Blohmer, Dr. Jens-Uwe: Kontrastmittel-Videodensitometrie und Automatisierte Mikroskop-Bildanalyse zur Messung der Durchblutung und Vaskularisation von Mammakarzinomen

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Kapitel 3. Patientinnen und Methoden

Die verschiedenen, hier dargestellten Ultraschallmethoden zur Untersuchung der Tumordurchblutung bauen zeitlich und methodisch aufeinander auf.
Bis 1995 wurden die Untersuchungen in der Abteilung für pränatale Diagnostik (Leiter: Prof. Dr. med. R. Bollmann) mit der hochfrequenten Farbdopplersonographie durchgeführt (6 MHz Ultraschallwellenfrequenz, UM 9, ATL, Bothel, USA). Ab 1996 wurde in den Studien der neu entwickelte, höherfrequente Color Power Angiomode (10 MHz Ultraschallwellenfrequenz, UM 9 und HDI 3000, ATL, Bothel, USA) eingesetzt. Seit 1996 ist das Ultraschallkontrastmittel Levovist® (Schering AG, Berlin, Deutschland) zugelassen und seit 1997 konnte ich die Videodensitometrie-Technik in der Forschungs-Abteilung Kontrastmittelentwicklung Ultraschall der Schering AG (Leiter: Dr. T. Fritzsch) zur Untersuchung der quantitativen Kontrastmittelkinetik im CPA nutzen. Die Studien zur präoperativen Chemotherapie von Mammakarzinomen begannen an der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Campus Charité Mitte (Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. W. Lichtenegger) im März 1996.
Zur Erfassung der Reliabilität (Zuverlässigkeit des Testverfahrens) der Ultraschall-Durchblutungsmessung wurden deren Ergebnisse mit denen der MRT-Untersuchung (Paralleltest-Reliabilität, Abschnitt 3.1.3.) und mit denen der Tumorvaskularisation (Abschnitt 3.3.) an identischen Patientinnen verglichen. Zur Testung der Validität (Tauglichkeit des Verfahrens für den zu messenden Sachverhalt) wurden alle Ergebnisse der Durchblutungsmessung mit den histologischen Ergebnissen und deren diagnostische Effektivität (Spezifität, Sensitivität) mit anderen Verfahren verglichen (Abschnitt 1.2.1.). Bei den Messungen zum Therapiemonitoring erfolgte der Vergleich mit dem klinischen, sonographischen und histologischen Ansprechen. Außerdem wurden, wenn möglich, die Untersuchungsergebnisse mit denen der kontralateralen, nicht erkrankten Brust verglichen (kriteriumsbezogene Validität).
Die Objektivität und Wiederholbarkeit der Messungen konnte bei der Gefäßmorphometrie durch wiederholte Messungen unterschiedlicher Untersucher und die Bestimmung des Variationskoeffizienten untersucht werden, bei den Durchblutungsuntersuchungen mußten aus Gründen der Rücksichtnahme auf die (präoperative) Patientin Mehrfachuntersuchungen eines Untersuchers reichen.
Im Sinne der Konstruktvalidität wurde jede Untersuchung mit einer Hypothese begonnen, die in der Diskussion angenommen oder verworfen wird.

3.1. Farbdopplersonographie (CD)

3.1.1. Differentialdiagnose und Farbdopplersonographie

Die Hypothese dieser Studie ist, daß verschiedene Parameter der gepulsten Farbdopplersonographie wie die maximale systolische Geschwindigkeit, der Resistance Index und die semiquantitative Parameter der Anordnung der Farbpixel geeignet sind, zwischen benignen und malignen Herdbefunden präoperativ zu unterscheiden.
Patientinnen: Zwischen Oktober 1993 und Mai 1995 wurden 200 Patientinnen (99 mit einem Mammakarzinom und 101 mit einem gutartigen Herdbefund der Mamma) präoperativ neben der Mammographie, der hochauflösenden Mammasonographie (Breit-Band-Scanner, 5-10 MHz), dem Mamma-MRT auch mit dem gepulsten und farbkodierten Farbdoppler untersucht.
132 der Patientinnen hatten einen Tastbefund selbst festgestellt oder ihr Gynäkologe stellte ihn bei der Vorsorgeuntersuchung fest, bei 68 wurde durch das verdeckte „Screening“ bei einer Routine-Mammographie ein nicht palpabler Herdbefund festgestellt.
Die Charakteristik der Patientinnen und der histologischen Befunde wird in Tabelle 1 (Abschnitt 1.2.1.) dieser Habilitationsschrift wiedergegeben. Bei 57% der präoperativ untersuchten Patientinnen war der Herdbefund in der linken Brust lokalisiert. Die Patientinnen mit benignen Herdbefunden der Brust waren signifikant jünger (medianes Alter: 47,6 Jahre) als die mit einem Mammakarzinom (medianes Alter: 58,1 Jahre).
Alle histologischen Untersuchungen erfolgten während des Untersuchungszeitraumes im Pathologischen Institut der Charité, Campus Charité Mitte (Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. M. Dietel). Die zytologischen Untersuchungen der Zystenpunktate erfolgten im zytologischen Labor (Leiter: Dr. J.-U. Blohmer) der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Charité, Campus Charité Mitte (Geschäftsführende Direktoren: Prof. Dr. med. U. Lau (bis 3/95) und Prof. Dr. med. W. Lichtenegger (ab 4/95)). Die Stadien des Mammakarzinoms waren wie folgt verteilt: pTis: N=4; pT1: N=50; pT2: N=31, pT3/pT4: N=14. Lymphknotenmetastasen (pN1) hatten 48 dieser Patientinnen. Fünf Patientinnen hatten Fernmetastasten (M1).


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Methodik: Für diese Studie wurden die Ultraschallgeräte Ultramark 9 und HDI 3000 (ATL, Bothell, WA, USA) mit dem gleichen elektronischen Linearschallkopf mit der Breitbandtechnologie L5-10 und einer Doppler-Frequenz von 6 MHz eingesetzt.
Folgende Geräteeinstellung (pre-set) wurde bei allen Untersuchungen automatisch mit Nutzung des Schallkopfes L5-10 eingestellt: Maximale Farbpriorität, minimaler Farbfilter (um auch geringste Flußgeschwindigkeiten farbig darstellen zu können), hohe PRF (Pulswiederholungsfrequenz oder pulsed repetition frequency, 700-1000 Hz) zu Beginn der Untersuchung. Diese wurde schrittweise reduziert, um das Aliasing-Phänomen (Abbildung 2, Abschnitt 1.2.) bei schnellen Flüssen zu vermeiden, Farbgesamtverstärkung (color gain) ca. 50% (Beginn mit maximaler color gain und Reduktion soweit, daß gerade ein leichtes Farbrauschen sichtbar war.). Die individuelle Einstellung der color gain und der PRF wurde während der gesamten Untersuchung beibehalten. Intraindividuell durften keine Unterschiede in der Geräteeinstellung gemacht werden. Es durfte mit dem Schallkopf kein Druck auf das Gewebe ausgeübt werden.
Wenn mit dem Farbmodus ein Fluß sichtbar wurde, wurde das sample volume des Spektraldopplers in diesen Fluß gelegt und die Dopplerflußkurve drei Mal abgeleitet. Alle im Herdbefund sichtbaren Blutflüsse wurden mit dieser Methode gemessen. Die Kurve mit der höchsten maximalen systolischen Geschwindigkeit wurde für diese Studie ausgewählt, da so die genaueste Analyse der einzelnen Parameter reproduzierbar ist. Für die Ableitung korrekter Geschwindigkeiten, mußte der Untersucher einen Dopplerwinkel (alpha) von mindestens 30-60 Grad einhalten. Wenn es nicht möglich war, einen Dopplerwinkel von kleiner als 30 Grad einzustellen, mußte mit Hilfe der arithmetischen Winkelkorrektur ein Winkel zwischen 0 und 30 Grad in diesem Bereich angenommen und der entsprechende Geschwindigkeitswert berechnet und gewählt werden (Ultraschall-Geräte-Software). Die Blutflüsse im korrespondierenden Quadranten der gegenüberliegenden, nicht erkrankten Brust (Spiegelbild-Quadrant) wurden mit den gleichen Methoden untersucht und auch hier wieder die Dopplerflußkurve aus dem Gefäß mit der höchsten maximalen systolischen Geschwindigkeit für die Analyse gewählt.
Folgende Farbpixelcharakteristika und Parameter der Dopplerhüllkurven wurden hinsichtlich ihres Wertes für die Differentialdiagnostik von Herdbefunden der weiblichen Brust untersucht:
-Maximale Anzahl der pulsierenden Pixelflächen (Blutflüsse) in einer Ebene des Herdbefundes
-Lokalisation des mit dem Farbdoppler sichtbaren Blutflusses (pulsierende Farbpixel) im Herdbefund oder in seiner Peripherie (definiert als Randbereich um den Herdbefund, der ca. 10% des maximalen Durchmessers des Herdbefundes entspricht). Der Herdbefund wurde als Region mit einer zur Umgebung verschiedenen Echogenität definiert (im allgemeinen echoarmer Herdbefund in einem echoreichen Drüsengewebe).
-Semiquantitative Klassifikation der pulsierenden Farbpixel in 3 Gruppen nach Sohn et al. 1996 (61,79, Abbildungen 3-5):

