Blohmer, Dr. Jens-Uwe: Kontrastmittel-Videodensitometrie und Automatisierte Mikroskop-Bildanalyse zur Messung der Durchblutung und Vaskularisation von Mammakarzinomen

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Kapitel 1. Einleitung

1.1. Angiogenese, Tumorvaskularisation, Tumordurchblutung und Hypoxie des Mammakarzinoms

Angiogenese, Tumorvaskularisation, Tumordurchblutung und Hypoxie sind vier Merkmale eines Karzinoms, die komplex miteinander verbunden sind. Der Zusammenhang zwischen Tumordurchblutung und Metastasierung wurde schon 1907 beschrieben (1).
Die Tumorangiogenese ist die Neubildung von Blutgefäßen innerhalb des Tumors ab einem Tumorvolumen von größer als 1-2 mm3 oder ab ca. 106 Tumorzellen (2,3). Die Tumorzellen können (pro-) angiogenetische und antiangiogenetische Faktoren bilden wie das Angiostatin und Thrombospondin. Angiogenese-Inhibitoren werden ab einer Tumorgröße von ca. 109 Tumorzellen in größerer Menge gebildet (4). Das Gleichgewicht dieser Faktoren und zwischen Tumorproliferation und Apoptose führen zu einem Stillstand des Wachstums des Primärtumors und seiner Metastasen („dormancy“ (5)). Die Störung dieses Gleichgewichts („angiogenic switch“) führt zur Angiogenese und zum Wachstum des Primärtumors und seiner Metastasen (6a). Dieser angiogenic switch kann durch Hypoxie aktiviert und durch Onkogene wie das mutierte ras-Gen oder p53-Mutationen ausgelöst und verstärkt werden. Zellen mit einem mutierten ras-Gen reagieren auf die Hypoxie mit einer stärkeren Synthese der angiogenetischen Faktoren wie dem vascular endothelial growth factor (VEGF (6b)). Eine p53-Mutation kann mit einem Verlust des Angiogenese-Inhibitors Thrombospondin und einer verstärkten Synthese von VEGF assoziiert sein (7). Ein hypoxisches Milieu führt wieder bevorzugt zu einer Selektion des mutierten p53 (8).
Mehr als 14 Angiogenese-Faktoren sind bekannt, zu den wichtigsten zählen die durch die Tumorzellen synthetisierten Mitogene (Proteoglykane) wie der basic fibroblastic growth factor (bFGF) und die vascular endothelial growth factors (VEGF 1-3 (9)), Proteasen wie Matrix Metalloproteinasen aus der Extrazellulärmatrix und Zell-Adhäsionsmoleküle der Integrin-Familie und Wachstumsfaktoren. Die Überexpression der angiogenetischen Faktoren während des angiogenic switch wird durch die Extrazellulärmatrix aktiviert (10) oder durch die vom Tumor induzierten Makrophagen (VEGF 1) selbst vorgenommen (11). Gleichzeitig kommt es zu einer Downregulation der Angiogenese-Inhibitoren wie Thrombospondin, das u.a. von normalen Fibroblasten und vom p53-Wildtyp reguliert wird (12). Die Synthese von VEGF durch die Tumorzellen wird während und nach der Transkription u.a. durch die Wirkung des hypoxy inducible factor (hif)-1a induziert. Dieses eine Porphyrinstruktur enthaltende Protein wird durch Phosphorylierung unter Hypoxie aktiviert, bindet sich an Hypoxie regulierende Elemente (HRE) an der DNA und induziert damit u.a. die Synthese des Zytokins VEGF (13).
