Blohmer, Dr. Jens-Uwe: Kontrastmittel-Videodensitometrie und Automatisierte Mikroskop-Bildanalyse zur Messung der Durchblutung und Vaskularisation von Mammakarzinomen

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Kapitel 5. Diskussion

5.1. Farbdopplersonographie (CD)

Die Ergebnisse der publizierten Studien zum Einsatz der CD beim Mammakarzinom sind vielfältig und z.T. gegensätzlich. Es wurden hohe Flußgeschwindigkeiten (Vmax) und hohe periphere Widerstände (RI) im Mammakarzinom als typisch für das Mammakarzinom beschrieben (84-88) ebenso wie niedrige Flußgeschwindigkeiten und niedrige Gefäßwiderstände (30,89,90).
Eine mögliche Erklärung dieser Resultate ist sicher die im Verlauf von 10 Jahren veränderte Ultraschalltechnik, die es möglich machte, auch langsamere Flüsse zu erkennen. Jedoch gerade die älteren Arbeiten beschrieben die langsamen Flüsse als typisch. Eventuell sind hier tumornahe Parenchymgefäße selektiert worden in der Hoffnung, die Ergebnisse aus der Doppleruntersuchung der Ovarialkarzinome (91,92) beim Mammakarzinom zu übernehmen. Die Zunahme des Gesamtquerschnittes bei der Tumorangiogenese machte dies auch plausibel. Im Gegensatz zum Ovarialkarzinom besteht im Mammakarzinom ein hoher hydrostatischer Druck. Zusätzlich zu den Besonderheiten der Tumorgefäße (siehe Einleitung, Abschnitt 1.1.) würde dies eher einen hohen Gefäßwiderstand und hohe Flußgeschwindigkeiten (in den arterio-venösen Shunts) erwarten lassen, was auch experimentell gemessen wurde (18,89) und den Ergebnissen der hier vorgelegten Studie entspricht (Mammakarzinome hatten eine signifikant höhere Vmax (median 17,6 cm/s) als benigne Herdbefunde (median 13,9 cm/s) und einen signifkant höheren RI (median 0,72) als benigne Herdbefunde (median 0,69).
Eine weitere Erklärung für die unterschiedlichen Untersuchungsergebnisse der Studiengruppen liegt sicher auch in der interindividuellen und intraindividuellen Inhomogenität der Vaskularisation und Durchblutung der Mammakarzinome. In einem Mammakarzinom sind also verschiedene Meßergebnisse zu erwarten. Es muß deshalb eine genaue Definition der Auswahl der Tumorgefäße für die vergleichenden Messungen erfolgen, so auch in den in dieser Habilitationsschrift vorgestellten Studien, bei denen die schnellsten Flüsse in jedem Herdbefund und die Ebene mit den meisten pulsierenden Farbpixeln ausgewählt wurden, um Vergleichbares zwischen den Herdbefunden zu vergleichen und die intraindividuelle Inhomogenität der Meßergebnisse zu reduzieren.
Die Messung von Absolutwerten aus der Dopplerhüllkurve (maximale systolische und minimale enddiastolische Geschwindigkeit) war bei hohen Geschwindigkeiten im Vergleich mit der Analyse von Flußkurven mit kleinen Geschwindigkeiten präziser. Würde man die Summe aller Flußkurven bilden, wie Madjar et al. (93,94) dies getan haben, könnten durch die Möglichkeit der Mehrfachmessung eines Flusses in einer anderen Tumorebene methodische Fehler auftreten. Wenn die Anzahl der auszuwertenden Parameter wie die der ableitbaren Flüsse von Patientin zu Patientin jedoch variiert, ist ein statistischer Vergleich der Durchblutung mit Hilfe der Dopplerflußkurve nicht möglich.
Die interindividuellen Unterschiede der Durchblutung des Mammakarzinoms können auch an der großen Streuung der hier vorgestellten Ergebnisse erkannt werden (Tabellen 12 und 13). Trotzdem sind die Ergebnisse dieser Untersuchung zur Differentialdiagnose mit der CD valide, denn signifikante Unterschiede zwischen benignen und malignen Herdbefunden der gewählten Parameter Vmax und RI wurden bei der Durchblutung in den Herdbefunden, nicht bei der Durchblutung in der gesunden, kontralateralen Brust nachgewiesen. So sind signifikante Unterschiede zwischen den malignen und benignen Herdbefunden mit den meßbaren Parametern der Tumordurchblutung zu erkennen, die Hypothese dieser Studie kann also angenommen werden.
Die große Streuung der Meßergebnisse und die komplizierte und zeitaufwendige Methodik machen die konventionelle Farbdopplersonographie jedoch wenig geeignet für die Differentialdiagnose in der täglichen Praxis. Die relativ niedrige Spezifität (75%) und der niedrige positive Vorhersagewert (72%) im Vergleich zur Mammographie (77% und 79%) und Mammasonographie (80% und 81%) unterstreichen diese kritische Wertung der CD in der Differentialdiagnostik. Sie ist nicht besser als die Ergebnisse der bisherigen Untersuchungsmethoden in der Mammadiagnostik. Schelling et al. (95) haben ebenfalls mit der CD eine geringere Sensitivität (85%) und Spezifität (79%) als mit der B-Bild-Sonographie (88 bzw. 96%) erreicht, aber durch die Kombination beider Verfahren eine Sensitivität von 97% und eine Spezifität von 96% erreicht, allerdings bei einer präoperativen Untersuchung ausschließlich palpabler Mammatumoren. Sie haben einen einfachen Entscheidungsbaum aus beiden Methoden entwickelt und können durch die Kombination von palpablem Tumor, breitem Randsaum des sonographischen Herdbefundes und einer nachweisbaren Durchblutung mittels der logistischen Regression (siehe Abschnitt 1.2.1.) eine diagnostische Sicherheit von 100% für ein palpables Mammakarzinom erreichen.
Delorme et al. (96) haben ebenfalls mit der Methode der Bestimmung der Vmax nur eine Sensitivität von 55% und eine Spezifität von 45% erreichen können. Sie haben zudem nach systematischen Farbdoppler-Untersuchungen an der Schilddrüse Schwankungen in der Bestimmung der


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Flußgeschwindigkeit von 20-30% zwischen den Untersuchern festgestellt (allerdings nur eine grenzwertig signifikante Untersucherabhängigkeit, da in die Ergebnisse auch Inhomogenitäten der Durchblutung und interindividuelle Schwankungen eingehen, p=0,05 im t-Test der Paardifferenzen). Folgerichtig muß nach Methoden der Messung der Tumordurchblutung gesucht werden, die in der Differentialdiagnostik diese Nachteile nicht aufweisen. Es müssen Merkmale gemessen werden, die leicht reproduzierbar und objektiv zu erheben sind (97). Cosgrove und Eckersley (97) haben mit ihrem Artikel „Doppler indices in tumors - resolution of a dilemma?“ auf die biologischen (inhomogene Tumordurchblutung), technischen (Selektion der schnellen Flüsse, da sie leichter erkannt werden und reproduzierbarer gemessen werden, siehe Abschnitt 3.1.1 zur Methodik der Spektraldoppleruntersuchung), praktischen (lang dauernde Untersuchung) Probleme hingewiesen und damit die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Techniken zur gleichzeitigen Darstellung der Durchblutung im gesamten Tumor begründet.