Klasse I: Nur einzelne, isolierte, pulsierende Farbpixel sind sichtbar (eventuell Artefakte durch Patientenbewegung oder Geräterauschen).
Klasse II: Eine pulsierende Pixelfläche ist sichtbar.
Klasse III: Mehr als eine Pixelfläche ist sichtbar.
-maximale systolische Geschwindigkeit (Vmax) und Resistance-Index (RI) (Abbildung 2, Abschnitt 1.2.).
-Differenz zwischen Blutfluß im Herdbefund und im Spiegelbild-Quadranten hinsichtlich von Vmax und RI

Abbildung 3: Farbpixelverteilung der Pixelklasse I im Tumor (Mammakarzinom pT3pN1G2M0).


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Abbildung 4: Farbpixelverteilung der Klasse II im Rand des Tumors (Mammakarzinom pT3pN1G2M0)

Abbildung 5: Farbpixelverteilung der Klasse III im Tumor (Mammakarzinom pT4dpN1G2M0)

Die Charakteristik der farbigen, pulsierenden Pixel (Anordnung, Zahl, Klassen) wurde in nur einer Ebene des Herdbefundes bestimmt, um Mehrfachmessungen zu vermeiden. Es wurde die Ebene mit den meisten pulsierenden Pixelpunkten oder -flächen gewählt.
Zugelassen waren nur die Untersuchungen, bei denen eine eindeutige Zuordnung in die Gruppe der benignen oder die Gruppe der malignen Herdbefunde möglich war und eine Untersuchung des Spiegelbildquadranten möglich war. Bei 43 Patientin war es nicht möglich, einen Blutfluß in der kontralateralen Brust darzustellen. Bei 4 Patientinnen war diese Brust bereits abladiert. Wenn im Herdbefund kein Blutfluß darstellbar war (N=24), wurden diese den benignen Herdbefunden zugeordnet. Bei den anderen oben genannten Parametern mußte der Untersucher entscheiden, ob er den Herdbefund der Gruppe der benignen oder der Gruppe der malignen Herdbefunde zuordnet.
Für fehlende Meßergebnisse wurden, um die anderen Daten der Patientin trotzdem in die Studie aufnehmen zu können, sogenannte Missing-Werte eingesetzt. Daher ist die Zahl der in die verschiedenen Tests eingegangenen Messungen variabel und häufig kleiner als die aus 99 Patientinnen bestehende Patientinnengruppe. Fehlende Meßwerte konnten auftreten, wenn es z.B. gelang eine pulsierende Pixelfläche darzustellen und damit die Einteilung in die 3 Pixelklassen gelang, aber eine Dopplerflußkurve konnte nicht mit gepulsten Spektraldoppler abgeleitet werden.
Die Untersuchung wurde prospektiv und präoperativ durchgeführt und dokumentiert und mit den am Folgetag vorliegenden histologischen Befunden verglichen.
Statistische Untersuchungen: Der Wilcoxon Matched Pairs Signed Ranks-Test, der Student‘s t-Test und der Chi-Quadrat-Tast wurden für die statistische Untersuchung der Unterschiede zwischen benignen und malignen Herdbefunden hinsichtlich der Parameter der Farbdoppleruntersuchung benutzt, eine Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von < 0.05 wurde als signifikant angenommen. Alle statistischen Auswertungen dieser Analyse erfolgten mit dem Statistikprogramm SPSS, Version 6.0.1.


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3.1.2. Prognose und Farbdopplersonographie

Die Hypothese dieser Studie ist, daß mit den Parametern der CD in vivo auf die histomor-phologischen Ergebnisse der etablierten Prognosefaktoren (pT, pN0, G, Hormonre-zeptorstatus) geschlossen werden kann.
Patientinnen und Methodik: Es wurden die gleichen dopplersonographischen Messungen mit der gleichen Technologie bei den 99 Patientinnen mit einem Mammakarzinom durchgeführt wie bei der Untersuchung zur CD in der Differentialdiagnose (Abschnitt 3.1.1.).
Die farbdopplersonographische Befundung und Dokumentation erfolgte prospektiv und präoperativ im gleichen Zeitraum vom Oktober 1993 bis zum Mai 1995 wie die zur Differentialdiagnose.
Die untersuchten, etablierten Prognosefaktoren des Mammakarzinoms waren die Tumorgröße (pTis-pT1, pT2, pT3/pT4), der Lymphknotenstatus (pN0, pN1) und das Grading (G 1-3) und der Hormonrezeptorstatus.
Statistische Untersuchungen: Alle statistischen Auswertungen dieser Analyse erfolgten ebenfalls mit dem Statistikprogramm SPSS, Version 6.0.1.
Für die Analyse, ob es bei der Ausprägung der Parameter der CD Unterschiede zwischen allen Tumorstadien gab, wurde der nichtparametrische Tests für unabhängige Stichproben (Kruskal-Wallis 1-Way Anova) angewendet. Der statistische Vergleich zwischen je zwei einzelnen pT-, pN- oder Grading-Gruppen erfolgte mit Hilfe des Mann-Whitney-Test, jeweils mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05.

3.1.3. Vergleich der Farbdopplersonographie mit der Magnetresonanztomographie (MRT) in der Differentialdiagnose von Mammatumoren

Die Hypothese dieser Arbeit ist es, daß die Ergebnisse der Farbdopplersonographie und der Kontrastmittel-MRT der Mamma miteinander in Wechselbeziehung stehen (korrelieren), da mit beiden Methoden Merkmale der Durchblutung der Herdbefunde der Mamma dargestellt werden. Die Ergebnisse der Farbdopplersonographie wären dann mit denen der MRT der Mamma vergleichbar.
Patientinnen: Von den präoperativ mit beiden Methoden im Jahr 1996 untersuchten 37 Patientinnen wurde bei 27 Patientinnen ein Karzinom (pT1: N=11, pT2: N=6, pT3/pT4: N=4, Rezidiv: N=6) festgestellt und bei 10 Patientinnen ein benigner Herdbefund (Fibroadenom: N=2, eine Form der Mastopathie: N=6, Papillom: N=1, Abszeß: N=1). Bei den 27 Patientinnen mit einem Mammakarzinom wurden, aufgrund von Multifokalität und Multizentrizität bei 5 Patientinnen, insgesamt 36 Karzinome entdeckt und untersucht.
Diese 36 Karzinome hatten die folgenden histologischen Typen: invasives duktales Karzinom: N=24, invasives duktales Karzinom und intraduktale Komponente: N=6, invasives lobuläres Karzinom: N=4, medulläres Karzinom: N=2. Das mediane Alter der Patientinnen betrug 54 Jahre (39-72 Jahre).
Methodik: Die Ultraschalltechnologie, Geräteeinstellung, Ultraschalluntersuchung, Definition der sonographischen Herdbefunde, Parameter der Farbdopplersonographie waren identisch mit denen der Studien in den Abschnitte 3.1.1. bis 3.1.2.
Die kernspintomographischen Untersuchungen erfolgten mit einem Hochfeld MRT, 1,5 Tesla (ACN-NT 15, Philips, Einthoven, Holland, und Magnetom SP 63, Siemens, Erlangen, Deutschland) im MRT-Labor der Strahlenklinik und Poliklinik der Charité (Geschäftsführender Direktor Professor Dr. Dr. h.c. R. Felix) im Campus Virchow-Wedding, in erster Linie durch die Herren Dres. H. Oellinger und C. Siewert. Die Datenerfassung erfolgte durch Herrn G. von Klitzing.
Zu Untersuchungsbeginn wurden mit einem transversalen und coronaren Localizer die Untersuchungsebenen festgelegt; anschließend wurde mit einer T2-gewichteten Spin-Echo-Sequenz (TR=2500 ms, TE=90 ms) untersucht. Darauf folgte eine T1-gewichtete 3D- Gradienten-Echo-Sequenz (TR 11ms, TE 4,9ms, Matrix 256x256). Bei allen 37 Patientinnen wurde in transversaler und bei 26 Patientinnen in coronarer Schnittführung mit der 3D-Technik untersucht. Die Schichtdicke betrug 2,5 beziehungsweise 4 mm. Als Kontrastmittel wurde Gadolinium DTPA (Gd-DTPA, Magnevist®, Dosierung: 0,2 mg/kg Körpergewicht) in die linke Kubitalvene über einen MR-Injektor (XD 7000, Fa. Ulrich, Ulm) injiziert. Für diese Untersuchungen wurde ein Volumendurchsatz des Kontrastmittels (KM) von 3 ml/s eingestellt. Nach der Kontrastmittelgabe wurde die 3D-GE-Sequenz fünffach wiederholt. Nach Untersuchungsende wurden Subtraktionsbilder der Kontrastmittelkinetik berechnet (Postkontrast minus Prekontrast) und unter Verwendung des MIP-Algorithmus (Maximale Intensitäts Projektion) in cranio-caudaler (CC) und mediolateraler Ansicht (ML) eine dreidimensionale Darstellung beider Mammae angefertigt. Diese Darstellung vermittelt einen Gesamteindruck über die verschiedenen Kontrastmittelanreicherungen (Parenchym, Tumor, Gefäße) und erfolgte in Anlehnung an den in der konventionellen Mammographie verwendeten Strahlengang. Die Subtraktionsaufnahmen wurden auf mögliche Läsionen untersucht, dann in den Postkontrastaufnahmen mittels ROI-Technik (region of interest) das Signalenhancement gemessen und die Kinetik der Anreicherung über die Zeit als Kurve berechnet und dargestellt. Die


