Beinert, Herrn Dr. med. Thomas : Untersuchungen zur oxidativen Lungenbelastung unter Radio-Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Bronchialkarzinom

Aus der medizinischen Klinik und Poliklinik II
mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Habilitationsschrift
Untersuchungen zur oxidativen Lungenbelastung unter
Radio-Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Bronchialkarzinom

Zur Erlangung der Venia legendi
für das Fach

Innere Medizin

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


von Herrn Dr. med. Thomas Beinert,
geboren am 29.9.1955 in München

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
Gutachter: Prof. Drings, Heidelberg

Datum der Promotion: 2.6.2000

Zusammenfassung:

Reaktive Sauerstoffspezies sind die entscheidenden Faktoren der pulmonalen Toxizität unter Radio-Chemotherapie. Sie induzieren eine akute pulmonale entzündliche Reaktion, unter der es zur Ausschüttung einer sich selbst verstärkenden Zytokinkaskade im Sinne eines
multifaktoriellen Zytokinnetzwerkes und in der Folge unter einer persistierenden Zytokinkaskade zur Generierung von sekundären reaktiven Sauerstoffspezies kommt.

Die Aktivierung dieser Zytokinkaskade ist noch Monate nach Chemotherapie oder Strahlentherapie auch bei Patienten, die klinisch keine Symptome der Lungenschädigung zeigen, nachweisbar. Dieser Prozeß kann, ähnlich wie bei der fibrosierenden Alveolitis, mit einer Fibrosierung des Lungengewebes und mit Ablagerung von extrazellulärer Matrix einhergehen.

Die vorliegende Arbeit hat durch die systematische Analyse an 261 Lavagen von 199 Bronchialkarzinom-Patienten vor, unter und nach zytoreduktiver Therapie die Determinanten des oxidativen pulmonalen Stress untersucht.

Als Meßparameter des akuten oxidativen Stress ist die Gesamtzellzahl in der BALF, der Methioninsulfoxidgehalt sowie die Konzentration von Glutathion, IL-1, IL-6 und IL-8, TNF-alpha, weiterhin die VEGF-Konzentration in der ELF geeignet. Erstmalig gezeigt werden konnte hierbei, daß VEGF nicht nur im Rahmen der Neoangiogenese, sondern auch durch reaktive Sauerstoffspezies hochreguliert wird und oxidativen Stress sensitiv anzeigt.

Bei manifester Lungenfibrosierung könnte P-III-P ein sensitiver Marker der Fibroblasten-aktivierung und der Produktion extrazellulärer Matrix sein. Die Untersuchungen ergaben zwischen den Folgen der Strahlentherapie und Chemotherapie lediglich quantitative, keine qualitativen Unterschiede.

Die vorliegende Arbeit möchte die Grundlage schaffen, dosisintensivierte multimodale Therapien bezüglich der oxidativen pulmonalen Belastungen bei Patienten mit Bronchialkarzinom invasiv zu monitoren. Dies könnte eine individuelle Dosisoptimierung durch die Bestimmung der oxidativen
pulmonalen Kapazität, insbesondere der Glutathionkonzentration in der ELF, schaffen.

Schlagwörter:
Schlagworte: Lunge, Krebs, Chemotherapie, Radiotherapie, oxidativer Stress

Abstract:

Induction of reactive oxygen is the main pathway of acute pulmonary injury
during radio-chemotherapy. This release of cytokines during inflammation
leads to a self perpetuating cytokine cascade as a cytokine network,
resulting in the generation of secondary oxidative stress.

This cytokine activation is detectable during therapy as well as months
after therapy, even if the patient is clinically asymptomatic. This
activated cytokine network can be accompanied by the deposition of
extracellular matrix (similar as in lung fibrosis).

In our study, we analysed 261 bronchoalveolar lavages (BAL) from 199
patients with lung carcinoma under, before and after chemotherapy and / or
radiotherapy.

