Beinert, Herrn Dr. med. Thomas : Untersuchungen zur oxidativen Lungenbelastung unter Radio-Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Bronchialkarzinom

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Kapitel 4. Material und Methoden

4.1 Patientenkollektiv

4.1.1 Einteilung in die Therapiegruppen

Untersucht wurden 261 Proben von 199 Patienten mit überwiegend lokal fortgeschrittenem, funktionell oder prospektiv nicht operablem Bronchialkarzinom. Die Bronchoskopie erfolgte in Gruppe 1 zur Diagnostik im Rahmen des Tumorstagings, in allen übrigen Gruppen zur Remissionskontrolle unter oder nach zytoreduktiver Therapie. Die Patienten wurden in folgende Gruppen unterteilt:

Gruppe 1

Patienten mit Bronchialkarzinom, vor Therapie

Gruppe 2

Patienten unter laufender Chemotherapie

Gruppe 3

Patienten bis 2,5 Monate nach Chemotherapie

Gruppe 4

Patienten 2,5 - 15 Monate nach Chemotherapie

Gruppe 5

Patienten mehr als 15 Monate nach Chemotherapie

Gruppe 6

Patienten unter laufender Radiotherapie

Gruppe 7

Patienten bis 2,5 Monate nach Radiotherapie

Gruppe 8

Patienten 2,5 - 15 Monate nach Radiotherapie

Gruppe 9

Patienten mehr als 15 Monate nach Radiotherapie

Gruppe 10

Patienten unter erneuter Chemotherapie, nach Radiotherapie

Gruppe 11

Patienten in kompletter Remission, nach mindestens 2 Jahre zurückliegender Operation mit nachfolgender Radiotherapie.

Gruppe 1

Patienten, die mit dem Verdacht einer Raumforderung im Bereich der Lunge vorgestellt wurden, erhielten im Rahmen der stationären Abklärung eine Bronchoskopie, wobei auch eine Lavage gewonnen wurde. Zur weiteren Analyse gelangten nur Proben, bei denen histologisch anhand einer Tumorbiopsie (exophytisch wachsend oder durch transbronchiale Biopsie unter Bildwandler) oder zytologisch (Feinnadelbiopsie oder Bürstenabstrich) ein kleinzelliges oder nicht kleinzelliges Bronchialkarzinom nachgewiesen wurde.


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Gruppe 2

Diese Gruppe enthält Patienten, die unter einer laufenden Chemotherapie bei überwiegend metastasiertem Tumorwachstum zur Remissionskontrolle untersucht wurden. Hierbei waren mindestens 2 Zytostatika-Gaben des ersten Therapiezyklus bereits verabreicht worden (im Mittel 2,6 Zyklen entsprechend).

Hierbei wurden zur Therapie des Bronchialkarzinoms (NSCLC und SCLC) die folgenden üblichen Zytostatikakombinationen eingesetzt:

Tabelle 6: Verwendete Chemotherapiekombinationen zur Behandlung des Bronchialkarzinoms

Platinbasierte Kombinations-Chemotherapien:

Gemcitabin / Cisplatin

Mitomycin C / Ifosfamid / Cisplatin

Etoposid / Vinorelbin / Carboplatin

Paclitaxel / Carboplatin

Adriamycin / Vinblastin / Carboplatin

Ifosfamid / Etoposid / Carboplatin

Ifosfamid / Carboplatin

 

Nicht platinbasierte Kombinations-Chemotherapien

Vindesin / Mitomycin

Gemcitabin / Vindesin

Ifosfamid / Etoposid

Cyclophosphamid / Etoposid

 

Mono-Chemotherapien

Paclitaxel

Trofosfamid

Etoposid oral

Eine Chemotherapie gilt nach dem letzten verabreichten Zyklus für den Zeitraum, der bis zu Beginn eines neuen Zyklus vergangen wäre, noch als fortdauernd, auch wenn dieser Zeit keine weitere Therapie verabreicht wird (zumeist 4 Wochen).


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Gruppe 3, 4 und 5

Patienten, die nach einer Chemotherapie lavagiert wurden, teilen sich entsprechend dem Zeitpunkt in drei Gruppen auf: Patienten der Gruppe 3 wurden frühestens nach einer Zykluslänge (zumeist 4 Wochen) nach der letzten Therapiegabe und spätestens 2,5 Monate nach Beendigung der Chemotherapie untersucht. Gruppe 4 wurde in der Zeitspanne zwischen 2,5 und 15 Monaten untersucht. Gruppe 5 umfaßt Patienten, die später als 15 Monate nach Ende der Chemotherapie im Rahmen einer Kontrolluntersuchung lavagiert wurden.

Gruppe 6, 7, 8 und 9

In diese Gruppen wurden Patienten eingeschlossen, die entweder konsolidierend nach erfolgreicher vorangegangener Chemotherapie (partielle (PR) oder komplette Remission (CR), oder bei unter Chemotherapie progredientem lokalen Tumorwachstum (PD) strahlentherapiert wurden, weiterhin . Somit ging allen Bestrahlungen eine Chemotherapie voraus.

Die Strahlentherapie erfolgte bei allen Patienten konventionell fraktioniert in Einzeldosen von 2-3 Gy pro die in 5 Gaben pro Woche mit einer thorakalen Gesamtdosis von 56 bis 62 Gy.

Die Gruppenzuordnung folgt dem Zeitschema wie bei den Gruppen 2 bis 5 (nach Chemotherapie):

Gruppe 6:

Die Untersuchung erfolgte unter einer konventionell fraktionierten Radiotherapie der Thoraxorgane, wobei der Beginn der Therapie länger als eine Woche zurücklag. Die Lavage wurde jeweils im bestrahlten Lungengebiet durchgeführt.

Gruppe 7:

Die Untersuchung lag mindestens 4 Wochen nach Strahlentherapie bis maximal 2,5 Monate zurück.

