Beinert, Herrn Dr. med. Thomas : Untersuchungen zur oxidativen Lungenbelastung unter Radio-Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Bronchialkarzinom

55

Kapitel 5. Ergebnisse

5.1 Einteilung der Proben

Insgesamt wurden 261 Lavageproben von 199 Patienten vor, unter oder nach Therapie eines Bronchialkarzinoms untersucht. Die Proben wurden in die folgenden Gruppen aufgeteilt, die im folgenden erläutert werden:

Gruppe 1

 

Vor Therapie

9 Proben von 9 Patienten

Gruppe 2

 

Unter laufender Chemotherapie

45 Proben von 41 Patienten

Gruppe 3

 

Bis 2,5 Monate nach Chemotherapie

10 Proben von 10 Patienten

Gruppe 4

 

2,5 - 15 Monate nach Chemotherapie

19 Proben von 13 Patienten

Gruppe 5

 

Mehr als 15 Monate nach Chemotherapie

19 Proben von 12 Patienten

Gruppe 6

 

Unter Radiotherapie

4 Proben von 4 Patienten

Gruppe 7

 

Bis 2,5 Monate nach Radiotherapie

15 Proben von 14 Patienten

In dieser Gruppe hatten 3 Patienten klinisch und radiologisch eine Pneumonitis entwickelt


3 Proben von 3 Patienten

Gruppe 8

 

2,5 - 15 Monate nach Radiotherapie

54 Proben von 42 Patienten

In dieser Gruppe boten 2 Patienten klinisch, radiologisch und lungenfunktionsanalytisch das Bild einer geringen bis mäßiggradigen Lungenfibrose



(2 Proben von 2 Patienten)

Gruppe 9

 

Mehr als 15 Monate nach Radiotherapie

44 Proben von 35 Patienten


56

Gruppe 10

 

Unter Chemotherapie, nach Radiotherapie

9 Proben von 9 Patienten

Gruppe 11

 

Mindestens 2 Jahre zurückliegende Operation mit nachfolgender Bestrahlung (komplette Remission)


33 Proben von 29 Patienten

5.2 Anthropometrische Daten

5.2.1 Altersverteilung

Tabelle 8: Die Altersverteilung in den einzelnen Gruppen, bezogen auf die Anzahl der Proben

Gruppe

Median

Minimum

Maximum

25. Perzentil

75. Perzentil|

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

64,00

46,00

88,00

54,50

76,00

2

64,00

47,00

79,00

58,75

70,00

3

64,50

45,00

77,00

52,00

72,00

4

63,00

44,00

81,00

59,00

68,00

5

63,00

33,00

72,00

56,00

63,00

6

66,00

59,00

71,00

60,25

70,25

7

61,00

39,00

79,00

58,00

68,00

8

64,00

38,00

79,00

59,00

69,00

9

64,00

48,00

81,00

59,00

67,50

10

63,00

52,00

71,00

57,50

65,50

11

68,00

35,00

86,00

59,75

70,25


57

Zur Überprüfung, ob die oben gezeigte Verteilung in den Subgruppen signifikant different ist, wurde der Kruskal-Wallis-Test angewendet. Gemäß diesem Testverfahren fanden sich in den Subgruppen für das Alter folgende Ränge:

Tabelle 9: Ränge der Altersverteilung innerhalb der Patientengruppen

Gruppe

N

Mittlerer Rang

 

 

 

1

9

143,39

2

45

137,92

3

10

131,15

4

19

128,79

5

19

107,89

6

4

152,88

7

15

119,63

8

54

128,89

9

44

129,44

1

9

115,17

11

33

145,08

 

 

 

Gesamt

261

 

Hieraus ergab sich im Kruskal-Wallis-Test eine asymptotische Signifikanz von p=0,9, d.h., die Altersverteilung bezogen auf die Proben in den Subgruppen war nicht signifikant different.

5.2.2 Geschlechtsverteilung und Tumorhistologie in den Patientengruppen

Die folgende Tabelle gibt die Geschlechtsverteilung und die Tumorhistologie in den Therapiegruppen, bezogen auf die Anzahl der Proben, an:

Tabelle 10: Geschlechtsverteilung und die Tumorhistologie in den Therapiegruppen

Gruppe

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

m

7

38

7

15

14

3

11

41

38

7

20

w

2

7

3

4

5

1

4

13

6

2

13

NSCLC

8

36 15 15 1 10 42 32 7 22

8

15

15

1

10

42

32

7

22

SCLC

1

9

2

4

4

3

5

12

12

2

11


58

In der Kontingenztafelanalyse fand sich im Chi-Quadrat-Test nach Pearson ein Signifikanzniveau von 0,51. Somit wies die Geschlechtsverteilung in den Subgruppen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Subgruppen auf.

Insgesamt wurden 193 Proben von Patienten mit NSCLC und 68 Patienten mit SCLC gewonnen, einem Anteil an kleinzelliger Bronchialkarzinome von gut 35% entsprechend. Da sich die Anzahl der Proben prozentual entsprechend auf die Anzahl der Patienten verteilte (nicht gezeigt), entspricht dies einem gegenüber der Häufigkeitsverteilung der Erkrankung überproportionalen Anteil am Gesamtkollektiv.

5.2.3 Chronische Bronchitis und Nikotinabusus

Insgesamt wurden 79 Proben von Patienten mit chronischen Bronchitis gewonnen. Diese teilen sich auf die Therapie-Subgruppen auf wie folgt:

Tabelle 11: chronische Bronchitis in den Therapie-Subgruppen

Gruppe

chronische Bronchitis

ja

/ nein

 

 

 

 

1

 

2

7

2

 

15

30

3

 

3

7

4

 

3

15

5

 

0

18

6

 

2

2

7

 

4

11

8

 

15

39

9

 

19

25

10

 

3

5

11

 

13

20

 

 

79

182

Die Häufigkeit des Auftretens von chronischer Bronchitis bezogen auf die Probenanzahl in den Subgruppen wurde mit einer Kontingenztafelanalyse auf signifikante Unterschiede überprüft. Der Chi-Quadrat-Test ergab in der Analyse aller Datensätze ein Signifikantniveau von 0,13. In der Kontingenztafelanalyse lag jedoch in der Gruppe 5 die beobachtete Häufigkeit des Auftretens einer chronischen Bronchitis hinter der erwarteten Häufigkeit:

Gruppe 5: erwartete Häufigkeit: 5 Fälle. Beobachtete Häufigkeit: 0 Fälle.

