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Kapitel 1. Einleitung

1.1. Angiogenese, Tumorvaskularisation, Tumordurchblutung und Hypoxie des Mammakarzinoms

Angiogenese, Tumorvaskularisation, Tumordurchblutung und Hypoxie sind vier Merkmale eines Karzinoms, die komplex miteinander verbunden sind. Der Zusammenhang zwischen Tumordurchblutung und Metastasierung wurde schon 1907 beschrieben (1).
Die Tumorangiogenese ist die Neubildung von Blutgefäßen innerhalb des Tumors ab einem Tumorvolumen von größer als 1-2 mm³ oder ab ca. 10⁶ Tumorzellen (2,3). Die Tumorzellen können (pro-) angiogenetische und antiangiogenetische Faktoren bilden wie das Angiostatin und Thrombospondin. Angiogenese-Inhibitoren werden ab einer Tumorgröße von ca. 10⁹ Tumorzellen in größerer Menge gebildet (4). Das Gleichgewicht dieser Faktoren und zwischen Tumorproliferation und Apoptose führen zu einem Stillstand des Wachstums des Primärtumors und seiner Metastasen („dormancy“ (5)). Die Störung dieses Gleichgewichts („angiogenic switch“) führt zur Angiogenese und zum Wachstum des Primärtumors und seiner Metastasen (6a). Dieser angiogenic switch kann durch Hypoxie aktiviert und durch Onkogene wie das mutierte ras-Gen oder p53-Mutationen ausgelöst und verstärkt werden. Zellen mit einem mutierten ras-Gen reagieren auf die Hypoxie mit einer stärkeren Synthese der angiogenetischen Faktoren wie dem vascular endothelial growth factor (VEGF (6b)). Eine p53-Mutation kann mit einem Verlust des Angiogenese-Inhibitors Thrombospondin und einer verstärkten Synthese von VEGF assoziiert sein (7). Ein hypoxisches Milieu führt wieder bevorzugt zu einer Selektion des mutierten p53 (8).
Mehr als 14 Angiogenese-Faktoren sind bekannt, zu den wichtigsten zählen die durch die Tumorzellen synthetisierten Mitogene (Proteoglykane) wie der basic fibroblastic growth factor (bFGF) und die vascular endothelial growth factors (VEGF 1-3 (9)), Proteasen wie Matrix Metalloproteinasen aus der Extrazellulärmatrix und Zell-Adhäsionsmoleküle der Integrin-Familie und Wachstumsfaktoren. Die Überexpression der angiogenetischen Faktoren während des angiogenic switch wird durch die Extrazellulärmatrix aktiviert (10) oder durch die vom Tumor induzierten Makrophagen (VEGF 1) selbst vorgenommen (11). Gleichzeitig kommt es zu einer Downregulation der Angiogenese-Inhibitoren wie Thrombospondin, das u.a. von normalen Fibroblasten und vom p53-Wildtyp reguliert wird (12). Die Synthese von VEGF durch die Tumorzellen wird während und nach der Transkription u.a. durch die Wirkung des hypoxy inducible factor (hif)-1a induziert. Dieses eine Porphyrinstruktur enthaltende Protein wird durch Phosphorylierung unter Hypoxie aktiviert, bindet sich an Hypoxie regulierende Elemente (HRE) an der DNA und induziert damit u.a. die Synthese des Zytokins VEGF (13).
Durch diese unter Hypoxie aktivierten und synthetisierten Faktoren kommt es zur Ausbildung spezifischer Tumorgefäße. Die Endothelzellen besitzen mindestens 3 verschiedene VEGF-Rezeptoren (Tyorsin-Kinasen (14)). Deren Lumen entsteht zunächst aus Vakuolen, die sich aus dem Golgi-Apparat oder dem endoplasmatischen Retikulum entwickeln, innerhalb der Endothelzellen. Ein zweiter Weg ist die Protrusion von Teilen (Pseudopodien) benachbarter Endothelzellen, die sich aneinander lagern und so ein Lumen entstehen lassen. Für diese Entwicklung bedarf es einer aktiven Endothelmigration und angiogener Stimuli. Nur ca. zwei Drittel dieser Frühformen entwickeln sich weiter zu Tumorgefäßen. Die Endothelzellen verändern sich durch Abflachen und Abnahme der Zellorganellen. Damit wird das Gefäßlumen größer. Ab wann sich eine Basalmembran bildet, ist noch nicht eindeutig geklärt. Schließlich erhalten diese neu gebildeten Tumorgefäße Anschluß an den präformierten Gefäßbaum (15).
Die Tumorgefäße weisen einige Besonderheiten auf: Sie bestehen nur aus Endothelzellen und einer porösen Basalmembran, sie haben keine Media (keine glatte Muskulatur). Durch diese Membranlücken kommt es zu Extravasaten. Die Extravasation wird außerdem durch VEGF, auch Vascular permeability factor (VPF) unterstützt (14). Die Extravasation, unter anderem von Fibrin ist die Voraussetzung für die Bildung des für das Tumorwachstum notwendigen Tumorstromas.
Der Aufbau des Gefäßbaumes ist nicht hierarchisch. Typisch sind Kalibersprünge und Gefäßabbrüche und sinusoidale Plexus ebenso wie arterio-venöse Shunts. Bereiche mit einer hohen Gefäßdichte liegen neben Arealen mit wenigen Tumorgefäßen.
Tumorgefäße haben keine Nervenversorgung und keine umgebenden Lymphgefäße, keine Differenzierung in Venen und Arterien (15,16). Der hydrostatische Druck innerhalb des Tumors ist deshalb hoch (im Tumor 45 mm Hg, im normalen Gewebe 5-20 mm Hg (17)). Aufgrund dieser Druckdifferenz fließt die interstitielle Flüssigkeit radiär vom Tumorzentrum zur Tumorperipherie und bedingt das peritumoröse Ödem (16). Der Gefäßwiderstand ist aufgrund der Gefäßform (archaisch), der wechselnden Gefäßdurchmesser und des hohen hydrostatischen Druckes hoch, trotz einer Vielzahl von Tumorgefäßen (18). Zwischen den Tumorgefäßen ist der interstitielle Raum groß, es resultiert eine lange Diffusionsstrecke. Die Blutversorgung innerhalb des Tumors ist heterogen (18).