Durch diese unter Hypoxie aktivierten und synthetisierten Faktoren kommt es zur Ausbildung spezifischer Tumorgefäße. Die Endothelzellen besitzen mindestens 3 verschiedene VEGF-Rezeptoren (Tyorsin-Kinasen (14)). Deren Lumen entsteht zunächst aus Vakuolen, die sich aus dem Golgi-Apparat oder dem endoplasmatischen Retikulum entwickeln, innerhalb der Endothelzellen. Ein zweiter Weg ist die Protrusion von Teilen (Pseudopodien) benachbarter Endothelzellen, die sich aneinander lagern und so ein Lumen entstehen lassen. Für diese Entwicklung bedarf es einer aktiven Endothelmigration und angiogener Stimuli. Nur ca. zwei Drittel dieser Frühformen entwickeln sich weiter zu Tumorgefäßen. Die Endothelzellen verändern sich durch Abflachen und Abnahme der Zellorganellen. Damit wird das Gefäßlumen größer. Ab wann sich eine Basalmembran bildet, ist noch nicht eindeutig geklärt. Schließlich erhalten diese neu gebildeten Tumorgefäße Anschluß an den präformierten Gefäßbaum (15).
Die Tumorgefäße weisen einige Besonderheiten auf: Sie bestehen nur aus Endothelzellen und einer porösen Basalmembran, sie haben keine Media (keine glatte Muskulatur). Durch diese Membranlücken kommt es zu Extravasaten. Die Extravasation wird außerdem durch VEGF, auch Vascular permeability factor (VPF) unterstützt (14). Die Extravasation, unter anderem von Fibrin ist die Voraussetzung für die Bildung des für das Tumorwachstum notwendigen Tumorstromas.
Der Aufbau des Gefäßbaumes ist nicht hierarchisch. Typisch sind Kalibersprünge und Gefäßabbrüche und sinusoidale Plexus ebenso wie arterio-venöse Shunts. Bereiche mit einer hohen Gefäßdichte liegen neben Arealen mit wenigen Tumorgefäßen.
Tumorgefäße haben keine Nervenversorgung und keine umgebenden Lymphgefäße, keine Differenzierung in Venen und Arterien (15,16). Der hydrostatische Druck innerhalb des Tumors ist deshalb hoch (im Tumor 45 mm Hg, im normalen Gewebe 5-20 mm Hg (17)). Aufgrund dieser Druckdifferenz fließt die interstitielle Flüssigkeit radiär vom Tumorzentrum zur Tumorperipherie und bedingt das peritumoröse Ödem (16). Der Gefäßwiderstand ist aufgrund der Gefäßform (archaisch), der wechselnden Gefäßdurchmesser und des hohen hydrostatischen Druckes hoch, trotz einer Vielzahl von Tumorgefäßen (18). Zwischen den Tumorgefäßen ist der interstitielle Raum groß, es resultiert eine lange Diffusionsstrecke. Die Blutversorgung innerhalb des Tumors ist heterogen (18).