Von den 261 Proben entfielen 237 auf Raucher. Der kumulative Nikotinabusus verteilte sich auf die Therapie-Subgruppen wie folgt:


59

Tabelle 12: Verteilung des kumulative Nikotinabusus auf die Therapie-Subgruppen

Gruppe

Median

Minimum

Maximum

25. Perzentil

75. Perzentil|

 

 

 

 

 

 

1

20,00

0,00

30,00

15,00

20,00

2

30,00

0,00

80,00

20,00

40,00

3

22,50

0,00

40,00

20,00

30,00

4

10,00

0,00

45,00

5,00

25,00

5

10,00

0,00

40,00

5,00

30,00

6

30,00

20,00

40,00

22,50

37,50

7

25,00

0,00

40,00

15,00

35,00

8

20,00

0,00

80,00

10,00

40,00

9

20,00

0,00

50,00

20,00

30,00

10

30,00

00,00

80,00

17,50

30,00

11

30,00

10,00

40,00

20,00

30,00

Der Anteil der 24 Proben der Nichtraucher verteilte sich weitgehend homogen über die Gruppen, wobei der mittlere Anteil an der gesamten Probenzahl bei 91% lag. In der Gruppe ohne Tumorloading und ohne Therapie (Gruppe 11) sowie in der kleinen Gruppe unter Strahlentherapie befanden sich ausschließlich Raucher.

Der kumulative Nikotinabusus war in dem überwiegend aus Rauchern bestehenden Kollektiv bei den Patienten mit bzw. ohne chronischer Bronchitis (bezogen auf die Anzahl der Proben) im Mann-Whitney-U-Test in der Gruppe der Bronchitiker signifikant gegenüber denjenigen ohne Bronchitis erhöht (p=0,019).

Abb. 1: kumulativer Nikotinabusus / chronische Bronchitis


60

5.3 Zytologische Parameter der BALF

5.3.1 Vitalitätsprüfung der Zellen in der BALF

Die Vitalitätsprüfung der durch bronchoalveolären Lavage gewonnenen Zellen erfolgte mit der Trypan-Blau-Methode. Im Mittel lag der Anteil der hiermit gefärbten avitalen Zellen in der BALF zwischen 25% und 35% mit einer Spannweite von 3% bis maximal 50%. Das Verteilungsmuster innerhalb der Subgruppen der Proben (nicht dargestellt) erbrachte im Kruskal-Wallis-Test keine signifikanten Unterschiede.

5.3.2 Gesamtzellzahl in der BALF

Zur besseren Vergleichbarkeit wurde die Gesamtzellzahl in Zellzahl x 106 pro 100 ml BALF ausgedrückt. Hierfür wurde die aus dem Pellet gewonnene Zellzahl durch die Recovery geteilt und mit 100 multipliziert.

Abb. 2: Zellzahl (/100ml BALF) / Gruppen

Die höchsten Zellzahlen fanden sich in den BALF-Proben der Patienten unter Strahlentherapie, wobei sich in dieser Gruppe allerdings lediglich 4 Proben von 4 Patienten befanden. Adaptiert an die geringe Fallzahl wurde Fisher's exakter Test angewendet, der im Vergleich zu der Gruppe 11, also Proben von Patienten, die vor mehr als 2 Jahren operiert und strahlentherapiert wurden, ein Signifikanzniveau von > 0,001 ergab.

Im Vergleich der Mediane (siehe Box-Plots) fand sich der zweithöchste Wert für die Gruppe, die


61

nach einer erfolgten Strahlentherapie erneut chemotherapiert wird. Im Mann-Whitney-U-Test war die Zellzahl hier gegenüber der Gruppe 11 ebenfalls signifikant erhöht (p>0,001).

Die nächsthöhere Zellzahl (Median) fand sich in der Gruppe der Patienten unter laufender Chemotherapie. Auch in dieser Gruppe war die Zellzahl signifikant gegenüber der Gruppe 11 erhöht (p>0,001, Mann-Whitney-U-Test).

Auffällig war, daß die Zellzahlen nach zytoreduktiver Therapie rasch abfielen und bereits 2,5 Monate nach Chemotherapie nicht mehr signifikant gegenüber den als Kontrollgruppe dienenden Proben der Gruppe 11 erhöht waren. Bei Z.n. Radiotherapie fand sich in der Gruppe bis 2,5 Monate nach Therapieende noch eine deutliche Erhöhung der Zellzahlen, nach 2,5 Monaten war jedoch auch dieser therapieassoziierte Anstieg der Zellzahlen in den BALF nicht mehr nachweisbar.

In den Proben der Gruppe 7 lag der Median der Zellzahl bei 13,24 /100 ml BALF, 25. und 75. Percentil bei 11,98 und 16,77. Die Patienten mit Pneumonitis wiesen hierzu mit Zellzahlen von 19, 26 und 29 Zellen /100 ml BALF deutlich höhere Werte auf. In der Gruppe 8 lagen die beiden Patienten mit manifester Lungenfibrosierung mit 23 und 26 Zellen/100 ml BALF ebenfalls über dem Gruppenmedian (3,34, 25. Perzentil 2,0, 75. Perzentil 9,43 Zellen/100 ml BALF).

Eingesetzt wurden sowohl für das NSCLC wie das SCLC vorrangig Polychemotherapien, die beim nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom in der first-line Therapie zumeist platinbasiert waren.