Bis die bis heute experimentellen Entwicklungen in der Praxis verfügbar sein werden, muß nach anderen diagnostischen Wegen gesucht werden. Reproduzierbar (61) und einfach zu erheben und heute schon verfügbar ist die Einteilung der pulsierenden Farbpixel in Pixelklassen. Mit dieser Methode wurde auch in dieser Untersuchung ein hoch signifikanter Unterschied (p<0,0002) zwischen malignen und benignen Herdbefunden erkannt. Trotzdem gelang es nicht, bessere Ergebnisse als mit der hochauflösenden Mammasonographie im direkten Vergleich (multivariate Diskriminanzanalyse (39)) zu erreichen. Delorme et al. (96) haben mit der automatisierten Analyse verschiedener Merkmale der Farbpixel der CD eine Spezifität von mindestens 90% und einen positiven Vorhersagewert von 80% erreichen können. In der Differentialdiagnose wird zunehmend die „Morphologie der Tumorvaskularisation“ im CD-Modus zur Differenzierung der sonographischen Herdbefunde genutzt (98). Bei Betrachtung der zur Illustrierung dieses „malignen Typs“ publizierten Abbildungen kann dieser auch der semiquantitativen Pixelklasse III und der „benigne“ Typ der Pixelklasse II zugeordnet werden. Dadurch würden sprachliche und fachliche Ungenauigkeiten und willkürliche und unkorrekte Bezeichnungen wie: Durchblutung anstelle von Vasku-larisation, Tumor anstelle von Herdbefund, „Morphologie“ anstelle von Bildgebung, „penetrieren“ anstelle von Überlagerung usw. vermieden.
Ein anderer Weg mit den Ergebnissen der CD in der Differentialdiagnostik umzugehen, ist diese Technik in einer anderen Indikation, hier in der präoperativen Abschätzung der Prognose mit der CD einzusetzen.
Sohn et al. (31) benutzten ein neues, vom konventionellen Farbdoppler abweichendes, sonographisches Verfahren zur farbigen Darstellung langsamer Blutflüsse in Mammatumoren, die Maximum Entropy Method-Technology (MEM, Acoustic Imaging, Phoenix Arizona, USA). Damit gelang es ihnen, mit einer semiquantitativen Einteilung der Farbpixel statistisch signifikante Zusammenhänge zwischen einzelnen Prognosefaktoren (TNM, Ploidie, S-Phasen-Fraktion, Hormonrezeptorstatus) und diesen Pixelklassen darzustellen. In dieser Untersuchung wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Eingruppierung in diese Gruppen zwischen verschiedenen Untersuchern festgestellt. Diese Klasseneinteilung ist somit reproduzierbar und objektiv.
Seit 1995 sind einige Publikationen zur präoperativen Einschätzung der Prognose von Patientinnen mit einem Mammakarzinom mit Hilfe der Farbdopplersonographie erschienen (60-62,79,80). Nach Lee et al. (60) soll bei T1-Mammakarzinomen eine hohe systolische Maximalgeschwindigkeit mit der Lymphknotenmetastasierung assoziiert sein, nicht jedoch bei den größeren Mammakarzinomen. In der hier vorgelegten Untersuchung nahmen die medianen Geschwindigkeiten mit steigender Tumorgröße zu, waren aber nicht signifikant höher bei größeren Tumorstadien. Die Anzahl der pulsierenden Farbpixel nahm mit steigender Tumorgröße in der hier vorgestellten Untersuchung schwach signifikant zu (p=0,048).
Ein signifikanter Zusammenhang zwischen hohen Flußgeschwindigkeiten und einer Lymphknotenmetastasierung konnte in der hier vorgestellten Habilitationsschrift (Abschnitt 4.1.2) ebenfalls festgestellt werden. Auch die semiquantitative Einschätzung der pulsierenden Farbpixel im sonographischen Herdbefund in Pixelklassen läßt Schlüsse auf die Lymphknotenmetastasierung zu. So wurden bei Patientinnen mit Lymphknotenmetastasen signifikant häufiger pulsierende Farbpixelflächen (Klasse II und III in 95%, p=0,008) registriert als bei Patientinnen ohne Lymphknotenmetastasen. Die Unterteilung zwischen nicht erkennbarem und erkennbarem Fluß wäre in der hier vorgestellten Untersuchung für die präoperative Aussage zur Lymphknotenmetastasierung methodisch ausreichend gewesen. In der Studie von Sohn et al. (61) hatten 91% der Patientinnen, deren Blutfluß im Mammakarzinom in die Klasse I eingeordnet wurde, keine Lymphknotenmetastasen, im Gegensatz zu denen mit der Pixelklasse III, die dann zu 81% lymphknotenpositiv waren. In dieser vorgelegten Studie innerhalb der Habilitationsschrift hatten von den Patientinnen mit der Pixelklasse I 82% keine Lymphknotenmetastasen. In der Patientengruppe mit der Pixelklasse III hatten hingegen 63% metastatisch befallene Lymphknoten. Die Untersuchung von Sterns et al. (62) kommt zu ähnlichen Ergebnissen. Der Nachweis von Blutfluß mit der CD im Herdbefund war häufiger bei Patientinnen mit Lymphknotenmetastasen und späterem Rezidiv,

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wenngleich nicht statistisch signifikant. Allerdings konnten sie nur bei 25% aller 207 untersuchten Patientinnen mit einem invasiven duktalen Mammakarzinom Blutfluß im sonographischen Herdbefund mit der von ihnen eingesetzten Technologie nachweisen.
In der hier vorgestellten Studie waren die medianen maximalen systolischen und minimalen enddiastolischen Geschwindigkeiten der mit der CD darstellbaren Blutflüsse in den gering differenzierten Karzinomen signifikant höher als bei den gut differenzierten.
Somit konnte auch in dieser Untersuchung die Hypothese angenommen werden, daß mit den Parametern der CD in vivo auf einige histomorphologische Ergebnisse (pN, G) geschlossen werden kann.
Das bedeutet jedoch nicht, daß auf die histomorphologische Untersuchung des Mammakarzinoms und der axillären Lymphknoten verzichtet werden kann, da bisher alle adjuvanten Therapien von den histologischen Ergebnissen des Mammatumors und der axillären Lymphknoten und dem Alter der Patientin abhängig gemacht wurden. Die Reduktion der Mortalität am Mammakarzinom trotz steigender Inzidenz wurde neben der verbesserten Früherkennung durch den Einsatz der adjuvanten Therapie nach diesen etablierten Kriterien erreicht (99). Erst nach einer Prüfung des Einsatzes neuer Prognoseparameter innerhalb randomisierter Studien im Vergleich mit den bisherigen Methoden und dem Nachweis der Überlegenheit dieser neuen Parameter, dürfen diese in der klinischen Praxis eingesetzt werden. Bisher sind nur der Gehalt der Tumorproteasen (Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (uPA)) und deren spezifischen Inhibitoren (Plasminogenaktivator-Inhibitor 1, PAI-1) im Tumorgewebe in einer prospektiven Studie als unabhängige Prognosefaktoren nach einem multivariaten Vergleich bei nodalnegativen Mammakarzinomen nachgewiesen worden (52).
Zunächst wurde in der Untersuchung zum Vergleich der Farbdopplersonograhie mit der Magnetresonanztomographie (MRT) bestätigt, daß die Kontrastmittel-MRT besser in der Lage war, zwischen benignen und malignen Herdbefunden der Mamma zu unterscheiden (39,103-105). Mit der CD konnte dies beim Parameter Vmax in dieser Studie nicht und bei anderen Studien nur bei ausreichend hoher untersuchter Patientinnenzahl nachgewiesen werden (39,85,94,106). Die MRT ist offensichtlich besser in der Lage, die spezifische Durchblutung des Mammakarzinoms (Hypervaskularisation, erhöhte Gefäßpermeabilität) darzustellen als die Dopplersonographie.