Gruppe 8:

Diese Patienten wurden im Zeitraum zwischen 2,5 Monaten und 15 Monaten untersucht.

Gruppe 9:

Die Strahlentherapie lag mindestens 15 Monate zurück.

Gruppe 10:

Diese Patientengruppe wurde bei Stadium III primär einer Radiotherapie unterzogen und bei Tumorprogression oder Tumorrezidiv mit einer Chemotherapie behandelt. Die Indikation zur Chemotherapie ergab sich in 4 Patienten bei Lokalrezidiv, bei 5 Patienten bei metastasiertem Tumorwachstum.


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Gruppe 11:

Patienten, die im Rahmen einer Kontrolluntersuchung nach operativer Entfernung eines Bronchialkarzinoms zu einer Kontrolluntersuchung kamen, wurden in die Untersuchung eingeschlossen, sofern die Operation und die (in allen Fällen adjuvant durchgeführte) Strahlentherapie vor mindestens 2 Jahren abgeschlossen wurde, und sofern die aktuelle Untersuchung keinen Verdacht auf erneutes Tumorwachstum erbrachte (Langzeitremission), weiterhin weder klinisch noch lungenfunktionsanalytisch der Verdacht auf das Bestehen einer Lungenfibrosierung bestand.

4.1.2 Tumorhistologie

193 Proben, entsprechend 74%, stammten von Patienten mit nicht kleinzelligem Bronchialkarzinom, 68 Proben, entsprechend 26%, von Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom.

Die Gruppe der nicht kleinzelligen Bronchialkarzinome umfaßte folgende histomorphologische Diagnosen: Plattenepithelkarzinom: 84 Fälle, entsprechend 32%, Adenokarzinom: 81 Fälle, entsprechend 31%, großzellige Karzinome, 29 Fälle, entsprechend 11% der Proben.

4.1.3 Aufteilung der Lavage-Proben auf die Patientengruppen

Bei 261 Proben von insgesamt 199 Patienten entspricht dies einem Mehrfachuntersuchungsfaktor von 1,3. Dieser verteilt sich auf die Patienten-Gruppen ähnlich (Kruskal-Wallis-Test).

Tabelle 7: Charakteristika der Patienten bezogen auf die Gruppen der analysierten Proben

Gruppe

Patienten

Proben

m/w

/Proben

SCLC/NSCLC

/Proben

1

9

9

7/2

0/9

2

41

45

31/14

13/32

3

10

10

7/3

2/8

4

13

19

12/7

4/15

5

12

19

14/5

4/15

6

4

4

4/0

1/3

7

14

15

12/3

10/5

8

42

54

41/13

13/41

9

35

44

32/12

12/32

10

9

9

6/3

3/7

11

29

33

25/8

11/22


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Die Auswertung der Proben wurde bezogen auf die Anzahl der Proben.

Dieses Verfahren wurde aus zwei Gründen gewählt:

  1. Bezogen auf das Setting konsekutiver Patienten bei Mehrfachmessungen steht innerhalb einer Gruppe (z. B. wiederholte Kontroll-Bronchoskopie bei kompletter Remission) kein geeignetes Auswahlverfahren zur Verfügung, welche BALF pro Patient zur Analyse kommt,
  2. wurde vorausgesetzt, daß die gemessenen Parameter stärker von der Gruppenzugehörigkeit (z.B. Status vor oder unter Chemotherapie) als intrasubjektiv beeinflußt sind.

4.1.4 Remissionskriterien

Die Beurteilung der Tumorremission unter zytoreduktiver Therapie erfolgt gemäß den gültigen WHO-Kriterien (1979):

Der Tumor wird in zwei Dimensionen über den größten Durchmesser sowie im rechten Winkel hierzu ausgemessen.

Komplette Remission (CR): Verschwinden des vorhandenen Tumors, Bestätigung anhand einer Kontrolluntersuchung im Abstand von mindestens 4 Wochen.

Partielle Remission (PR): Mindestens 50%ige Verkleinerung der geometrischen Gesamttumorgröße des Tumors für mindestens 4 Wochen. Weiterhin dürfen keine neuen Gewebeveränderungen entstanden und keine Anzeichen für eine Progression bereits bestehender Gewebeveränderungen vorhanden sein.

Stable Disease (SD): Es ist weder eine 50%ige Verkleinerung der geometrischen Gesamttumorgröße noch eine 25%ige Größenzunahme einer oder mehrerer meßbarer Gewebeläsionen nachweisbar, und es besteht kein Anzeichen für das Auftreten einer neuen Läsion.

Progression (PD): Zunahme der Größe mindestens einer meßbaren Gewebeläsion um mindestens 25% oder Entstehung neuer Gewebeläsionen.

Die Dauer der partiellen Remission ist definiert als der Zeitraum ab der ersten Gabe der Chemotherapie bis zum Zeitpunkt des dokumentierten Beginns der Progression. Die Dauer der kompletten Remission ist definiert als Zeitraum ab dokumentiertem Beginn der kompletten


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Remission bis zum Zeitpunkt, an dem die Krankheitsprogression erstmalig beobachtet wird.

4.2 Bronchoalveolären Lavage (BAL)

4.2.1 Prinzip der BAL

Die bronchoalveoläre Lavage wird durch Einspülen und anschließendes Absaugen von Flüssigkeit über das flexible Fiberglas-Bronchoskop gewonnen. Die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF), ist ein Gemisch aus dem dünnen Flüssigkeitsfilm, der den die peripheren Bronchien und Alveolen auskleidenden Epithelien aufliegt (epithelial lining fluid, ELF), und dem zurückgewonnenen Anteil des eingespülten Mediums. Die ELF ist anatomisch dem Interstitium unmittelbar benachbart. Das in der ELF enthaltene Zellbild und die in ihr gelösten Mediatoren spiegeln somit nicht nur das Milieu interne des Alveolarraumes, sondern auch das des Interstitiums mit seinen zellulären Komponenten wider.