The following BAL parameters indicating oxidative stress were found: total
cell count, concentration of methionine sulfoxide, gluthatione, IL-1,
IL-6, IL-8, TNF-alpha and VEGF. It was shown for the first time that VEGF
is also upregulated by oxidative stress. If lung fibrosis is manifest,
P-III-P could be a marker of activation of fibroblasts and of the
production of extracellular matrix. In general, differences found in
measured parameters during chemotherapy or radiotherapy were of
quantitative, not of qualitative nature.

Our study wants to lay the groundwork in monitoring pulmonary stress
invasively in lung cancer patients. This could lead to better individual
dose application by defining the antioxidative capacity, especially the
gluthatione concentration in the BAL.

Keywords:
keywords: lung, cancer, chemotherapy, radiotherapy, oxidative stress


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur oxidativen Lungenbelastung unter Radio-Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Bronchialkarzinom
1 Einleitung
1.1Epidemiologie des Bronchialkarzinoms
1.2Therapie des Bronchialkarzinoms
1.3Pulmonale Nebenwirkungen der zytoreduktiven Therapie
1.4Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)
1.4.1Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies
1.5Die Lunge als Zielorgan oxidativer Schäden
1.6Bisherige Untersuchungen an der BALF von Patienten mit soliden Tumoren
2 Hintergrund
2.1Anatomische Vorbemerkungen
2.1.1Die Lungenperipherie
2.1.2Das Lungeninterstitium
2.1.3Der interstitielle Raum
2.1.4Die Basalmembran
2.2Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
2.2.1Zelluläre Bestandteile der BAL
2.2.1.1Monozyten/Alveolarmakrophagen
2.2.1.2Neutrophile Granulozyten
2.2.1.3Eosinophile Granulozyten
2.2.1.4Lymphozyten
2.2.2Nicht zelluläre Bestandteile der BAL
2.2.2.1Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-alpha)
2.2.2.2Interleukin 6 (IL-6)
2.2.2.3Wachstumsfaktoren
2.2.2.3.1Transforming Growth Factor (TGF-beta)
2.2.2.3.2Plateled-derived growth factor (PDGF)
2.2.2.3.3Vascular epithel growth factor (VEGF)
2.3Fibroblasten
2.3.1Fibroblastenaktivierung
2.3.2Kollagenbildung als Folge der Fibroblastenaktivierung
2.4Das intrapulmonale System der antioxidativen Abwehr
2.4.1Antioxidative Enzymsysteme
2.4.2Nicht-enzymatische Anitoxidantien
2.4.3Das pulmonale Glutathionsystem
2.4.4Methioninsulfoxid als Indikator intrapulmonaler ROS-Belastung
2.5Hitzeschockproteine (HSP)
2.6Reaktive Sauerstoffspezies unter zytoreduktiver Therapie
2.6.1Chemotherapie
2.6.1.1Bleomycin
2.6.1.2Cyclophosphamid und Ifosfamid
2.6.1.3Anthrazykline
2.6.2Wirkmechanismen ROS-vermittelter Lungenschädigungen unter Chemotherapie
2.6.3Strahlentherapie
2.6.3.1Wirkmechanismus
2.6.3.2Pulmonale Toxizität
2.6.4Klinische Bilder pulmonaler Toxizität unter zytoreduktiver Therapie
2.6.4.1Pneumonitis
2.6.4.2Lungenfibrose
3 Fragestellung
4 Material und Methoden
4.1Patientenkollektiv
4.1.1Einteilung in die Therapiegruppen
4.1.2Tumorhistologie
4.1.3Aufteilung der Lavage-Proben auf die Patientengruppen
4.1.4Remissionskriterien
4.2Bronchoalveolären Lavage (BAL)
4.2.1Prinzip der BAL
4.2.2Durchführung der BAL
4.2.3Aufbereitung der Proben
4.2.4Zytologische Untersuchungen
4.2.4.1Anfertigung der Zytozentrifugenpräparate
4.2.4.1.1Zytologische Färbungen
4.2.4.2Vitalitätsnachweis der Zellen
4.2.4.3Immunophänotypisierung der BALF-Lymphozyten
4.2.4.3.1Vorbereitung des Zell-Pallets zur FACS-Analyse
4.2.4.3.2Aufbereitung von peripherem Blut für die FACS-Analyse
4.2.4.4FACS-Analyse der intrazellulären Hitzeschockproteine
4.2.4.5Zytokin-Nachweis mittels ELISA
4.2.5Biochemische Untersuchungen der BALF
4.2.5.1Bestimmung des Volumens der ELF
4.2.5.1.1Prinzip der Harnstoffbestimmung
4.2.5.1.2Testansatz
4.2.5.2Gesamteiweiß
4.2.5.3Albumin
4.2.5.4Nachweis von Laminin in der BALF
