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3.  Eigene Arbeiten

3.1.  Interaktion zwischen entorhinalem Kortex und Hippokampus

3.1.1.  Ausbreitungsverhalten epileptiformer Aktivität

Der entorhinal-hippokampale Hirnschnitt bietet aufgrund der teilweise gut erhaltenen Konnektivitäten die Möglichkeit, das Ausbreitungsverhalten epileptiformer Aktivität zu untersuchen (Boulton et al., 1992). Bisherige Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem EC und dem Hippokampus ließen vermuten, daß unter physiologischen Bedingungen die Area dentata eine Filterfunktion übernimmt und die Übertragung epileptiformer Aktivität vom EC zum Hippokampus unterbindet. Im EC des in vitro Hirnschnittpräparates können durch Erniedrigung der extrazellulären Mg2+ -Konzentration spontane epileptiforme Entladungen induziert werden (Walther et al., 1986; Jones und Heinemann, 1988; Stanton et al., 1987). Mit Hilfe dieses Epilepsiemodells haben wir zunächst das Ausbreitungsverhalten epileptiformer Aktivität vom EC zur Area dentata und Area CA3 in Kontrolltieren sowie in chronisch epileptischen Tieren nach Amygdala-Kindling untersucht (Ref. 1). Während im Kontrolltier keine Ausbreitung entorhinaler epileptiformer Aktivität in den Hippokampus stattfand, kam es in der Area dentata und der Area CA3 des chronisch epileptischen Tieres zu einer Beteiligung elektrographischer Anfallsereignisse. Demzufolge scheint im gekindelten Tier die beschriebene Filterfunktion der Area dentata (Alger und Teyler, 1976; McNaughton et al., 1981; Heinemann et al., 1992; Lothman et al., 1992) aufgehoben zu sein. Da mit dieser Methode im gesamten Hirnschnitt die extrazelluläre Mg2+ -Konzentration erniedrigt wird, trifft die sich ausbreitende epileptiforme Aktivität immer auf ein bereits entladungsbereites neuronales Netzwerk. Um diesen methodischen Nachteil zu umgehen, haben wir eine Methode zur lokalen Perfusion eines disinhibierenden Mediums eingesetzt (s. Methodenteil). Diese Methode erlaubt es uns, einen eng umschriebenen epileptiformen Herd im Hirnschnitt zu induzieren (Ref. 2). Wir konnten zeigen, daß unter tonischer Disinhibition des EC die Area dentata gekindelter Tiere ein deutlich erhöhte Erregbarkeit aufweist. Zudem breiteten sich die im EC dieser Tiere induzierten epileptiformen Anfallsereignisse mit kurzer Latenz in die Area dentata aus (Abb. 2). Auch diese Experimente zeigen, daß im chronisch epileptischen Tier die der Area dentata zugeschriebene Filterfunktion aufgehoben ist und die ungehinderte Ausbreitung entorhinaler epileptiformer Aktivität in den Hippokampus ermöglicht. Neben den eingangs beschriebenen morphologischen Veränderungen (MFS) scheinen insbesondere Veränderungen der glutamatergen Neurotransmission für die Aufhebung der Filterfunktion verantwortlich zu sein (Ribak et al., 1992; Schwartzkroin, 1993).


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3.1.2.  Die Rolle des NMDA-Rezeptors in der Fortleitung epileptiformer Aktivität

Da der glutamaterge NMDA-Rezeptor eine zentrale Rolle in der Induktion verschiedener Formen nutzungsabhängiger Plastizität besitzt, ist er von wesentlichem Interesse in der Epileptogenese. Unsere Untersuchungen an Körnerzellen der Area dentata ergaben 48 Stunden nach dem letzten epileptischen Anfall eine Zunahme der NMDA-EPSCs (Ref. 3).