Da der durch die Lavage angespülte Alveolarbereich eine etwa 100mal größere Oberfläche als die durch die Lavage ausgewaschenen Anteilen des Bronchialbaums aufweist, entsprechen die durch die BAL gewonnenen zellulären und humoralen Anteile der Peripherie des lavagierten Lungensegments, wobei die Bronchialanteile zu vernachlässigen sind (Crystal et al.,1986).

4.2.2 Durchführung der BAL

Voraussetzung für die klinische Sicherheit der Durchführbarkeit der bronchoalveolären Lavage ist ein ausführlicher internistisch-pneumologischer Status des Patienten. Dieser wird anamnestisch, durch die körperliche Untersuchung und durch Erhebung lungenfunktionsanalytischer Parameter wie Vitalkapazität und Atemwegswiderstand sowie einer Blutgasanalyse in Ruhe erhoben. Die Bronchoskopie erfolgt unter Sauerstoffgabe über eine Nasensonde.

Der Patient ist während der Bronchoskopie wach und befindet sich in einer halb sitzenden Position. Angeschlossen ist ein EKG-Monitor. Die Einführung des Bronchoskops erfolgt nach einer ausführlichen Lokalanästhesie, die durch Verneblung sowie einer Applikation unter Sicht durch das Bronchoskop von insgesamt 10 ml einer 1%igen Lösung von Oxybuprocain-Hydrochlorid erfolgt. Prämedizierend wird zur Vagolyse 0,5 mg Atropinsulfat intravenös sowie 7,5 mg Hydrocodon subkutan appliziert. Zur Bronchoskopie werden Geräte der Fa Olympus (D-Hamburg) eingesetzt. Das Bronchoskop wird unter Sicht in das Bronchialsystem eingeführt. Zunächst erfolgt eine komplette Inspektion unter besonderer Berücksichtigung der Tumorlokalisation. Anschließend wird im Bereich des Mittellappens oder der Oberlappen der jeweils nicht tumorbefallenen Lunge das Bronchialsystem mit dem Gerät auf Niveau des Subbronchus atraumatisch verschlossen. In dieser Verschlußposition wird die bronchoalveoläre Lavage mit 100 ml isotoner pyrogenfreier Kochsalzlösung in einer Konzentration von 0,9% in 5 aufeinander folgenden Portionen zu je 20 ml durchgeführt. Die Instillation des Spülmediums erfolgt unter Raumtemperatur, wobei zur Rückgewinnung der eingespülten Flüssigkeit ein Zeitraum von 20 Sekunden nicht überschritten wird.

Alle bronchoalveolären Lavagen wurden in der Lungenklinik Treuenbrietzen, Akademisches


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Lehrkrankenhaus der Charité, Abteilung für Onkologie und Bronchologie, Chefärztin Frau Dr. med. C. Oehm, durchgeführt.

4.2.3 Aufbereitung der Proben

Alle Proben wurden innerhalb von längstens 4 Stunden in das Labor verbracht und aufgearbeitet, wobei in dieser Zeit die Proben bei Raumtemperatur belassen werden.

Die Lavage wurde zunächst durch sterile Gaze gegeben, um Schleimbeimengungen abzufiltrieren. BALF-Proben mit makroskopischen Blutbeimengungen wurden verworfen. Anschließend wurde die Flüssigkeitsmenge in einem sterilen Zylinder gemessen und damit der Anteil der bei der BAL zurückgewonnenen Spülflüssigkeit (Recovery) bestimmt. Im nächsten Schritt erfolgte die Zentrifugation bei 800 g über 10 min. Der Überstand wurde dekantiert und in Aliquots zu 2 ml aufgeteilt. Diese wurden bei - 80°C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.

Das nach der Dekantierung zurückgebliebene Zell-Pallet wurde mit 1 ml PBS aufgenommen. Anschließend wurde mit einem Coulter Counter (Fa Coulter Immunotech, D-Krefeld) in einer 5 µl-Probe die Zellzahl bestimmt.

4.2.4 Zytologische Untersuchungen

4.2.4.1 Anfertigung der Zytozentrifugenpräparate

Je 100 µl der BALF-Zellsuspension wurden in Zentrifugenkammern (Shandon GmbH, D-Frankfurt) gegeben. Diese wurden mit Filterpapier und Objektträgern in eine Zytozentrifuge eingespannt (Shandon GmbH, D-Frankfurt). Nach 5 min Zentrifugieren bei 600 g wurden die Präparate über 24 Stunden an der Luft getrocknet.

4.2.4.1.1 Zytologische Färbungen

Die Zelldifferenzierung am Präparat erfolgte anhand der Pappenheim-Färbung, die als panoptische Färbemethode die Differenzierung von Zellelementen wie Kernstrukturen, Zytoplasma und Granula erlaubt. Die Färbung wurde an den luftgetrockneten Präparaten durchgeführt. Sie wurden über 4 min mit May-Grünwald-Lösung (Merck, D-Darmstadt) in einer Färbeküvette inkubiert. Anschließend wurden die Präparate 2 min mit Aqua dest. gewaschen und für 15 min in der 1:20 mit Aqua dest. verdünnten Giemsa-Lösung (Merck, D-Darmstadt) gefärbt. Die Einbettung der Präparate erfolgte mit Glycergel als Einschlußmedium (Dako Diagnostika GmbH, D-Hamburg).

Lichtmikroskopische Auswertung:

Es wurden 300 Zellen lichtmikroskopisch differenziert (Alveolarmakrophagen, neutrophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Mastzellen, Lymphozyten).


