Berg, Thomas: Chronische Hepatitis C - Therapeutische Strategien, molekulare Resistenzmechanismen und Relevanz neuer Hepatitis-assoziierter Viren -

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Kapitel 2. Einleitung

2.1 Genomorganisation des Hepatitis C Virus (HCV)

1989 gelang Choo und weiteren Wissenschaftlern der Chiron Corporation (USA) (1) mittels moderner molekularbiologischer Verfahren die Identifizierung des gesuchten Non-A-Non-B Virus aus einem hochtitrig infektiösen Plasma (2) eines Schimpansen mit chronischer Non-A-Non-B-Hepatitis. Durch Sequenzierung sich überlappender cDNA Klone konnte schließlich die gesamte Nukleotid-Sequenz dieses Non-A-non-B Virus-Genoms dargestellt werden, welches als Hepatitis C Virus bezeichnet wurde (3). Es zeigte sich, dass bis zu 90% der akuten und chronischen Non-A-Non-B Hepatitiden auf eine Infektion mit dem HCV zurüchzuführen sind (4-8). HCV wurde als seperater Genus innerhalb der Familie der Flaviviridae klassifiziert (9, 10).

Tabelle 1: Taxonomische Einteilung der Flaviviridae

Familie

Genus

Spezies

Genotypen

Flaviviridae

Flaviviren

Gelbfieber Virus

 

 

West Nile Virus

 

 

FSME Virus

 

 

Japanisches B Enzephalitis Virus

 

 

Dengue

Dengue 1-4

Hepaciviren

Hepatitis C Virus

HCV Typ 1-6

 

GB Virus B

 

 

neuer Genus?

GB Virus C/ HGV

(Typ 1-3)

 

GB Virus A

 

 

Pestiviren

BVDV

 

 

HCHV

 

Die Tabelle enthält nur die wichtigsten Spezies aus der Familie der Flaviviridae. FSME: Frühsommer Meningoenzephalitits Virus; BVDV: Bovine viral diarrhoea Virus; HCHV: Hog Cholera Virus

HCV enthält ein Einzel-(+)-Strang RNA-Genom von ca. 9.600 Nukleotiden, das in einem Nukleokapsid verpackt wird. Das Genom beginnt mit einer für alle Isolate hochkonservierten nicht-codierenden Region von 341 Nukleotiden (9), die eine interne Ribosomenbindungsstelle enthält und die Expression des HCV-Polyproteins steuert. Dem nicht kodierenden 5'-Ende folgt ein langer offener Leserahmen von ~ 9033 Nukleotiden Länge, der für ein, je nach Virustyp, 3010-3033 Aminosäuren großes Vorläufer-Polyprotein kodiert. Von diesem Polyprotein werden an bestimmten


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Schnittstellen einzelne Proteine co- oder posttranslational von Wirts-kodierten Signalasen und Virus-kodierten Proteasen abgespalten (11-15). Das nicht-kodierende 3'-Ende ist je nach Isolat 27-55 Nukleotide lang (9, 16-18) und wird von einem poly(U)-Strang (17-19) gefolgt von einer hochkonservierten Region von 98 Nukleotiden beendet. Diese hochkonservierte Sequenz ist möglicherweise für die Replikation im Rahmen eines Selbstpriming von Bedeutung.

Das Polyprotein enthält drei Strukturproteine, das Kapsid ("core",C) und zwei Hüllproteine (E1 und E2) sowie die nicht-Strukturproteine p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B (15). Die Größe und Funktionen der einzelnen Proteine sind in Abb. 1 dargestellt.

Abb. 1: Genomorganisation des Hepatitis C Virus (HCV) (modifiziert nach 14). Dargestellt ist das ca. 9,6 kb umfassende HCV-Genom, die verschiedenen strukturellen (C, E1, E2/p7) und nichtstrukturellen (NS2, 3, 4A, 5A und 5B) HCV-Gene im Kontext des offenen Leserahmen sowie die daraus resultierenden HCV-Proteine mit ihrem Molekulargewicht und den bekannten Funktionen. (ISDR = Interferon-Sensitivitäts-determinierende Region, nach Enomoto [91]).

Das 70 kDa große NS3-Protein vermittelt drei enzymatische Aktivitäten: eine Serin- Protease (im N-terminalenn Drittel lokalisiert) und „downstream“ in den carboxyterminalen zwei Dritteln eine NTPase/Helikase-Kombination. Die kürzlich entschlüsselte kristallographische Struktur der Helikase erlaubt neue Einsichten in ihre Funktionsweise und macht das Enzym zu einer interessanten Zielsubstanz für neue anti-HCV-Medikamente. NS5A wird posttranslational phosphoryliert und liegt in einer 56 kDA und 58 kDA Form vor. Die Funktion des Proteins ist nicht


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bekannt. Neben einer möglichen transaktivierenden Funktion wurden auch Interaktionen des NS5A Proteins mit den Interferon-induzierten Effektorproteinen wie z.B. der PKR nachgewiesen. Das NS5A-Protein hat daher möglicherweise eine Bedeutung für die Interferon-Response. Das NS5B-Protein besitzt eine RNA-Polymerase-Aktivität und stellt somit ein weiteres mögliches Zielprotein für neue antivirale Substanzen dar (20).

2.2 HCV Genotypen

Eine große Zahl verschiedener HCV-Isolate sind bis heute kloniert und sequenziert worden (16-18, 21-24). Es zeigte sich, daß das HCV eine ausgeprägte genetische Heterogenität aufweist, wie man es auch von anderen RNA Viren kennt, die keine replikativen Reparaturmechanismen besitzen und zu Fehlern neigende Replikasen enthalten. Aufgrund der Ungenauigkeit der HCV-RNA-Polymerase kommt es bei der Replikation zu ca. 2 x 10-3 Mutationen pro Nukleotidposition pro Jahr. Phylogenetische Analysen der Nukleotid- bzw. Aminosäure-Sequenz von HCV-Isolaten aus unterschiedlichen geographischen Regionen haben die Existenz von 6 verschiedenen HCV-Genotypen ergeben. Die HCV-Genotypen zeigen eine Homologie auf der Nukleotid- bzw. Aminosäurenebene ca. 65-72% bzw. 75-86% (25-27). Diese 6 HCV-Typen können weiter in enger miteinander verwandte Subtypen (z.B. 1a, 1b, 1c,...) unterteilt werden. Während die HCV-Genotypen 1-3 eine weltweite Verbreitung zeigen, werden die Genotypen 4-6 nur in bestimmten geographischen Regionen gefunden. (Nord- und Zentral-Afrika (Typ 4), Süd-Afrika (Typ 5) und Hong-Kong, Vietnam (Typ 6).