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Kontrastmittelanreicherung im Tumor wurde bewertet und wie folgt klassifiziert: Anreicherung am Rand (ring like enhancemend), Rand und Zentrum, homogene oder inhomogene Anreicherung. Zur Charakterisierung des Kurvenverlaufes wurden zu bestimmten Zeitpunkten (alle 75 Sekunden) die absoluten Signalintensitäten bestimmt und aus deren Verhältnis zur Signalintensität ohne Kontrastmittel der relative Signalanstieg in Prozent errechnet.
Statistische Untersuchungen: Die Befunderstellung der Farbdopplersonograhie und der MRT erfolgten prospektiv und präoperativ. Zunächst wurde untersucht, ob jede Methode für sich in der Lage ist, benigne von malignen Herdbefunden zu trennen. Diese Berechnung erfolgte anhand des relativen Signalanstiegs nach Kontrastmittelgabe beim MRT und der maximalen systolischen Geschwindigkeit beim CD mit der Varianzanalyse für 2 Gruppen (benigne und maligne), t-Test für unabhängige Stichproben. Danach wurde für die Erkennung eines Zusammenhanges zwischen beiden Methoden (MRT und CD) eine Produktmomentkorrelationsanalyse nach Pearson durchgeführt. Die zugelassene Irrtumswahrscheinlichkeit (alpha-Fehler) betrug bei allen Berechnungen 5%.

3.1.4. Therapiemonitoring und Farbdopplersonographie

Neben der Bewertung dieses neuen Untersuchungsverfahrens in der Diagnostik und Prognoseeinschätzung interessierte uns sein Einsatz im Therapiemonitoring.
Während einer laufenden Phase-II-Studie (3/96 bis 3/97) zur präoperativen Chemotherapie lokal fortgeschrittener (T3-) und inflammatorischer (T4d-) Mammakarzinome (69,70) wurden bei diesen Patientinnen Untersuchungen mit der CD und unter Dokumentation der in den Abschnitten 3.1.1. und 3.1.2. aufgeführten Doppler-Parameter durchgeführt. Auch hier erfolgte die Datenerfassung dieser Parameter prospektiv und wurde mit dem klinischen Ansprechen verglichen. Für eine sonographische Diametrie waren die Herdbefunde zu groß (lokal fortgeschrittene Karzinome größer als 5 cm, Schallkopfbreite 3,8 cm, Linearschallkopf) oder hatten keine meßbaren Befunde in der Brust (inflammatorische Karzinome).
Die Hypothese ist, daß anhand der Veränderung von farbdopplersonographischen Parametern auf das Ansprechen des Mammakarzinoms auf eine präoperative Chemotherapie geschlossen werden kann.
Patientinnen: Neun Patientinnen mit einem lokal fortgeschrittenen Mammakarzinom (LABC) und 12 mit einem inflammatorischen Mammakarzinom (IBC) und ohne Fernmetastasierung (Röntgenuntersuchung des Thorax, Oberbauchsonographie und Skelettszintigraphie vor Einschluß der Patientinnen in die Studie) erhielten präoperativ 3 Zyklen einer Chemotherapie mit Ifosfamid 5 g/m2 und Epirubicin 60 mg/m2 alle 14 Tage (mit Filgastrim®) und adjuvant Epirubicin 60 mg/m2 und Paclitaxel 175 mg/m2 alle 14 Tage (mit Filgastrim®), gefolgt von Tamoxifen.
Östrogenrezeptor-positiv waren 15 Patientinnen, Progesteronrezeptor-positiv davon 5 Patientinnen. Die Hormonrezeptorbestimmung erfolgte immunhistochemisch mit der streptavidin-biotin- Markierung (LSAB-Methode) am Paraffinschnitt, der entsprechend vorbereitet (u.a. deparaffiniert) wurde. Die Antikörper zur Darstellung der Östrogenrezeptoren waren 6F11 (Novocastra), zur Darstellung der Progesteronrezeptoren PR-2C5 (Zymed). Diese Rezeptorenfärbung ist eine Kernfärbung. Es wurde der Prozentsatz der gefärbten Zellen (Kerne) angegeben und ein Karzinom entsprechend des International Consensus Panel on the Treatment of Primary Breast Cancer V: Update 1998 (51) als rezeptorpositiv bezeichnet, wenn mindestens 10% der Zellen angefärbt waren. Die Einteilung des Gradings erfolgte nach der Methode von Bloom und Richardson (81) in die Grade 1 (gut differenziert) bis 3 (gering differenziert). Die Beurteilung des histologischen Tumortyps, der Tumorgröße und der Lymphknotenmetastasierung erfolgte am mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Paraffinschnitt. Die Einschätzung der histologischen Regression erfolgte in die 4 Grade nach Sinn et al. (82).
Das mediane Alter der Patientinnen betrug 53 Jahre (Range 40-60 Jahre). Alle Patientinnen befanden sich vor Beginn der Therapie in einem guten Allgemeinzustand (Grad 0-1 nach WHO).
Ansprechrate insgesamt (ORR): 65% (Komplette Remission, CR: keine Patientin; partielle Remission, PR: 13 Patientinnen; keine Veränderung, NC: 8 Patientinnen; Tumorprogress, PD: keine Patientin).
16 dieser Patientinnen wurden während der Chemotherapie mit der CD untersucht. Neun dieser Patientinnen hatten ein T3- und sieben Patientinnen ein T4d- Mammakarzinom.
Methodik: Die Ultraschall- und Doppleruntersuchung erfolgte mit der gleichen Technologie, Geräteeinstellung und Untersuchungsmethodik wie in den Abschnitten 3.1.1. und 3.1.2. Folgende Parameter wurden prospektiv erhoben und dokumentiert:
-maximale systolische Geschwindigkeit (Vmax) vor Beginn und nach der präoperativen Chemotherapie
-Resistance Index (RI) vor Beginn und nach der präoperativen Chemotherapie
-Anzahl der pulsierenden Pixel vor und nach der präoperativen Chemotherapie.
Die Untersuchungsebene wurde im Untersuchungsprotokoll, im Ultraschallbild und auf der Haut der Patientin dokumentiert, um die nachfolgenden Ultraschalluntersuchungen in dieser Ebene und an den gleichen Blutgefäßen durchzuführen. Die Patientinnen wurden unter der Therapie im Abstand von 14


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Tagen mit der CD untersucht. Der Ultraschalluntersucher war „geblindet“ in bezug auf die klinische Remission, das heißt, er wußte nicht, ob die Patientin auf die Therapie angesprochen hat oder nicht. Die Ergebnisse der ersten und der letzten Doppler-Ultraschalluntersuchung wurden miteinander verglichen.