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4.2.4.2 Vitalitätsnachweis der Zellen

Der Nachweis der Zellvitalität beruht auf der Trypan-Blau-Methode. 2 %ige wässrige Trypan-Blaulösung (Fluka AG, D-Neu-Ulm). Nach Mischung mit 1,8% NaCl Lösung zu einer isotonen Lösung wurde ein Tropfen der BALF-Zellsuspension mit einem Tropfen der Lösung durchmischt. Lichtmikroskopisch stellen sich die avitalen Zellen blau angefärbt dar, deren relativer Anteil in einer Neubauer Zählkammer ausgezählt wurde.

4.2.4.3 Immunophänotypisierung der BALF-Lymphozyten

Die Lymphozytensubpopulationen wurden durchflußzytometrisch an einem FACS-Sorter (Becton Dickinson, D-Heidelberg) mit Argon Laser und Fluorescein-Isothiozyanat/Phycoerythrin (FITC/PE) Filtersatz analysiert, einer Wellenlänge von 488 nm (Grünfloureszens) und 595±30 nm (Rotfloureszens) entsprechend. Pro Markierung wird die Messung aller Parameter an 1 x 106 Zellen mit einer Flußrate von 150 Ereignissen/Sekunde durchgeführt. Alle Rohdatensätze wurden auf Datenträger gespeichert.

Die Differenzierung der durchflußzytometrisch erfaßten Zellen erfolgte über die unterschiedlichen Eigenschaften der Zellgröße (Vorwärtsstreulicht) und der Zellgranularität (Seitwärtsstreulicht). Aufgrund dieser beiden Parameter ist es möglich, Leukozytenpopulationen wie Lymphozyten, Monozyten und die neutrophilen Granulozyten zu identifizieren und voneinander abzugrenzen.

Das von den optischen Filtern getrennte Licht wird zur Analyse auf die Detektoren geleitet. Diese wandeln das Licht in elektrische Impulse um, wobei die Höhe des erzeugten Impulses mit der Stärke des Lichtsignals korreliert. Gleichzeitig verstärken die Detektoren das optische Primärsignal über eine Photonenkaskade. Die elektrischen Impulse der Detektoren werden elekronisch nachverstärkt, digitalisiert und über eine Spezial-Software graphisch als Histogramm dargestellt.

Im Histogramm kann eine beliebige Zellpopulation graphisch ausgewählt werden, indem sie achsenparallel durch eine horizontale und vertikale Linie oder über eine mit der Maus frei definierte Fläche von den übrigen Scatter-Punkten abgetrennt wird. Dieser Vorgang, das sogenannte Gaten, erlaubt die Selektion definierter Subpopulationen zur weiteren Analyse mittels fluoreszensgekoppelter Antikörper.

Das Fluoreszensverhalten der Zellen wird anschließend über die Software zur graphischen Darstellung angewählt, wobei auf der x-Achse die Intensität des FITC-Farbstoffes, auf der y-Achse die Intensität des PE-Farbstoffes angezeigt wird.

Die dargestellten Meßdaten müssen durch Setzen von Statistikregionen oder auch Quadranten unterteilt werden. Für jede dieser Statistikregionen oder Quadranten wird der prozentuale Anteil der darin enthaltenen Zellen am Gesamt-Histogramm errechnet (Padovan et al.,1992).


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4.2.4.3.1 Vorbereitung des Zell-Pallets zur FACS-Analyse

Die BALF-Zellsuspension wurde durch Zugabe von PBS auf eine Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml verdünnt. Bei hohem Erythrozytenanteil in der BAL erfolgte die Lysierung der Erythrozyten mittels eines speziellen Lysierungsreagenz (FACS-Lysing Solution, Becton Dickinson, D-Heidelberg) .

Bei 4°C wurden je 100 µl dieser Zellsuspension anschließend unter Lichtabschluß für 30 min mit je 10 µl des mit FITC oder PE markierten monoklonalen Antikörpers inkubiert. Im Folgeschritt wurden durch Zugabe von 1 ml speziellem Lysereagenz (FACS lysing solution, Becton Dickinson, D-Heidelberg) die Zellen fixiert, zugleich die Erythrozyten lysiert. Die Proben wurden erneut zentrifugiert, gewaschen und in gekühltem PBS (4°C) resuspendiert.

Es wurden folgende mit FITC- oder PE- Fluoreszenzfarbstoff direkt markierte Antikörper (Dako Diagnostika GmbH, D- Hamburg) eingesetzt:

IgG1 /IgG2a

(Isotyp Kontrolle) DAKO

CD 14/45

(Leukozyten, Differenzierung in Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten) DAKO

CD 3/4

(Pan T-Zell-Marker, T-Helfer-Zell-Marker) DAKO

CD 3/8

(Pan T-Zell-Marker, T-Supressor-Zell-Marker) DAKO

CD 4/8

(T-Helfer-Zell-Marker, T-Supressor-Zell-Marker) DAKO

4.2.4.3.2 Aufbereitung von peripherem Blut für die FACS-Analyse

10Fl des monoklonalen direktkonjugierten Antikörpers wurden in ein Röhrchen pipettiert, mit 100 Fl Vollblut (mit EDTA oder Citrat versetzt) vermischt und 15-30 min bei Raumtemperatur unter Lichtabschluß inkubiert.

Zur Erythrozytenlyse wurde 1 ml Lysierungsreagenz (FACS-Lysing Solution, Becton Dickinson, D-Heidelberg) auf die mit dem Antikörper vorinkubierten Zellen gegeben. Die Inkubationszeit betrug 10 min und wurde wiederum bei Raumtemperatur unter Lichtabschluß durchgeführt.