Während in der Probengruppe von Patienten mit primärer Chemotherapie ausschließlich Polychemotherapien verabreicht wurden, kamen bei 3 Patienten nach Radiotherapie auch Monotherapien zum Einsatz. In der Polychemotherapiegruppe wurde für die weitere Analyse zwischen platinbasierten und nicht platinbasierten Therapien unterschieden. Hier fand sich unter primärer Chemotherapie kein Unterschied zwischen den Therapiegruppen, während nach vorangegangener Strahlentherapie die platinbasierte Chemotherapie zu einer signifikant erhöhten Zellzahl in der BALF führte (Mann-Whitney-U-Test, p<0,05). Die weitere Zelldifferenzierung zeigte gleichsinnige Ergebnisse (nicht dargestellt).


62

Abb. 3: Zellzahl (/ 100ml BALF) / Gruppe

Um den möglichen Einfluß des Tumorgeschehens auf die Zellzahl in den BALF-Proben zu ermitteln, wurde getestet, ob die Gruppe, bei der ein Lungentumor frisch diagnostiziert wurde, gegenüber der Gruppe mit Patienten in kompletter Remission (Gruppe 11) eine erhöhte Zellzahl aufwies. Die Zellzahlen in beiden Gruppen waren jedoch ähnlich (Signifikanzniveau von p=0,45, Mann-Whitney-U-Test) .

45 Lavage-Proben stammten von Nichtrauchern, 216 von Rauchern. Der Anteil von Passivrauchern unter den Nichtrauchern, der anläßlich der Rauchgewohnheiten in den Haushalten sowie dem gegenüber nicht exponierten Nichtrauchern vermehrten Erkrankungsrisiko für ein Bronchialkarzinom zu vermuten ist, ließ sich nicht exakt erheben. In den Proben von Rauchern fand sich gegenüber den Proben von Nichtrauchern eine signifikant erhöhte Zellzahl (Mann-Whitney-U-Test, p>0,001).


63

Abb. 4: Zellzahl (/ 100 ml BALF) / Raucher

5.3.3 Durchflußzytometrische Zelldifferenzierung

Diese Untersuchungen standen nicht von allen Proben zur Verfügung. In den Gruppen wurden die folgende Anzahl von Proben systematisch durchflußzytometrisch aufgearbeitet:

Gruppe 1

5 Proben von 5 Patienten

Gruppe 2

7 Proben von 6 Patienten

Gruppe 3

4 Proben von 4 Patienten

Gruppe 4

6 Proben von 6 Patienten

Gruppe 5

8 Proben von 7 Patienten

Gruppe 6

3 Proben von 3 Patienten

Gruppe 7

5 Proben von 4 Patienten

Gruppe 8

8 Proben von 8 Patienten

Gruppe 9

9 Proben von 9 Patienten

Gruppe 10

6 Proben von 5 Patienten

Gruppe 11

10 Proben von 9 Patienten

Die durchflußzytometrisch erhaltenen Werte wurden lichtmikroskopisch am sogenannten Zytospin-Präparat mikroskopisch bestätigt, wobei sich im Mittel eine Divergenz von unter 5% ergab. Da zur weiteren Auswertung die durchflußzytometrischen Parameter (Helfer/Supressorzellen) herangezogen wurden, bildeten diese Daten auch die Grundlage der morphologischen Differenzierung.


64

5.3.3.1 Alveolarmakrophagen

Bei allen Patientengruppen überragte der Anteil an Alveolarmakrophagen bei den zellulären Bestandteilen. Auffällig war, daß der Anteil an Alveolarmakrophagen sowohl nach Chemo- als auch nach Strahlentherapie signifikant erniedrigt war (jeweils p<0,001, Mann-Whitney-U-Test), wobei dieser Effekt bei den Patienten nach Strahlentherapie etwas später, nämlich erst in der Gruppe nach 2,5 Monaten nach Therapieende einsetzte. Weiterhin fiel auf,

Abb. 5: Alveolarmakrophagen BALF (%) / Gruppe

daß unter Chemo- wie Radiotherapie der Makrophagenanteil gegenüber der Kontrollgruppe nicht verändert war, während nach vorangegangener Radiotherapie und erneuter Chemotherapie (Gruppe 10) der Makrophagenanteil geringgradig, jedoch signifikant (p<0,05, Mann-Whitney-U-Test) erniedrigt war.

5.3.3.2 Lymphozyten

Der lymphozytäre Anteil der BALF-Zellen stellte sich in den Gruppen wie folgt dar:


65

Abb. 6: Lymphozyten BALF (%) / Gruppe

In der Varianzanalyse ergaben sich entsprechend des differenten Verteilungsmusters in den Subgruppen signifikante Gruppenunterschiede. Wurden diese nichtparametrisch im Kruskal-Wallis-Test nachgeprüft, fanden sich sowohl nach Chemo- als auch nach Radiotherapie signifikant erhöhte Lymphozytenanteile gegenüber der Gruppe vor Therapie (p<0,05). Unter Chemotherapie waren die Lymphozytenzahlen signifikant erhöht, wenn eine Strahlentherapie vorausging. Ein Unterschied zwischen platinbasierter und nicht platinbasierter Chemotherapie war nicht auszumachen.

Mit einem Lymphozytenanteil von 8% und 10% zeigten die beiden Patienten mit Pneumonitis gegenüber dem Gruppenmittel (Gruppe 7, Median 5,5%, 25. Perzentile 5%, 75 Perzentile 9%) erhöhte Werte.


66

5.3.3.3 Neutrophile Granulozyten

Abb. 7: Neutrophile Granulozyten BALF (%) / Gruppe

Die in der BALF gewonnenen neutrophilen Granuloyzten entsprachen lichtmikroskopisch der Morphologie neutrophiler Granulozyten aus dem peripheren Blut. In den Patientengruppen fand sich folgender Verteilungsmodus: Während alle Patientengruppen unter Therapie nur sehr geringe Anteile an neutrophilen Granulozyten aufwiesen, war sowohl nach Chemo- als auch nach Radiotherapie der Anteil an Neutrophilen sowohl gegenüber den Therapiegruppen als auch der Kontrollgruppe signifikant erhöht (Mann-Whitney-U-Test, 0<0,05).