Die HCV-Genotypen unterscheiden sich jedoch nicht nur in ihrer geographischen Verteilung sondern auch in ihren biologischen Effekten. Besonderes Interesse besteht derzeit in der Erforschung Genotypen-abhängiger Unterschiede bei der Virusreplikation, der Mutationsrate, des Krankheitsverlaufs der chronischen Hepatitis C und vor allem bei der Response auf eine antivirale Therapie (28-37).

2.3 Epidemiologie und Transmission der HCV-Infektion

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist weltweit verbreitet. Ca. 3% der Weltbevölkerung sind mit HCV infiziert, was ungefähr 170 Millionen chronischen Virusträgern entspricht (38). In der Allgemeinbevölkerung ist die HCV-Prävalenz geographisch unterschiedlich mit ca. 0.5% in nordeuropäischen Ländern und ca. 2% in den Mittelmeerländern (39, 40). In Deutschland sind etwa 0.5% der Bevölkerung chronisch mit HCV infiziert (ca. 350.000 Virusträger). Die Rate der jährlichen HCV-Neuinfektionen wird in Deutschland auf 5000 geschätzt.

Der Mensch ist für HCV der einzige natürliche Wirt. HCV wird parenteral durch Blut und Blutprodukte übertragen. HCV-Genom kann aber mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)


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auch in anderen Körperflüssigkeiten (Speichel, Sperma) nachgewiesen werden (41). Die Übertragung von HCV durch Bluttransfusionen und durch nicht inaktivierbare zelluläre Blutprodukte ist seit der Einführung des anti-HCV-Screenings von Blutspendern deutlich zurückgegangen und spielt heute nur noch eine untergeordnete Rolle. Für Vollblut-Transfusionen wird ein Restrisiko der HCV-Übertragung von etwa 1:100.000-200.000 angegeben. Durch die Einführung des HCV-Genomnachweises (PCR-Testung) bei Blutspendern wird dieses Restrisiko weiter gesenkt werden (42). Für tiefgefrorenes Frischplasma liegt das HCV-Übertragungsrisiko weit unterhalb dieser Angaben.

Intravenöser Drogenabusus stellt in den entwickelten Ländern den wichtigsten HCV-Transmissionsweg dar. Bis zu 80% der i.v. Drogenabhängigen sind anti-HCV positiv. Demgegenüber wird HCV in den Entwicklungsländern v.a. durch unhygienische Injektionspraktiken übertragen. Dialysepatienten sind in 10-30% mit HCV infiziert (43). Das Risiko einer vertikalen HCV-Transmission (von der Mutter auf das Kind) ist mit ca. 5% gering und ist abhängig von der HCV-Konzentration im mütterlichen Blut (44, 45). Bei gleichzeitiger HIV-Infektion steigt das Übertragungsrisiko an (bis ca. 20%) (46). Ein HCV-Übertragung durch Muttermilch konnte bisher nicht dokumentiert werden. Man muss HCV-infizierten Müttern daher nicht vom Stillen abraten. Die sexuelle Übertragung von HCV ist prinzipiell möglich; die epidemiologische Bedeutung bzw. das Ausmaß der sexuellen Transmission ist jedoch unklar (47). Bei heterosexuellen Partnern von Patienten mit chronischer Hepatitis C finden sich mit ca. 0-4% niedrige anti-HCV Prävalenzen. Demgenüber zeigen sexuell promiskuitive Personen mit 2-12% deutlich höhere anti-HCV-Prävalenzen als die Normalbevölkerung. Beim medizinischen Personal ist die anti-HCV-Prävalenz gegenüber der Normalbevölkerung nicht erhöht. Bei bis zu 30% der Patienten mit chronischer Hepatitis C läßt sich keiner der bekannten Risikofaktoren nachweisen.

Verlauf der Hepatitis C Virus-Infektion

Die Infektion mit Hepatitis C-Viren (HCV) führt in der Regel zur Etablierung eines chronischen HCV-Carrierstatus, ohne daß eine akute Hepatitis vorausgeht (48). Auch in den wenigen Fällen, die enzymserologisch und histologisch das Bild einer akuten Hepatitis C entwickeln, fehlt meist der Ikterus. Dies ist der Grund dafür, daß die chronische HCV-Infektion erst nach Jahren und dann auch oft eher zufällig erkannt wird.

Patienten mit mehrjähriger HCV-Infektion haben kaum Chancen einer Spontanheilung bzw. spontanen HCV-Elimination. Dies bedeutet aber nicht zwangsläufig, daß die Prognose ungünstig sein muß. Langzeitbeobachtungen zum Spontanverlauf der chronischen Hepatitis C haben gezeigt, daß bei ca. 30 % der Patienten mit der Entwicklung einer Cirrhose zu rechnen ist (49-54). Demnach wird der überwiegende Teil der Patienten mit chronischer HCV-Infektion keine gravierende Lebererkrankung entwickeln und auch durch diese chronische Infektion zeitlebens nicht oder nur wenig in seiner Lebensqualität beeinträchtigt sein. Dennoch ist im Hinblick auf die relativ hohe Prävalenz der chronischen HCV-Infektion die Zahl der Patienten mit progredienter


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chronischer Hepatitis und schließlich Entwicklung einer Cirrhose erheblich. Der Anteil der Patienten, die wegen einer HCV-induzierten dekompensierten Cirrhose transplantiert werden, liegt in unserem Zentrum bei 18 % und in den USA bei 15-30 %. Hinzu kommt das hohe Risiko hinsichtlich der Entwicklung eines hepatozelluären Carcinoms (HCC), wenn die chronische Hepatitis in eine Cirrhose übergegangen ist (52, 54, 55-57). Abbildung 2 zeigt mit welcher Zunahme von Komplikationen der chronischen HCV-Infektion im Jahre 2008 zu rechnen ist (58, 59).