Anschließend wurde der Ansatz bei 1400 U/min über 5 min zentrifugiert, dekantiert und zweimal mit je 2 ml PBS gewaschen, dazwischen mit 1400 U/min über 5 min rezentrifugiert. Die Zellen wurden in 500 Fl PBS resuspendiert und dann durchflußzytometrisch analysiert. Hierfür wurden die oben aufgeführten, zur Differenzierung der BALF-Zellen eingesetzten Antikörper verwendet.

4.2.4.4 FACS-Analyse der intrazellulären Hitzeschockproteine

Da Hitzeschockproteine intrazellulär exprimiert werden, müssen die Zellen zur FACS-Analyse permeabilisiert werden. Hierfür wurden100 µl BAL-Zellen vor Zugabe der spezifischen Antikörper 1 Stunde mit -20EC gekühltem 80% Methanol bei -20EC inkubiert. Hierbei werden sie in einem


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Arbeitsschritt fixiert und zugleich permeabilisiert.

Die monoklonalen Antikörper gegen das HSP-Antigen liegen in unkonjugierter Form vor. Somit erfolgte der Ansatz indirekt über zwei Stufen. Zunächst wurde das Zell-Pellet mit 10µ l des unkonjugierten Antikörper über 30 min bei 4°C inkubiert und mit 4EC gekühlten PBS gewaschen. Anschließend wurde die Zellsuspension mit je 5µ l des Sekundärantikörpers (FITC oder PE konjugiert) über 15 min inkubiert. Ein wiederholter Waschvorgang mit PBS folgte.

Die Negativkontrolle erfolgte mit dem jeweiligen Isotyp des Primärantikörpers (IgG 1, IgG 2a) in analogen Arbeitsschritten.

Verwendet wurden folgende Isotyp-Kontroll-Antikörper und HSP-Antikörper:

IgG 1, IgG 2a

(DAKO Diagnostika GmbH, D Hamburg)

HSP 70

(DAKO Diagnostika GmbH, D Hamburg)

HSP 90

(Sigma, D Deisenhofen)

4.2.4.5 Zytokin-Nachweis mittels ELISA

Quantitativer Sandwich Enzym Immunoassay (ELISA), Kit-Systeme:

IL-1, IL-2, IL-6, IL8, TNF-alpha, (Antikörper: R&D Systems, D-Wiesbaden)

Auf einer Mikrotiterplatte sind für das jeweilige Zytokin spezifische monoklonale Antikörper gebunden. Standards und Patientenproben wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert und hier von den immobilisierten Antikörpern gebunden. Nach einer Inkubationszeit von 16-24 Stunden wurden die ungebundenen Substanzen mit einem Waschpuffer (R&D Systems, D-Wiesbaden) ausgewaschen, anschließend der jeweils spezifische enzymgebundene polyklonale Antikörper in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert. Durch einen wiederholten Waschvorgang mit Waschpuffer (R&D Systems, D-Wiesbaden) wurde das ungebundene Antikörper-Enzym-Reagenz herausgewaschen, anschließend eine Substratlösung (stabilisierte Hydrogen-Peroxidase und stabilisiertes Chromogen (Tetramethylbenzidine), R&D Systems, D-Wiesbaden) in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert.

Nach wiederholter Inkubation wurde eine Amplifier-Lösung (R&D Systems, D-Wiesbaden) hinzugegeben, die den Farbkomplex auslöst.

Die Reaktion der Farbentwicklung wurde nach 30 min durch die Zugabe von Stopplösung (2N Sulfuric Azid, R&D Systems, D-Wiesbaden) beendet, die Farbintensität anschließend mittels ELISA-Readers (Mikroplatten Absorptionsphotometer, Anthos labtec instruments, A-Salzburg) bei 450-495 nm abgelesen. Gemessen wurde die Absorption entsprechend der optischen Dichte des Farbkomplexes.

Zur Qualitätskontrolle der Messungen erfolgte stets eine Doppelbestimmung der Parameter. Lag


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die Abweichung zwischen erster und zweiter Messung über 5%, wurden die Werte verworfen und die Messungen wiederholt.

4.2.5 Biochemische Untersuchungen der BALF

4.2.5.1 Bestimmung des Volumens der ELF

Die bronchoalveoläre Lavage führt zu einer starken Verdünnung des epithelialen Flüssigkeitsfilms. Dieser Verdünnungsfaktor, der in den durch Absaugung gewonnen Proben schwankt, kann indirekt durch die Harnstoffverdünnungsmethode bestimmt werden. Diese Methode vergleicht den Harnstoffgehalt in der BALF und im peripheren Blut. Da Harnstoff weitgehend frei diffusibel in den Alveolarraum ist, finden sich in der ELF und im peripheren Blut die gleiche Konzentration. Der Verdünnungsfaktor ergibt sich als Quotient aus Harnstoffkonzentration im Serum und Harnstoffkonzentration in der BALF. Das Volumen der ELF ergibt sich nun aus dem Verdünnungsfaktor multipliziert mit dem BALF-Volumen.

4.2.5.1.1 Prinzip der Harnstoffbestimmung

Die Harnstoffkonzentration wurde im Serum wie in der BALF mit der Test-Combination Harnstoff S (Spaltung mit Urease, Berthelot-Reaktion) durchgeführt (Boehringer Mannheim GmbH, D-Mannheim). Zunächst wurde bei diesem enzymatischen Test Harnstoff unter Zugabe von 2H2O durch Urease in Ammoniak umgewandelt. Die Ammonium-Ionen reagierten sodann mit Salicylat und Hypochlorit unter Bildung eines grünen Farbstoffes.