Beim Vergleich der relativen Zunahme der Signalintensität im MRT nach Injektion des Kontrastmittels Gd-DTPA mit der Vmax des CD fällt auf, daß es eine enge Korrelation zwischen beiden Methoden bei den untersuchten benignen Herdbefunden der Mamma gibt, nicht aber bei den malignen Herdbefunden. Eine schnelle Anreicherung und hohe Signalintensität nach Kontrastmittelgabe bei der MRT stand im Zusammenhang mit einer hohen systolischen maximalen Geschwindigkeit, gemessen mit der CD in Gefäßen benigner Herdbefunde. Die relative Signalintensitätserhöhung im MRT korrelierte nur mit der maximalen systolischen Geschwindigkeit zu den Zeitpunkten 2-5, also zum Zeitpunkt des Plateaus, nicht zum Zeitpunkt 1, also der Zeit des Anstiegs der Signalintensität. Eine mögliche Erklärung ist, daß es bei malignen Herdbefunden aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität der Tumorgefäße zu einem Austritt des MRT-Kontrastmittels Gd-DTPA aus den Gefäßen kommt. Es charakterisiert also nicht nur die intravasale Kontrastmittelkinetik, sondern bei den malignen Herdbefunden auch die Kinetik des extravasalen Kontrastmittels (33,34). In benignen Herdbefunden verbleibt das Gd-DTPA in den Gefäßen. Hier korreliert die intravasale Kontrastmitteldynamik mit der intravasal gemessenen Vmax.
Die insbesondere für das Mammakarzinom bekannte Heterogenität der Durchblutung (107) erschwert sicher auch den direkten Vergleich verschiedener Methoden zu dessen Charakterisierung. Die Hypothese, daß die Ergebnisse von MRT und CD miteinander in Korrelation stehen, kann für die benignen Herdbefunde angenommen werden. Für die malignen Herdbefunde muß die Hypothese abgelehnt werden, da beide Methoden unterschiedliche Merkmale der Blutperfusion (vermehrte Durchblutung und schneller Fluß in den arteriovenösen Shunts versus gesteigerte Gefäßpermeabilität und vermehrte Durchblutung) innerhalb der Tumorgefäße (siehe Abschnitt 1.1.) charakterisieren.
Grüner et al. (108) haben bei 24 Patientinnen den Zusammenhang zwischen dem relativen Signalintensitätsanstieg (in %) zwischen der 1. und 5. Minute nach Gd-DTPA-Gabe beim MRT und der Anflutungszeit des Ultraschallkontrastmittels Levovist® (in Sekunden), gemessen durch die Beobachtung des Beginns des Kontrastmitteleffektes auf die CD, untersucht. Sie stellten eine schwache (r=0,47), aber signifikante Korrelation (p=0,02) zwischen diesen Parametern der beiden verschiedenen Untersuchungsmethoden fest. Benigne Herdbefunde zeigten im MRT eine geringere Signalverstärkung und eine längere Zeit bis zum Erkennen des Effektes des Ultraschallkontrastmittels als Mammakarzinome.
In der hier vorgelegten Studie wurde die interessante Beobachtung gemacht, daß sich beide Methoden in der Darstellung der als Fluß sichtbaren Gefäßmorphologie in ca. 60-70% glichen. Mit beiden Methoden gelang es im konkreten Fall z.B. eine randständige Durchblutung oder eine über den gesamten Herdbefund verteilte Durchblutung zu erkennen. Daß eine Differenz in der Kontrastmittelanreicherung zwischen Tumorperipherie und dem Tumorzentrum im MRT beobachtet

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werden kann, wurde Anfang der 90er Jahre von Feldmann et al. (28) und als ein differentialdiagnostischer Hinweis im MRT von Sherif et al. (34) beschrieben.
In der hier vorgestellten Studie zum Therapiemonitoring mit der Farbdopplersonographie an 16 Patientinnen, die wegen eines lokal fortgeschrittenen oder inflammatorischen Mammakarzinoms eine Chemotherapie mit Ifosfamid und Epirubicin erhalten haben, konnten keine signifikanten Veränderungen der im Referenzgefäß gemessenen maximalen systolischen Geschwindigkeit, des Resistance Index und der Anzahl der pulsierenden Pixelflächen unter der Chemotherapie festgestellt werden. Aus der Änderung der Vmax, des RI und der Anzahl der pulsierenden Pixelflächen konnte auch keine Prädiktion des Ansprechens erkannt werden, wobei eine endgültige Aussage durch die geringe Fallzahl und das geringe histologische und klinische Ansprechen (NC: N=3, PR: N=13; histologische Regressionsgrade: 3: N=1, 2: N=0, 1 und 0: N=15) nur bedingt möglich ist.
Die Hypothese, daß sich mit diesen Parametern der CD das Ansprechen des Tumors erkennen und vorhersagen läßt, kann mit dieser Studie also weder belegt noch widerlegt werden. Andere, in dieser Habilitationsschrift außerdem untersuchte Parameter der Durchblutung (Kontrastmittel-Videodensitometrie) und Vaskularisation (CD34-Färbung und AMBA) müssen deshalb gezielt auf diese Fragestellung hin untersucht werden. Kedar et al. (90) konnten bei allen ihrer unter präoperativer Chemotherapie untersuchten 34 Patientinnen Veränderungen in der Durchblutung (in dieser Publikation als vaskularity bezeichnet) feststellen. Außerdem konnten mit der CD mindestens 4 Wochen eher als klinisch oder B-Bild-sonographisch das Ansprechen des Tumors auf die Chemotherapie erkannt werden. Sie schlußfolgern daraus, daß mit der CD das Ansprechen erkannt werden und die Methode benutzt werden kann, um das Ansprechen des Tumors auf eine Therapie vorherzusagen. Das mittlere Alter der untersuchten Patientinnen war das gleiche wie in unserer Studie, 53 Jahre. In die Studie wurden ebenfalls Patientinnen mit einem lokal fortgeschrittenen oder inflammatorischen Mammakarzinom aufgenommen. Der Anteil der Non-Responder war ebenfalls gering(7/34). Der Untersucher war ebenso „geblindet“ in bezug auf das klinische Ansprechen. Im Unterschied zu unserer Untersuchung wurden die Patientinnen mit heterogenen Chemotherapien (CMF, MMM) oder mit Tamoxifen über verschiedene Zeiträume behandelt. Die Doppler-Frequenz betrug nur 3 MHz im Gegensatz zu unserer Studie mit einer Doppler-Frequenz von 6 MHz, mit der langsamere Flüsse erkannt werden können. Die Geräteeinstellungen und Art der Doppler-Untersuchung waren vergleichbar. Es wurden ebenso die pulsierenden Farbpixel pro Untersuchungsebene gezählt.
Nach Kedar et al. (90) eignet sich die CD für die Beurteilung der Tumorvaskularisation besser als der histologische Schnitt, da in vitro die Tumorgefäße kollabieren und bei in Formalin fixierten Tumoren die Gefäßgröße abnimmt (100). In der Untersuchung von Kedar et al. (90) nahm die Anzahl der pulsierenden Pixel pro Untersuchungsebene signifikant bei Ansprechen der Therapie ab. In unserer Untersuchung nahm die Anzahl der pulsierenden Pixel bei 11 der 16 Patientinnen (alle 11 zeigten klinisch eine PR) unter einer Chemotherapie zu.