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Abbildung 1: Zusammenhang zwischen Angiogenese, Hypoxie und Vaskularisierung (modifiziert nach Harris 1998 (23))

Durch diesen Zusammenhang zwischen Angiogenese und Tumorwachstum kann durch die Gabe von antiangiogenetisch wirkenden Substanzen das Wachstum des Tumors gehemmt werden. Außerdem können durch die dann veränderte Vaskularisation und den geringeren hydrostatischen Druck Chemotherapeutika oder antitumoral wirksame Hormone leichter zu den Tumorzellen diffundieren und dort wirken (24).
Der vierte Faktor in diesem System ist die Durchblutung. Sie wird maßgeblich durch die Form der Blutgefäße beeinflußt, hier von den Tumorgefäßen (arterio-venöse Shunts, hoher Gefäßwiderstand durch hohen hydrostatischen Druck usw.). Aus den bekannten experimentellen Untersuchungen kann der Blutfluß in malignen Tumoren wie folgt charakterisiert werden (25): Der Blutfluß kann innerhalb gleicher Primärtumoren, Tumorstadien und histologischer Klassifikationen variieren. Die Blutflußrate im Tumor kann so hoch wie in Organen mit einer hohen Metabolisierungsrate wie dem Herz, der Leber oder dem Gehirn sein. Es ist aber auch ein Blutfluß wie in gering metabolisierten Organen wie der Haut, dem ruhenden Skelettmuskel oder dem Fettgewebe möglich. Der Tumorblutfluß ist unabhängig vom Blutfluß im umgebenden Gewebe. Er ist z.B. im Mammakarzinom höher als im postmenopausalen Mammagewebe und niedriger als in der laktierenden Mamma. In einigen malignen Tumoren ist der Blutfluß in der Tumorperipherie höher als im Tumorzentrum, bei anderen Tumoren ist der Blutfluß im Zentrum höher als in der Peripherie.
Mit der Laser Doppler Flowmetrie ließen sich zeitliche Unterschiede des Blutflusses im mikroskopischen Level der Tumoren nachweisen (26). Der Tumorblutfluß zeigt ebenso wie die

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1.2. Die Erkennung, Differentialdiagnose, Prognoseeinschätzung und das Therapiemonitoring von Mammakarzinomen mit bildgebenden Verfahren