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Der Test-Kit enthält folgende Lösungen:

Lösung 1: Puffer / Urease / Salicylat

 

Phosphat-Puffer

120 mmol/l, pH 7,0

Urease

> 5 U/ml

Natriumsalicylat

62,5 mmol/l

Nitroprussid-Na

5,00 mmol/l

EDTA

1,48 mmol/l

 

 

Lösung 2: Hypochlorit

 

Natriumhypochlorit

6 mmol/l

Natriumhydroxid

150 mmol/l

 

 

Lösung 3: Standardlösung

 

Harnstoff

30 mg/dl bzw. 5 mmol/l

Da die Harnstoffwerte in der BALF unter dem Bereich des Standards lagen, wurde dieser nochmals 1:5 (1mmol/l) verdünnt. Als Kontrolle wurde das Reagenz "cfas-cal" 15,2 mmol/l (Boehringer GmbH D-Mannheim) in einer Verdünnung von 1:100 verwendet.

4.2.5.1.2 Testansatz

500 Fl der BALF-Probe wurden mit 1 ml der Lösung 1 in ein Röhrchen aufgenommen und über 15-30 min inkubiert. Anschließend wurde der Testansatz mit 1 ml der Lösung 2 über 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann in eine Meßküvette überführt. Standards und Proben wurden bei 578 nm an einem Eppendorf-Photometer PCP 6123 (Eppendorf GmbH, D-Hamburg) gemessen.

Zur Qualitätskontrolle der Messungen erfolgte stets eine Doppelbestimmung der Parameter. Toleriert wurde eine Abweichung zwischen erster und zweiter Messung bis 3%.

Wesentliche Voraussetzung für die Anwendbarkeit der Harnstoffverdünnungsmethode ist die standardisierte Durchführung der BAL. Wie oben aufgeführt, ist hier insbesondere die Einhaltung der Zeitgrenze während der Rückgewinnung der Spülflüssigkeit wesentlich. Wir verwendeten daher ausschließlich Proben, bei denen eine Instillationszeit von 20 sec bis zum Absaugen der eingeschwemmten Flüssigkeit nicht überschritten worden war.


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4.2.5.2 Gesamteiweiß

Die Gesamteiweißkonzentration wurde in der BAL mit dem Bio-Rad Protein Assay (BIO-RAD Laboratories GmbH, München), Methode nach Lowry, durchgeführt.

Der Textilfarbstoff Coomassie Brillant Blue G 250(CBB-G250), Absorptionsmaximum bei 465 nm, liegt in leicht saurer Lösung vor. Mit Proteinen reagiert CBB-G250 rasch unter Ausbildung eines Protein-Farbstoff-Komplexes und Verschiebung des Absorptionsmaximums auf 595 nm.

In dem Meß-Kit sind folgende Reagenzien enthalten:

Lösung 1

450 ml konzentriertes Dye-Reagenz (Phosphor Azid und Methanol) Wird 1:5 mit Aqua dest verdünnt

 

Standard 1

cfas-cal 1:100 verdünnt

Testansatz:

100 µl der BALF-Probe wurden in 2 ml Protein Assay Lösung (Lösung 1) aufgenommen.

Die Messung gegen einen Leerwert erfolgte am Eppendorf Photometer PCP 6123 (Eppendorf GmbH, D-Hamburg) bei 578 nm.

4.2.5.3 Albumin

Das Testprinzip von Albumin in der BALF basiert auf einem immunologischen Trübungstest. Die Albumin-Antikörper reagieren mit dem Antigen aus der Probe unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes, der nach Agglutination turbidimetrisch gemessen wird.

Der gebrauchsfertige Kit enthält folgende Lösungen:

Reagenz 1

Puffer (Tris-Puffer 50 mmol/l, pH 8,0, PEG 4,2%, EDTA 3,7 g/l, Konservierungsmittel

Reagenz 2

Albumin-Antikörper (polyklonaler Anti-Human-Albumin-Antikörper vom Schaf)

Reagenz 3

Kalibratoren (humanes Albumin, Phoshat-Puffer 50 mmol/l, pH 8,0, Konservierungsmittel)


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Die Messungen erfolgten an einem Photometer Hitachi 911(Eppendorf, D-Hamburg).

Das Gerät überführt die Verdünnungen der Reagenzien und die 10 µl BALF-Probe vollautomatisch in die Meßküvetten. Die Messung wurde bei einer Wellenlänge von 340 nm durchgeführt.

Zu allen Werten wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Toleriert werden Abweichungen zwischen erster und zweiter Messung bis 5% wurden toleriert.

4.2.5.4 Nachweis von Laminin in der BALF

Die Messung von Laminin wurde mit einem ELISA (Fa. Takara, Japan) durchgeführt. Ein gegen das Antigen gerichteter primärer Antikörper ist an eine Platte mit 96 Vertiefungen gebunden. Im ersten Inkubationsschritt bindet die gesamte Antigenmenge an diesen im Überschuß vorliegenden Antikörper. Nach Auswaschen von Serumbestandteilen mit einem vorgegebenen Puffer wurde in einem weiteren Inkubationsschritt ein Enzym-markierter Sekundär-Antikörper hinzugegeben. Er bindet an ein weiteres Epitop des an den Primärantikörper gebundenen Antigens unter Ausbildung eines Sandwichkomplexes, der das Antigen von beiden Seiten umschließt. Die gebundene enzymatische Aktivität im Probenansatz ist proportional der Konzentration des Antigens. Die Reaktion der Farbentwicklung wurde nach 30 min durch die Zugabe von Stopplösung (Fa Takara, Japan) beendet, die Farbintensität anschließend mittels ELISA-Readers (Mikroplatten Absorptionsphotometer, Anthos labtec instruments, A-Salzburg) bei 492 nm abgelesen. Gemessen wurde die Absorption entsprechend der optischen Dichte des Farbkomplexes.