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Die Folge dieses Tumorgefäßaufbaus ist wiederum die Gewebshypoxie, die zu einer weiteren VEGF-Synthese führt.
Die Endothelzellen selbst synthetisieren ebenfalls Wachstumsfaktoren und Zytokine, die das Wachstum und die Migration der Tumorzellen stimulieren (Parakriner Effekt) wie insulin-like growth factor I und II (IGF-1 und -2), basic fibroblastic growth factor (bFGF), interleucin-6 und interleucin-8 (IL-6 und -8). IL-6 stimuliert z.B. die Motilität der Mammakarzinom-Zellen und ermöglicht damit ihre Invasion in das Gefäßsystem und damit in die Blutzirkulation (19,20,21). Die gegenseitige metabolisch-nutritive und parakrine Beeinflussung der Tumorzellen und Endothelzellen wird von Folkman (22) als „two-cell compartment-model of a tumor“ beschrieben. Harris hat diesen Zusammenhang während eines Vortrages auf dem 21st Annual San Antonio Breast Cancer Symposium am 15. Dezember 1998 graphisch dargestellt (Abbildung 1 (23)).

Abbildung 1: Zusammenhang zwischen Angiogenese, Hypoxie und Vaskularisierung (modifiziert nach Harris 1998 (23))

Durch diesen Zusammenhang zwischen Angiogenese und Tumorwachstum kann durch die Gabe von antiangiogenetisch wirkenden Substanzen das Wachstum des Tumors gehemmt werden. Außerdem können durch die dann veränderte Vaskularisation und den geringeren hydrostatischen Druck Chemotherapeutika oder antitumoral wirksame Hormone leichter zu den Tumorzellen diffundieren und dort wirken (24).
Der vierte Faktor in diesem System ist die Durchblutung. Sie wird maßgeblich durch die Form der Blutgefäße beeinflußt, hier von den Tumorgefäßen (arterio-venöse Shunts, hoher Gefäßwiderstand durch hohen hydrostatischen Druck usw.). Aus den bekannten experimentellen Untersuchungen kann der Blutfluß in malignen Tumoren wie folgt charakterisiert werden (25): Der Blutfluß kann innerhalb gleicher Primärtumoren, Tumorstadien und histologischer Klassifikationen variieren. Die Blutflußrate im Tumor kann so hoch wie in Organen mit einer hohen Metabolisierungsrate wie dem Herz, der Leber oder dem Gehirn sein. Es ist aber auch ein Blutfluß wie in gering metabolisierten Organen wie der Haut, dem ruhenden Skelettmuskel oder dem Fettgewebe möglich. Der Tumorblutfluß ist unabhängig vom Blutfluß im umgebenden Gewebe. Er ist z.B. im Mammakarzinom höher als im postmenopausalen Mammagewebe und niedriger als in der laktierenden Mamma. In einigen malignen Tumoren ist der Blutfluß in der Tumorperipherie höher als im Tumorzentrum, bei anderen Tumoren ist der Blutfluß im Zentrum höher als in der Peripherie.
Mit der Laser Doppler Flowmetrie ließen sich zeitliche Unterschiede des Blutflusses im mikroskopischen Level der Tumoren nachweisen (26). Der Tumorblutfluß zeigt ebenso wie die


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Tumorvaskularisation eine positive Korrelation zur VEGF-Expression. Er hängt im Unterschied zur Durchblutung im gesunden Gewebe nicht von metabolischen Erfordernissen ab. Die Unterschiede im Blutfluß innerhalb eines Tumors sind geringer als die zwischen verschiedenen Tumoren. Die Unterschiede des Blutflusses innerhalb des Tumors sollen mit den Unterschieden innerhalb der Gefäßdichte korrelieren (27).
Die zeitliche Veränderung der Durchblutung (Nur 25-85% des Tumors sind permanent durchblutet (16).) der Tumoren zu messen, gelang bisher nur annähernd experimentell. In vivo ist dies erst seit ca. 10 Jahren mit der Einführung von diagnostischen Geräten mit einer ausreichend hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung, wie der dynamischen Magnetresonanztomographie (dMRT), der dynamischen Computertomographie (dCT (28)), der Positronen Emissions Tomographie (PET (29)), und der Color-Dopplersonographie (CD (30)) möglich. Die CD ermöglicht die Darstellung von Flüssen von unter 0,001 ml/sek. (31). Mit dieser Methode kann die Geschwindigkeit und der periphere Widerstand und deren Veränderungen des intravasalen Blutflusses tomographisch und in „Echt-Zeit“ festgestellt werden. Durch aufgrund ihrer Molekülgröße intravasal verbleibende Kontrastmittel kann diese intravasale Darstellung eventuell noch verbessert werden (32). Bei der MRT-Untersuchung der Durchblutung von Mammatumoren muß die Hyperpermeabilität von Tumorgefäßen und die damit verbundene extravasale Anreicherung von Kontrastmittel im Interstitium als Folge der Neoangiogenese neben der intravasalen Kontrastmittelkinetik in Betracht gezogen werden (33,34).
Durch die Messung der Durchblutung von Mammakarzinomen sollte eine Kontrolle der Wirkung antiangiogenetischer und antitumoröser Therapien möglich sein.

1.2. Die Erkennung, Differentialdiagnose, Prognoseeinschätzung und das Therapiemonitoring von Mammakarzinomen mit bildgebenden Verfahren