Die Patienten mit einer Lungenfibrosierung wiesen in ihrer Gruppe mit 85 und 88% deutlich erhöhte Werte auf: Median 76%, 25. Perzentil 61,75%, 75. Perzentil 84,25%)


67

5.3.3.4 Eosinophile Granulozyten

Abb. 8: Eosinophile Granulozyten BALF (%) / Gruppe

Der Anteil eosinophiler Granulozyten wurde lichtmikroskopisch am Zytospin-Präparat der BALF ausgezählt. In allen Probengruppen war ihr Anteil gering. Vermehrte Werte fanden sich in den Proben, die nach Chemo- oder Radiotherapie gewonnen wurden, wobei nach Chemotherapie ein relativer Anstieg von Eosinophilen unmittelbar anschließend, nach Radiotherapie im Intervall von 15 Monaten gesehen wurde. In der Kontrollgruppe war der Anteil an eosinophilen Granulozyten 0% (nicht dargestellt).

In der Patientengruppe mit Pneumonitis und Lungenfibrosierung war der Anteil an eosinophilen Granulozyten nicht erhöht.

5.3.3.5 Immunphänotypisierung der Lymphozytensubpopulationen

5.3.3.5.1 T-Helfer- und T-Suppressor.-Lymphozyten


68

Abb. 9: Positive BALF-Zelle (%) / Gruppe

Die Untersuchungen zeigen eine Überschneidung der Ergebnisse in den Subgruppen, die keine Differenzierung zwischen den Zeitpunkten unter und nach Therapie erlauben. Für die Gruppe 6 (unter Radiotherapie) lagen keine Meßergebnisse vor.


69

5.3.3.5.2 Verhältnis von T-Helfer- und T-Supressorlymphozyten

Abb. 10: T4/T8 Lymphozyten / Gruppe

Bei relativ geringer Fallzahl und hoher Streuung der Parameter schien lediglich die Gruppe nach Chemotherapie einen geringgradig verminderten T4/T8-Quotienten aufzuweisen. Dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant (Mann-Whitney-U-Test, p=0,1).

In der kleinen Gruppe der Patienten mit Pneumonitis bzw. Lungenfibrosierung ergaben sich durch die Analyse der Lymphozytensubpopulationen im Vergleich zu den Ergebnissen der Proben in den jeweiligen Gruppen tendenziell erniedrigte Werte.

5.4 Ergebnisse der biochemischen BALF-Untersuchungen

5.4.1 Quantifizierung der epithelialen Flüssigkeit (ELF)

In den bronchoalveolären Lavagen wurden auch bei standardisierter Gewinnungstechnik unterschiedliche Anteile des als Spülflüssigkeit instillierten Volumens (Recovery) zurückgewonnen. Die folgende Tabelle zeigt die zurückgewonnenen Volumina in den Patientengruppen (bezogen auf die gewonnenen Proben).


70

Tabelle 13: Recovery in ml in den Patientengruppen

Gruppe

Median

Minimum

Maximum

25. Perzentil

75. Perzentil

1

34,00

20,00

37,00

24,75

34,00

2

34,00

18,00

60,00

34,00

38,00

3

33,50

15,00

40,00

21,00

34,00

4

34,00

14,00

42,00

34,00

35,00

5

34,00

12,00

53,00

27,00

34,00

6

38,50

34,00

40,00

35,00

39,75

7

34,00

23,00

45,00

27,00

40,00

8

34,00

16,00

55,00

30,00

42,00

9

34,00

18,00

51,00

30,50

39,75

10

41,00

30,00

50,00

37,25

45,00

11

34,00

12,00

52,00

26,75

34,00

Die Recovery zeigte in allen Patientengruppen ein relativ ausgewogenes Verteilungsmuster, lediglich bei den Patienten, bei denen unter einer Chemotherapie nach vorangegangener Radiotherapie lavagiert wurde, war der Anteil der zurückgewonnenen BAL-Flüssigkeit mit 41 ml geringgradig erhöht (Kruskal-Wallis-Test, p<0,05).

Die Recovery zeigte keinen Zusammenhang mit dem Vorliegen einer chronischen Bronchitis (Mann-Whitney-U-Test, p=0,6).

Da alle in der Lavage analysierten Substanzen ursprünglich in dem epithelialen Flüssigkeitsfilm gelöst waren, ist eine Rekonstruierung der ursprünglichen Konzentration für den interindividuellen Vergleich der biochemischen Meßparameter wesentlich. Diese Umrechnung erfolgte mittels der Harnstoffverdünnungsmethode. Mögliche Einflüsse der unterschiedlichen Recovery auf die Berechnung der ELF wurden durch Bestimmung des ELF-Volumens pro 100 ml zurückgewonnene bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit ausgeschlossen.

Die aus BALF, Recovery und Harnstoffkonzentration errechneten ELF-Volumina wiesen in den einzelnen Gruppen nur geringe Schwankungen auf, die bei den relativ hohen Standardabweichungen in den Einzelgruppen nicht signifikant voneinander zu diskriminieren waren.


71

Abb. 11: ELF(ml/100ml BALF) / Gruppe

5.4.2 Gesamtprotein und Albumin

Abb. 12: Gesamtprotein (mg/ml ELF) / Gruppe


72

Abb. 13: Albumin (mg/ml ELF) / Gruppe

Die Konzentration von Gesamtprotein und Albumin in der BALF wurde auf das Volumen der Epithelial Lining Fluid umgerechnet und als mg/ml ELF dargestellt.

Signifikant erhöhte Werte für Gesamtprotein fanden sich in den Proben unter Strahlentherapie sowie unter Chemotherapie, sofern eine Strahlentherapie vorausgegangen war (Gruppe 10).

Als möglicher Marker einer Permeabilitätsstörung der alveolokapillären Membran wurde zusätzlich das Verhältnis von Albumin zum Gesamtprotein bestimmt.