Bamber et al. (101) haben mit dem continious wave Doppler (sensitiv für langsame Flüsse aber nicht selektiv für Tumorgefäße) eine Verringerung im Frequenz-Shift (vergleichbar mit Veränderungen der Vmax) unter präoperativer Tamoxifen-Therapie festgestellt. In unserer Studie nahm hingegen die Vmax zu. Eine Erklärung wäre die in unserer Studie intensivere Dosis effektiverer Medikamente, die in einem kürzeren Zeitraum gegeben wurden. In dieser Zeit kann es zu einer Abnahme des hydrostatischen Druckes innerhalb des Tumors kommen(18). Der periphere Widerstand nimmt ab, die Flußgeschwindigkeit kann zunehmen, damit nimmt die Zahl der erkennbaren Blutflüsse (pulsierender Farbpixel) zu. Bei einer länger dauernden Therapie kommt es bei histologischer Regression zur Tumorfibrose (82) und damit Zunahme des peripheren Widerstandes und Abnahme der Vmax.
In Übereinstimmung mit den beiden zitierten Autorengruppen wird die Notwendigkeit von weniger subjektiven und weniger zeitaufwendigen und automatisierten Untersuchungsmethoden für die Erfassung von Veränderungen der Durchblutung unter der Chemotherapie betont (101,102).
Ultraschall-Kontrastmittelsonographie (Videodensitometrie)
Bei allen Vorteilen hat die Dopplersonographie auch Nachteile, die ihren Einsatz nur begrenzt möglich machten. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, diese Nachteile durch andere diagnostische Methoden auszugleichen. Dies gilt insbesondere für den Nachweis von langsamen Blutflüssen. Doch gerade in der Tumordiagnostik interessieren die sehr langsam durchflossenen Gefäße zur Differenzierung zwischen malignen und benignen Veränderungen, da die Neovaskularisation als typisches Merkmal eines malignen Gewebes kleinste Gefäße ohne eine Muscularis hervorbringt, so daß dort der Blutfluß sehr langsam sein sollte.
Sohn stellte 1995 in einer Studie (31) fest (14 Patientinnen, 8 maligne und 6 benigne Herdbefunde der Mamma), daß sich bei allen malignen Mammatumoren in der konventionellen Farbtechnik und der Angio-Farbe ein Blutfluß darstellen ließ. Mit dem Angio-Mode konnten mehr Gefäße dargestellt werden als mit dem konventionellen Color Doppler (velocity mode). Außerdem konnte die für Tumorgefäße typische anarchische Gefäßarchitektur mit dem CPA dargestellt werden.

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Als Geräteeinstellung für die CPA-Untersuchung wurde in dieser Habilitationsschrift die von Rubin et al. (109) empfohlene verwendet und bei den folgenden Studien zur Videodensitometrie beibehalten.
Auch die in dieser Habilitationsschrift vorgelegte Studie zum Color Power Angiomode (CPA) im Vergleich zur Farbdopplersonographie (CD) konnte eine bessere Erkennbarkeit des Blutflusses mit dem CPA im Vergleich zur CD nachweisen. Die Empfindlichkeit für die Erkennung von Blutfluß mit dem CPA war also auch in der klinischen Praxis erhöht. Theoretisch wurde dies auch wegen der erhöhten Ultraschallfrequenz von 10 MHz im Vergleich mit den 6 MHz bei der CD angenommen. Diese Beobachtung wurde besonders bei den malignen Herdbefunden gemacht. Hier war der typische anarchische Gefäßverlauf zu erkennen. Die Hypothese dieser Studie, daß der CPA für die Erkennung von Blutflüssen in Mammatumoren sensitiver als die CD ist, wurde damit angenommen.
Die CPA konnte nun als Ultraschallmethode zur sensitiven Darstellung des Blutflusses für die Untersuchungen zur Differentialdiagnose mit der Ultraschallkontrastmittel-Videodensitometrie eingesetzt werden.
Weil sich die auf Mikrobläschen basierenden Ultraschallkontrastmittel ausschließlich intravasal verteilen, können Untersuchungen zur intravasalen Durchblutung durchgeführt werden, die nicht durch das Diffusionsverhalten des Kontrastmittels in das umliegende (Tumor-) Gewebe, wie etwa beim MRT-Kontrastmittel Gadolinium-DTPA (33,34), beeinflußt werden. Außerdem scheint als mögliche Real-time-Untersuchung der Ultraschall im CPA-Mode, wiederum im Gegensatz zu der MRT-Untersuchung, eine optimale funktionelle und kinetische Untersuchungsmethode der Transitzeit des Kontrastmittels und anderer zeitlich veränderlicher Parameter zu sein.
Cosgrove (110) untersuchte zunächst den Einsatz der älteren Ultraschall-Methode, des geschwindigkeitskodierten, konventionellen Farbdopplers, für die Messung der Parameter “time to maximum brightness“ und die “wash-out time back to baseline“ nach Ultraschallkontrastmittelgabe. Blomley (111) war mit der CD ebenfalls in der Lage, mit Computergestützter Analyse die Parameter “peak enhancement“ oder “the area under the time-enhancement curve“ und “ time to peak enhancement“ relativ einfach und reproduzierbar zu erheben und in der Differentialdiagnose von Mammatumoren einzusetzen. Mit unserer Studie konnten wir diese Ergebnisse auch beim Einsatz des modernen und sensitiveren CPA bestätigen und die Machbarkeit der Differentialdiagnostik von Mammatumoren mit Hilfe des CPA und der Kontrastmittel-Videodensitometrie nachweisen. Außerdem nahmen wir den von der Erkennung der Baseline nahezu unabhängigen T90%, l in die für die Differentialdiagnose einsetzbaren Parameter zusätzlich auf, außerdem der errechnete Parameter “Zeit und Helligkeitsparameter“. Da dieser Parameter und der “wash-in-wash-out-time Parameter“ aus mehr als einem Kurvenparameter berechnet werden, sind sie leichter reproduzierbar und objektiv, daß heißt weniger von der Genauigkeit eines Meßparameters abhängig. Es war mit diesen Parametern möglich, signifikante Unterschiede zwischen benignen und malignen Herdbefunden der Mamma zu erkennen. Diese Parameter und ihre cut-off-Werte wurden retrospektiv nach prospektiv erfaßter Messung erarbeitet mit dem Ziel, die besten Parameter mit der höchsten Spezifität (über 90%) für die Erkennung maligner Herdbefunde zu erhalten.
Die Hypothese, daß es gelingt, mit verschiedenen Parametern der Ultraschall-kontrastmittel-Videodensitometrie sicher zwischen benignen und malignen Herdbefunden der Mamma zu unterscheiden, konnte also angenommen werden.
Albrecht et al. (112) erfaßten mit einer ebenfalls Computer-assistieren quantitativen Technik anhand von Zeit-Intensitäts-Kurven an 20 Patientinnen mit Herdbefunden der Mamma verschiedene Parameter zur Differentialdiagnose. Allerdings verwendeten sie ein anderes Ulterschallkontrastmittel und benutzten als Ultraschalltechnologie den konventionellen Farbdoppler. Im Unterschied zu unseren Ergebnissen erfaßten sie eine statistisch signifikant längere Zeit der Signalintensitätserhöhung und ein multiphasisches Auswaschen des Kontrastmittels, erkennbar an mehrgipfligen Zeit-Intensitäts-Kurven, bei Karzinomen. Das kann am ehesten mit der anderen Kinetik des verwendeten Kontrastmittels Echogen® (längere Persistenz im Gefäßbett, längere Halbwertzeit des Kontrastmittels) erklärt werden. In unserer Studie war es schwierig, genaue Aussagen zum Auswaschen des Kontrastmittels Levovist® aufgrund der Bewegungsartefakte und der relativ kurzen Plasma-Halbwert-Zeit des Levovists® zu erhalten. Unsere Ergebnisse stimmen allerdings in der guten Beurteilung der Parameter “T90%, l “und “Tmax“, “wash-in wash-out Parameter“ - ein schnelles Anfluten und langsames Auswaschen des Kontrastmittels - mit der Arbeitsgruppe um Albrecht (112) überein.