Die chronische Hepatitis C stellt zunehmend ein epidemiologisches, ein klinisches und auch ein kostenträchtiges Problem dar. Die dringende Notwendigkeit einer effektiven Therapie liegt auf der Hand. Die Behandlungsergebnisse konnten in letzter Zeit deutlich verbessert werden.

Abb. 2: Zu erwartende Probleme durch die chronische Hepatitis C. Dargestellt ist die prozentuale Zunahme der jeweiligen Komplikation im Jahr 2008 (nach 58).

(HCC = Hepatozelluläres Karzinom)

2.4 Wirkung der Interferone

Interferone sind Proteine, die den Zytokinen zugeordnet werden und von Leukozyten und Fibroblasten als Reaktion auf eine Virusinfektion gebildet werden. Sie haben antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Wirkungen (Abbildung 3) (60-62). Der antivirale Effekt wurde 1957 von Isaacs und Lindenmann entdeckt (63, 64). Man unterteilt die Interferone in Alpha-, Beta- und Gamma-Interferone, die sich strukturell, biochemisch und auch in ihren antigenen


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Eigenschaften unterscheiden. Alpha-Interferon wird von Monozyten und transformierten B-Zell-Linien als Antwort auf Virusinfektionen und Antigenstimulation produziert. Natürliches Interferon-alpha enthält mindestens 15 unterschiedliche Subfraktionen mit Molekulargewichten zwischen 16 und 27 kDa (65). Bislang wurden 23 verschiedene Gene für die Kodierung der menschlichen Alpha-Interferone gefunden, die alle auf Chromosom 9 lokalisiert sind (66). Beim klinischen Einsatz stehen rekombinante Alpha-Interferone im Vordergrund.

Abb. 3: Wirkung der Interferone (nach 62).

IFN = Interferon, NK-Zellen = natürliche Killerzellen, R = Rezeptor

Beta-Interferon wird von Fibroblasten gebildet und ist beim Menschen das Produkt eines einzigen Gens auf dem Chromosom 9 (66). Neben Virusinfektionen können auch synthetische Produkte, wie anionische Polymere, Lipide und Peptide Beta-Interferon induzieren (67). Die Alpha- und Beta-Interferone werden wegen ihrer Verwandtschaft als Typ-I-Interferone bezeichnet (68).

Im Gegensatz hierzu zeichnet sich das Gamma-Interferon (Typ-II-Interferon) durch einen anderen Genlocus und eine andere Struktur aus. Das entsprechende Gen befindet sich auf Chromosom 12 (69-71). Gamma-Interferon wird von T-Lymphozyten gebildet. Verschiedene Antigene und Mitogene induzieren die Bildung von Gamma-Interferon. Gamma-Interferon hat vor allem immunregulatorische Wirkungen (72).


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Die Wirkungen von Interferonen werden durch Rezeptoren vermittelt. Die Interferone haben keine biologische Aktivität innerhalb der Zelle, in der sie gebildet werden. Sie werden zunächst sezerniert, um dann über spezifische Rezeptoren ihr Signal abzugeben (73, 74). Man unterscheidet zwei Interferonrezeptoren, einen für Typ-I-Interferone (IFNalpha/ beta) und einen für Typ-II-Interferone (IFN-gamma). Diese Interferon-Rezeptoren sind auf einer Vielzahl menschlicher Zellen exprimiert. Nach Bindung an den Rezeptor wird der Interferon-Rezeptorkomplex rasch durch rezeptorvermittelte Endozytose ins Zellinnere aufgenommen (75, 76). Innerhalb der Zelle wird die Interferonwirkung über sog. „Second Messengers“ vermittelt. Die Signalübermittlung führt in einem weiteren Schritt zur Aktivierung der Transkription von Genen. Unter den messenger RNAs und Proteinen, die durch das Interferon-System hochreguliert werden, gehören unter anderem die 2‘, 5‘-Oligoadenylatsynthetase, 2‘, 5‘-Phosphodiesterase, Doppelstrang-RNA-abhängige Protein-kinase, das Mx-Protein, HLA-Antigene, ß-Microglobulin, der TNF-Rezeptor und verschiedene Enzyme (77-80).

Im Zusammenhang mit der Behandlung der chronischen Virushepatitis interessieren insbesondere die antivirale und die immunmodulatorische Wirkung. Die antiproliferative Wirkung ist für einige Nebenwirkungen verantwortlich, die man bei Patienten unter länger dauernder Interferon-Therapie beobachtet, wie z. B. Thrombozytopenie und Leukopenie sowie Haarausfall.

Der Virus-Replikationszyklus beginnt mit dem Kontakt des Virus auf der Zielzelle und endet mit der Ausschleusung („Release“) der kompletten Viruspartikel. Frühreplikative Momente beinhalten das Virusanheften („Attachment“), die Penetration der Zellmembran und das Freilegen („Uncoating“) der viralen Erbsubstanz. Darauf folgt die Replikation der viralen Proteine und Nukleinsäuren. Zum Schluß kommt der Zusammenbau („Assembly“, „Packaging“) und „Release“ der fertigen Viruspartikel. Interferone können jeden dieser Schritte in Abhängigkeit der Virus-Familie hemmen. Am besten untersucht ist der antivirale Wirkung auf die Translation des viralen Genoms durch die Induktion antiviraler Effektorproteine. Hierzu gehören die Doppelstrang-RNA-abhängige Proteinkinase (PKR) , die 2‘, 5‘-Oligoadenylatsynthetase (2‘, 5‘-OAS) und das Mx Protein (78). So führt die Induktion der 2‘, 5‘-OAS zur Bildung von 2‘, 5‘-Oligoadenylat, das wiederum eine Ribonuklease aktiviert, die bevorzugt virale einzelsträngige RNA abbaut und damit die Virusreplikation hemmt. (81, 82). Die Induktion und Bindung der PKR an Doppelstrang-RNA führt zu einer Aktivierung der PKR durch Dimerisation und Autophosphorylierung. Die Aktivierung der PKR führt wiederum zu einer Phosphorylierung des Initiationsfaktors der Proteinbiosynthese (eIF2alpha), wodurch es zu einer Blockierung der Proteinbiosynthese und somit auch der Virusreplikation kommt.