Vorbereitende BALF-Konzentrierung

Die Bestimmung von Laminin in der ELF wurde unternommen, um spezifische Aktivierungsprozesse des Bindegewebes zu erfassen. Da dieses Protein in Lavagen von interstitiellen Lungenerkrankungen lediglich in 20% nachweisbar ist, wurde zu deren besseren Quantifizierbarkeit die BALF einer Konzentrierung durch Zentrifugenfiltration unterzogen. Diese wurde durch eine fraktionierte Zentrifugation, die das Ausgangsvolumen kontrolliert vermindert, erreicht. Die Volumenreduktionsschritte erfolgen hierbei von 2,5 auf 0,5 ml. Der Konzentrierungsfaktor wurde durch Vergleich des Proteingehaltes in den Proben ermittelt.

4.2.5.5 N-terminales Prokollagen-III-Peptid (N-P-III-P)

Die Bestimmung der N-P-III-P-Konzentration wurde mittels Radioimmunoassay durchgeführt (RIA-gnost P III P - coated tube, Behringwerke, D-Marburg). Eingesetzt wurde ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen humanes N-P-III-P, der hochspezifisch für das intakte N-P-III-P ist und eine Kreuzreagibilität gegenüber N-P-III-P-Spaltprodukten von lediglich 10% aufweist.

Der Radioimmunoassay arbeitet in 2-Schritt-Sandwich-Technik. Zunächst wurde aus wandgebundenem Anti-N-P-III-P-Antikörper (monoklonal, Maus) und 125J markiertem Anti-N-P-III-P-


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Antikörper (monoklonal, Maus) ein Komplex gebildet. Anschließend erfolgte die Auswaschung freier Traceranteile. Der spezifisch an die Wandung des Teströhrchens gebundene Tracer-Anteil wurde nun mit einem Gamma-Counter gemessen. Die Ergebnisse wurden durch Vergleich mit einer 7-Punkt Standardkurve mit Hilfe eines computergestützten Auswerteprogramms ermittelt. Die untere Nachweisgrenze betrug für N-P-III-P 0,1 E/ml.

Für Doppelmessungen wurde eine Toleranzgrenze von 10% vorgegeben.

4.2.6 Neoangiogene Faktoren und Wachstumsfaktoren

Vascular endothelial cell growth factor (VEGF ), Transforming growth factor (TGF), Epidermal growth factor (EGF), Platelet derived growth factor (PDGF) und Fibroblast growth factor (FGF-alpha und FGF-beta)

Der Test basiert auf einem quantitativen Sandwich Enzym Immunassay. Ein spezifischer monoklonaler Antikörper gegen VEGF ist auf einer Mikrotiterplatte fixiert. Standards und Proben wurden in die vorgegebene Vertiefungen pipettiert und dort von dem Antikörper gebunden. Bei einem Waschvorgang wurden alle nichtbindenden Substanzen entfernt und anschließend ein Sekundärantikörper (polyklonaler Antikörper mit Enzym) hinzugegeben, der spezifisch an den gebildeten VEGF-Antikörper-Komplex bindet.

Anschließend wurde durch ein Substrat farblich die Bindung mit dem jeweiligen nachzuweisenden Faktor detektiert und mittels ELISA-Reader abgelesen.

Alle Meßparameter wurden doppelt bestimmt, eine Abweichung bis 5% zwischen erstem und zweitem Meßwert toleriert.

4.2.7 Methioninsulfoxid

Methioninsulfoxid (Met(O)) entsteht durch Oxidation der Thioäthergruppe von Methionin. Der Oxidationsgrad eines Proteins läßt sich an dem Anteil der oxidierten Methioninreste im Vergleich zu dem Gesamtmethioningehalt des Makromoleküls ablesen.

Die bei -80°C aufbewahrten Aliquots wurden aufgetaut. Die Methode erfordert eine Mindestmenge von 100 µg Protein, entsprechend etwa 1,5 ml BALF. Zunächst wurde bei einer Temperatur von 4°C eine dreistündige Dialyse gegen entionisiertes Wasser durchgeführt, dann lyophylisiert und in 840 µl 75%iger stickstoffgesättigter Ameisensäure gelöst. Methionin wurde nun durch Zugabe von Bromcyan (CNBr, Rockford, USA) bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M unter Lichtabschluß bei Raumtemperatur in einer 100% Stickstoffatmosphäre inkubiert. Hierdurch erfolgte die Umwandlung von Methionin in Homoserin und Homoserin-Lakton (Shechter 1975, Beck-Speier 1988). Die mit CNBr behandelten Proteine wurden lyophilisiert und über 48 Stunden mit 6 M HCL (Merck, D-Darmstadt) unter 5mM Dithioerythritol (Merck, D-Darmstadt) unter Vakuum bei 110°C hydrolysiert, wobei (Met(O)) quantitativ zu Met reduziert wurde. Anschließend wurde eine reversed-phase High-Performance Liquid-Chromatography (RP HPLC, Fa Kontron, D-München. Zum Prinzip s.u.)


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durchgeführt, in der die initial oxidierten Methioninreste als Methionin und die nicht oxidierten Methioninreste als Homoserin nachgewiesen wurden.

4.2.8 Gesamtglutathion

Das Glutathiondisulfid (GSSG) wird im Meßansatz durch die Glutathionreduktase unter Verbrauch von NADPH zu zwei Molekülen GSH reduziert. Hieraus ergibt sich die Gesamtglutathion (GSHt) -Konzentration aus der Summe von reduziertem GSH und der zweifachen Menge des gemessenen GSSG.

100 µl BALF wurden mit 1.1 ml 0,1 M Sodium Phosphat Puffer, pH 7,0, bestehend aus 1mM ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA), 0,2 mM nicotinamide adenine dinucleotide phophate (NADPH), 63,5 µM 5.5-dithiobis (2-Nitrobenzoic Azid) (DTNB) und 4 U/ml Glutathione Reduktase versetzt (alle Chemikalien von Sigma-Aldrich, D-Deisenhofen).

Die Reduktionsrate von DTNB wurde spektophotometrisch bei einer Wellenlänge von 412 nm gemessen. Die GSHt Konzentration von der BALF wurde mit einer internen Standardlösung von 0,84µM GSH berechnet.