Huber et al. (49,50) untersuchten in einem anderen Ansatz zur Messung der Kontrastmittelkinetik die Veränderungen der color pixel density (CPD) nach der Injektion von Levovist® bei 31 Patientinnen mit einem invasiven Mammakarzinom und 16 Patientinnen mit benignen Herdbefunden der Brust. Die CPD beschreibt die Menge an Farbe im gewählten Bildausschnitt. Huber et al. scanten die Ultraschallbilder von einem Videoband alle 10 Sekunden in der ersten Minute nach der Injektion von Levovist® und alle 20 Sekunden in den nächsten 2 Minuten ein und errechneten aus den Computerdaten die CPD. Leider wurden keine Angaben zur Ultraschalltechnologie und zu den

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Geräteeinstellungen gegeben, um die Ergebnisse vergleichen zu können. Die Zeit bis zur maximalen Helligkeit war bei Huber et al. (49,50) mit 38 Sekunden bei Karzinomen signifikant kürzer (71 Sekunden) als bei benignen. Diese Zeiten sind nach unserer Erfahrungen sehr lang (median Tmax: 22,0 Sekunden bei den Mammakarzinomen und 35,0 Sekunden für benigne Herdbefunde). Die Ursache könnte in der geringen Aquisitionsfrequenz (ein Bild alle 10-20 Sekunden gescannt) in der Huber-Studie (49,50) verglichen mit unserer Aquisitionsrate (25 Bilder pro Sekunde) liegen. Stuhrmann et al. (98) konnten keinen signifikanten Unterschied zwischen benignen und malignen Herdbefunden hinsichtlich der sujektiv-visuell am S-VHS-Video gemessenen Anflutungszeit des Kontrastmittels Levovist® erkennen. Sie beobachteten bei malignen Herdbefunden eine mittlere Anflutungszeit von 32 ±14 Sekunden und bei benignen Herdbefunden von 38±15 Sekunden. Diese Arbeitsgruppe benutzte die gleiche Kontrastmittelkonzentration und Injektionszeit aber führte die Untersuchungen im CD-Modus aus und benutzte keine Densitometrie zur objektiven Erfassung des Kontrastmitteleffektes.
Ein Problem unserer Studie war die Erkennung des Beginns des Kurvenanstiegs und damit die korrekte Messung der Zeit bis zum Maximum der Kontrastmittel-Intensität, Tmax. Deshalb wurde die Anflutungszeit über die maximale Helligkeit bestimmt. T90%, I (l für linken Teil der Kurve, siehe Abbildung 9) entspricht der Zeit bis zum Erreichen von 90% der maximalen Helligkeitsintensität. Die maximale Helligkeitsintensität ist einfach zu bestimmen, damit ist auch T90%, I leichter reproduzierbar und objektiver als die subjektive Bestimmung des Beginns des Helligkeitsanstiegs. T90%, I kann die für die Videodensitometrie entwickelte software selbst bestimmen. Die Videodensitometrie erreichte außerdem ein hohes Maß an Selektion mit einer Spezifität von 92%, einer Sensitivität von 64% und einem Signifikanzniveau für die Trennung von malignen von benignen Herdbefunden von p<0,005 für diesen Parameter. T90%,I konnte ebenso wie der weniger objektive Parameter Tmax (Zeit bis zur maximalen Helligkeit) und die berechneten Parameter wie “Zeit-und-Amplituden-Parameter“ und “wash-in wash-out time-Parameter“ in der vorliegenden Studie mit einer Spezifität von über 90% die ausgewählten Herdbefunde der Mamma differenzieren.
Grüner et al. (108) erreichten eine Spezifität von 78,6% und eine Sensitivität von 85% für die Dopplersonographie mit Levovist®. Sie maßen vor der Kontrastmittelgabe und 5 Minuten nach i.v.-Gabe des Kontrastmittels die Flußgeschwindigkeiten mit dem Spektraldoppler und gaben als cutt-off Level eine SD (Systole-Diastole)-Ratio von 3,5 an und beurteilten die Kontrastmitteleffeke visuell und subjektiv vom S-VHS-Videoband. Interessant war, daß bei ihrer Studie die Flußgeschwindigkeiten nach Levovist® niedriger waren als vorher, allerdings zu einer Zeit gemessen, die nach der Halbwertzeit des Kontrastmittels lag.
Bei malignen und benignen Herdbefunden konnte in unserer Studie mit der Videodensitometrie eine Zunahme der maximalen Helligkeit (Bmax) nach Levovist®- Gabe nachgewiesen werden, obgleich diese nicht signifikant war. Die Zunahme der Helligkeit durch die Gabe von Kontrastmitteln könnte auch indirekt durch die Zunahme der gemessenen maximalen systolischen Geschwindigkeit Vmax nachgewiesen werden. Wir haben uns in einer Studie (112) mit diesem Phänomen beschäftigt und es als einen reproduzierbaren, weitestgehend Untersucher- und Technik-unabhängigen Parameter für die Differentialdiagnose von sonographischen Herdbefunden der Mamma inauguriert. Bei Mammakarzinomen stieg die gemessene Vmax unter Levovist® signifikant höher an als bei benignen Herdbefunden. Ähnliche Beobachtungen machten auch Mäurer et al. (113), in dem sie einen stärkeren Anstieg der gemessenen Vmax nach Levovist bei Lymphknotenmetastasen als bei reaktiven Lymphknoten beobachteten, diesen Parameter allerdings nicht nach seinem Wert für die Differentialdiagnostik untersuchten.
Mit dieser erfolgreich abgeschlossenen Machbarkeits-Studie zur Videodensitometrie bei Mammatumoren und der Erarbeitung von Parametern, die sicher zwischen malignen und benignen Herdbefunden unterscheiden können, wurde es möglich, diese Methode und die erarbeiteten Parameter in anderen Einsatzgebieten einzusetzten. Nachfolgende prospektive Phase-III-Studien müssen heraus finden, ob diese Parameter besser als die etablierten wie Mammographie und Mammasonographie in der Differentialdiagnose von Herdbefunden der Mamma sind. Kann durch ihren Einsatz auf unnötige Operationen verzichtet werden?
Folgerichtig und entsprechend der Konzeption dieser Habilitationsschrift erfolgte zunächst der Einsatz der Videodensitometrie im Monitoring des Effektes einer präoperativen Chemotherapie bei lokal fortgeschrittenen Mammakarzinomen.
Ein Vorteil der präoperativen Chemotherapie ist, daß sich ihre Wirksamkeit auf denTumor der individuellen Patientin nachweisen läßt. Mit zunehmendem Einsatz noch wirksamerer Medikamente wie den Taxanen mit einer hohen Toxizität trotz der Verbesserung von toxischen Medikamentenkombinationen, wie durch den Einsatz des 4' Epimer vom Doxorubicin, dem Epirubicin (114), wird es zunehmend wichtiger, individuell wirksame Medikamente einzusetzen und deren Toxizität in Kauf zu nehmen und den Einsatz nicht wirksamer Medikamente mit dann nicht

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akzeptablen Nebenwirkungen bei Patientinnen zu vermeiden. Zur schnellen Erkennung der individuellen Wirksamkeit von Medikamenten werden bildgebende Verfahren eingesetzt. Die älteste und am weitesten verbreitete Methode dazu ist die klinische Untersuchung, bei den Mammakarzinomen die Palpation und Ausmessung des Tumordurchmessers in 2 Ebenen. Außerdem werden die Konsistenzänderung und der Rückgang der Hautfärbung z.B. beim inflammatorischen Karzinom registriert (74). Diese Einschätzung der Tumorgröße ist unsicher und subjektiv, damit also kaum reproduzierbar und unter verschiedenen Untersuchern vergleichbar.