3.2. Ultraschall-Kontrastmittelsonographie (Videodensitometrie)

3.2.1. Color Power Angiomode (CPA) im Vergleich zur Farbdopplersonographie (CD)

Aus der Darstellung der Methodik der Farbdopplersonographie-Studie wird klar, daß es schwierig ist, die Ergebnisse dieser Ultraschalltechnologie zu reproduzieren und zu objektivieren. Es fehlen vom Untersuchter weitgehend unabhängige und damit objektive Verfahren zur Quantifizierung der meßbaren Tumordurchblutung. Einen Ausweg aus diesem Dilemma bietet eventuell die Videodensitometrie, bei der die Kinetik des intravenös injizierten Kontrastmittels im Tumorgefäß (An- und Abflutung) gemessen wird. Theoretisch müßte hier der Color Power Angiomode (CPA) besser geeignet sein als die CD. Voraussetzung ist, daß der CPA nicht nur theoretisch aufgrund seiner höheren Ultraschallwellenfrequenz (10 MHz beim CPA vs. 6 MHz beim Farbdoppler), sondern auch praktisch in der Darstellung von Blutfluß in Mammatumoren sensibler als die CD ist.
Die Hypothese am Eingang dieses Abschnitts ist, ob der CPA eine im Vergleich zur CD höhere Sensitivität in der Darstellung von Blutflüssen im sonographischen Herdbefund hat.
Patientinnen: 50 Patientinnen wurden präoperativ vom Juni 1996 bis zum Dezember 1996 mit dem CPA untersucht. Bei allen Patientinnen stand die OP-Indikation wegen eines Tastbefundes (N=41) oder eines mammographisch suspekten Befundes (N=9) fest und wurde durch die Ultraschalluntersuchung nicht geändert.
36 Patientinnen hatten ein Mammakarzinom (pT1: N = 15, pT2: N = 14, pT3: N = 4,pT4: N = 3 ; pN0: N = 20, pN1: N = 14, pN2: N = 2), davon hatten 26 Frauen ein invasives duktales Karzinom, 7 Patientinnen ein invasives duktales Karzinom mit intraduktaler Komponente, eine Patientin ein invasives adenoid-zystisches und zwei Patientinnen ein invasives lobuläres Karzinom. 14 Patientinnen hatten benigne Mammaläsionen, davon 5 Patientinnen eine Fibrose, 4 Patientinnen ein Fibroadenom, zwei Patientinnen eine Entzündung, zwei Patientinnen eine Zyste und eine Patientin hatte ein Lipom.
Das mediane Alter betrug bei den Patientinnen mit einem Mammakarzinom 55 Jahre (Range: 39 bis 74 Jahre) und bei den Patientinnen mit benignen Läsionen 48,5 Jahre (31 bis 70 Jahre).
Methodik: Die eingesetzte Ultraschalltechnologie, Geräteeinstellung und die Methodik der Definition der Herdbefunde mit dem hochauflösenden Ultraschall und der konventionellen Farbdopplersonographie war die gleich wie in den Abschnitten 3.1.1. und 3.1.2. Die verwendete CPA-Frequenz war 10 MHz.
Es wurde die Anzahl der pulsierenden Farbflächen erst im Farbdoppler (CD)- und dann im CPA-Mode bei jeder Patientin gezählt. Dazu wurde die Ebene des sonographischen Herdbefundes gewählt, in der die meisten Pixelflächen mit dem Farbdoppler ausgezählt werden konnten. In der gleichen Einstellung erfolgte die Auszählung der Pixelflächen mit dem CPA-Mode. Anschließend wurde verglichen, mit welcher Methode mehr Farbpixelflächen darstellbar waren.
Dazu erfolgte die Einteilung der Untersuchungsergebnisse in 4 Gruppen:
Gruppe 1: weniger Blutfluß im CPA als in der CD
Gruppe 2: gleiche Anzahl pulsierender Pixelflächen im CPA und in der CD
Gruppe 3: mehr Blutfluß im CPA als in der CD (1-3 pulsierende Pixelflächen zusätzlich)
Gruppe 4: deutlich mehr Blutfluß im CPA als in der CD (mehr als 3 pulsierende Pixelflächen zusätzlich).
Statistische Untersuchungen: Der Student‘s t-Test wurde für die statistische Untersuchung der Unterschiede zwischen CD und CPA benutzt, eine Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von < 0.05 wurde als signifikant angenommen. Die statistischen Auswertungen dieser Analyse erfolgten mit dem Statistikprogramm SPSS, Version 6.0.1.

3.2.2. Differentialdiagnose mit der Ultraschallkontrastmittel-Videodensitometrie

Es sollten in dieser experimentellen Studie mit der für diese Fragestellung erstmals eingesetzten Videodensitometrie mit der quantitativen Analyse der Kontrastmittelkinetik in Tumorgefäßen Parameter definiert werden, deren Ausprägung sich signifikant zwischen der Gruppe der benignen Läsionen der Mamma und der Gruppe der Mammakarzinome unterscheidet.
Für einen cut-off Wert, der eine hohe Spezifität erlaubt, sollte die Spezifität und Sensitivität berechnet werden. Diese Faktoren sollen dann im Therapiemonitoring (Abschnitt 3.2.3.) eingesetzt werden.
Die Hypothese dieser Phase II-Studie ist, daß es gelingt, mit verschiedenen Parametern der Ultraschallkontrastmittel-Videodensitometrie (folgend vielfach nur Densitometrie genannt) sicher


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zwischen benignen und malignen Herdbefunden der Mamma zu unterscheiden. Die Ergebnisse der präoperativen Densitometrie wurden mit den histologischen Befunden verglichen. Ein Vergleich mit anderen diagnostischen Verfahren im Sinne einer Phase III-Studie erfolgte nicht.
Patientinnen: 33 Patientinnen (22 mit einem Mammakarzinom, 11 mit benignen Befunden der Mamma) wurden an der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Campus Charité Mitte vom Juni 1997 bis zum Dezember 1997 präoperativ mit der Ultraschallkontrastmittel-Videodensitometrie untersucht. Die Stadien und histologischen Typen dieser Herdbefunde sind in den Tabellen 4 und 5 aufgeführt.

Tabelle 4: Charakteristik der Mammakarzinome und Patientinnen mit einem Mammakarzinom (N=22)

Tumorcharakteristik

Anzahl

pT1
pT2
pT3
pT4b
pT4d
pN0
pN1
Invasives duktales Karzinom
Invasives lobuläres Karzinom
Mittleres Alter (Jahre)
Mittlere Tumorgröße (mm)
Arterieller Hypertonus, Gefäßerkrankung

7
2
3
4
6
8
14
20
2
58,3 (±11,5)
22,5 (±13,4)
keine

Tabelle 5: Charakteristik der benignen Befunde und der Patientinnen mit diesen Herdbefunden (N=11)

Tumorcharakteristik

Anzahl

Fibroadenom
Intrazystisches oder intraduktales Papillom
Mastitis nonpuerperalis
Fibröse Narbe
Mammahypertrophie ohne Herdbefund
Mittleres Alter (Jahre)
Mittlere Tumorgröße (mm)
Arterieller Hypertonus, Gefäßerkrankung

3
3
2
1
2
48 (±12,4)
19,8 (±12,3)
keine

Mit Ausnahme der histologischen Typen und des Alters der Patientinnen gab es auch in bezug auf die Größe des Herdbefundes keine signifikanten Unterschiede. Keine Patientin hatte einen arteriellen Hypertonus oder eine arterielle Gefäßkrankheit.
Für diese Phase II Studie wurden nur Patientinnen ausgewählt, bei denen sich ein Blutgefäß mit dem CPA darstellen ließ. Bei 6 von 39 für die Studie vorgesehenen Patientinnen gelang dies nicht (2 von 24 mit einem später histologisch nachgewiesenen Mammakarzinom, 4 mit histologisch gesicherten benignen Befunden). Bei 25 dieser 33 Patientinnen wurde der Herdbefund in der Brust von der Patientin selbst oder durch den behandelnden Arzt getastet. Bei 6 Patientinnen wurde der nicht palpable Herdbefund ausschließlich mammographisch und/oder sonographisch (je 3 bei malignen und benignen Befunden) festgestellt. Die beiden Patientinnen in der Vergleichsgruppe der benignen Befunde mit einer Mammahypertrophie hatten nach der histologischen Aufarbeitung des resizierten