1.2.1. Erkennung und Differentialdiagnose von Mammakarzinomen

Die Voraussetzung für die Messung der Tumordurchblutung ist eine hohe Sensitivität dieses Verfahrens in der Erkennung und Möglichkeit der Darstellung des Blutflusses im zu untersuchenden Herdbefund. Bei den ultraschallgestützten Verfahren muß dieser Herdbefund zunächst mit der konventionellen Mammasonographie aufgefunden werden. Danach interessiert die Rate der erkannten und als suspekt eingestuften Blutflüsse in diesem sonographischen Herdbefund. Diese beiden Schwerpunkte waren die Zielkriterien der ersten Studien im Rahmen der vorgestellten Habilitationsschrift.
Bei der Beurteilung eines diagnostischen Verfahrens muß zwischen seinem Einsatz im Screening, in der Differentialdiagnose, in der Einschätzung der Prognose oder im Therapiemonitoring unterschieden werden. Für die Differentialdiagnostik müssen die Spezifität und der positive Vorhersagewert (positive predictive value, ppv) hoch sein, um z.B. unter den im Mammographie-Screening entdeckten suspekten Herdbefunden die benignen Läsionen zu erkennen und deren unnötige Operation zu vermeiden (35-38).
In einer Studie, die an der Frauenklinik der Charité zum Vergleich der bildgebenden Verfahren in der präoperativen Differentialdiagnostik von März 1993 bis zum Mai 1995 an 200 Patientinnen (Charakteristik der untersuchten Herdbefunde in Tabelle 1) durchgeführt wurde (39), hatte die hochauflösende Mammasonographie die höchste Sensitivität und Spezifität in der Erkennung des Mammakarzinoms (Tabelle 2). Diese Angaben sind eine Gegenüberstellung der Methoden, lassen aber keinen direkten Vergleich zu. Dieser wurde in dieser Studie mit der multivariaten Diskriminanzanalyse durchgeführt. An erster Stelle in der präoperativen diagnostischen Effektivität lag die Mammasonographie.
Es sollte also mit der Mammasonographie gelingen, 95% aller malignen Herdbefunde präoperativ aufzufinden (Sensitivität 95%). Die Methoden, welche die Tumordurchblutung zur Differentialdiagnostik nutzen, wie die MRT und die CD hatten ebenfalls eine akzeptable Sensitivität von 90 bzw. 82 % aber eine Spezifität (63 bzw. 75%), die zur Differentialdiagnostik nicht akzeptabel ist (Tabelle 2). Methodische Verbesserungen sind hier notwendig. Ob diese mit der Ultraschallkontrastmittel-unterstützten Videodensitometrie möglich sind, wird in dieser Habilitationsschrift beantwortet werden (Abschnitt 4.2.2).


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Tabelle 1: Postoperative histologische Befunde der präoperativ mit Mammographie, Mammasonographie, Farbdoppplersonographie und Mamma-MRT (MRM) untersuchten Patientinnen (aus Blohmer et al. 1999 (39))

Histologischer Typ

Anzahl

Alle Mammakarzinome

99

Invasive duktale Karzinome
Invasive lobuläre Karzinome
Intraduktale Karzinome
Muzinöse Karzinome
Medulläre Karzinome
Großzelliges Karzinom

79
11
4
2
2
1

Alle benignen Herdbefunde

101

Proliferative und nichtproliferative Mastopathie
Atypische duktale Hyperplasie
Fibroadenome
Sklerosierende Adenosen
Adenome
Mastitis nonpuerperalis
Neurofibrom

41
12
34
7
3
2
1

Tabelle 2: Sensitivität, Spezifität, positiver prädiktiver Wert (ppv) und negativer prädiktiver Wert (npv) für jede diagnostische Methode für die gegebene Prävalenz des Mammakarzinoms (aus Blohmer et al. 1999 (39))

Diagnostische Methode

Anzahl der Patienten
mit eindeutiger Diagnose/
Anzahl untersuchter Patientinnen

Sensitivität

Spezifität

Prävalenz

ppv

npv

Mammographie

158/166

0,85
(68/80)

0,77
60/78)

0,5

0,79

0,83

Mamma-
sonographie

168/173

0,95
(76/80)

0,8
(70/88)

0,48

0,81

0,94

Color Doppler

150/157

0,82
(58/71)

0,75
(59/79)

0,47

0,72

0,84

MRT

68/68

0,90
(37/41)

0,63
(17/27)

0,6

0,79

0,63

Für die Erkennung von Herdbefunden nutzt der Untersucher die spezifischen Interaktionen der Ultraschallwellen mit den malignen Herdbefunden aus. Die Ultraschallwellen des B-Bildes (von brightness: Grauwertabstufung des zweidimensionalen Echtzeit-Ultraschall-Bildes) werden von stromareichen Mammakarzinomen in typischer Weise absorbiert, reflektiert, gestreut, gebeugt und gebrochen (40-42). Es resultieren typische sonographische Phänomene, mit denen man Herdbefunde sicher (Tabelle 2) erkennen und sie als malignitätsverdächtig einstufen kann. Die gleichen Phänomene gelten auch für die dreidimensionale B-Bild-Sonographie (43,44). Die diagnostische Wertigkeit jedes einzelnen Merkmals kann durch die odds-Ratio (Maß für das relative Risiko für das


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Vorliegen eines Mammakarzinoms, wenn dieses Merkmal vorhanden ist, Tabelle 3), die Sensitivität und Spezifität für die Erkennung des Karzinoms angegeben werden (45,46).