Bei nicht behandelten Patientinnen erlaubt die Mammographie durch den Dichteunterschied zwischen Tumor und Drüsengewebe eine sichere Beurteilung der Tumorausdehnung einschließlich der intraduktalen Ausläufer durch die Beachtung des suspekt gruppierten Mikrokalkes. Da es unter der Chemo- oder Hormontherapie zu einer Dichteabnahme des Karzinoms kommen kann, ist die Beurteilbarkeit mit der Mammographie deutlich eingeschränkt (115).
Eine im Vergleich zur Palpation wesentlich genauere Methode zur Abschätzung des histologisch beobachteten Ansprechens ist der Ultraschall. Diese Aussage aus einer Phase II-Multizenterstudie (44 Patientinnen) zur präoperativen Chemotherapie (4 Zyklen mit Doxorubicin 50 mg/m2 und Docetaxel 75 mg/m2 im Abstand von 14 Tagen, unterstützt von Wachstumsfaktoren) in Deutschland (GEPARDO) wurde 1999 erstmalig publiziert und durch vergleichende Untersuchungen der Methoden belegt (73).
Die sonographische Größenmessung stimmt mit der histologischen weitgehend überein (73), obwohl auch mit dieser Methode die Abnahme der Echogenität des malignen Herdbefundes und eine Verwaschung des Randsaumes beobachtet werden (74).
Die Magnetresonanztomographie eignet sich nach Ansicht vieler Untersucher (74,77,116) sehr gut zur Größen- und Volumenbeurteilung des Tumors unter Chemotherapie. In der Magnetresonanztomographie kommt es durch die Chemotherapie zur Verkleinerung der Gd-DTPA-anreichernden Struktur und zur Veränderung (bis zum Angleich an die Kinetik des asymptomatischen Drüsengewebes) der Kontrastmittelkinetik. Bei einer kompletten und partiellen Remission unter der Therapie ändern sich die Größe und die Kontrastmittelkinetik, bei einer stable disease oder einem Tumorprogress bleiben beide unverändert (117).
Mit der 31P Magnetspektroskopie als nichtinvasive Methode können Informationen über den Phospholipidmetabolismus, die Zellenergetik und den intrazellulären pH-Wert gewonnen werden. Das Vorhandensein von erhöhten Konzentrationen an Phosphomonoestern in Mammakarzinomen konnte in verschiedenen in vitro- und in vivo-Untersuchungen nachgewiesen werden (118). Die wichtigsten Phosphomonoester (PME) im menschlichen Mammakarzinom, wie auch in anderen Tumoren sind das Phosphorylcholin (PC) und das Phosphorylethanolamin (PE); diese gelten als die Vorläufermoleküle der Phospholipidbiosynthese, so daß der Phosphomonoesterspiegel als Parameter für das Tumorzellwachstum genutzt werden kann. Für die Verlaufskontrolle der präoperativen Therapie des Mammakarzinoms könnte dies von Bedeutung sein, da dann die Möglichkeit bestünde, mit Hilfe der Magnetresonanzspektroskopie ein Absterben der Karzinomzellen vor einem bildmorphologischen Nachweis des Ansprechens der Chemotherapie zu belegen. Aus einem Teil publizierter Studien (119) geht hervor, daß ein Anstieg der PME mit einer Tumorprogression und ein Abfall mit einem Ansprechen des Tumors auf die Therapie korrelieren.
Die Veränderung in Größe, Volumen, Kontrastmittelkinetik (77,116) und Veränderung des 31P-Spektrums können zum Monitoring dieser Therapie benutzt werden. Diese verschiedenen Untersuchungen können an einem Gerät ohne Umlagerung erfolgen.
Eine weitere Methode zum Monitoring der Chemotherapie ist die nuklearmedizinische Positronen-Emissions-Tomographie (PET (120)).
Es zeigte sich in dieser ersten Beschreibung des Einsatzes der Videodensitometrie im Therapiemonitoring, daß es möglich sein kann, Unterschiede in der Durchblutung zwischen einer partiellen/kompletten Remission und einem Nicht-Ansprechen auf die Chemotherapie zu erkennen. Bei den von uns untersuchten Patientinnen nahm die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Signalintensität (Tmax, T90%,l) bei einer klinischen Remission bei den meisten Patientinnen zu und die damit verbundenen „Zeit-und-Amplituden-Parameter“ und „wash-in-wash-out-Parameter“. Die Werte der Densitometrie glichen dann denen benigner Herdbefunde der Brust. Bei keiner Patientin, die eine PR oder CR unter der präoperativen Chemotherapie zeigte, wurde eine Abnahme dieser Werte beobachtet. In dieser Studie wurden die gleichen Patientinnen mit der MRT im Verlauf der Chemotherapie untersucht. Die relative Signalintensität nach Kontrastmittelgabe nahm bei den Patientinnen mit einer PR oder CR ab. Sie stieg nie bei diesen Patientinnen an. Durch die Vergleichbarkeit der Aussagen beider Methoden in der Erkennung von PR und CR kann auf die Plausibilität der Densitometrie-Daten geschlossen werden. Anhand der Kontrastmittelkinetik im MRT und im CPA-Ultraschall kann also eine Veränderung der Durchblutung im Mammakarzinom unter Chemotherapie erkannt werden und daraus auf das klinische Ansprechen des Tumors geschlossen

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werden. Die Hypothese wird also bestätigt.
Aufgrund der kleinen Zahl untersuchter Patientinnen können jedoch keine Empfehlungen für die Praxis gegeben werden. Phase-III-Studien zum Vergleich verschiedener Methoden insbesondere mit dem zur Zeit geltenden „gold standard“ klinische Einschätzung werden durchgeführt. Ein Vergleich der Ergebnisse der Videodensitometrie unter der Chemotherapie mit Daten aus der internationalen Literatur kann nicht erfolgen, da ähnliche Untersuchungen bisher nicht publiziert wurden. Tumorvaskularisation und automatisierte Mikroskop-Bildanalyse (AMBA)
Zunächst sollte der Vergleich der Tumordurchblutung mit der morphometrisch bestimmten Tumorvaskularisation erfolgen. Traditionell wurde untersucht, ob die funk-tionellen Untersuchungen zu den morphologischen Befunden passen, ob die Durchblu-tungsmessungen die morphologischen Besonderheiten der Tumorvaskularisation wiedergeben (siehe Einleitung). Im Rahmen dieser Studie sollten im Gegensatz dazu funktionelle Durchblutungsmessungen (CD) durch morphometrische Untersuchungen der Gefäße bestätigt werden. Es sollte zunächst untersucht werden, in welchen Gefäßen der Blutfluß mit der CD sichtbar gemacht werden kann.
In der vorgelegten Studie wurden 88 Patientinnen mit einem invasiven Mammakarzinom präoperativ mit der CD untersucht. Von diesen Karzinomen wurden 34 mit einem dopplersonographisch homogenen Blutfluß im gesamten sonographischen Herdbefund und einem invasiven duktalen Mammakarzinom als Stichprobe zur Beantwortung spezieller Fragen zum Zusammenhang zwischen der Dopplersonographie und der Tumorvaskularisation ausgewählt.
Die histologischen Schnitte mit einem großen Anteil des invasiven Karzinoms wurden mit CD34-Antikörpern gefärbt und verschiedene Gefäßparameter (Gefäßanzahl, Lumenflächen, Gefäßwanddicke) in vorgegebenen, zufällig selektierten Gesichtsfeldern mit der automatisierten Mikroskop-Bildanalyse nach Scannen der Bilder und unter Verwendung eines für diese Untersuchung erstellen Computerprogramms analysiert. Der Vergleich dieser Daten mit den CD-Ergebnissen erfolgte getrennt nach großlumigen (Gefäßdurchmesser >100 µm) und kleinlumigen Gefäßen (Gefäßdurchmesser < 100 µm) und allen Gefäßen zusammen.