Abb. 2 : Ausbreitung epileptiformer Aktivität vom EC zur Area dentata (DG)

Nach fokaler Applikation eines disinhibierenden Mediums (50 µM Bicuculline, 10 mM KCl) wird spontane epileptiforme Aktivität im EC des Kontrolltieres sowie des gekindelten Tieres induziert. Während im Kontrolltier keine Ausbreitung der Aktivität in die Area dentata stattfindet, treten im Kindling-Modell nach kurzer Latenz synchrone Entladungen in der Area dentata auf.


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Abb. 3 : Simultane Feldpotential- und Einzelzellaufzeichnungen in der Area dentata des Kontrolltieres und des Kindling-Modells während hochfrequenter Doppelreizung

Im Kontrolltier führt Doppelreizung mit 100 Hz zu einer Depression der zweiten evozierten Antwort. Demgegenüber zeigt sich in Tieren des Kindling-Modells (24 h nach dem letzten Anfall) eine deutliche Potenzierung der Antworten in Form eines Populations-Spikes (extrazelluläre Ableitung, oben) bzw. eines Aktionspotentials (intrazelluläre Ableitung, Aktionspotential abgeschnitten, unten) (A). Normalisierte Aufzeichnungen von evozierten EPSCs in beiden Untersuchungsgruppen zeigen eine deutlich verlängerte Kinetik der exzitatorischen Einwärtsströme (in Gegenwart von GABAA - und GABAB -Antagonisten) im Kindling-Modell (B).

Der relative Anteil der AMPA-EPSCs nahm im epileptischen Tier zeitgleich ab, ein Befund der am ehesten durch den Zuwachs der NMDA-EPSCs zu erklären ist. Funktionelle postsynaptische Kainat-Rezeptoren konnten wir weder im Kontrolltier noch im epileptischen Tier nachweisen. Die Veränderungen der NMDA-Rezeptorleitfähigkeit führte zu einer verlängerten Kinetik der exzitatorischen Antworten und somit zu einer initialen Faszilitierung hochfrequenter reizevozierter EPSPs (20-100 Hz) in den Körnerzellen der Area dentata (Abb. 3). Die Depression der während einer tonischen Stimulation nachfolgenden EPSPs war insensitiv gegenüber GABAA - und GABAB -Rezeptorantagonisten und ist somit am ehesten durch eine Entleerung der präsynaptischen Glutamat-Vesikel zu erklären (Galarreta und Hestrin, 1998; Zucker, 1989; Liu und Tsien, 1995; Ryan und Smith, 1995; Silver et al., 1998). Elektrographische Anfallsereignisse des EC zeigen in der initialen tonischen Phase ebenfalls [Seite 26↓] hochfrequente Entladungen mit einem vergleichbarem Frequenzspektrum. Diese Ergebnisse legen nahe, daß aufgrund der im epileptischen Tier veränderten glutamatergen Neurotransmission, entorhinale Anfälle während eines kurzen Zeitfensters (≤ 50ms) die Area dentata überwinden können und in den Hippokampus weitergeleitet werden. Vier Wochen nach dem letzten Anfallsereignis waren die beschriebenen Veränderungen der NMDA-Rezeptorkanäle allerdings nicht mehr nachweisbar. Die Anteile der NMDA- und AMPA-EPSCs entsprachen denen der Kontrolltiere. Dieser Befund legt nahe, daß die postiktual auftretenden Veränderungen der NMDA-Rezeptoren eher in der Epileptogenese als in der Iktogenese eine Rolle spielen.