73

Abb. 14: Quotient Gesamtprotein/Albumin / Gruppe

Die Verteilung des Quotienten von Gesamtprotein zu Albumin zeigte ein relativ homogenes Muster. Auffällig ist der signifikante Abfall dieses Quotienten in der Gruppe der Patienten, die nach einer erfolgten Radiotherapie erneut chemotherapiert wurden (Gruppe 10, Mann-Whitney-U-Test, p<0,05). Weder die Protein- noch die Albuminkonzentration in der ELF zeigten eine Abhängigkeit von dem Vorliegen einer chronischen Bronchitis.

5.4.3 Nachweis spezifischer Bindegewebsproteine

Die folgenden Bindegewebsproteine wurden als Marker von Regenerierungs- bzw. Reparationsprozessen untersucht


74

5.4.3.1 Prokollagen-III-Peptid (P-III-P)

P-III-P wurde bestimmt, um die Kollagensynthese in der Lunge zu quantifizieren.

Abb. 15: P-III-P (U / ml ELF) / Gruppe

Die P-III-P Werte zeigten in den einzelnen Gruppen eine vergleichsweise große Streuung und erschienen ungerichtet. So waren die Werte nach wie unter Therapie teils erhöht, teils lagen sie im unteren Meßbereich. Bei den Patienten mit Pneumonitis lagen die Ergebnisse mit einem P-III-P-Spiegel in der ELF von 1,2 und zweimal 1,3 U/ml ELF über dem Gruppen- 75. Perzentil (Gruppe 7). In Gruppe 8 wurden in den Proben der beiden Patienten mit manifester Lungenfibrose mit 3,5 und 5,78 U/ml ELF die höchsten Werte gemessen.

5.4.3.2 Laminin-P1-Konzentrationen

In einer Vorserie fanden sich überwiegend Werte im Bereich der Nachweisgrenze des Tests, so daß wir für diese Messung eine Konzentrierung der Lavageflüssigkeit über eine fraktionierte Zentrifugation durchführten. Hierbei erfolgte eine Reduktion des Ausgangsvolumens von 2000 µl auf etwa 500 µl. Der Konzentrierungsfaktor betrug im Mittel 4,1 ± 0,3.


75

Abb. 16: Laminin (ng/ml ELF) / Gruppe

Auch diese Meßergebnisse zeigten eine relativ große Streuung der Einzelwerte, ohne daß sich gerichtete signifikante Gruppenunterschiede diskriminieren ließen.


76

5.5 Wachstumsfaktoren

5.5.1 Plateled derived growth factor (PDGF)

In den Patientengruppen fand sich folgende PDGF-Verteilung in der ELF:

Abb. 17: PDGF (ng / ml ELF) / Gruppe

Die PDGF-Spiegel in den Gruppen zeigten bis auf die Gruppe unter Radio-Chemotherapie (Gruppe 10, Erhöhung) und die Gruppe bis 2,5 Monate bzw bis 15 Monate nach Radiotherapie (Gruppe 6 und 7) keine signifikanten Abweichungen voneinander und sind von einer deutlichen Streuung der Einzelwerte gekennzeichnet. Auch das Patienten-Subset mit klinischer pulmonaler Manifestation nach Therapie zeigte keine im Gruppenvergleich erkennbar gerichteten Ergebnisse.


77

5.5.2 Basic fibroblast growth factor (bFGF)

Abb. 18: basic FGF (ng / ml ELF) / Gruppe

Auffällig waren die im Vergleich zur Kontrollgruppe gering erhöhten Konzentrationen von bFGF in der Gruppe vor Therapie sowie unter wie nach Chemotherapie (Mann-Whitney-U-Test, p<0,05), während nach Radatio ähnliche Werte wie in der Gruppe 11 gemessen wurden. Insgesamt zeigten die Werte gedoch eine starke Streuung innerhalb der Gruppen. Auch die Werte der 5 Patienten, die nach Therapie eine Pneumonitis oder Lungenfibrosierung entwickelt hatten, zeigten keine vom Gruppenmittel gerichtet abweichenden Ergebnisse der bFGF Spiegel in der ELF.


78

5.5.3 Epidermal growth factor (EGF)

Abb. 19: EGF (ng / ml ELF) / Gruppe

Die Meßergebnisse zeigten ähnliche EGF-Spiegel in allen Subgruppen, signifikante Gruppenunterschiede bestanden nicht. Diese Ergebnisse belegen, daß EGF kein sensitiver Marker für therapieassoziierte Lungenveränderungen bei Patienten mit Bronchialkarzinom ist. Lediglich ein EGF-Spiegel in den Proben der Patienten mit Pneumonitis zeigte einen erhöhten Wert, während in den Proben der Patienten mit Lungenfibrose keine erhöhten Spiegel auftraten.


79

5.5.4 Transforming growth factor beta (TGF-beta)

Abb. 20: TGFv (ng / ml) / Gruppe

In den Gruppen fand sich ein signifikanter Anstieg der TGF-beta-Spiegel nach Chemotherapie (Mann-Whitney-U-Test, p<0,05), jedoch kein Anstieg nach Radiotherapie. Hier fielen jedoch einzelne erhöhte Werte in den Proben auf, die 2,5 bis 15 Monate nach Radiotherapie gewonnen wurden und den Proben von Patienten entsprechen, die eine Lungenfibrose entwickelt haben (Gruppe 8). Auch in Gruppe 7 ist einer der deutlich gegenüber dem Gruppenmedian erhöhten Werte (siehe Graph) einer Probe eines Patienten mit Pneumonitis zuzuordnen.