Die immunmodulatorische Wirkung der Alpha-Interferone wird hauptsächlich über eine Aktivierung von natürlichen Killerzellen vermittelt, die wiederum selektiv die virusinfizierten Zellen abtöten. Außerdem induzieren Alpha-Interferone in den meisten Zellen des Körpers die Expression von MHC-Klasse-I-Proteinen und erhöhen so deren Resistenz gegen natürliche Killerzellen und ihre Anfälligkeit für cytotoxische CD8-T-Zellen.


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2.5 Interferon-Wirkung bei chronischer Hepatitis C

Alpha-Interferone können verschiedene direkte und indirekte antivirale Mechanismen wie intrazelluläre virale RNA-Degradation, Hemmung der viralen RNA-Translation, Aktivierung des zellulären Immunsystems zur Erkennung virusbefallener Zellen und Prävention einer Virusinfektion von susceptiblen Zellen induzieren (83, 84). Welcher Effekt bei der Interferon-alpha (IFNa)-Therapie von Patienten mit chronischer Hepatitis C im Vordergrund steht, ist nicht genau bekannt. Neue Erkenntnisse über die mögliche IFNa-Wirkung bei chronischer Hepatitis C wurden durch mathematische Berechnungen der Hepatitis C Viruskinetik unter IFNa-Therapie abgeleitet (Abb. 4). (85-87). Nach IFNa-Applikation kommt es mit einer Latenz von ca. 8 h bei nahezu allen Patienten zu einem raschen Abfall der Hepatitis C Virämie (Phase 1). Die Phase-1-Kinetik ist IFNa-dosisabhängig und offenbar das Resultat einer direkten IFNa-vermittelten HCV-Replikationshemmung durch Induktion der o.g. Effektor-Proteine (87). Der Abfall der HCV-RNA im Serum in Phase 2 (ca. 24-48 h nach Therapiebeginn) verläuft deutlich flacher, reflektiert die Abnahme der produktiv infizierten Hepatozyten und ist vermutlich durch immunmodulatorische Eigenschaften des IFNa bedingt. Die hohe Relapse-Rate nach initial erfolgreicher IFNa-Therapie ist wahrscheinlich damit zu erklären, daß es nicht zu einer Elimination aller HCV-infizierten Zellen gekommen ist. Demgegenüber scheint bei Patienten mit anhaltender Remission durch die IFNa-Therapie eine immunologische Kontrolle der HCV-Infektion induziert worden zu sein. Diese Hypothese wird durch Untersuchungen gestützt, die zeigten, daß bei Langzeitrespondern auf eine IFNa-Therapie eine andauernde und starke T-Zell Response gegen HCV Proteine nachgewiesen werden kann, nicht hingegen bei Non-Respondern (88, 89).


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Abb. 4. Mathematisches Modell der Kinetik der Hepatitis C Virämie unter Interferon-alpha Therapie.

Warum Patienten mit chronischer Hepatitis C ein unterschiedliches IFNa-Responseverhalten zeigen, ist ungeklärt, und mehr als nur eine Ursache dürfte für diese Tatsache verantwortlich sein. Virologische Faktoren spielen hierbei sicher eine besondere Rolle, wie das unterschiedliche Responseverhalten der verschiedenen HCV-Genotypen beweist. Enomoto und Mitarbeiter waren die ersten, die versucht haben, HCV-genomische Regionen zu identifizieren, die mit der IFNa-Response korrelieren (90, 91). Die Autoren konnten zeigen, dass ge 4 Aminosäure-Mutationen innerhalb des carboxyterminalen Bereichs des NS5A-Proteins (Kodon 2209-2248) (= sog. „mutant type“, im Gegensatz zur HCV-1b Prototyp-Sequenz [HCV-J; = Wildtyp]), signifikant mit einer anhaltenden Response bei HCV-Genotyp 1b-infizierte Patienten korreliert waren (90-93). Diese Region wurde daraufhin die Interferon-Sensitivitäts-determinierende Region (ISDR) genannt (91). In ersten Studien aus Europa und USA konnten diese Assoziation jedoch zunächst nicht bestätigt werden (94-96).


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Abb. 5 Schematische Darstellung des NS5A-Proteins mit PKR-bindenden Domäne sowie PKR-bindenden Region und der von Enomoto und Mitarbeitern beschriebenen Interferon-Sensitivitäts-Determinierenden Region (ISDR). Die Anzahl der Mutation innerhalb der ISDR bei HCV-Genotyp 1b-Isolaten hat Relevanz für das Therapieansprechen (90, 91).

Die antivirale Wirkung von IFNa wird durch die Induktion der Transkription verschiedener antiviraler Gene vermittelt einschließlich der Doppelstrang-RNA-abhängigen Proteinkinase (PKR), die die Proteinsynthese durch Phosphorylierung des Translations-Initiationsfaktors eIF2alpha hemmt (78). Viele Viren haben Strategien entwickelt, um den antiviralen Effekten der IFNa-induzierten Effektorproteine (z.B. der PKR) zu entgehen. Gale und Mitarbeiter konnten auf der Suche nach einer Erklärung für die oben genannten Beobachtungen von Enomoto zeigen, dass das Wildtyp-ISDR-Protein die PKR funktionell hemmen kann, jedoch Mutationen innerhalb der ISDR diese Interaktion aufheben (97-99). Die Autoren konnten weiter zeigen, dass die ISDR (NS5A2209-2248) zwar notwendig aber nicht ausreichend für die Interaktion zwischen NS5A und PKR ist. Die Region zwischen Kodon 2209 und 2274 konnte im Folgenden als die komplette PKR-bindende Region des NS5A-Proteins identifiziert werden (99) (Abb.5 und 6).


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Abb. 6: Hemmung der Proteinkinase (PKR)-vermittelten anti-viralen Wirkung von Interferon-Alpha (IFNa) durch das Hepatitis C Virus (HCV)-NS5A-Protein (nach 99).