Tabelle 3: Sonographische B-Bild-Dignitätskriterien und die berechnete Sensitivität, Spezifität, der positive prädiktive (ppv) und negative prädiktive Wert (npv) und die odds-Ratio (aus Blohmer et al. 1997 (46))

Ultraschallkriterium

Sens

Spez

ppv

npv

Odds-ratio

Echogenität

81,5

9,4

29

52,6

0,45

Binnenechos

29,9

62

26,4

66

0,69

Tumorachse

79,4

53

43,5

84,9

4,4

Randwall

92,8

96,7

92,8

96,7

378

Laterale Randschatten

96,9

61

53,1

97,7

49

Architektur

88,7

96,7

92,5

94,9

230

Deformierbarkeit

92,8

70,4

58,8

95,5

31

Dorsale Schallabschwäch.

76,3

76,5

59,7

87,6

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Ein anderer Weg die typischen Veränderungen, welche die Ultraschallwellen erhalten, wenn sie auf ein Mammakarzinom treffen und die sich letztlich in verschiedenen Abstufungen und Mustern der Grauwerte des Ultraschallbildes äußern, ist die Texturanalyse des B-Bildes (47). Diese Methode ist weitestgehend unabhängig von der subjektiven Beurteilung des Ultraschallbildes und hat sicher Zukunft in der Differentialdiagnose von Herdbefunden der Mamma mit dem Ultraschall.
In der Dopplersonographie wird die Eigenschaft der Schallwellen genutzt, ihre Frequenz zu ändern,


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wenn sie auf ein bewegtes, echogenes Medium treffen.
Die Kodierung der Frequenzverschiebung der Ultraschallwellen in Form der Dopplerhüllkurve
( V (m/s) = fD (Hz) x c (m/s) / f0 (Hz) x 2 x cos alpha;
fD: Frequenzverschiebung, c: Schallgeschwindigkeit, f0 Frequenz des Dopplerschallkopfes, alpha: Winkel der Schallwellen zum Blutgefäß oder auch Dopplerwinkel)

beim gepulsten Spektraldoppler erlaubt die Wiedergabe quantitativer Flußmerkmale wie der systolischen Maximalgeschwindigkeit (Vmax), der enddiastolischen Geschwindigkeit (Vmin) und der Indizes für den peripheren Gefäßwiderstand, wie den Resistance Index (RI= Vmax - Vmin / Vmax) und den Pulsatilitäts-Index (PI= Vmax - Vmin / Vmean) von Flüssen in ausgewählten Gefäßen (Abbildung 2).

Abbildung 2: Farbkodierte Dopplersonographie in der oberen Bildhälfte und Dopplerflußkurve des gepulsten Spektraldopplers in der unteren Bildhälfte. Eingezeichnet sind Vmax, Vmin und das Aliasing-Phänomen

(Aliasing-Phänomen: Die PRF ist nicht mindestens doppelt so hoch wie die maximal zu messende Dopplerfrequenz. Geschwindigkeiten oberhalb des durch die PRF gesetzten Limits werden nicht mehr korrekt erfaßt und unterhalb der Nullinie, also in einem anderen Kanal, dargestellt (48).).
Die Kodierung der Frequenzverschiebung der Flüsse in diesen Gefäßen in Farbe und in einer größeren Fläche (durch die Verwendung vieler sample volumes entlang der Schallwellenachse im gepulsten Farbdoppler) erlaubt Aussagen zur Lokalisation dieser Blutflüsse im Herdbefund, zur Blutflußrichtung, zur Bildung von Turbulenzen, jedoch nur eingeschränkt zur Flußgeschwindigkeit. Außerdem gelingt die Ableitung von Dopplerflußkurven des gepulsten Spektraldopplers optimal, da das Meßfenster (sample volume) in einem möglichst spitzen Winkel in den zu untersuchenden, jetzt farbig sichtbaren, Fluß gelegt werden kann. In der vorliegenden Habilitationsschrift werden häufig beide Untersuchungsmethoden, da sie den gepulsten Doppler als Grundlage haben und einander bedingen als Farbdoppler (Color Doppler, CD) zusammengefaßt. Die Ergebnisse der beiden Verfahren des gepulsten Dopplers (quantitative Ergebnisse des gepulsten Spektraldopplers vs. qualitative oder semiquantitative Ergebnisse des gepulsten und farbkodierten Dopplers) werden jedoch getrennt untersucht und dargestellt.
Im CPA werden äquivalent zu den Grauabstufungen der Spektraldopplerkurve die Amplituden des reflektierten Ultraschalls farbkodiert. Ein Synonym für diese Art der Ultraschalluntersuchung ist deshalb auch „Amplituden kodierter Doppler“. Die Amplitude wird durch die Anzahl der fließenden Blutkörperchen (in erster Linie Erythrozyten) bestimmt. Um Gewebs- und Flußamplituden voneinander zu unterscheiden, wird nur ein gering von 90 Grad zur Blutflußrichtung abweichender Winkel des Ultraschalls benötigt. CPA ist damit nahezu winkelunabhängig. Kalkulationen unter Einschluß des Dopplerwinkels wie im Farbdoppler sind nicht notwendig. Theoretisch müßte die CPA aufgrund der höheren Frequenz der ausgesendeten Schallwellen (10 MHz vs. 6 MHz beim Farbdoppler) empfindlicher bei der Darstellung langsamer Flüsse sein. Außerdem gelingt die Darstellung langsamer Flüsse in kleinen Gefäßen, die senkrecht zu den Schallwellen verlaufen. Dadurch wird, ähnlich wie in der Angiographie, eine im Vergleich zum Farbdoppler „kräftige“ und farbige Darstellung des Blutflusses in nahezu dem gesamten Gefäßbett möglich. Die Bezeichnung dieser Technologie ist