80

5.5.5 Vascular epithel growth factor (VEGF)

Abb. 21: VEGF (ng / ml ELF) / Gruppe

Die Gruppen 1, 2, 6 und 10 zeigten gegenüber der Kontrollgruppe erhöhte VEGF-Werte (Mann-Whitney-U-Test, p<0,05), wobei die Werte vor Therapie, also in der Gruppe mit der größten Tumorlast, und unter Radiotherapie am höchsten lagen. Auffällig war weiterhin, daß die VEGF-Spiegel in der Chemotherapiegruppe signifikant höher lagen, wenn eine Radiotherapie vorausgegangen war (Mann-Whitney-U-Test, p<0,05). In den Proben der Patienten, die eine Pneumonitis entwickelt hatten, fanden sich gegenüber der Werteverteilung der Gruppe (Median 99,5 ng/ml ELF , 25. Perzentil 62,5 ng/ml ELF, 75. Perzentil 221,8 ng/ml ELF) mit 212, 219 und 233 ng/ml ELF deutlich erhöhte Werte. Auch bei den beiden Patienten, bei denen eine pulmonale Fibrosierung bestand, fanden sich überproportional hohe VEGF-Spiegel: Median 117,8 ng/ml ELF, 25. Perzentil 67,7 ng/ml ELF, 75. Perzentil 151,3 ng/ml ELF, Probe 1: 310 ng/ml ELF, Probe 2 320 ng/ml ELF.

In einem Subset von 16 Patienten wurden zusätzlich die VEGF-Spiegel im peripheren Blut gemessen. Hier ergab sich ein nicht sehr ausgeprägter, jedoch signifikanter direkter Zusammenhang (r = 0,38, p < 0,01, Freadman Korrelationskoeffizient).


81

5.6 Zytokine

5.6.1 Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-alpha)

Abb. 22: TNFalpha (ng / ml ELF) / Gruppe

Das Ergebnis zeigte gegenüber der Kontrollgruppe deutlich erhöhte TNF-alpha-Spiegel in der Patientengruppe, die bestrahlt wurde, und in der Chemotherapiegruppe, wenn eine Radiatio vorausgegangen war (Mann-Whitney-U-Test, jeweils p<0,01) . Auch die Patienten mit manifester pulmonaler Therapiefolge zeigten erhöhte TNF-alpha Werte: Gruppe 7 (Werte in Klammern von Gruppe 8): Median 0,54 (0,66) ng/ml ELF, 25. Perzentil 0,24 (0,12) ng/ml ELF, 75. Perzentil 1,75 (0,98) ng/ml ELF, Proben 1-3 (1 und 2): 1,6, 1,8 und 2,1 (1,2, 1,4) ng/ml ELF.


82

5.6.2 Interleukin 1 (IL-1).

Abb. 23: IL-1 (ng / ml ELF) / Gruppe

Die höchsten Werte für IL-1 in der ELF fanden sich in der Gruppe unter Radiotherapie, während die Ergebnisse vor und unter Chemotherapie ähnlich und von denen der Kontrollgruppe nicht different waren. Signifikant erhöhte Werte fanden sich in den Proben der Patienten, die sich nach Radiotherapie einer erneuten Chemotherapie unterzogen. Auch die Werte der Patienten mit Pneumonitis (Gruppe 7) oder Lungenfibrosierung (Gruppe 8) zeigten mit Werten, die in den Gruppen über der 75. Perzentil (Gruppe 7: 28,9, Gruppe 8: 23,9 ng/ml ELF) lagen, erhöhte IL-1 Spiegel.


83

5.6.3 Interleukin 2 (IL-2)

Abb. 24: IL-2 (ng / ml ELF) / Gruppe

In den meisten Gruppen lagen die IL-2-Spiegel unter der Nachweisgrenze. Erhöhte Werte fanden sich in den beiden Chemotherapiegruppen, nicht jedoch in den Proben der Patienten, die radiotherapiert wurden. Auch bei den Patienten mit Pneumonitis oder Lungenfibrose war IL-2 nicht nachweisbar.


84

5.6.4 Interleukin 6 (IL-6)

Abb. 25: IL-6 (ng / ml ELF) / Gruppe

In den Gruppen fanden sich unter Therapie gegenüber der Kontrollgruppe keine erhöhten IL-6- Werte, während nach der Chemotherapie (Gruppe 3 und 4) IL-6 vermehrt in den ELF-Proben nachweisbar war. Hierbei ist der IL-6 Wert bis 2,5 Monate nach Chemotherapie signifikant höher als 2,5 Monate nach Strahlentherapie. Unter Radiatio stand nur ein Meßwert zur Verfügung.

Die Patienten mit Pneumonitis und Fibrose zeigten mit Werten überhalb der 75. Perzentile innerhalb ihrer Gruppen (Gruppe 7 und 8) erhöhte IL-6 Spiegel (Gruppe 7: Median 14,5 ng/ml ELF, 25. Perzentil 8,9 ng/ml ELF, 75. Perzentil 20,2 ng/ml ELF, Proben 1-3: 21, 23 und 30 ng/ml ELF, Gruppe 8: Median 23,1 ng/ml ELF, 25. Perzentil 12,0 ng/ml ELF, 75. Perzentil 51,7 ng/ml ELF, Proben 1 und 2: 55 und 63 ng/ml ELF).


85

5.6.5 Interleukin 8 (IL-8)

Abb. 26: IL-8 (ng / ml ELF) / Gruppe

In allen Therapiegruppen fanden sich gegenüber den Werten in Gruppe 11 erhöhte IL-8- Spiegel in der ELF, wobei die höchsten Werte in der Gruppe unter Radiotherapie gemessen wurden. In den Proben vor Chemotherapie war gegenüber der Kontrollgruppe der IL-8 Spiegel nicht erhöht. Auffällig war, daß noch lange Zeit nach Chemo- bzw. Strahlentherapie die IL-8 Spiegel gegenüber der Kontrollgruppe erhöht blieben. Die IL-8-Spiegel der Gruppe 9 waren gegenüber der Gruppe 8 nicht signifikant erhöht (Mann-Whitney-U-Test, p=0,06). Die höchsten Werte in den Gruppen 7 und 8 wurden von Proben der Patienten mit pulmonaler Krankheitsaktivität gebildet.