Die Expression der Doppelstrang-RNA-abhängigen Proteinkinase (PKR) wird vorwiegend durch Interferon-alpha/beta stimuliert. Nach Bindung der PKR an Doppelstrang-RNA kommt es intrazellulär zu einer Aktivierung der PKR durch Autophosphorylierung. Die aktivierte PKR phophoryliert den Initiationsfaktor der Proteinbiosynthese (eIF2alpha) an der alpha-Untereinheit. Normalerweise hat eIF-2alpha die zentrale Aufgabe, Met-tRNA zur 40S-Untereinheit des Ribosoms zu transportieren und damit die Translation zu initiieren. Dabei wird jeweils an eIF-2alpha-gebundenes GDP durch GTP mit Hilfe des Enzyms eIF2B ausgetauscht. Durch die Phosphorylierung von eIF-2alpha entsteht jedoch ein inaktiver Komplex aus eIF2-GDP und eIF2B am Ribosom, der die Translation inhibiert. Es scheint dabei eine relative Selektivität für die Hemmung der viralen Translation zu bestehen, da einige wichtige zelluläre Proteine weiter exprimiert werden. Das NS5A-Protein von HCV-Genotyp 1-Isolaten besitzt eine Bindungsstelle für die Dimerisationsdomäne der PKR. Diese Bindung führt zu einer Inhibition der PKR und damit ungehemmten Translation der Virusproteine und Virusreplikation. Verschiedene Mutationen im NS5A-Protein verhindern in vitro die Bindung an die PKR. Interessant sind daher die Untersuchungen, dass die Zahl der Mutationen innerhalb der PKR-Bindungsregion des NS5A-Protein mit dem Ansprechen auf die Interferontherapie korreliert sind (90, 91).

eIF-2alpha = Translations-Initiationsfaktor, P = Phosphorylierung.


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Taylor und Mitarbeiter haben kürzlich ein 12 Aminosäuren großes Fragment innerhalb des HCV-Hüllproteins E2 identifiziert, das eine hohe Sequenzhomologie zu der Autophophorylisationsstelle der PKR und der Translations-Initiationsfaktor (eIF2alpha)-Phosphorylisationsstelle aufweist (Abb. 7) (100). Diese Region wurde als PKR-eIF2alpha Phosphorylisations-Homologie-Domäne (PePHD) bezeichnet. Die Autoren zeigten, dass die PePHD von HCV-Genotyp 1-Isolaten, nicht jedoch von Typ 2 und 3-Isolaten, in vitro die PKR hemmt und dadurch ihre inhibitorischen Effekte auf die Proteinbiosynthese und das Zellwachstum aufhebt. Diese Daten lassen vermuten, dass HCV auf 2 Ebenen, nämlich NS5A und E2, über eine Interaktion mit den IFNa-induzierten Signaltransduktions-Pathway die antiviralen Effekte von IFNa umgehen kann.

Abb 7. Schematische Darstellung der HCV-E2-Region mit der PKR-eIF2á-Phosphorylierungs-Homologie-Domäne (PePHD). Dargestellt ist außerdem die homologe Aminosäuresequenz im Bereich der Autophosphorylisationsregion der PKR sowie die E2-Sequenz unterschiedlicher HCV-Isolate. Nur HCV-Genotyp 1-Isolate zeigen eine signifikante Aminosäuresequenz-Homologie zur PKR führten in vitro zu einer Inhibition der PKR (nach 100).

Für die Therapie der chronischen Hepatitis C sind bisher zwei rekombinant hergestellte alpha-Interferone, IFNa-2a (Roferon A®, Hoffmann-La Roche) und IFNa-2b (Intron A®, Essex-


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Pharma) für die subcutane Applikation zugelassen. Consensus Interferon ist ebenfalls ein synthetisches Typ-1 Interferon und ist in Deutschland als Inferax® (Yamanouchi) in Dosierungen von 9 µg 3 x pro Woche s.c. für die Therapie der chronischen Hepatitis C zugelassen. Es setzt sich aus den jeweils am häufigsten vertretenen Aminosäuren der verschiedenen bekannten alpha-Interferone zusammen und enthält somit die Consensus-Sequenz der bekannten Typ-1 Interferone. Dieses sogenannte Consensus-Interferon ist zu 89% mit Interferon-alpha-2b identisch (101). Natürliches Interferon-alpha wird aus humanen lymphoblastoiden Zellkulturen gewonnen und enthält eine Mischung aus bis zu 20 der natürlich vorkommenden alpha-Interferone, die im Gegensatz zu den rekombinanten Interferonen zum Teil auch glykosyliert sind (102). Natürliches IFNa ist bisher nicht für die Therapie der chronischen Hepatitis C zugelassen.

Ein wesentlicher Fortschritt bei der Therapie der chronischen Hepatitis C stellt die Entwicklung der pegylierten Interferone (PEG-IFNa) dar. Durch die Kopplung von Polyethylenglykol an das rekombinante Interferon-alpha wird eine bis zu 10-fache Verlängerung der Halbwertszeit erreicht, so daß eine einmal wöchentliche Gabe ausreichend ist, um einen konstanten IFNa-Serumspiegel aufrecht zu erhalten.

Die Pegylierung therapeutischer Proteine (z.B. IFNa) hat folgende Vorteile:

Derzeit existieren 2 PEG-Interferone, die sich hinsichtlich Aufbau, Molekulargewicht, Pharamkokinetik und Pharmakodynamik voneinander unterscheiden. PEG-Interferon-alfa-2b (PegIntron®, Essex Pharma) ist inzwischen in Deutschland für die Therapie der chronischen Hepatitis C zugelassen. Die Zulassung von PEG-Interferon-alfa-2a (PEGASYS®, Hoffmann-La Roche) wird 2002 erwartet.