3.1.3.  Die Rolle der Kainat-Rezeptoren in der Area dentata

Weder in Kontrolltieren noch in chronisch epileptischen Tieren (Kindling-Modell) konnten wir aktivierbare Kainat-Rezeptoren in Körnerzellen der Area dentata nachweisen (Ref. 3). Diesen, primär exzitatorischen Rezeptoren, wird allerdings seit kurzer Zeit eine wesentliche Rolle in der Regulation inhibitorischer Interneurone zugesprochen. Der zugrundeliegende Mechanismus wird derzeit kontrovers diskutiert (Lerma et al., 2001). Eine reduzierte GABA-Freisetzung inhibitorischer Interneurone würde zu einer Disinhibition der Körnerzellen führen. Wir konnten zeigen, daß in gekindelten Tieren die Aktivierung interneuronaler Kainat-Rezeptoren zu einer deutlich stärkeren Verminderung der eIPSCs in Körnerzellen führt als in Kontrolltieren (Ref. 4, Abb. 4). Da auch spontane Ca2+ - unabhängiger Miniatur-IPSCs eine Reduzierung ihrer Frequenz, nicht aber ihrer Amplitude zeigten, ist von einem präsynaptischen, die Terminale modulierenden Mechanismus auszugehen. Die Aktivierung von Kainat-Rezeptoren, welche sich auf den Terminalen inhibitorischer Interneurone befinden, scheinen über einen metabotropen, bislang nicht gänzlich geklärten Mechanismus die GABA-Freisetzung zu reduzieren. Über diesen Mechanismus kann der während eines epileptischen Anfalls vermehrt freigesetzte exzitatorische Neurotransmitter Glutamat die GABAerge Inhibition vermindern und somit die Erregbarkeit der Area dentata steigern.


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Abb. 4: Kindling verstärkt die über Kainat-Rezeptoren vermittelte Depression GABAerger Inhibition in Körnerzellen der Area dentata

Badapplikation von Glutamat (100 µM) in der Gegenwart von NMDA- und AMPA-Rezeptorantagonisten (APV, NBQX) führt in Tieren des Kindling-Modells zu einer signifikant stärkeren Depression monosynaptisch evozierter GABAA -Rezeptorströme (auf ~50% der Ausgangswerte) als in Kontrolltieren (auf ~80% der Ausgangswerte).


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3.2.  Die Rolle des Subikulums in der Temporallappenepilepsie

Die Semiologie limbischer Anfälle ist nicht ausschließlich durch die Anfallsgenerierung eines epileptogenen Fokus, sondern vielmehr durch die Ausbreitung der epileptischen Aktivität charakterisiert. Sekundär generalisierende Temporallappenanfälle durchlaufen die hippokampale Schleife, um schließlich über das Subikulum in andere kortikale und subkortikale Hirnareale weitergeleitet zu werden. Unter funktionell anatomischen Gesichtspunkten ist diese Struktur somit von besonderer Bedeutung für die Generierung und Weiterleitung hippokampaler Anfälle. Zudem verfügen subikuläre Zellen über intrinsische Eigenschaften, welche epileptiforme Entladungen begünstigen.

Während ca. 2/3 aller Zellen auf depolarisierende Pulse (20 ms) mit einem burst von 3-5 Aktionspotentialen antworten (sog. burst-spiking Zellen), antworten die übrigen Zellen mit nur einem Aktionspotential (sog. regular-spiking Zellen) (Abb. 5).

Abb. 4 : Membraneigenschaften subikulärer Neurone

Spannungskurven und Entladungsverhalten von burst-spiking (links) und regular-spiking (rechts) Zellen bei hyper- und depolarisierenden Strompulsen. Burst-spiking Zellen zeigen initial einen Burst von 3-5 Aktionspotentialen mit nachfolgenden einzelnen Aktionspotentialen, welche im Gegensatz zu regular-spiking Zellen keine Akkomodation aufweisen.


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Abb. 5 : Epileptiforme Aktivität im Subikulum

Nach ca. 30 Minuten Auswaschzeit der Mg2+ -Ionen treten im isolierten Subikulum der Ratte epileptiforme Anfallsereignisse auf, welche aus einer initialen tonischen und nachfolgenden klonischen Phase bestehen und bis zu 60 Sekunden andauern können.

Ein wesentliches Unterscheidungsmerkmal beider Zelltypen ist die fehlende Aktionspotential-Akkomodation und langsame Nachhyperpolarisation der burst-spiking Zellen während bzw. nach einer längeren Depolarisation (z.B. 500-1000 ms) (Ref. 5). Regular-spiking Zellen zeigen dem entgegen eine deutliche Akkomodation ihrer Aktionspotentiale sowie eine am ehesten Ca2+ -abhängige langsame Nachhyperpolarisation. Beide Zelltypen zeichnen sich während hyperpolarisierender Ströme durch einen gleichrichtenden Einwärtsstrom aus. Nach Beendigung hyperpolarisierender Ströme kommt es bei beiden Zelltypen zu einer Nachdepolarisation, die zur Auslösung einzelner Aktionspotentiale oder Bursts von Aktionspotentialen führen kann.