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deshalb auch „Color Power Angiography“ oder „Power Doppler“ oder „Color Power Angiomode (CPA)“.
Für die Verbesserung des intravasalen Ultraschallsignals ist das Ultraschallkontrastmittel (USKM) Levovist® (Schering AG, Berlin) seit 1996 in Deutschland zugelassen. Ein optimales Kontrastmittel muß eine hohe Echogenität wie z.B. Luft haben und aufgrund einer kleinen Partikelgröße bis in die Kapillarregion gelangen können. Eine Stabilisierung dieser freien Mikrobläschen ist notwendig, da freie Mikrobläschen sehr schnell zerfallen. Levovist® ist deshalb eine mikrokristalline Suspension aus 99,9% Galactose und 0,1% Palmitinsäure mit eingeschlossenen Luftbläschen, die nach Mischen und Aufschütteln der Substanz mit physiologischer Kochsalzlösung entstehen. Beide Stoffe sind natürliche Nahrungsbestandteile. Sie werden nach oraler Aufnahme bis auf den seltenen Fall einer Galactosämie problemlos vertragen. Galactose wird hauptsächlich in der Leber als Galactose-1-phosphat gespeichert. Sie kann aber auch nach Isomerisierung zu Glukose-1-phosphat und Metabolisierung zu CO2 verstoffwechselt werden. Die Plasmahalbwertzeit des Levovist® beträgt 11 Minuten (Angabe der Schering AG). Der Palmitinsäurezusatz in Levovist® erhöht die Stabilität der Mikrobläschen so weit, daß sie die Lungenkapillarpassage, auch mehrmals, überstehen. Hierdurch wird die Wirksamkeit im gesamten Gefäßbett gewährleistet (32).
Problematisch in der Befundung der Durchblutungsuntersuchungen mit den Ultraschallmethoden ist deren geringe Objektivierbarkeit. Eine Möglichkeit der objektiven Quantifizierung wäre die Ultraschallkontrastmittel-Videodensitometrie. Mit dieser Methode wird die Wirkung eines Ultraschallkontrastmittels während der Anflutung und des Auswaschens in den bzw. aus dem Herdbefund unter Nutzung der ausgehenden Videosignale des Ultraschallgerätes gemessen. Huber et al. (49,50) haben 1998 die Ergebnisse dieser Methode unter der computerassistierten Registrierung der Veränderung der Farbdopplersignale nach Levovist®-Applikation publiziert. Bei Mammakarzinomen (N=31) war die Zunahme der color pixel density (Prozentsatz der Farbpixel in einer festgelegten Region (region of interest, CPD) signifikant stärker ausgeprägt und die Zeit bis zum Maximum der Änderung der CPD war signifikant kürzer als bei benignen Herdbefunden der Brust (N=16). Für die Anwendung der Videodensitometrie müßte der CPA besser als der Farbdoppler sein, da nur die Höhe der Signalamplitude farbkodiert ist, nicht die Richtung des Blutflusses. Der im Ultraschall dargestellte Blutfluß wird nach der Injektion von Ultraschallkontrastmittel (USKM) im CPA durch die Veränderung der Signalamplitude nur heller und ändert seine Farbe nicht. Damit ist nur eine Registrierung der Helligkeit über die Zeit und keine zusätzliche Analyse der Farbveränderung notwendig.