2.6 Interferon-alpha-Therapie bei chronischer Hepatitis C

1986 wurden erstmals Patienten mit chronischer Non-A-Non-B-Hepatitis mit Interferon alfa (IFNa) behandelt. In dieser kleinen Gruppe kam es bei den meisten Patienten unter der Therapie zum Rückgang oder zur Normalisierung der Transaminasen (103). Mit der Entdeckung des HCV


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und der Entwicklung diagnostischer Tests ließen sich die Patienten mit chronischer Hepatitis Non-A, Non-B bis auf eine kleine Restgruppe der chronischen Hepatitis C zuordnen. Daraufhin wurden zahlreiche randomisierte, kontrollierte Studien zur Behandlung der chronischen Hepatitis C mit IFNa durchgeführt, die übereinstimmend die Effektivität der IFNa-Therapie bei chronischer Hepatitis C belegten (104-110). Die publizierten Studien zur IFNa-Therapie der chronischen Hepatitis C haben in folgenden Punkten zu weitgehend übereinstimmenden Ergebnissen geführt:

  1. Die Dosierung des IFN- a mit 3 x 5 bzw. 6 Mio. IE. pro Woche ist einer initialen Dosis von 3 x 3 Mio IE. überlegen und zeigte initiale Responder-Raten bis ca. 50 % und anhaltende Remissionen von < 20 %.
  2. Eine Therapiedauer von 12 Monaten war einer kürzeren Therapiedauer, z.B. von 6 Monaten, überlegen.
  3. Patienten mit anhaltender Response pflegen innerhalb der ersten drei Monate nach Therapiebeginn die Transaminasen zu normalisieren und HCV-RNA negativ zu werden.

2.7 Ribavirin bei chronischer Hepatitis C

Ribavirin (1-beta-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamid) gehört in die Gruppe der Nukleosidanaloga (Guanosin-Analogon) und besitzt ein relativ breites Wirkungsspektrum gegenüber einer Vielzahl von RNA- und DNA-Viren (111, 112). Als Wirkmechanismus des Ribavirins werden eine Depletion des intrazellulären Guanosin-Nukleotidpools durch Hemmung der Inosin-Monophosphat-Dehydrogenase und eine Hemmung der viralen RNA-abhängigen Polymerase diskutiert (113, 114). Der Wirkungsmechanismus von Ribavirin bei Patienten mit chronischer Hepatitis C Virus (HCV)-Infektion ist jedoch unbekannt. Mehrere kontrollierte Studien, in denen Ribavirin als Monosubstanz in einer Dosierung von 1000-1200 mg per os täglich zur Therapie der chronischen Hepatitis C eingesetzt worden ist, zeigten zwar, daß sich unter dieser Therapie in ca. 30 % der behandelten Patienten die Transaminasen normalisierten, die Hepatitis C Virämie jedoch unbeeinflußt blieb (115-119).

2.8 Amantadin bei chronischer Hepatitis C

Amantadin (1-aminoadamantanamine) ist ein synthetisches trizyklisches Amin mit gut charakterisierter antiviraler Wirkung gegen Influenza A Virus (121). Der molekulare Wirkungsmechanismus beruht in erster Linie auf einer Inhibition der Frühphase der Virusreplikation, wahrscheinlich dem Virus „Uncoating“. (122, 123). Die antivirale Aktivität von Amantadin bei Patienten mit chronischer Hepatitis C ist bisher nicht charakterisiert. Eine dosisabhängige Hemmung der HCV-Replikation in kultivierten mononuklären Zellen (PBMC) von HCV-infizierten Patienten durch Amantadin wurde beschrieben (124). Eine erste klinische Pilot-


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Studie zur Amantadin-Monotherapie bei IFNa-Nonresponder-Patienten mit chronischen Hepatitis C zeigte vielversprechende Ergebnisse mit virologischen Ansprechraten von ca. 20% (120). In der Folge wurden zahlreiche Studien zur Amantadin Mono- oder Kombinationstherapie sowohl bei unvorbehandelten als auch vorbehandelten Patienten mit chronischer Hepatitis C durchgeführt, die widersprüchliche Ergebnisse lieferten. (125-133).

2.9 Kombinationstherapie (Interferon-alpha + Ribavirin) bei chronischer Hepatitis C

In einer ersten Pilotstudie zeigte sich 1994 ein günstiger Effekt der Kombination IFNa plus Ribavirin (Brillanti). Inzwischen belegen umfangreiche kontrollierte Studien die Überlegenheit der Kombinationstherapie gegenüber der IFNa-Monotherapie (134-138). Die Kombinationstherapie ist seit 1999 in Deutschland zugelassen und stellt heute die Standard-Therapie der chronische Hepatitis C dar.

Bei 1-jähriger Kombinationstherapie mit 3 x 3 Mio Einh. IFNa pro Woche plus 1000-1200 mg Ribavirin per os täglich können anhaltende Remissionen in bis zu 41 % erreicht werden. Abb. 8 faßt die Ergebnisse der beiden größten Multizenterstudien mit 1744 Patienten zusammen (136, 138). Aus diesen Studien geht eindeutig hervor, daß die bis dahin vor allem in den USA übliche Standardtherapie der chronischen Hepatitis C mit 3 x 3 Mio. Einh. IFNa pro Woche über 6 Monate kaum wirksam ist und auch eine Verlängerung der IFNa-Monotherapiedauer auf 1 Jahr mit 16 % anhaltenden Remissionen nur unbefriedigende Ergebnisse liefert. Außerdem zeigte sich mit der Kombination, daß, entgegen den bisherigen Erfahrungen mit der Monotherapie, auch nach Monat 3 der Therapie noch eine HCV-RNA Negativierung eintreten kann. Ca. 10 % der kombiniert behandelten Patienten mit anhaltender Remission wurden erst jenseits der 3-monatigen Kombinations-Therapie HCV-RNA negativ. Die Entscheidung zum Therapieabbruch wegen virologischer Nonresponse (HCV-RNA im Serum weiterhin positiv) wird zur Zeit daher bei Kombinationstherapie erst nach 6-monatiger Therapiedauer getroffen.


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Abb. 8: Anhaltende virologische Responseraten nach Kombinationstherapie (24 bzw. 48 Wochen) mit IFNa-2b plus Ribavirin (1000-1200 mg/Tag) im Vergleich zu einer IFNa-Monotherapie (3 x 3 Mio. E/Woche; 24 bzw. 48 Wochen) bei unvorbehandelten Patienten mit chronischer Hepatitis C (n=1744; nach 136 und 138).