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Mammagewebes keinen Herdbefund, der vorher sonographisch darstellbar war. Hier wurde ein Parenchymgefäß innerhalb des Mammagewebes für die Densitometrie ausgewählt.
Die sonographisch ausgewählten Befunde wurden auf der Haut markiert, um sicher zu sein, daß das videodensitometrisch untersuchte Gewebe später operativ entfernt wurde.
Methodik: Auch diese Studie wurde mit der gleichen Gerätetechnologie, der gleichen Geräteeinstellung, Definition eines sonographischen Herdbefundes wie in den anderen Studien (Abschnitte 3.11. bis 3.2.1.) durchgeführt. Da die Videodensitometrie Helligkeiten in der gesamten region of interest (ROI) mißt, wurde die Helligkeit des B-Bildes nach Identifikation des Herdbefundes komplett zurückgenommen. Es konnte somit nicht zu einer Beeinflussung der Farbhelligkeit durch die B-Bild-Helligkeit kommen. Auch hier wurde die Geräteeinstellung während der gesamten Untersuchung einer Patientin nicht verändert (keine intraindividuellen Unterschiede, Abbildungen 6 bis 8).
Das Ultraschallkontrastmittel (USKM) Levovist® wurde dann intravenös als Bolus über 5-10 Sekunden in einer Konzentration von 300 mg/l (7 ml Lösung) durch einen weiteren Arzt injiziert. Zwei Minuten vorher wurde die Lösung durch Mischung und Schütteln des Galactose-Palmitin-Granulates mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung hergestellt.
Die gesamte Untersuchung, beginnend mit der Einstellung vor der USKM-Injektion wurde auf ein S-VHS-Videoband aufgenommen. Die Messung der Veränderung der Helligkeit über die Zeit nach Injektion des USKM erfolgte mit dem Videodensitometer vom S-VHS-Videoband.
Die Auswertungen der S-VHS-Videobänder erfolgten zunächst mit der Videodensitometrie im Tierlabor der Forschungsabteilung für Ultraschallkontrastmittel der Schering AG in Berlin (Leiter: Dr. T. Fritzsch). Das Videodensitometer basierte auf einem personal computer (PC) mit folgender Konfiguration: 33 MHz Intel-486 Mikroprozessor, Dash 16 Videodigitizer-board, 8 Bit Graustufen (Keithley, USA).
Für die Videodensitometrie wurde folgendes Verfahren entwickelt:
Zunächst mußte das analoge S-VHS-Video in ein digitales Video konvertiert werden (digitalisiert werden), also in eine Datei, deren Daten mit einem Pentium-PC (199 MHz) verarbeitet werden können. Das analoge PAL-Videosignal besteht aus Einzelbildern, die 25 mal in der Sekunde wiedergegeben werden. Ein Einzelbild besteht aus 768 x 576, also 442.368 Bildpunkten (Pixeln). Die Pixel sind rasterförmig angeordnet. Wenn für jeden Farbanteil, bestehend aus der Mischung der drei Grundfarben Rot, Grün und Blau (sogenannter RGB-Modus), ein Byte je Grundfarbe zur Kodierung verwendet wird (Die kleinste mögliche Speichereinheit des PC ist das Byte. Es setzt sich aus 8 möglichen Zustandsformen, den Bits, zusammen. Jedes Bit kann an oder aus (on oder off, 1 oder 0) sein. Das ergibt pro Byte 28=256 mögliche Zustände.), ergeben sich 256 x 256 x 256 = 16,7 Millionen verschiedene Farben. Das wären 1.327.104 Signale oder Bytes oder 1,26 Megabytes (MB) pro Einzelbild (Frame) und pro Sekunde (25 Einzelbilder) 33.177.600 Bytes oder 31,7 MB.
Kein derzeit verfügbarer PC kann diese Datenmenge pro Sekunde verarbeiten. Deshalb muß die Datenmenge komprimiert werden. In der hier vorgestellten Studie wurde eine theoretisch verlustiere Methode zur Datenkomprimierung gewählt, bei der jedes Einzelbild in den Arbeitsspeicher gelegt, komprimiert, später auf die Festplatte gespeichert und numeriert wird. Im hier verwendeten 8 Bit Farbmodus werden aus 16,7 Millionen Farben 256 ausgewählt. Im Videospeicher steht also eine Zahl zwischen 0 und 255. Die echte Farbe liegt in einer Tabelle, der Palette. Die Zahl im Videospeicher zeigt nur die Position des echten Farbwertes in dieser Tabelle an. Bei der Wiedergabe des digitalisierten Videos wird diese Videodatei geöffnet, in den Arbeitsspeicher gelegt, dekomprimiert und Bild für Bild in der gespeicherten Reihenfolge in den Videospeicher kopiert. Dazu ist eine kommerziell erhältliche Zusatzhardware in Form einer sogenannten Digitalisierungskarte und eine passende Software notwendig.
Die nun vorhandenen digitalen Daten können nun analysiert werden, hier in Form der Densitometrie:
Bei der additiven Farbmischung wird die Farbe um so heller, je höher der Anteil der einzelnen Farbkomponenten ist. Wenn alle Farbkomponenten den Maximalwert 255 angenommen haben, resultiert Weiß, wenn alle Farben den Minimalwert 0 haben, resultiert Schwarz. Für die Densitometrie müssen die informationstragenden Pixel der CPA-Signale ausgewertet werden und von den nicht informationstragenden B-Bild-Informationen getrennt werden. Die Auswertungssoftware muß also über einen Algorithmus verfügen, der die Bildinformation filtert. Dazu wurde in unserer Arbeitsgruppe eine spezielle Software auf der Grundlage der Game SDK (Software Development Kit) von Microsoft® entwickelt. Die Entwicklung und Programmierung dieses Algorithmus zur Videodensitometrie erfolgten unter der Mitarbeit der Herren P. Hieke und J. Schmidt (Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät) und Herrn M. Reinhardt (Schering AG Berlin, Abteilung Ultraschallkontrastmittel).
Die Farbe Grau des B-Bildes besteht aus den immer gleichen Anteilen von Rot, Grün und Blau. Um das farbige CPA-Bild vom B-Bild zu filtern, subtrahiert die Filterprozedur bei jedem Pixel zwei RGB-Anteile voneinander, wie Rot von Blau. Ist die Differenz größer als Null, sind beide Farbanteile nicht gleich groß, dann gehört dieses Pixel zu einer farbigen Signalfläche.

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Es gibt im Ultraschallbild Bereiche, in denen niemals eine relevante Information zu finden ist, wie z.B. die Kopfzeile, in der die Patientendaten gespeichert sind. Um hier Rechenleistung einzusparen, können diese Bereiche mit der Software aus der Informationserfassung ausgeschlossen werden. Hier wurde ein Viereck um den Bereich der relevanten Information (region of interest, ROI) gelegt. Nur hier wurde die Bildinformation gefiltert und ausgewertet.
Das CPA-Signal stellt Flußintensität unabhängig von deren Richtung dar. Je heller die Farbe ist, um so höher ist die Flußintensität. Der RGB-Wert einer Farbe wird höher mit ansteigender Helligkeit. Das in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Analyseprogramm zählt die Pixel und mißt die Summe aller RGB-Werte innerhalb der ROI. Aus der Summe der RGB-Werte und der Anzahl der Pixel wird die mittlere Helligkeit eines Einzelpixels pro Bildfläche in der ROI bestimmt. Analysiert man auf diese Weise eine ganze Videosequenz, erhält man eine geordnete Reihe von Werten der mittleren Helligkeit (Abschnitt 8, Anhang). Werden diese Werte auf eine Zeitachse aufgetragen, erhält man eine Kurve, welche die Flußinformation eines Gefäßes oder mehrerer Gefäße im beobachteten Zeitraum beschreibt.
Nach der Injektion eines Ultraschallkontrastmittels erscheint das gemessene Gefäß heller und das farbige Areal wird größer (sogenanntes Color Blooming). Die Anzahl und Helligkeit der informationstragenden Pixel steigt und damit die durchschnittliche Helligkeit. Durch die Verwendung der durchschnittlichen Helligkeit wird der Effekt des Color Blooming minimiert.
Nach digitaler Aufnahme der Videoinformation, dem Filterprozeß und der Bestimmung der mittleren Helligkeit der Pixel in der ROI über die Untersuchungszeit, wurden die erhaltenen quantitativen Werte in eine Excel-Datei exportiert. Aus diesen Daten kann dann eine Kurve der mittleren Helligkeit über die Zeit, die Densitometrie-Kurve konstruiert werden und die Daten ausgewertet und in Diagrammen dargestellt werden. Die Einheit der Helligkeit ist die Density Unit (DU). Die maximale Helligkeit war in dieser Studie 8 Bit oder ein Byte, damit sind 256 Helligkeitsstufen, hier DU möglich (ca. 0,031 Bit sind 1 DU). Die Messung der Helligkeit erfolgte innerhalb einer vom Untersucher definierten region of interest (ROI) während der Zeit der Anflutung und des Auswaschens des USKM. Es wurde versucht, über mindestens 120 Sekunden zu messen.
Die ROI wurde wie folgt plaziert: Nach Betrachten der gesamten digitalisierten Untersuchung wurde die ROI vom Untersucher so dicht wie möglich um eine Pixelfläche gelegt, die über einen langen Zeitraum einen Effekt des USKM erkennen ließ und wenig durch Bewegungsartefakte gestört war. Wenn durch Atem- oder andere Bewegungen der Patientin im Verlauf der Untersuchung die pulsierende Pixelfläche aus der ROI „rutschte“, mußte die ROI größer oder eine andere Pixelfläche gewählt werden (Abbildungen 7 und 8).