3.2.1.  Das Subikulum im Epilepsiemodell

Wir haben gezeigt, daß das Subikulum im in vitro Epilepsiemodell (Niedrig Mg2+ -Modell) eine Bereitschaft zur Generierung spontaner bis zu 60 Sekunden lang andauernder epileptiformer Entladungen besitzt (Ref. 6, Abb. 6). Diese elektrographischen Anfallsereignisse sind denen des EC in Dauer und Anfallsmuster vergleichbar und gehen nach einer Auswaschzeit des Mg2+ von 60-90 Minuten in rekurrente Entladungen von 1-3 Sekunden Dauer über. Sowohl die frühe als auch die späte epileptiforme Aktivität persistiert nach Durchtrennen der alveolären und entorhinalen Afferenzen und bedarf somit keiner externen Generatoren wie der Area CA1 oder dem EC. Diese Eigenschaft ist nach allgemeiner Auffassung auf den hohen Anteil von burst-spiking Zellen zurückzuführen (Heinemann, 1987; Jensen und Yaari, 1997). Chronisch epileptische Tiere (Kindling-Modell) besaßen einen unverändert hohen Anteil an burst-spiking Zellen (Ref. 7). Die durch eine Serie von Aktionspotentialen induzierte schnelle und langsame (nur burst-spiking Zellen) [Seite 30↓] Nachhyperpolarisation war zwei Tage nach dem letzten epileptischen Anfall in beiden Zelltypen deutlich vermindert. Diese Zunahme der intrinsischen Erregbarkeit konnten wir jedoch 28 Tage nach dem letzten Anfall in beiden Zelltypen nicht mehr nachweisen. Demzufolge spielen diese transienten Veränderung der Membraneigenschaften insbesondere in der Epileptogenese, weniger in der Ictogenese eine Rolle.

3.2.2.  Die temporoammonische Projektion des EC zum Subikulum

Neben dem bekannten alveolären Eingang der Area CA1 zum Subikulum haben wir mit intrazellulären Ableitungen erstmals die temporoammonische Projektion ausgehend von Schicht III-Zellen des EC in Kontrolltieren charakterisiert (Ref. 8). Nach Stimulation der Schicht III des medialen EC zeigten subikuläre Neurone nach einer kurzen Latenz von 2,4 bis 6,6 ms sowohl exzitatorische (AMPA/NMDA) als auch inhibitorische (GABAA /GABAB ) postsynaptische Potentiale. NMDA-EPSPs konnten bereits bei Ruhemembranpotential und einer extrazellulären Mg2+ -Konzentration von 1,8 mM ausgelöst werden. Allerdings zeigte sich eine projektionsspezifisch kleinere NMDA-Komponente nach Stimulation des Tractus perforans im Vergleich zum alveolären Eingang. Simultane Aktivierung der alveolären und entorhinalen Afferenzen führte zu eine Potenzierung der exzitatorischen Potentiale. Stimulation des alveolären Eingangs nach einer kurzen Latenz, welche der synaptischen Neurotransmission entlang der trisynaptischen hippokampalen Schleife entspricht, führte hingegen zu einer Depression der subikulären Antworten.