2.10 Therapie der chronischen Hepatitis C mit pegylierten Interferonen (PEG-IFNa)

Die bisher publizierten Langzeitergebnisse zur Therapie der chronischen Hepatitis C mit PEG-IFNa sind in den Abb. 9 und 10 dargestellt. Hieraus geht eindeutig die verbesserte Wirksamkeit der PEG-IFNa gegenüber der Standard-IFNa Therapie hervor, die zu einer Verdopplung der anhaltenden Responseraten führt (139-142). Die verbesserte antivirale Wirkung der PEG-IFNa ist in erster Linie eine Folge der konstanten IFNa-Wirkspiegel, die, im Gegensatz zu den Standardinterferonen, zu einer kontinuierlichen Suppression der Hepatitis C Virämie führen. Vergleichende Untersuchungen zwischen PEG-IFNa-2a und -2b existieren bisher nicht.


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Abb. 9: Anhaltende virologische Responseraten nach PEG-IFNa-2b-Therapie in unterschiedlichen Dosierungen über 48 Wochen im Vergleich zu Standard-IFNa (IFNa-2b) bei unvorbehandelten Patienten mit chronischer Hepatitis C (nach 139).

Abb. 10: Anhaltende virologische Responseraten nach PEG-IFNa-2a-Therapie (180 µg/Woche) im Vergleich zu Standard-IFNa (IFNa-2a) bei unvorbehandelten Patienten mit chronischer Hepatitis C (n=1596, nach 140, 141).


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Für die Kombinationstherapie von Ribavirin und PEG-IFNa wurden kürzlich erste Daten präsentiert, die in Analogie zur Standard-IFNa-Kombinationstherapie eine Steigerung der Remissionsraten zeigen (Abbildung 11) (143-145). Es zeichnet sich daher schon jetzt ab, daß die PEG-IFNa-Ribavirin Kombinationstherapie den neuen Standard in der Therapie der chronischen Hepatitis C darstellen wird.

Abb. 11: Therapie der chronischen Hepatitis C mit PEG-IFNa-2a plus Ribavirin im Vergleich zur PEG-IFNa-2a-Monotherapie bzw. Standard-IFNa-Kombinationstherapie (n=1121) (unveröffentlichte Daten).

2.11 Definition der Response

Das Response-Verhalten auf eine antivirale Therapie mit IFNa mit oder ohne Ribavirin orientiert sich nach derzeitigem Stand weniger an den Transaminasen (biochemische Response) als vielmehr an der HCV-RNA im Serum (virologische Response) im zeitlichen Ablauf. Die verschiedenen Formen der Response sind exemplarisch in Abb. 12 dargestellt. Ziel der antiviralen Therapie ist, eine anhaltende virologische Response zu induzieren. Um von einer anhaltenden Response sprechen zu können, ist eine Nachbeobachtung von mindestens 6 Monaten notwendig. Sofern die Transaminasen durchgehend im Normbereich geblieben sind und die PCR zum Nachweis von HCV-RNA stets negativ war, darf von einer anhaltenden Response ausgegangen werden. Nonresponder sind als Patienten definiert, die unter einer mindestens 3-monatigen IFNa-Monotherapie bzw. 6-monatigen Kombinationstherapie nicht HCV-RNA negativ geworden sind.


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Abb. 12: Formen der Interferon-Response bei chronischer Hepatitis C.

2.12 Prognostische Faktoren für das Therapieansprechen bei chronischer Hepatitis C

Die Ursachen und Mechanismen für das unterschiedliche Responseverhalten von Patienten mit chronischer Hepatitis C auf die Interferon-Therapie sind bis heute unbekannt. Unter den Faktoren, die eine prognostische Relevanz hinsichtlich des Ansprechens auf eine antivirale Therapie haben, kann zwischen Wirtsfaktoren und viralen Faktoren unterschieden werden (Abb. 13). Auch die Höhe der Medikationsdosis und die Therapiedauer haben prognostische Bedeutung (146-152).


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Abb. 13. Faktoren, die das Therapieansprechen beeinflussen.

Therapeutisch relevante, unabhängige prognostische Faktoren für die IFNa-Therapie bei chronischer Hepatitis C konnten im Rahmen der internationalen Multizenter-Studien zur Kombinationstherapie definiert werden (136, 138).

Prognostisch günstig sind:

Wenngleich durch die etablierten prognostischen Parameter eine Abschätzung der wahrscheinlichen Therapieresponse möglich ist, so kann keiner der prognostischen Parameter im Einzelfall eine Response oder Nonresponse verläßlich voraussagen. Die Aufdeckung der Mechanismen der Interferon-Response bzw. der Interferon-Resistenz ist daher eines der zentralen Forschungsthemen auf dem Gebiet der chronischen Hepatitis C. Hierbei ist vor allem die Bedeutung Virus-genomischer Merkmale („Response-Motifs“) für das Therapieansprechen von Interesse (90, 91, 100).


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2.13 Neue Hepatitis-assoziierte Viren

Mit der Entdeckung des Hepatitis-C-Virus (HCV) konnte die Ursache von über 90% der bis dahin als Non-A, non-B bezeichneten Hepatitiden geklärt werden. Es verbleibt eine Gruppe von posttransfusionell und sporadisch (d.h ohne erkennbaren Übertragungsweg) vorkommenden, akuten und chronischen Hepatitiden, die keinem der bisher bekannten Hepatitisviren zugeordnet werden können (Tabelle 2) (153-155). Man vermutet daher, daß weitere Hepatitisviren existieren, die für die sogenannte Non-A-E-Hepatitis verantwortlich sind.