Bisher wurde bei Studien, welche die CD und die histologische Vaskularisation miteinander verglichen, angenommen, daß der Blutfluß homogen im Tumor ist (60,121). Nach Axelsson et al. (60) beträgt die Übereinstimmung der Untersuchungen zur Vaskularisation von Mammatumoren innerhalb der Untersucher und verschiedener Tumorregionen 73%. Die Studien von Vaupel (25) hingegen zeigten, daß besonders beim invasiven duktalen Mammakarzinom typischerweise eine inhomogene Vaskularisation (oder ein ungleichmäßig angelegtes Tumorgefäßbett) vorliegt und nur ca. 25% der Gefäße zu jedem beliebigen Zeitpunkt durchblutet sind. Das bedeutet jedoch nicht, daß nur wenige Regionen des Tumors durchblutet sind. Wäre dies so, müßten die invasiven duktalen Karzinome zum größten Teil nekrotisch aufgrund ihrer Minderdurchblutung sein. Vielmehr bedeutet dies, daß nicht immer alle angelegten Tumorgefäße von Blut durchflossen werden. Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen der Verteilung der dopplersonographisch sichtbaren Durchblutung und der inhomogenen Tumorvaskularisation bei invasiven duktalen Mammakarzinomen sind bisher nicht publiziert worden. Außerdem wurde bisher nicht bei der Untersuchung dieses Zusammenhanges von der Durchblutung ausgegangen und die Tumorvaskularisation zusätzlich computergestützt, also weitgehend objektiv untersucht.
Bisher wurden die Regionen, in denen die Vaskularisation beurteilt wurde, subjektiv vom Untersucher nach sogenannten „hot spots“, also Regionen, in denen sich viele Gefäße anfärben ließen, ausgewählt (55,56,123). Neu ist außerdem in diesem Zusammenhang die Untersuchung weiterer Parameter der Vaskularisation neben der Gefäßanzahl und ihrem Verhältnis zur Tumorfläche (micro vessel count oder micro vessel density), getrennt nach groß- und kleinlumigen Tumorgefäßen.
Die erste Hypothese dieser Studie, daß es signifikante Unterschiede in bezug auf die Tumorvaskularisation zwischen den dopplersonographischen Durchblutungsklassen (Pixelklassen) gibt, konnte bei einigen Vaskularisationsparametern bestätigt werden.
Die intratumoralen Gefäße in der vorgelegten Studie wurden mit der CD 34 Antikörperfärbung des Gefäßendothels (Antikörper gegen das Adhäsionsmolekül CD34) dargestellt. Die CD34-Färbung wurde wegen ihrer hohen Sensitivität in der Darstellung von menschlichen Gefäßen gewählt, obwohl es auch in geringem Maße das perivaskuläre Stroma mitfärben kann. Allerdings behaupten Fox et al. (124), daß die CD34-Färbung nur einen Teil des Gefäßendothels anfärbt. Sie stehen mit dieser Meinung allerdings allein in der verfügbaren internationalen Literatur. Durch die Markierung der angefärbten Gefäßregionen mit der PC-Mouse konnte weitestgehend ausgeschlossen werden, daß markiertes perivaskuläres Stroma mit in die Auswertung einbezogen wurde. Die CD34 Färbung wird außerdem im Pathologischen Institut der Charité routinemäßig zum Nachweis einer vaskulären Tumorinfiltrationn (V1) durchgeführt. Es konnten also die Routineschnitte mit der Region der maximalen Invasion ohne zusätzliches Zuschneiden und Färben für die Untersuchung genutzt werden.
Möglich ist ebenfalls die Gefäßfärbung mit dem Faktor-VIII. Diese Färbung ist sehr spezifisch,

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allerdings wenig sensitiv (55,56,62,122). Die CD31-Färbung (Antikörper, JC70, gegen CD31, Färbung gegen Endothelzellen-/ Thrombozyten-Adhäsionsmoleküle) ist kreuzreaktiv mit Fibroblasten und verschiedenen Tumor- und Plasmazellen (125,126). Aus diesen Gründen kombinierten Horak et al. (123) die Faktor VIII- mit der CD31-Färbung. Die größte Sensitivität wird mit der Mab E9-Färbung erzielt, allerdings nur am Gefrierschnitt. Trotz aller beschriebenen Vor- und Nachteile konnten mit allen hier angeführten Gefäßfärbetechniken vergleichbare Ergebnisse zum Zusammenhang zwischen der Prognose einer Patientin und dem Gefäßreichtum des Mammakarzinoms erzielt werden.
Mit unserer Methode der CD34-Färbung und der automatisierten und quantititativen Messung von verschiedenen Parametern der Vaskularisation von Mammakarzinomen, getrennt nach groß- (> 100 µm Durchmesser) und kleinlumigen (< 100 µm Durchmesser) Gefäßen, gelang es uns, Zusammenhänge zwischen der Vaskularisation und der CD (semiquantitative Darstellung als Pixelklassen) zu erkennen. Eine starke farbdopplersonographisch erkennbare Durchblutung korrelierte mit der Gesamtgefäßfläche aller Gefäße und der kleinlumigen Gefäße, ein plausibles Ergebnis (25,121).
Die zweite Hypothese wurde ebenfalls bestätigt. Neben der Gefäßzahl kann auch an anderen Vaskularisationsparametern wie der Gefäßfläche der Zusammenhang zwischen Tumordurchblutung und Tumorvaskularisation nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis bestätigt die morphologisch-histologische Beobachtung, daß nicht die Dichte der Gefäße, sondern ihre Architektur, hier beschrieben durch die Gefäßflächen und die Unterteilung in großlumige und kleinlumige Gefäße, die Blutflußgeschwindigkeit (in dieser Studie durch die Pixelklassen 1-3 wiedergeben) beeinflußt. Daneben beeinflußt der hydrostatische Druck des Tumors die Blutflußgeschwindigkeit (25).
Die Untersuchungen von Fox et al. (124) werden durch unsere Ergebnisse unterstützt. Dessen Arbeitsgruppe hat in Kenntnis der Nachteile der subjektiven Erhebung der microvessel density eine Computeranalyse der Gefäßanzahl und des Lumendurchmessers und der Lumenfläche von 211 invasiven Mammakarzinomen durchgeführt. Sie untersuchten dabei retrospektiv auch die Präparate (von 30 Patientinnen), die Horak et al. (123) in bezug auf die Vaskularisation manuell ausgezählt haben. Die Methode der Computeranalyse war mit unserer vergleichbar (Videokamera, Digitalisierung, manuelle Markierung der angefärbten Gefäßaußenränder und automatisiertes Zählen, Messen und Kalkulieren). Im Unterschied zu der hier vorgestellten Studie haben Fox et al. (124) die Gefäße mit CD31-Antikörpern angefärbt und nur die Außenränder der Gefäße markiert und damit eher die Gefäßaußendurchmesser und Gefäßaußenflächen und Gefäßgesamtflächen bestimmt. Im Gegensatz zu unserem Vorgehen wurde keine Unterscheidung zwischen klein- und großlumigen Tumorgefäßen gemacht. Es bestanden in der Arbeit von Fox et al. (124) signifikante Zusammenhänge zwischen der manuellen Auszählung der Gefäßanzahl und der Computeranalyse der Gefäßdurchmesser, Gefäßfläche und Gefäßanzahl. Außerdem bestand ein enger Zusammenhang (Korrelationskoeffizient von 0,81) zwischen der Anzahl der Gefäße und den Gefäßdurchmessern, Lumenflächen und angefärbten Flächen (entspricht der Gefäßgesamtfläche).