Prognoseeinschätzung von Mammakarzinomen
Die Ausprägung von Prognosefaktoren bestimmt die systemische (adjuvante) und lokale Therapie des Mammakarzinoms (51). Ihre frühzeitige Kenntnis erlaubt die schnellstmögliche Einleitung der wirksamsten bzw. maximal sinnvollen Therapie und vermeidet damit eine Unter- oder Übertherapie der konkreten Patientin.
Bisher findet die Bestimmung der etablierten Prognosefaktoren mit Ausnahme des Alters der Patientin nach der Operation des Mammakarzinoms statt und orientiert sich an den Faktoren Karzinomgröße, Lymphknotenmetastasierung, histologischer Differenzierungsgrad und Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus (pTNM, G, ER, PR (51)). Aussagen zur Lymphknotenmetastasierung sind erst durch die axilläre Lymphonodektomie möglich. Um in Zukunft diese Operation vermeiden zu können, wurden und werden verschiedene andere Prognosefaktoren, wie c-erbB-2- Onkoprotein, EGF-Rezeptor (epithelial growth factor), Expression des mutierten p53, KI67-Expression (Proliferationsfaktor der Zellzyklusphasen G1, S und G2/M), S-Phase, uPA (Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp), PAI-1 (Inhibitor von uPA) und andere Faktoren in randomisierten Studien untersucht (52). Das Grading gilt heute schon als unabhängiger Prognosefaktor für das Gesamtüberleben bei lymphknotennegativen Mammakarzinomen, die immerhin in ca. 30% innerhalb von 10 Jahren metastasieren (53). Da die „neueren“ Prognosefaktoren häufig mit den etablierten in einer abhängigen Wechselbeziehung stehen (KI67-Expression mit dem Grading), ist für deren Bewertung als unabhängige Prognosefaktoren die Multivarianzanalyse notwendig. Danach behielten nur PAI-1 und die S-Phase eine statistisch signifikant unabhängige prognostische Aussagekraft (54). Das sind Faktoren, die das Invasionspotential (PAI-1) und das Proliferationspotential (S-Phase) des Tumors beschreiben.
Bisher können diese neuen Prognosefaktoren nicht als prädiktive Faktoren für die Auswahl bestimmter Therapieformen (Hormon- oder Chemotherapie, Anthrazykline, Taxane, Herceptin®) eingesetzt werden.
Inzwischen gilt es als etabliert, daß Patientinnen mit einem kleinen Mammakarzinom und einer hohen angiogenetischen Aktivität und hoher Gefäßdichte eine schlechtere Prognose als die gering durchbluteten haben (55,56). Nach den histomorphologischen Untersuchungen von Weidner et al. (57) ist die „microvessel density“ der einzige statistisch signifikante Vorhersagewert für die Überlebenschancen bei Patientinnen ohne Befall der operativ entfernten Lymphknoten. Diese