Tabelle 2: Häufigkeit von akuten und chronischen Lebererkrankungen unklarer Ätiologie

Lebererkrankung

Häufigkeit in %

Akute Hepatitis Non-A-E

3%

Akute Post-Transfusions-Hepatitis Non-A-E

16%

Fulminante Hepatitis Non-A-E

40%

Chronische Hepatitis Non-A-E

10%

Cryptogene Cirrhose

5-10%

2.14 GB-Virus C/ Hepatitis G Virus

1995 sind unabhängig voneinander zwei neue Viren entdeckt worden, das GB Virus C (GBV-C) und Hepatitis G Virus (HGV), die als mögliche Ursache akuter und chronischer Hepatitiden unklarer Ätiologie angesehen wurden (156, 157). Die Entdeckung des GBV-C geht auf Studien aus den sechziger Jahren von F. Deinhardt und Mitarbeitern zurück. Die Arbeitsgruppe um Deinhardt inokulierte Tamarins (kleine Primaten) mit Plasma eines an akuter Hepatitis (Non-A-C) erkrankten Chirurgen (mit den Initialien GB). Die Inokulationen führten bei den Tamarins zu einer Hepatitis. Mehrere Passagen in Nicht-Menschen-Affen zeigten, daß es sich um ein übertragbares Agens handelt, welches das „GB-Agens“ genannt wurde. Aus dem Plasma infizierter Tamarins gelang es 1995 Wissenschaftlern der Firma Abbott, zwei neue Viren zu isolieren, die als GB-Virus-A (GBV-A) und GBV-B bezeichnet wurden (158-160). GBV-A führt zu einer persistierenden, nicht-pathogenen Infektion bei verschiedenen Neue-Welt Nicht-Menschenaffen, während GBV-B bei diesen Affen eine Hepatitis induzieren kann. Durch Genamplifikation mittels Primer von gemeinsamen Sequenzen des GBV-A, GBV-B und HCV gelang schließlich die Isolation eines neuen humanen Virus, das GBV-C.


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Zur gleichen Zeit isolierten Forscher der Firmen Genelabs/ Boehringer Mannheim in Zusammenarbeit mit den Centers of Disease Control aus dem Plasma eines Patienten mit chronischer Hepatitis ein neues Virus, das als Hepatitis-G-Virus (HGV) bezeichnet wurde (157). Sequenzanalysen des GBV-C- und HGV-Genoms zeigten eine Homologie auf der Nukleotidebene von 85% und auf der Aminosäurenebene von 95%, so daß es sich bei den neu entdeckten Viren um Isolate oder Genotypen derselben Virusspezies handelt.

2.15 Genom-Organisation des GBV-C/HGV

GBV-C enthält ein Einzel-(+)-Strang RNA Genom von ca. 9.400 Nucleotiden Länge (161). Aufgrund seiner Genomorganisation und Länge wird es der Familie der Flaviviridae zugeordnet zu welcher auch das Hepatitis C Virus gehört (Tabelle 1) (Abbildung 14). Das GBV-C Genom enthält einen langen offenen Leserahmen (ORF) der für ein Polyprotein von 2842-2933 Aminosäuren kodiert. Der ORF hat eine variable Länge, da er in Abhängigkeit vom Isolat an unterschiedlichen Stellen „upstream“ des Signalpeptids für E1 beginnt. Ein Kapsid (core-Protein), wie man es von den anderen Flavivirin kennt, konnte bisher bei GBV-C Isolaten nicht gefunden werden. Diese Eigenart teilt das GBV-C mit dem GBV-A. Das hepatotrope GBV-B hat jedoch wie das HCV ein Nukleokapsidprotein.

Eine Unterteilung von GBV-C/HGV in mindestens fünf Genotypen bzw. Subtypen wurde aufgrund von phylogenetischen Sequenzanalysen verschiedener Virusisolate vorgeschlagen. Danach finden sich der Subtyp 1a und 1b vornehmlich in Westafrika, der Subtyp 2a und 2b in Nordamerika und Europa sowie der Genotyp 3 überwiegend in Südost-Asien (162).


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Abb. 14. Genomorganisation des GB-Virus-C/ Hepatitis G-Virus (nach 161).

2.16 TT-Virus (TTV)

Im Dezember 1997 wurde von japanischen Forschern ein neues DNA Virus, das TT-Virus (TTV), im Serum eines Patienten (mit den Initialien T.T.) mit anikterischer selbstlimitierender akuter Posttransfusions-Hepatitis unklarer Ätiologie (Non-A-G) identifiziert (163, 164). Im folgenden konnten TTV-Sequenzen bei mehr als 45% der Patienten fulminanter Hepatitis oder chronischer Lebererkrankung und auch bei Patienten mit parenteralen Risikofaktoren (Hämodialyse, Patienten mit Hämophilie, i.v-Drogenabhängige) gefunden werden (163, 164). Die Autoren folgerten, dass TTV neben GBV-C/HGV ein weiteres Kandidaten-Virus für akute und chronische Hepatitiden unklarer Ätiologie darstellen könnte.

2.17 Genom Organisation

TTV ist ein hüllenloses, Einzelstrang-DNA-Virus welches eine geschlossene zirkuläre DNA von 3.852 Nukleotiden Länge enthält, das für 2 offene Leserahmen von ca. 761-770 und 150-156 Aminosäuren kodiert (Abbildung 15). Das Virus hat einen Partikel-Durchmesser zwischen 30 and 50 nm (163-166). TTV zeigt Ähnlichkeiten mit der Familie der Circoviridae, Viren die Pflanzen und Wirbeltiere (z.B. Schweine, Vögel) infizieren. Sequenz-Homologie-Suchen in den vorhandenen Gen-Datenbanken konnten allerdings bisher keine Identitäten zwischen TTV und anderen bekannten Viren herstellen. Mushahwar und Mitarbeiter haben daher vorgeschlagen, TTV als ein


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Mitglied einer neuen Virusfamilie, vorläufig bezeichnet als Circinoviridae, zu klassifizieren (166). Phylogenetische Analysen zeigten, dass TTV eine extrem weite Sequenz-Divergenz besitzt und daher in bis zu 16 Genotypen eingeteilt werden kann (168-173). Komplette Sequenzanalysen von 4 verschiedenen TTV-Isolaten wurden bisher publiziert: TA278 (164), GH1 (166), TUS01 (168) und SANBAN (167). GH1-, TUS01- und SANBAN-Isolate haben auf der Nukleotidsequenz-Ebene eine Homologie mit dem japanischen Prototyp-Isolat TA278 von nur 93%, 60,5%, and 56.7%. Aufgrund dieser ausgeprägten genetischen Diversität stellen einige TTV-Isolate eher eine neue TTV-ähnliche Virusspezies bzw. Genus als einen TTV-Genotyp dar (166).

Abb. 15. Genomorganisation des TT-Virus (nach 172).


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Tue Sep 17 17:18:48 2002