Abbildung 6: CPA-Bild vor der intravenösen Gabe des Ultraschallkontrastmittels Levovist® bei einem Mammakarzinom (pT3pN1G3M0, ER+, PR+). Der gelbe Pfeil zeigt auf die ROI, in der die Veränderung der CPA-Helligkeit im Blutgefäß unter Kontrastmittelgabe gemessen werden soll. Die Gesamtverstärkung des B-Bildes ist maximal zurückgenommen. Deshalb erscheint es schwarz.


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Abbildung 7: Maximaler Effekt des Levovist® auf das CPA-Bild nach der Gabe des Ultraschallkontrastmittels bei gleicher Patientin wie in Abbildung 6. In der ROI nehmen die Helligkeit und die Anzahl der Farbpixel zu.

Abbildung 8: Abnehmender Effekt des Levovist® auf das CPA-Bild nach der Gabe des Ultraschallkontrastmittels bei gleicher Patientin wie in den Abbildungen 6 und 7.

Diese Messungen am eingescannten Bild des PC einschließlich der Positionierung der ROIs wurden von 3 unabhängigen Untersuchern nacheinander durchgeführt. Die interobserver variability der Bestimmung der mittleren maximalen Helligkeit pro Pixel (folgend als maximale Helligkeit bezeichnet), aus der sich die anderen Meßgrößen ableiten, lag pro Patientin unter 10%. Die resultierende Helligkeits-Zeit-Kurven wurden ausgedruckt (Abbildung 9 und Abschnitt 8, Anhang), die Parameter dieser Kurve wurden in eine Excel-Datei für die statistische Analyse importiert. Die gemessenen und berechneten Parameter der Helligkeits-Zeit-Kurven der Videodensitometrie wurden folgendermaßen definiert (Abbildung 9):


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Abbildung 9: Zeit-Helligkeits-Kurve mit der Definition der charakteristischen Parameter

Zeitparameter:
T10%,l : Zeit bis zum Erreichen von 10% der maximalen Helligkeit, linke Seite des Peaks
T90%,l : Zeit bis zum Erreichen von 90% der maximalen Helligkeit, linke Seite des Peaks
Tmax: Zeit bis zum Erreichen der maximalen Helligkeit
T90%,r: Zeit von der maximalen Helligkeit bis zum Erreichen von 90% der maximalen Helligkeit, rechte Seite des Peaks
T10%,r: Zeit von der maximalen Helligkeit bis zum Erreichen von 10% der maximalen Helligkeit, rechte Seite des Peaks
Helligkeitsparameter:
B(0): Minimale Helligkeit (baseline der Helligkeit vor Einsetzen des USKM-Effektes)
B10%, l: 10% der maximalen Helligkeit während den Anflutens des USKM
B90%, l: 90% der maximalen Helligkeit während den Anflutens des USKM
Bmax: Maximale Helligkeit
B90%, r: 90% der maximalen Helligkeit während den Auswaschens des USKM
B10%, r: 10% der maximalen Helligkeit während den Anflutens des USKM
B(120s): Helligkeit 120 Sekunden nach dem Beginn des USKM-Effektes
Berechnete Parameter:
„Zeit-und-Helligkeits-Parameter“:
Tmax x Bmax / (Bmax - B(0))
„wash-in-wash-out-Parameter“ (Anflutungs-Auswasch-Paramter:
(T90%,l - T10%,l) / (T10%,r - T90%,r)
Statistische Untersuchungen: Die Unterschiede der Ausprägung der Zeit-, Helligkeits- und berechneten Parameter zwischen den beiden Gruppen (Mammakarzinome und benigne Läsionen) wurden mit dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Test (p<0.05) berechnet. Außerdem wurden die Sensitivität und Spezifität für die errechneten cut-off Werte zum Erreichen einer maximalen Spezifität kalkuliert.

3.2.3. Therapiemonitoring mit der Ultraschallkontrastmittel-Videodensitometrie

Das Ziel dieser Untersuchung war, mit der Methode der Videodensitometrie Veränderungen in der Durchblutung eines Mammakarzinoms unter einer Chemotherapie zu erkennen.
Untersucht wurde die Wertigkeit aller Parameter, mit denen bei der Studie zur Differentialdiagnose und Videodensitometrie (Abschnitt 3.2.2.) sicher zwischen benignen und malignen Herdbefunden unterschieden werden konnte.
Die Hypothese ist, daß es mit diesen Parametern der Videodensitometrie (Tmax, T90%, l, „wash-in-wash-out-Parameter“, Zeit-und-Helligkeits-Parameter“) gelingt, Unterschiede in der Durchblutung zwischen den Karzinomen mit einem klinischen Ansprechen auf die Therapie (Komplette Remission (CR) und Partielle Remission (PR)) und denen, die kein Ansprechen zeigten (No change (NC) und Progression Disease (PD)) zu erkennen. Der Vergleich mit dem klinischen Ansprechen erfolgte, da das klinische Ansprechen immer noch international zum Vergleich der verschiedenen Therapien eingesetzt wird (73) und uns aus früheren Untersuchungen bekannt war, daß es keinen Zusammenhang zwischen dem klinischen Ansprechen und den histologischen Regresssionsgraden nach Sinn et al. (82) gab


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(69,70). Aus Gründen der Plausibilität der erhaltenen Ergebnisse wurden die gleichen Patientinnen außerdem mit der MRT untersucht und die Höhe des relativen Signalanstiegs unter der Therapie dokumentiert.
Patientinnen und Methodik: Für diese Untersuchungen wurden 6 Patientinnen mit einem Mammakarzinom (Stadium T3N1M0, ER+ bei allen Patientinnen) unter der präoperativen Chemotherapie (3 Zyklen mit Epirubicin 120 mg/m2, gefolgt von 3 Zyklen mit Docetaxel 100 mg/m2, Abstand 14 Tage, G-CSF von Tag 3-7 (83)) vor jedem Therapiezyklus mit der Densitometrie und der MRT untersucht.
Die Methodik der Densitometrie war die gleiche wie im Abschnitt 3.2.2. Zusätzlich zur Densitometrie wurde bei 6 dieser Patientinnen vor jedem Therapiezyklus eine MRT der Mammae durchgeführt. Die kernspintomographischen Untersuchungen erfolgten mit einem Hochfeld MRT, 1,5 Tesla (ACN-NT 15, Philips, Einthoven, Holland und Magnetom SP 63, Siemens, Erlangen, Deutschland) im MRT-Labor der Strahlenklinik und Poliklinik der Charité (Geschäftsführender Direktor: Professor Dr. Dr. h.c. R. Felix) im Campus Virchow-Wedding, in erster Linie durch die Herren Dres. H. Oellinger und C. Siewert. Die Datenerfassung erfolgte durch Herrn H. Wieder.
Die Methodik der MRT-Untersuchung war die gleiche wie im Abschnitt 3.1.3. Zu bestimmten Zeitpunkten (alle 75 Sekunden) wurde die absolute Signalintensität bestimmt und aus deren Verhältnis zur Signalintensität ohne Kontrastmittel der relative Signalanstieg in Prozent errechnet. Anschließend erfolgte die Gegenüberstellung beider Methoden zur Messung einer Kontrastmittelkinetik. Die Werte des relativen Signalanstieges unter dem Kontrastmittel Gd-DTPA im MRT wurden in ihrem Verlauf unter der präoperativen Chemotherapie dargestellt und mit dem Verlauf der Werte der Ultraschall-Kontrastmittel-Videodensitometrie (mit dem Kontrastmittel Levovist®) verglichen.
Die Zielstellung dieser Studie war es, zu untersuchen, ob es möglich ist, Veränderungen der Parameter der Densitometrie und der MRT abhängig vom Ansprechen des Mammakarzinoms auf die präoperative Chemotherapie zu erkennen.