86

5.7 Parameter des Oxidantien/Antioxidantien-Gleichgewichts

5.7.1 Methioninsulfoxidgehalt alveolärer Proteine als Indikator der pulmonalen oxidativen Belastung

Abb. 27: MET (0) [%] / Gruppe

Der Anteil oxidierter zu nicht oxidierten Methioninresten war in den Therapiegruppen (Gruppe 2, 6 und 10) sowohl gegenüber der Gruppe vor Therapie als auch der Referenzgruppe signifikant erhöht (Mann-Whitney-U-Test, p<0,05). Die höchsten relativen Werte oxidierten Methionins fanden sich in der Gruppe unter Strahlentherapie. In den Proben nach Radio- wie Chemotherapie lag der oxidierte Methioninanteil in einem untereinander wie zur Kontrollgruppe ähnlichem Niveau. Ebenfalls nicht signifikant different war der Methioninsulfoxidgehalt zwischen Rauchern und Nichtrauchern in den Einzelgruppen (Kruskal-Wallis-Test, asymptotische Signifikanz: p=0,09). Der Anstieg des Methioninsulfoxidgehaltes der ELF-Proteine war an einen Glutathion-Konzentrations-Schwellenwert gekoppelt, der bei etwa 400 µM lag (nicht dargestellt).

In den Gruppen 7 und 8 lagen die Werte der Patienten mit Pneumonitis oder Lungenfibrose deutlich über der jeweiligen 75. Perzentile: Gruppe 7 (in Klammern Werte für Gruppe 8): Median 2,9% (4,1%), 25. Perzentil 2,2% (2,1%), 75. Perzentil 4,5% (5,9%), Patientenproben 1-3: 5,2%, 5,4%, 6,1% (7,3%, 8,4%).

5.7.2 Glutathion

Die mittlere Gesamt-Glutathionkonzentration in der ELF lag bei den Proben, die von Rauchern gewonnen worden waren, über alle Gruppen gemittelt um den Faktor 2,5 höher (nicht dargestellt).


87

Die höchsten Glutathion-Werte wurden in der Gruppe vor Therapie gemessen, die jedoch zu den Proben in der Kontrollgruppe nicht signifikant erhöht waren (Mann-Whitney-U-Test, p=0,2), was durch den Umstand erklärt werden könnte, daß sich in der Kontrollgruppe ausschließlich Raucher befanden.

Deutlich erniedrigte Glutathion-Werte fanden sich in den Gruppen unter Chemotherapie, wobei hier zudem der Anteil des reduzierten Glutathions am Gesamt-Glutathion vermindert war.

Glutathionkonzentration in der ELF

Abb. 28: Glutathion (10~6 M) / Gruppe


88

Abb. 29: Verhältnis von reduziertem zu Gesamt-Glutathion / Gruppe

Glutathion-Werte unter Strahlentherapie (Gruppe 6) standen nicht zur Verfügung. Es war jedoch auffällig, daß nach Chemo- wie Strahlentherapie ein zeitabhängiger Erholungsvorgang mit langsamem Anstieg der Glutathion-Konzentration in der ELF zu beobachten war. Bemerkenswert hierbei war, daß sich das Verhältnis von reduziertem zu Gesamt-Glutathion rascher als der Gesamt-Glutathion-Wert normalisierte und lediglich unmittelbar unter der Therapie vermindert war.

In der Gruppe von Patienten mit Pneumonitis oder Lungenfibrosierung fanden sich jeweils deutlich erniedrigte Werte für Gesamt-Glutathion und ein verminderter Anteil an reduziertem Glutathion:

Gruppe 7: Glutathion Median 600 10-6 M, GSH 570 10-6 M, 25. Perzentil Glutathion 564 10-6 M, GSH 541 10-6 M, 75. Perzentil Glutathion 598 10-6 M, GSH 582 10-6 M, Proben 1-3: Glutathion 542, 548 und 554 10-6 M, GSH 529, 521, 529 10-6 M.

Gruppe 8: Glutathion Median 648 10-6 M, GSH 631 10-6 M, 25. Perzentil Glutathion 600 10-6 M, GSH 567 10-6 M, 75. Perzentil Glutathion 750 10-6 M, GSH 726 10-6 M, Proben 1und 2: Glutathion 562 und 555 10-6 M, GSH 531 und 520 10-6 M.

5.8 Hitzeschockproteine (HSP)

Diese Untersuchungen konnten an einem Subset von 21 Proben durchgeführt werden. Dargestellt wird der Prozentsatz von Alveolarmakrophagen, bei denen durchflußzytometrisch eine Expression des jeweiligen Hitzeschockproteins nachweisbar war.


89

Tabelle 14: Prozentsatz von Alveolarmakrophagen, bei denen durchflußzytometrisch eine Expression des jeweiligen Hitzeschockproteins nachweisbar war

Gruppe

2

3

4

5

7

8

9

11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

HSP-70 (%)

 

 

 

 

 

 

 

 

24,18

 

 

 

 

 

X

 

 

27,57

 

X

 

 

 

 

 

 

59,92

 

 

 

 

 

 

X

 

62,87

 

 

 

 

 

X

 

 

67,45

 

 

 

 

 

 

 

X

68,93

 

 

 

 

 

 

X

 

73,54

 

 

 

 

X

 

 

 

79,14

 

 

X

 

 

 

 

 

80,06

X

 

 

 

 

 

 

 

80,91

X

 

 

 

 

 

 

 

84,02

 

 

 

 

 

 

 

X

86,01

 

 

 

 

 

 

 

X

86,42

 

 

 

 

 

X

 

 

86,62

 

 

 

X

 

 

 

 

87,20

X

 

 

 

 

 

 

 

88,15

X

 

 

 

 

 

 

 

90,19

 

 

 

 

 

 

 

X

91,60

 

 

 

 

 

 

X

 

94,68

 

 

 

 

X

 

 

 

96,00

 

 

 

 

 

X

 

 

99,32

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gruppe

2

3

4

5

7

8

9

11


90

Tabelle 15: Prozentsatz von Alveolarmakrophagen, bei denen durchflußzytometrisch eine Expression des jeweiligen Hitzeschockproteins nachweisbar war

Gruppe

2

3

4

5

7

8

9

11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

HSP-90 (%)

 

 

 

 

 

 

 

 

20,61

 

 

 

 

 

 

X

 

23,93

 

 

 

 

 

 

X

 