4.2.5.5N-terminales Prokollagen-III-Peptid (N-P-III-P)
4.2.6Neoangiogene Faktoren und Wachstumsfaktoren
4.2.7Methioninsulfoxid
4.2.8Gesamtglutathion
4.2.8.1Glutathiondisulfid / reduziertes Glutathion
4.2.8.1.1HPLC (high performance liquid chromatography)
4.3Statistik
5 Ergebnisse
5.1Einteilung der Proben
5.2Anthropometrische Daten
5.2.1Altersverteilung
5.2.2Geschlechtsverteilung und Tumorhistologie in den Patientengruppen
5.2.3Chronische Bronchitis und Nikotinabusus
5.3Zytologische Parameter der BALF
5.3.1Vitalitätsprüfung der Zellen in der BALF
5.3.2Gesamtzellzahl in der BALF
5.3.3Durchflußzytometrische Zelldifferenzierung
5.3.3.1Alveolarmakrophagen
5.3.3.2Lymphozyten
5.3.3.3Neutrophile Granulozyten
5.3.3.4Eosinophile Granulozyten
5.3.3.5Immunphänotypisierung der Lymphozytensubpopulationen
5.3.3.5.1T-Helfer- und T-Suppressor.-Lymphozyten
5.3.3.5.2Verhältnis von T-Helfer- und T-Supressorlymphozyten
5.4Ergebnisse der biochemischen BALF-Untersuchungen
5.4.1Quantifizierung der epithelialen Flüssigkeit (ELF)
5.4.2Gesamtprotein und Albumin
5.4.3Nachweis spezifischer Bindegewebsproteine
5.4.3.1Prokollagen-III-Peptid (P-III-P)
5.4.3.2Laminin-P1-Konzentrationen
5.5Wachstumsfaktoren
5.5.1Plateled derived growth factor (PDGF)
5.5.2Basic fibroblast growth factor (bFGF)
5.5.3Epidermal growth factor (EGF)
5.5.4Transforming growth factor beta (TGF-beta)
5.5.5Vascular epithel growth factor (VEGF)
5.6Zytokine
5.6.1Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-alpha)
5.6.2Interleukin 1 (IL-1).
5.6.3Interleukin 2 (IL-2)
5.6.4Interleukin 6 (IL-6)
5.6.5Interleukin 8 (IL-8)
5.7Parameter des Oxidantien/Antioxidantien-Gleichgewichts
5.7.1Methioninsulfoxidgehalt alveolärer Proteine als Indikator der pulmonalen oxidativen Belastung
5.7.2Glutathion
5.8Hitzeschockproteine (HSP)
5.9Korrelationen zwischen den einzelnen Untersuchungsparametern
6 Diskussion
6.1Zelluläre Bestandteile der BALF
6.2Zytokine und Wachstumsfaktoren
6.3Bindegewebsproteine
6.4Hitzeschockproteine
6.5Glutathionsystem und Methioninsulfoxidgehalt der alveolären Proteine
6.6Patientenkollektiv
7 ROS-assoziierte pulmonale Krankheitsbilder
8 Therapieansätze zur Modulation des pulmonalen oxidativen Stress bei Lungenerkrankungen
9 Zusammenfassung
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der Abkürzungen
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Symptome bei Erstdiagnose eines Bronchialkarzinoms bei 650 Patienten (Hopwood et Stephens,1995)
Tabelle 2: Histomorphologische Klassifikation und relative Häufigkeit maligner epithelialer Lungentumore (Beinert et al.,1998)
Tabelle 3: Intrapulmonale Mechanismen der Zellschädigung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS)
Tabelle 4: Reaktive Sauerstoffspezies:
Tabelle 5: Pulmonale Toxizität zytoreduktiver Pharmaka (nach Niedermeyer et al., 1996)
Tabelle 6: Verwendete Chemotherapiekombinationen zur Behandlung des Bronchialkarzinoms
Tabelle 7: Charakteristika der Patienten bezogen auf die Gruppen der analysierten Proben
Tabelle 8: Die Altersverteilung in den einzelnen Gruppen, bezogen auf die Anzahl der Proben
Tabelle 9: Ränge der Altersverteilung innerhalb der Patientengruppen
Tabelle 10: Geschlechtsverteilung und die Tumorhistologie in den Therapiegruppen
Tabelle 11: chronische Bronchitis in den Therapie-Subgruppen
Tabelle 12: Verteilung des kumulative Nikotinabusus auf die Therapie-Subgruppen
Tabelle 13: Recovery in ml in den Patientengruppen
Tabelle 14: Prozentsatz von Alveolarmakrophagen, bei denen durchflußzytometrisch eine Expression des jeweiligen Hitzeschockproteins nachweisbar war
Tabelle 15: Prozentsatz von Alveolarmakrophagen, bei denen durchflußzytometrisch eine Expression des jeweiligen Hitzeschockproteins nachweisbar war
Tabelle 16: Korrelationskoeffizienten zwischen ELF- Parametern (Korrelationskoeffizient "r" nach Freadman, Signifikanzniveau ("p") darunter)

