.


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14.01.2004