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Aussage konnte durch weitere immunhistochemische Arbeiten am Mammakarzinom bestätigt werden (58,59).
Seit 1996 sind einige Publikationen zur präoperativen Einschätzung der Prognose von Patientinnen mit einem Mammakarzinom mit Hilfe der Farbdopplersonographie erschienen (60-62). Nach Lee et al. (60) und Peters-Engl et al. (63) soll bei T1-Mammakarzinomen eine hohe systolische Maximalgeschwindigkeit in den Tumorgefäßen mit der Lymphknotenmetastasierung assoziiert sein, nicht jedoch bei den größeren Mammakarzinomen.
Therapiemonitoring von Mammakarzinomen
Nach dreidimensionaler mikroskopischer Betrachtung (Schichtdicke 50 Mikrometer) und CD34-Gefäßwandfärbung der Tumor-Kapillaren-Einheit (oder two-cell compartment-model of a tumor) konnten auf ein Gramm Tumorgewicht 109 Tumorzellen und 2 x 107 Endothelzellen berechnet werden. Es werden also 100 Tumorzellen von einer Endothelzelle versorgt. Auch wenn diese Berechnung aufgrund der Heterogenität der Tumorvaskularisation fehlerhaft sein kann, ist die Vorstellung faszinierend, mit der Zerstörung einer Endothelzelle 100 Tumorzellen zu vernichten (64). Eine Resistenz der Endothelzellen ist aufgrund ihrer langsamen Zellteilung ebenfalls nicht zu erwarten. Das erklärt die Beobachtung, daß das antiangiogenetisch wirkende Pacltitaxel noch nach 20 Therapiezyklen (im dreiwöchigen Abstand) bei einigen Patientinnen eine Tumorkontrolle ermöglicht (65,66).
Die theoretischen Möglichkeiten dieses two-cell-compartment-models sind mit der Chance der antiangiogenetischen Erhaltungstherapie im kombinierten Einsatz mit Zytostatika noch nicht ausgeschöpft. Durch die antiangiogenetisch wirkenden Medikamente wird z.B. der hydrostatische Druck im Tumor gesenkt, und die intravasalen Chemotherapeutika können in das Interstitium des Tumors gelangen (Folkman 1997).
Die meisten Anti-Angiogenese-Medikamente (IL-4, IL-12, TNP-470 (67)) wirken allerdings nur tumorstatisch und müssen als Dauertherapie eingesetzt werden, eine Messung des Tumordurchmessers oder -volumens unter der Therapie erlaubt somit nur eingeschränkte Aussagen zur therapeutischen Effektivität (67). Beim heterogen durchbluteten Mammakarzinom macht eine Messung des Sauerstoffpartialdruckes ebenso wie die Messung der Vaskularisierung unter der Therapie wahrscheinlich wenig Sinn. Diese Verfahren sind außerdem invasiv. Es bleiben also zwei Methoden, die Messung von Angiogenese-Faktoren im Serum oder Urin als Surrogatmarker für die antiangiogenetische Therapie und die Messung der Durchblutung mittels bildgebender Verfahren (67).
Mit dem zunehmenden Einsatz der primären oder präoperativen oder neoadjuvanten Chemo- oder Hormontherapie müssen diese Verfahren auch zur Messung der Effektes dieser Therapien auf die Tumordurchblutung eingesetzt werden. Bisher waren das inflammatorische und das lokal fortgeschrittene Mammakarzinom die klassischen Indikationen für eine primäre Chemotherapie. Durch diese Chemotherapie wird eine Operation mit einer Resektion im Gesunden erst möglich (68). Mit dieser Therapieform können klinische Remissionsraten zwischen 50 und 80% erreicht werden. (68-70). Das 5-Jahres-Gesamtüberleben liegt dann bei ca. 50% (71). In diesen Studien konnte der Zusammenhang zwischen dem Ansprechen des Tumors und dem rezidivfreien und dem Gesamtüberleben der Patientin gezeigt werden (68). Bei den operablen Mammakarzinomen brachte die präoperative Chemotherapie im Vergleich mit der adjuvanten Chemotherapie in einer randomisierten Studie der amerikanischen Studiengruppe NSABP (Studie B-18, 1506 Patientinnen (72)) keinen signifikanten Gewinn für das Gesamtüberleben der Patientinnen. Es konnte aber in der Gruppe der präoperativ chemotherapierten Patientinnen mit einem Mammakarzinom von mindestens 5 cm Größe die Rate der brusterhaltenden Operationen von 8% auf 22% erhöht werden.
Die Beurteilung des Ansprechens des Tumors auf die Chemotherapie ist deshalb wichtig für die Prognose der Patientin und die weitere Therapieplanung. Von der Beurteilung der Remission hängt es ab, ob diese Chemotherapie fortgesetzt werden kann oder abgebrochen werden muß, ob andere Therapieformen eingesetzt werden (Bestrahlung, veränderte Chemotherapiesubstanzen) und ob eine brusterhaltende Operation mit der Patientin besprochen und geplant werden kann. Eine frühzeitige Beurteilung vermeidet unnötige Nebenwirkungen und gestattet eine kalkulierte Chemotherapie.
Verschiedene Methoden wurden bisher zum Therapiemonitoring unter primärer Chemo- oder Hormontherapie eingesetzt, wie die konventionelle Sonographie (73), dreidimensionale Sonographie (47), die Mammographie (74), die MRT-Kontrastmittel-Untersuchung (28,75), die MRT-Spektroskopie (76,77), die PET (29). Deren Ergebnisse werden zusammen mit denen der dopplersonographischen Verfahren in der Diskussion dieser Habilitationsschrift (Abschnitt 5) verglichen werden.
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