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: kumulativer Nikotinabusus / chronische Bronchitis
Abb. 2: Zellzahl (/100ml BALF) / Gruppen
Abb. 3: Zellzahl (/ 100ml BALF) / Gruppe
Abb. 4: Zellzahl (/ 100 ml BALF) / Raucher
Abb. 5: Alveolarmakrophagen BALF (%) / Gruppe
Abb. 6: Lymphozyten BALF (%) / Gruppe
Abb. 7: Neutrophile Granulozyten BALF (%) / Gruppe
Abb. 8: Eosinophile Granulozyten BALF (%) / Gruppe
Abb. 9: Positive BALF-Zelle (%) / Gruppe
Abb. 10: T4/T8 Lymphozyten / Gruppe
Abb. 11: ELF(ml/100ml BALF) / Gruppe
Abb. 12: Gesamtprotein (mg/ml ELF) / Gruppe
Abb. 13: Albumin (mg/ml ELF) / Gruppe
Abb. 14: Quotient Gesamtprotein/Albumin / Gruppe
Abb. 15: P-III-P (U / ml ELF) / Gruppe
Abb. 16: Laminin (ng/ml ELF) / Gruppe
Abb. 17: PDGF (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 18: basic FGF (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 19: EGF (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 20: TGFv (ng / ml) / Gruppe
Abb. 21: VEGF (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 22: TNFalpha (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 23: IL-1 (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 24: IL-2 (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 25: IL-6 (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 26: IL-8 (ng / ml ELF) / Gruppe
Abb. 27: MET (0) [%] / Gruppe
Abb. 28: Glutathion (10~6 M) / Gruppe
Abb. 29: Verhältnis von reduziertem zu Gesamt-Glutathion / Gruppe

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