3.3. Tumorvaskularisation und automatisierte Mikroskop-Bildanalyse (AMBA)

3.3.1. Vergleich der Tumordurchblutung mit der morphometrisch bestimmten Tumorvaskularisation

Nachdem in den ersten Abschnitten dieser Arbeit (Abschnitte 3.1.1. bis 3.2.3.) die verschiedenen neueren Ultraschallmethoden zur Beurteilung der Tumordurchblutung untersucht wurden, interessiert jetzt die Tumorvaskularisation, insbesondere der Vergleich der Tumorvaskularisation mit der Tumordurchblutung bei einzelnen Patientinnen.
Folgende Hypothesen werden für diese Studie aufgestellt:

  1. Es existieren signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Graden der dopplersonographisch gemessenen Durchblutung (Klasse I bis III, siehe Abschnitt 3.1.1.) hinsichtlich der Vaskularisation im histopathologischen Schnittpräparat. Dies betrifft insbesondere die größeren Gefäße, da hier der Blutfluß schnellerer und somit dopplersonographisch leichter erkennbarer sein soll.
  2. Neben der Gefäßzahl eignen sich auch andere meßbare Gefäßcharakteristika wie Dicke der Gefäßwand, Gefäßinnenfläche (Gefäßlumenfläche) und Gefäßgesamtfläche zur Messung der Tumorvaskularisation.

Patientinnen: Von 1994 bis 1996 wurden alle Patientinnen der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Campus Charité Mitte präoperativ mit der Farbdopplersonographie (CD) untersucht. Die Einteilung in die 3 Pixelklassen erfolgte prospektiv.
88 Patientinnen mit einem Mammakarzinom (68 mit einem invasiven duktalen und 20 mit anderen histologischen Typen des invasiven Mammakarzinoms) wurden präoperativ im Rahmen dieser Studie mit der Farbdopplersonographie (CD) untersucht. Die Ergebnisse der CD und die morphometrischen Untersuchungen von 34 dieser Patientinnen wurden für diese vergleichende Untersuchung beider Methoden aufgenommen. Diese 34 Frauen hatten ein invasives duktales Mammakarzinom und zeigten im CD eine homogene Durchblutung. Das bedeutete: In allen Ultraschallebenen konnten pulsierende Farbpixel im sonographischen Herdbefund gefunden werden. Karzinome, die dopplersonographisch nur an einem Rand des Herdbefundes (medial, lateral, kranial oder kaudal) pulsierende Pixel zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen. 28 der 34 ausgeschlossenen invasiven duktalen Mammakarzinome wiesen eine sonographisch erkennbare Durchblutung im Tumorrand und 6 im Tumorzentrum auf. Es erschien uns zu störanfällig, diesen Rand zu markieren und von dort die histologischen Schnitte für die Vaskularisationsanalyse anzufertigen. Deshalb haben


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wir uns für diese Studie für die Stichprobe der sonographisch homogen durchbluteten Mammakarzinome entschieden.
Die Gruppe der invasiven duktalen Mammakarzinome wurde ausgewählt, um mögliche Einflüsse auf die Tumorvaskularisation durch den histologischen Typ auszuschließen.
Die Stadienverteilung der Karzinome ist in Tabelle 6 angegeben. Die Hälfte der Karzinome war kleiner als 2 cm.

Tabelle 6: Verteilung der Tumorstadien (pT) und der histologischen Differenzierung (Grading) der 34 Patientinnen mit homogener Tumordurchblutung und einem invasiven duktalen Mammakarzinom

Tumorstadium (pT)

Patientinnen

Grading

Patientinnen

1a

1

1

8

1b

3

2

17

1c

13

3

9

2

13

4

0

3

1

 

 

4a

1

 

 

4b

0

 

 

4c

0

 

 

4d

2

 

 

Das mediane Alter der Patientinnen war 55,4 Jahre.
Methodik: Die Untersuchungstechnologie, Geräteeinstellung, Definition der Herdbefunde, usw. war die gleiche wie in den Abschnitten 3.1.1. bis 3.1.2. Die Pixelklassen wurden ebenfalls gleich eingeteilt mit der Ausnahme, daß eine zusätzliche Pixelklasse 0 für die Herdbefunde ohne sichtbare Farbpixel in der Farbdoppleruntersuchung eingeführt wurde.
Die Verteilung der Pixelklassen war folgende:
Pixelklasse 0: N= 7,
Pixelklasse 1: N=3,
Pixelklasse 2: N=3,
Pixelklasse 3: N=21.
Die Auswahl der histologischen Schnitte für die Anti-CD34-Färbung erfolgte am Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitt. Der Schnitt des Mammakarzinoms mit dem größten Anteil am invasiven Karzinom (Auswahl durch Frau Dr. U. Schneider, Pathologisches Institut der Charité, Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. M. Dietel) wurde für die Endothelfärbung und AMBA-Messung ausgewählt (Abbildungen 23 und 24). Die Anti-CD34-Färbung erfolgte am deparaffinisierten, rehydrierten, inkubierten (für 14 Minuten mit 3% H2O2 in destillierten Wasser), gepufferten und nochmals mit dem monoklonalen Antikörper für eine Stunde in feuchter Kammer und in Raumtemperatur inkubierten Präparat nach der labelled-strebtavidin-biotin-Methode (LSAB, siehe Abschnitt 3.1.4.). Die primären Antikörper gegen CD34 waren die Antikörper Clone43A1, Ancell (verdünnt in tris-gepufferter Salzlösung (TBS) mit 1%igem bovinen Serum Albumin (BSA)). Die CD34-Färbung ist eine zytoplasmatische Färbung.
Die Analyse der gefärbten Schnitte erfolgte an einem Lichtmikroskop Jenaval (Carl-Zeiss Jena GmbH), Vergrößerung 12,5 x 10. Die mikroskopischen Bilder wurden durch eine auf das Okular gesetzte 3Chip-CCD Videokamera (Sony 3CCD, D x C 930P) und einem Digitizer (Matrix-Comet image processing board, Matrox Electronic Systems Ltd., Canada) digitalisiert und in einen Pentium personal computer (PC) importiert und gespeichert (Tabelle 7).


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Tabelle 7: Komponenten des Bildverarbeitungssystems

Mikroskop:

Jenaval ( Carl Zeiss Jena GmbH)

Kamera:

Sony 3 CCD- Color video Camera

Personal Computer:

CPU Pentium 100 MHz 32 MB RAM, MS DOS V 6.20

Windows for workgroups 3.11

Graphikkarte/ Framegrabber:

Matrox Comet

Bildverarbeitunssoftware:

AMBA (Dr. Hufnagl, IBSB GmbH, Berlin)

Das Messen und Auswerten der mikroskopischen Bilder erfolgte am PC mit einem speziell für diese Studie entwickelten Computer-Programm der automatisierten Mikroskop-Bildanalyse. Die Markierung der äußeren und inneren Gefäßwand der angefärbten Blutgefäße erfolgte manuell mit der PC-Mouse durch Frau A. Gohlke (jetzt Klinik für Urologie, Klinikum Berlin-Buch). Gefärbtes Stroma wurde nicht markiert. Zuerst wurde die innere Gefäßwand markiert, dann die äußere. Das Programm zeigte dann die markierten Regionen als farbige Flächen.
Die Parameter der Blutgefäße mit einem Durchmesser von über 100 µm wurden über die gesamte Tumorfläche des ausgewählten Objektträgers bestimmt. Die Blutgefäße mit einem Durchmesser von unter 100 µm wurden in 10 zufällig gewählten Meßfenstern (Gesichtsfeldern) vermessen. Die Anzahl dieser kleinlumigen Gefäße pro Meßfenster (270057 µm2 oder ca. 0,27 mm2) schwankte zwischen 3 und 44. Entsprechend schwankten die Mittelwerte der Gefäßflächen von Gesichtsfeld zu Gesichtsfeld. Durch die Vermessung von 10 zufällig gewählten Gesichtsfeldern mit insgesamt durchschnittlich 100 Gefäßanschnitten konnte der Variationskoeffizient der mittleren Gefäßzahl pro mm2, bei Mehrfachmessung des gleichen Präparates unter 15% gesenkt werden.
Folgende Vaskularisationsparameter wurden getrennt für die Gefäße mit einem Durchmesser von unter und über 100 µm bestimmt:

  1. Anzahl der Gefäße pro mm2
  2. Mittlere Breite der Gefäßwand (in µm)
  3. Mittlere innere Gefäßfläche (Lumenfläche, in µm2)
  4. Gesamtfläche aller Gefäße (in µm2) im histologischen Schnitt
  5. Gesamtfläche aller großen (>100 µm) und kleinen Gefäße (<100 µm) im histologischen Schnitt

Statistische Verfahren: Die mittleren Werte der oben genannten Parameter wurden auf signifikante Unterschiede zwischen den Pixelklassen 0-4 mit dem t-Test für ungepaarte Stichproben untersucht. Außerdem wurden die Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten rho für den Zusammenhang zwischen den Durchblutungsklassen (Pixelklassen 0-3) und den Vaskularisationsparametern berechnet.