1.2.1. Erkennung und Differentialdiagnose von Mammakarzinomen

Die Voraussetzung für die Messung der Tumordurchblutung ist eine hohe Sensitivität dieses Verfahrens in der Erkennung und Möglichkeit der Darstellung des Blutflusses im zu untersuchenden Herdbefund. Bei den ultraschallgestützten Verfahren muß dieser Herdbefund zunächst mit der konventionellen Mammasonographie aufgefunden werden. Danach interessiert die Rate der erkannten und als suspekt eingestuften Blutflüsse in diesem sonographischen Herdbefund. Diese beiden Schwerpunkte waren die Zielkriterien der ersten Studien im Rahmen der vorgestellten Habilitationsschrift.
Bei der Beurteilung eines diagnostischen Verfahrens muß zwischen seinem Einsatz im Screening, in der Differentialdiagnose, in der Einschätzung der Prognose oder im Therapiemonitoring unterschieden werden. Für die Differentialdiagnostik müssen die Spezifität und der positive Vorhersagewert (positive predictive value, ppv) hoch sein, um z.B. unter den im Mammographie-Screening entdeckten suspekten Herdbefunden die benignen Läsionen zu erkennen und deren unnötige Operation zu vermeiden (35-38).
In einer Studie, die an der Frauenklinik der Charité zum Vergleich der bildgebenden Verfahren in der präoperativen Differentialdiagnostik von März 1993 bis zum Mai 1995 an 200 Patientinnen (Charakteristik der untersuchten Herdbefunde in Tabelle 1) durchgeführt wurde (39), hatte die hochauflösende Mammasonographie die höchste Sensitivität und Spezifität in der Erkennung des Mammakarzinoms (Tabelle 2). Diese Angaben sind eine Gegenüberstellung der Methoden, lassen aber keinen direkten Vergleich zu. Dieser wurde in dieser Studie mit der multivariaten Diskriminanzanalyse durchgeführt. An erster Stelle in der präoperativen diagnostischen Effektivität lag die Mammasonographie.
Es sollte also mit der Mammasonographie gelingen, 95% aller malignen Herdbefunde präoperativ aufzufinden (Sensitivität 95%). Die Methoden, welche die Tumordurchblutung zur Differentialdiagnostik nutzen, wie die MRT und die CD hatten ebenfalls eine akzeptable Sensitivität von 90 bzw. 82 % aber eine Spezifität (63 bzw. 75%), die zur Differentialdiagnostik nicht akzeptabel ist (Tabelle 2). Methodische Verbesserungen sind hier notwendig. Ob diese mit der Ultraschallkontrastmittel-unterstützten Videodensitometrie möglich sind, wird in dieser Habilitationsschrift beantwortet werden (Abschnitt 4.2.2).

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Tabelle 1: Postoperative histologische Befunde der präoperativ mit Mammographie, Mammasonographie, Farbdoppplersonographie und Mamma-MRT (MRM) untersuchten Patientinnen (aus Blohmer et al. 1999 (39))

Histologischer Typ	Anzahl
Alle Mammakarzinome	99
Invasive duktale Karzinome Invasive lobuläre Karzinome Intraduktale Karzinome Muzinöse Karzinome Medulläre Karzinome Großzelliges Karzinom	79 11 4 2 2 1
Alle benignen Herdbefunde	101
Proliferative und nichtproliferative Mastopathie Atypische duktale Hyperplasie Fibroadenome Sklerosierende Adenosen Adenome Mastitis nonpuerperalis Neurofibrom	41 12 34 7 3 2 1

Tabelle 2: Sensitivität, Spezifität, positiver prädiktiver Wert (ppv) und negativer prädiktiver Wert (npv) für jede diagnostische Methode für die gegebene Prävalenz des Mammakarzinoms (aus Blohmer et al. 1999 (39))

Diagnostische Methode	Anzahl der Patienten mit eindeutiger Diagnose/ Anzahl untersuchter Patientinnen	Sensitivität	Spezifität	Prävalenz	ppv	npv
Mammographie	158/166	0,85 (68/80)	0,77 60/78)	0,5	0,79	0,83
Mamma- sonographie	168/173	0,95 (76/80)	0,8 (70/88)	0,48	0,81	0,94
Color Doppler	150/157	0,82 (58/71)	0,75 (59/79)	0,47	0,72	0,84
MRT	68/68	0,90 (37/41)	0,63 (17/27)	0,6	0,79	0,63

Für die Erkennung von Herdbefunden nutzt der Untersucher die spezifischen Interaktionen der Ultraschallwellen mit den malignen Herdbefunden aus. Die Ultraschallwellen des B-Bildes (von brightness: Grauwertabstufung des zweidimensionalen Echtzeit-Ultraschall-Bildes) werden von stromareichen Mammakarzinomen in typischer Weise absorbiert, reflektiert, gestreut, gebeugt und gebrochen (40-42). Es resultieren typische sonographische Phänomene, mit denen man Herdbefunde sicher (Tabelle 2) erkennen und sie als malignitätsverdächtig einstufen kann. Die gleichen Phänomene gelten auch für die dreidimensionale B-Bild-Sonographie (43,44). Die diagnostische Wertigkeit jedes einzelnen Merkmals kann durch die odds-Ratio (Maß für das relative Risiko für das