Die über die temporoammonische Projektion vermittelte Modulation des subikulären Informationstransfers zeigte in chronisch epileptischen Tieren (Kindling-Modell) veränderte synaptische Entladungsmuster: In Kontrolltieren konnten wir zeigen, daß hochfrequente Reizung entorhinaler Neurone der Schicht III zu schnell akkomodierenden Aktionspotentialen und einer langandauernden synaptischen Nachhyperpolarisation führt. Die Dauer dieser Nachhyperpolarisation beträgt bis zu 20 s und ist in ihrem ersten Anteil sensitiv gegenüber dem GABAB Rezeptorantagonisten CGP-55845A, in ihrem zweiten Anteil gegenüber Atropin und in ihrem letzten Anteil gegenüber Naloxon (Gloveli et al., 1997). In chronisch epileptischen Tieren waren hingegen sowohl die Akkomodation der Aktionspotentiale als auch die über GABAB -Rezeptoren vermittelte Nachhyperpolarisation deutlich reduziert (Ref. 9). Als Ursache konnten wir eine verstärkte Autoinhibiton der präsynaptischen GABAB Rezeptoren der inhibitorischen Interneurone zeigen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß im Rahmen der TLE eine Veränderung der frequenzabhängigen Neurotransmission vom EC zur Area CA1 und zum Subikulum stattfindet.


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3.2.3.  Pharmakologische Untersuchungen

Neben den exzitatorischen und inhibitorischen Neurotransmittern Glutamat und GABA modulieren auch körpereigene Amine wie Serotonin (Behr und Heinemann, 1996; Behr et al., 1997) und Dopamin (Ref. 10, 11) über subkortikale Afferenzen das funktionelle Gleichgewicht aus Erregung und Hemmung im Subikulum.

Die Wirkungen von Dopamin auf die Neurotransmission sind vielfältig, abhängig von den beteiligten Rezeptoren in der entsprechenden Hirnregion. Das Subikulum, das eine ausgeprägte mesenzephale, dopaminerge Projektion vom ventralen Tegmentum erhält (Descarries et al., 1987; Gasbarri et al., 1994; Verney et al., 1985), expremiert sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren (Martres et al., 1985; Fremeau, Jr. et al., 1991; Meador-Woodruff et al., 1994; Bruinink und Bischoff, 1993) . Dopamin (200 µM) führte in subikulären Pyramidenzellen zu einer Abnahme des Eingangswiderstandes sowie zu einer geringen Hyperpolarisation des Membranpotentials der Zellen (Ref. 10). Ähnliche Effekte wurden bereits für Pyramidenzellen der Area CA1 (Benardo und Prince, 1982; Berretta et al., 1990; Gribkoff und Ashe, 1984) sowie Neurone der Schicht II des EC (Pralong und Jones, 1993) beschrieben und scheinen durch die Öffnung von K+ -Kanälen bedingt zu sein. Wir konnten zudem zeigen, daß Dopamin (100 µM) die glutamaterge synaptische Transmission über die Aktivierung eines präsynaptisch lokalisierten D1-Dopaminrezeptor unterdrückt (Ref. 11, Abb. 7A). Für einen ausschließlich präsynaptischen Mechanismus sprechen die modulierende Wirkung von Dopamin auf durch Doppelreize evozierte EPSCs sowie Miniatur EPSCs, der verbleibende Effekt nach Auswaschen der postsynaptischen G-Proteine, die unveränderte Kinetik der reizevozierten Ströme sowie der fehlende Effekt auf EPSCs nach Druckapplikation des Glutamat-Rezeptoragonisten AMPA. Die NMDA- und AMPA-EPSPs waren in gleichem Maße vermindert. Die alveoläre Projektion der Area CA1 war signifikant stärker supprimiert als die Projektion der Schicht III des EC (Reduktion auf 56% bzw. 76% der Kontrollwerte). Auch polysynaptisch evozierte GABAA - und GABAB -IPSPs wurden unter Dopamin (200 µM) auf ca. 64% reduziert (Ref. 10). Allerdings zeigte Dopamin in der Gegenwart der Glutamat-Rezeptorantagonisten APV und NBQX keinen Effekt auf monosynaptisch evozierte IPSPs/Cs (Abb. 7B). Diese Ergebnisse sprechen gegen eine direkte Hemmung der präsynaptischen GABA Freisetzung. Die Abnahme der polysynaptisch evozierten Potentiale ist vielmehr auf eine verminderte glutamaterge Erregung inhibitorischer Interneurone zurückzuführen.


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14.01.2004