26,49

 

 

 

 

 

X

 

 

29,00

 

 

 

 

 

X

 

 

44,28

 

 

 

 

 

 

 

X

46,17

 

X

 

 

 

 

 

 

47,10

 

 

 

 

 

X

 

 

47,27

 

 

 

 

 

X

 

 

48,21

 

 

 

 

 

 

 

X

55,48

 

 

 

 

X

 

 

 

59,06

 

 

 

 

 

 

 

X

63,53

 

 

 

 

 

 

X

 

67,52

X

 

 

 

 

 

 

 

84,57

X

 

 

 

 

 

 

 

85,82

X

 

 

 

 

 

 

 

91,71

 

 

 

 

 

 

 

X

91,98

 

 

X

 

 

 

 

 

94,13

 

 

 

X

 

 

 

 

94,54

 

 

 

 

X

 

 

 

98,25

X

 

 

 

 

 

 

 

99,54

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gruppe

2

3

4

5

7

8

9

11

Für die Gruppen unter Radiotherapie (Gruppe 6) und unter Chemotherapie nach vorangegangener Radiotherapie standen keine Meßdaten zur Verfügung. Für HSP-90 schien sich im Vergleich zur Kontrollgruppe eine höhere Expression in den Proben unter Chemotherapie (Gruppe 2) anzudeuten. Hier fand sich in Fisher's exaktem Test für kleine Stichproben eine Signifikanz von lediglich 0,2 (nicht signifikant), jedoch eine Punkt-Wahrscheinlichkeit von 0,043.

Zusammenfassend konnte an den vorliegenden Ergebnissen zur HSP-70 und HSP-90 Expression an BALF-Zellen lediglich tendenziell eine vermehrte HSP-90 Expression unter Chemotherapie abgelesen werden.


91

5.9 Korrelationen zwischen den einzelnen Untersuchungsparametern

Die Ergebnisse des Zusammenhangs der gemessenen Parameter in der ELF untereinander sind in Tabelle 16 dargestellt. Erwartungsgemäß zeigen die Konzentrationen von Gesamt-Glutathion, reduziertem Glutathion und Methioninsulfoxidgehalt einen sehr engen Zusammenhang, der die Interaktion dieser zentralen Parameter des pulmonalen Oxidantien/Antioxidantien-Systems dokumentiert. Weiterhin sind insbesondere die Zytokine IL-6 und IL-8, hochsignifikant invers mit der Glutathion-Konzentration in der ELF verbunden. Ebenfalls ein enger Zusammenhang besteht zwischen der Gesamt-Zellzahl und dem Anteil an neutrophilen Granulozyten, also den Zellpopulationen, die Zytokineinwirkung reaktive Sauerstoffspezies generieren (s.u.).


92

Tabelle 16: Korrelationskoeffizienten zwischen ELF- Parametern (Korrelationskoeffizient "r" nach Freadman, Signifikanzniveau ("p") darunter)

Parameter

IL-1

IL-2

IL-6

IL-8

TNF-a

TGFb

VEGF

EGF

GN

GSH

Met(O)

IL-2

0,25

<0,05

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IL-6

0,35

<0,01

0,25

<0,05

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IL-8

0,51

<0,01

0,43

<0,01

0,49

<0,01

 

 

 

 

 

 

 

 

TNF-a

0,61

<0,01

0,24

<0,05

0,37

<0,01

0,53

<0,01

 

 

 

 

 

 

 

TGF-b

0,26

<0,05

0,10

n.s.

0,43

<0,01

0,32

<0,05

0,42

<0,01

 

 

 

 

 

 

EGF

0,14

n.s.

0,07

n.s.

0,13

n.s.

0,11

n.s.

0,08

n.s.

0,32

<0,05

 

 

 

 

 

VEGF

0,23

<0,05

0,25

<0,05

0,31

<0,01

0,48

<0,01

0,41

<0,01

0,24

<0,05

0,36

<0,05

 

 

 

 

GN

-0,27

<0,05

-0,33

<0,01

-0,41

<0,05

-0,61

<0,01

-0,54

<0,01

-0,25

<0,05

-0,31

<0,01

0,13

n.s.

 

 

 

GSH

-0,25

<0,05

-0,32

<0,01

-0,42

<0,05

-0,60

<0,01

-0,55

<0,01

-0,22

<0,05

-0,33

<0,01

0,08

n.s.

0,99

<0,01

 

 

Met(O)

0,31

<0,05

0,22

<0,05

0,64

<0,01

0,56

<0,01

0,49

<0,01

-0,07

<0,01

0,43

<0,01

0,21

n.s.

0,82

<0,01

0,83

<0,01

 

Zellenzahl

0,31

<0,05

0,22

<0,05

0,58

<0,01

0,61

<0,01

0,42

<0,01

0,12

n.s.

0,33

<0,01

0,04

n.s.

-0,47

<0,01

-0,49

<0,01

0,62

<0,01

PMN

0,36

<0,01

0,29

<0,05

0,61

<0,01

0,57

<0,01

0,41

<0,01

0,45

<0,01

0,47

0,01

0,13

n.s.

-0,53

<0,01

-0,55

<0,01

0,58

<0,01

Recovery

0,11

n.s.

0,10

n.s.

0,04

n.s.

0,08

n.s.

0,07

n.s.

0,12

n.s.

0,06

n.s.

0,03

n.s.

0,11

n.s.

0,03

n.s.

0,02

n.s.

Legende: n.s. : nicht signifikant; IL-1 : Interleukin 1; IL-2 : Interleukin 2; IL-6 : Interleukin 6; IL-8 : Interleukin 8; TNF-a : TNF-alpha; TGF-b : TGF-beta; EGF : epidermal growth factor; VEGF : vaskular endothelial growth factor; GN : Gesamt-Glutathion; GSH : reduziertes Glutathion; Meth(O) : prozentualer Anteil der oxidierten Methioninreste am Gesamtmethioningehalt der ELF-Proteine; PMN : polymorphkernige neutrophile Granulozyten.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Oct 5 14:08:04 2001