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Tabelle 3: Sonographische B-Bild-Dignitätskriterien und die berechnete Sensitivität, Spezifität, der positive prädiktive (ppv) und negative prädiktive Wert (npv) und die odds-Ratio (aus Blohmer et al. 1997 (46))

Ultraschallkriterium	Sens	Spez	ppv	npv	Odds-ratio
Echogenität	81,5	9,4	29	52,6	0,45
Binnenechos	29,9	62	26,4	66	0,69
Tumorachse	79,4	53	43,5	84,9	4,4
Randwall	92,8	96,7	92,8	96,7	378
Laterale Randschatten	96,9	61	53,1	97,7	49
Architektur	88,7	96,7	92,5	94,9	230
Deformierbarkeit	92,8	70,4	58,8	95,5	31
Dorsale Schallabschwäch.	76,3	76,5	59,7	87,6	10

Ein anderer Weg die typischen Veränderungen, welche die Ultraschallwellen erhalten, wenn sie auf ein Mammakarzinom treffen und die sich letztlich in verschiedenen Abstufungen und Mustern der Grauwerte des Ultraschallbildes äußern, ist die Texturanalyse des B-Bildes (47). Diese Methode ist weitestgehend unabhängig von der subjektiven Beurteilung des Ultraschallbildes und hat sicher Zukunft in der Differentialdiagnose von Herdbefunden der Mamma mit dem Ultraschall.
In der Dopplersonographie wird die Eigenschaft der Schallwellen genutzt, ihre Frequenz zu ändern,

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Abbildung 2: Farbkodierte Dopplersonographie in der oberen Bildhälfte und Dopplerflußkurve des gepulsten Spektraldopplers in der unteren Bildhälfte. Eingezeichnet sind V_max, V_min und das Aliasing-Phänomen

(Aliasing-Phänomen: Die PRF ist nicht mindestens doppelt so hoch wie die maximal zu messende Dopplerfrequenz. Geschwindigkeiten oberhalb des durch die PRF gesetzten Limits werden nicht mehr korrekt erfaßt und unterhalb der Nullinie, also in einem anderen Kanal, dargestellt (48).).
Die Kodierung der Frequenzverschiebung der Flüsse in diesen Gefäßen in Farbe und in einer größeren Fläche (durch die Verwendung vieler sample volumes entlang der Schallwellenachse im gepulsten Farbdoppler) erlaubt Aussagen zur Lokalisation dieser Blutflüsse im Herdbefund, zur Blutflußrichtung, zur Bildung von Turbulenzen, jedoch nur eingeschränkt zur Flußgeschwindigkeit. Außerdem gelingt die Ableitung von Dopplerflußkurven des gepulsten Spektraldopplers optimal, da das Meßfenster (sample volume) in einem möglichst spitzen Winkel in den zu untersuchenden, jetzt farbig sichtbaren, Fluß gelegt werden kann. In der vorliegenden Habilitationsschrift werden häufig beide Untersuchungsmethoden, da sie den gepulsten Doppler als Grundlage haben und einander bedingen als Farbdoppler (Color Doppler, CD) zusammengefaßt. Die Ergebnisse der beiden Verfahren des gepulsten Dopplers (quantitative Ergebnisse des gepulsten Spektraldopplers vs. qualitative oder semiquantitative Ergebnisse des gepulsten und farbkodierten Dopplers) werden jedoch getrennt untersucht und dargestellt.
Im CPA werden äquivalent zu den Grauabstufungen der Spektraldopplerkurve die Amplituden des reflektierten Ultraschalls farbkodiert. Ein Synonym für diese Art der Ultraschalluntersuchung ist deshalb auch „Amplituden kodierter Doppler“. Die Amplitude wird durch die Anzahl der fließenden Blutkörperchen (in erster Linie Erythrozyten) bestimmt. Um Gewebs- und Flußamplituden voneinander zu unterscheiden, wird nur ein gering von 90 Grad zur Blutflußrichtung abweichender Winkel des Ultraschalls benötigt. CPA ist damit nahezu winkelunabhängig. Kalkulationen unter Einschluß des Dopplerwinkels wie im Farbdoppler sind nicht notwendig. Theoretisch müßte die CPA aufgrund der höheren Frequenz der ausgesendeten Schallwellen (10 MHz vs. 6 MHz beim Farbdoppler) empfindlicher bei der Darstellung langsamer Flüsse sein. Außerdem gelingt die Darstellung langsamer Flüsse in kleinen Gefäßen, die senkrecht zu den Schallwellen verlaufen. Dadurch wird, ähnlich wie in der Angiographie, eine im Vergleich zum Farbdoppler „kräftige“ und farbige Darstellung des Blutflusses in nahezu dem gesamten Gefäßbett möglich. Die Bezeichnung dieser Technologie ist

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