Oxidiertes Glutathion (GSSG) wurde nach der Methode Adams wie folgt bestimmt. Nach Zentrifugation (300 x g , 5 min) BALF wurde mit einem Volumen von 10 mM N-ethylmaleimide in 0,1 M Kaliumphophat-Puffer, pH 6,5, und 17,5 mM EDTA versetzt.

Mit 250 ml dieses Ansatzes wurde eine SEP-PAK c 18 Säule (Waters Associatea, Milford, UK-Manchester), gefolgt von 3 ml Methanol und 3 ml Aqua bidest, beschickt. GSSG wurde mit 1 ml 0,1 µ Kaliumphophat-Puffer, pH 7,5 mit 5 mM EDTA, 800 mM DTNB, 2 U/ml Glutathion- Reduktase und 1 mM NADPH verdünnt.

Die Reduktionsrate von DTNB wurde wiederholt am Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 412 nm gemessen. Die Standards von GSSG (Boehringer Mannheim, D- Mannheim) mit einer bekannten Konzentration von 0,25 - 4 µM wurden entsprechend den BALF-Proben gemessen und ergaben die Standardkurven.

Die Konzentration von GSHt wurde wie folgt berechnet:

GSHt = GSH + 2 x GSSG.

Alle Messungen wurden wegen des hohen relativen Fehlers der Einzelmessung dreifach durchgeführt, die vorgegebene Toleranzgrenze der Abweichung der Einzelmessungen voneinander betrug 10%.


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4.2.8.1 Glutathiondisulfid / reduziertes Glutathion

Die Messung des Gesamtglutathions umfaßte sowohl die reduzierte als auch die oxidierte Form und gab damit Aufschluß über das Verhältnis dieser Redox-Formen zueinander.

4.2.8.1.1 HPLC (high performance liquid chromatography)

Die Hochdruck-Flüssigkeit-Chromatographie ist eine leistungsfähige chemische Trennmethode, die zur quantitativen Analyse von geringen Stoffmengen angewendet wird.

Das Prinzip der Chromatographie beruht auf der unterschiedlichen Affinität der einzelnen Bestandteile eines Gemisches zu zwei verschiedenen Phasen, die nicht oder nur in begrenztem Umfang untereinander mischbar sind. Eine der Phasen, die sogenannte stationäre Phase, befindet sich durch die Bindung an einen festen Träger in Ruhe. Die andere, die mobile Phase, wird einer ständigen gerichteten Bewegung durch Überdruck unterzogen.

Aufgrund der unterschiedlichen Verteilungsgleichgewichte der einzelnen Komponenten des Analysengemisches zwischen stationärer und mobiler Phase kommt es zu einer differenten Retention der Einzelkomponenten an der stationären Phase und damit zu unterschiedlichen Retentionszeiten, d.h. unterschiedlichen Zeiten, welche die Einzelkomponenten bis zum Verlassen der Säule benötigen. Hierdurch kommt es zur Auftrennung der Stoffgemische.

Das in die entsprechenden Einzelsubstanzen aufgetrennte Eluat wird während des Verfahrens kontinuierlich fokussiert und durch den Meßstrahl eines Ultraviolettdetektors gelenkt. Das Signal wird aufgezeichnet und gegen eine Zeitachse aufgetragen. Das Ergebnis ist ein charakteristisches Chromatogramm, welches die aufgetragenen Substanzen qualitativ und quantitativ beschreibt.

Der Chromatograph besteht aus einer Pumpe, einem Probeninjektor, einer Trennsäule, dem mobilen Phasensystem und einem Ultraviolettdetektionssystem. Der Überdruck gewährleistet einen konstanten Fluß der mobilen Phase gegen den Widerstand der stabilen Phase in der Trennsäule.

4.3 Statistik

Die statistische Analyse erfolgte mit dem Programm SPSS Version 8, auf einem IBM-kompatiblen Personalcomputer. Alle angegebenen Mittelwerte entsprechen, sofern nicht anders ausgewiesen, dem arithmetischen Mittelwert, die Abweichungen wurden als Standardabweichungen angegeben. Unter der Voraussetzung, daß die Zahlenwerte innerhalb der Gruppen nicht normalverteilt sind, wurde zum Vergleich von unverbundenen Stichproben ausschließlich der nicht-parametrische Mann-Whitney-U-Test herangezogen. Für verbundene Stichproben wurde der Wilcoxon-U-Test eingesetzt. Zur graphischen Darstellung der Werteverteilung über die Gruppen wurden Box-Plots gewählt, da die von ihnen ausgegebenen graphischen Charakteristika den Gruppenmedian, den Interquartilbereich und die Extremwerte (Range) beinhalten und damit nicht normalverteilte Daten adäquat beschreiben.

Zum Vergleich nominalskalierter Daten wurde eine Kontingenztafelanalyse durchgeführt. Bei


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numerischem Datenformat erfolgte der Vergleich der Testvariablen über die Gruppenvariable unter der Hypothese nicht normalverteilter Daten parameterfrei mit dem Kruskal-Wallis-Test. Bei hier ausgegebenen Signifikanzen wurde mit dem U-Test unter Bonferroni-Korrektur paarweise nachgetestet.

Die Abhängigkeit zwischen zwei Variablen wurde parameterfrei mit dem Korrelationskoeffizient nach Freadman getestet. Zur Beschreibung numerischer Variablen mit nicht normalverteilten Werten wurden folgende Parameter tabellarisch angegeben: Median, Minimum, Maximum, 25. Perzentil, 75. Perzentil.

Für alle angewendeten Testverfahren wurde als Irrtumswahrscheinlichkeit ein alpha-Fehler von 0,05 angenommen.


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Fri Oct 5 14:08:04 2001