3.3.2. Prognose und Tumorvaskularisation

Im Abschnitt 3.1.2. wurde untersucht, ob mit der Farbdopplersonographie Aussagen zur Prognose der Patientin mit einem Mammakarzinom gemacht werden können. Im Abschnitt 3.3.1. wurde der Zusammenhang zwischen den Befunden der Farbdopplersonographie und der Tumorvaskularisation untersucht.
Die Hypothese ist jetzt, daß aus den Ergebnissen der morphometrisch bestimmbaren Parameter der Tumorvaskularisation Aussagen zur Prognose der Patientin mit einem Mammakarzinom gemacht werden können.
Patientinnen: Diese Untersuchungen wurden an den histologischen Präparaten der gleichen 34 Patientinnen mit einer homogenen Durchblutung und einem invasiven duktalen Mammakarzinom wie in der vorherigen Studie (Abschnitt 3.3.1.) durchgeführt.
Methodik: Es wurde die gleiche Gefäßfärbung wie in der vorhergehenden Studie (Abschnitt 3.3.1.) verwendet und die gleichen 5 Parameter der Vaskularisation, getrennt nach groß- und kleinlumigen Gefäßen bestimmt. Es wurde untersucht ob sich die Ausprägung dieser Parameter signifikant zwischen Patientinnen mit einer Lymphknotenmetastasierung (pN1) und denen ohne regionale Metastasierung (pN0) unterscheidet und ob die Vaskularisationsparameter von der Größe der Mammakarzinome abhängen.


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Statistische Untersuchungen: Die Stärke des Zusammenhangs zwischen der Lymphknotenmetastasierung (pN1 vs. pN0) und den morphometrisch bestimmten Parametern der Vaskularisation wurde mit dem Spearmen´schen Korrelations-koeffizienten rho beschrieben. Für den Zusammenhang zwischen der Tumorgröße und der Tumorvaskularisation wurde der Produktmomentkorrelationskoeffizient r nach Pearson berechnet.

3.3.3. Therapiemonitoring und Tumorvaskularisation

In den Abschnitten 3.1.4. und 3.2.3. wurde untersucht, wie sich die meßbare Tumordurchblutung in Mammakarzinomen unter der präoperativen Chemotherapie ändert. Die Hypothese dieser Studie ist, daß sich die morphometrisch meßbaren Parameter der Tumorvaskularisation unter der präoperativen Chemotherapie ändern.
Patientinnen: Von 19 Patientinnen (medianes Alter 55,7 Jahre, Range 38-74 Jahre) mit einem histologisch nachgewiesenen invasiven duktalen Mammakarzinom wurde von 1995 bis 1998 vor der präoperativen Chemotherapie eine Gewebsprobe (Biopsie) aus dem Tumor entnommen. An diesem Gewebe und an dem Gewebe des nach der Chemotherapie entnommenen Tumors wurden die Untersuchungen zur Vaskularisation durchgeführt, also an insgesamt 38 prä- und posttherapeutischen Gewebsproben.
Die Stadienverteilung und weitere Charakteristika der Karzinome sind in Tabelle 8 angegeben.

Tabelle 8: Verteilung der Tumorstadien (pT) vor der Chemotherapie der 19 untersuchten Mammakarzinome und weitere Charakteristika dieser Patientinnen mit einer präoperativen Chemotherapie

Tumorstadium (cT)

Patientinnen

Grading

Patientinnen

cT1c

2

G1

1

cT2

4

G2

10

cT3

3

G3

8

cT4b

5

 

 

cT4c

1

 

 

cT4d

4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Östrogen-/Progesteron-Rezeptor positiv

15

c-erbB2-postiv

14

Die Patientinnen erhielten Epirubicin 120 mg/m2 über 3 Zyklen im Abstand von je 14 Tagen (nach jedem Zyklus G-CSF 50 µg von Tag 3 bis Tag 7), gefolgt von 3 Zyklen mit Docetaxel 100 mg/m2 im Abstand von je 14 Tagen (nach jedem Zyklus G-CSF 50 µg von Tag 3 bis Tag 7).
Methodik: Die Methodik der Endothelfärbung, der AMBA und der Erfassung und Auswertung der Parameter der Tumorvaskularisation war die gleiche wie in den Abschnitten 3.3.1 und 3.3.2. Die Auswahl der repräsentativen Schnitte erfolgte von Frau Dr. med. B. Fleige (Pathologisches Institut der Charité), die Markierung der CD34-gefärbten Gefäße durch Frau D. Laubersheimer (Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät).
In dieser Studie wurden folgende Parameter der Vaskularisation am Tumorgewebe vor der Chemotherapie (offene oder Hochgeschwindigkeitsbiopsie zur histologischen Sicherung des Mammakarzinoms) und nach der Chemotherapie (Gewebe aus dem Areal der prätherapeutischen histologischen Sicherung innerhalb des entfernten Brustsegmentes oder Mammaabladates) bestimmt und miteinander verglichen:

  1. Anzahl der Gefäße pro mm2
  2. Mittlere Breite der Gefäßwand (in µm)

    31

  3. Mittlere innere Gefäßfläche (Lumenfläche, in µm2)
  4. Mittlere Gesamtgefäßfläche
  5. Mittlerer innerer Umfang der Gefäße (in µm)
  6. Mittlerer äußerer Umfang der Gefäße (in µm)

Es wurden alle CD34-gefärbten Tumorgefäße im ausgewählten und eingescannten histologischen Schnitt mit der Mouse markiert. Da die Gefäße insbesondere nach der Chemotherapie nicht homogen auf dem Objektträger verteilt waren, wurden nur die Regionen, in denen sich Gefäße anhand der CD34-Färbung nachweisen ließen, zur Analyse der Vaskularisation ausgewählt. Da großlumige Gefäße insbesondere die Messungen zur Gefäßfläche und zum Gefäßumfang pro mm2 stark beeinflussen würden und ihre Verteilung ungleichmäßig war, wurden nur die Gefäße mit einem Lumen von unter 100 µm in die Analyse aufgenommen. Nach den Ergebnissen der vorangegangenen Abschnitte (3.3.1. bis 3.3.2. bzw. 4.3.1. bis 4.3.2.) und der internationalen Literatur (Abschnitt 1) sind die Veränderungen der Tumorgefäße eher auf der Ebenen der kleinlumigen Gefäße der Mikrovaskularisation zu erwarten.
Da der Umfang die selten runden Tumorgefäße besser charakterisiert als deren über Formeln anhand des Durchmessers und einer angenommenen kreisrunden Form berechnete Flächen, wurde dieser Gefäßparameter in diese Analyse aufgenommen. Es wurde die Beobachtung während der Untersuchungen dieser Studie gemacht, daß sich die Form der Tumorgefäße unter der Therapie ändert. Diese Veränderungen lassen sich schwer beschreiben aber durch die Messung des Gefäßumfanges quantifizieren und vergleichen.
Statistische Verfahren: Die Mittelwerte der einzelnen Vaskularisationsparameter der kleinlumigen Gefäße pro mm2 wurden vor und nach der Chemotherapie mit dem Paarvergleich auf signifikante Unterschiede (p<0,05) innerhalb der gesamten Patientinnengruppe untersucht. Zusätzlich wurde mit der gleichen Methode die Veränderung der Vaskularisationsparameter bei jedem histologischen Regressionsgrad untersucht, um Aussagen zur Veränderung der Vaskularisation abhängig von der pathologischen Remission zu erhalten. Vorher erfolgte im Sinne Plausibilitätsprüfung der Vergleich der Ergebnisse dieses Abschnittes mit denen der Abschnitte 3.3.1. und 3.3.2. Die Größenordnung der Gefäßparameter der vorangegangenen Studien (Abschnitte 3.3.1. - 3.3.2. und 4.3.1. - 4.3.2.) muß mit denen vor der Therapie dieser Studie (Abschnitte 3.3.3 und 4.3.3.) vergleichbar sein.


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