Nach der Untersuchung zum Zusammenhang von Tumorvaskularisation und Prognose konnte die Hypothese insgesamt bestätigt werden. Es wurde ein enger Zusammenhang von Vaskularisationsparametern zur histologisch nachgewiesenen Lymphknotenmetastasierung (pN1) nachgewiesen und ein geringerer Zusammenhang zur Tumorgröße. Hier war eine große Gefäßlumen- und Gefäßgesamtfläche der groß- und kleinlumigen Gefäße ein Hinweis auf ein hohes Risiko für eine mögliche Lymphknotenmetastasierung. Mit steigender Tumorgröße nahmen die Gefäßflächen und die Anzahl der großlumigen Gefäße zu. Eine aktuelle Arbeit (35 Mammakarzinome mit Lymphknotenmetatastasen (58)) unterstützt unsere Ergebnisse. Eine hohe Anzahl von mit CD31-gefärbten Gefäßen im Gesichtsfeld bei 250facher Vergrößerung (Mikrovessel-Score) korrelierte mit einer Lymphknotenmetastasierung und war ein unabhängiger Prognosefaktor.
Beim Vergleich unserer Ergebnisse muß man die zu anderen Untersuchern differerierende Methodik der quantitativen Bestimmung der Vaskularisation beachten. In unserer Untersuchung wurden die Parameter der Gefäße mit einem Durchmesser von über 100 µm über das gesamte Tumorgewebe des ausgewählten Objektträgers bestimmt. Die Blutgefäße mit einem Durchmesser von unter 100 µm wurden in 10 zufällig gewählten Meßfenstern (Gesichtsfeldern) vermessen. Die Anzahl dieser kleinen Gefäße pro Meßfenster (270057 µm2 oder ca. 0,27 mm2) schwankte zwischen 3 und 44. Entsprechend schwankten die Mittelwerte der Gefäßflächen von Gesichtsfeld zu Gesichtsfeld. Durch die Vermessung von 10 zufällig gewählten Gesichtsfeldern mit insgesamt durchschnittlich 100 Gefäßanschnitten konnte die Reproduzierbarkeit, ausgedrückt als Variationskoeffizient, bei Mehrfachmessung des gleichen Präparates unter 15% gesenkt werden. Horak et al. (123) zählten z.B. die Gefäße in mikroskopischen Zählfeldern einer Größe von 0.384 und 0.196 mm2 und benutzten die „Anzahl der Gefäße pro Quadratmillimeter“ innerhalb des gefäßreichsten Areals als Vaskularisationsparameter für ihre Berechnungen zum Zusammenhang zwischen Vaskularisation und Prognose. Grischke et al. (125) maßen das Volumen, die Oberfläche und die Länge der Gefäße pro Kubikmillimeter für ihre Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen der Vaskularisation und

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spektraldopplersonographischen Parametern. Weidner et al. (57) berechneten aus verschiedenen mikroskopischen Zählfeldern die mittlere Gefäßzahl (microvessel count) pro 200x - und 400x - Feld (Gesichtsfeld in 200- oder 400-facher Vergrößerung) und teilten die Ergebnisse in 4 Klassen der Gefäßdichte (microvessel density) zur Berechnung des Zusammenhangs mit der Prognose ein. Bosari et al. (55) bestimmten die höchste und mittlere Anzahl der Gefäße von drei 200x-Feldern für die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Tumorvaskularisation und Prognose.
Die positiven Ergebnisse zum Zusammenhang zwischen Tumordurchblutung und Prognose werden von vielen (55,60,62,123,124,127), jedoch nicht von allen Studiengruppen (128), die sich mit diesem Thema beschäftigen, bestätigt. Nach Ellis und Fidler (129) ist es fragwürdig, warum Mammakarzinome aufgrund ihrer verstärkten Angiogenese schneller metastasieren sollen. Die Krebszellen durchlaufen verschiedene Stadien ihrer Entwicklung von der Stimulation der Angiogenese bis zur Metastasierung, so daß sie im Stadium der Angiogenese noch nicht in der Lage sein können zu metastasieren. Die frühen Tumorstadien sind zwar notwendige aber nicht zwangsläufige Bedingungen zur Metastasierung. Die Mammakarzinomzellen, die eine intensive Neovaskularisation induzieren, müssen nicht automatisch in der Lage sein, in das Gefäßsystem zu penetrieren und im Blut und in anderen Organen zu überleben. Interessant ist in diesem Zusammenhang die Beobachtung (58), daß die microvessel density in den Lymphknotenmetastasen niedriger ist als im Primärtumor. Erklärt wird dies mit immunologischen Reaktionen gegen die Tumorzellen und eine resultierende Hemmung der Angiogenese.
Die Erfassung der Tumorvaskularisation ersetzt nicht die Lymphonodektomie und die histologische Aufarbeitung der entfernten Lymphknoten.
Unabhängig von diesen morphometrischen Ergebnissen konnten wir (130) ebenso wie Lee et al. und Sterns et al. (60,62.) zeigen, daß Patientinnen mit einem Mammakarzinom und Lymphknotenmetastasierung signifikant häufiger eine höhere als eine niedrigere Pixelklasse und höhere Flußgeschwindigkeiten in der CD aufweisen. Wir beobachteten außerdem signifikante Unterschiede in bezug auf die maximale systolische Geschwindigkeit zwischen den histologischen Grading-Gruppen 1 bis 3, jedoch nicht in bezug auf die Pixelklassen. Interessant an dieser Studie zur Tumorvaskularisation ist auch die Beobachtung, daß von den 34 homogen durchbluteten Mammakarzinomen 22 (57.9%) Lymphknotenmetastasen (pN1) hatten, während es unter den 54 inhomogen durchbluteten Mammakarzinomen nur 8 Patientinnen (24.2%) waren. In einer aktuellen Arbeit von Leek et al. (86) wird auf den engen Zusammenhang von Tumornekrose, niedriger Tumordifferenzierung und hoher Gefäßbildung hingewiesen. Für aggressiv wachsende Tumoren ist eine Vielzahl von arterio-venösen Shunts typisch. In diesen Gewebearealen kann es zu keinem Blutgasaustausch kommen. Die Folge ist die Gewebsnekrose. Diese Ergebnisse bestätigen unsere zum Zusammenhang zwischen gemessener hoher Flußgeschwindigkeit (Vmax, a-v-shunts) und einer geringen histologischen Differenzierung (G3) der Mammakarzinome. Auf die in der Arbeit von Leek et al. (86) beobachtete hohe Zahl von Makrophagen in diesen nekrotischen Karzinomen und deren fördernden Einfluß auf die Tumorangiogenese wurde bereits in der Einleitung (Abschnitt 1, Abbildung 1) hingewiesen.
Die Ergebnisse zum Zusammenhang zwischen Vaskularisation/Durchblutung und Prognose werden durch aktuellere Arbeiten zur Konzentration des wichtigsten Angiogenesefaktors VEGF in den Tumorzellen und Prognose unterstützt (131). Patientinnen mit einer hohen Konzentration von VEGF im Zytosol der Mammakarzinomzelllen haben eine schlechtere Prognose, definiert als eine kürzere Lebenszeit (survival time) als die mit einer geringeren VEGF-Konzentration in den Karzinomzellen. In der multivariaten Analyse unter 525 Patientinnen (nur 25 Patientinnen erhielten eine adjuvante Chemotherapie, eine adjuvante Hormontherapie wurde nicht gegeben) war die intrazelluläre VEGF-Konzentration der härteste Prognosefaktor (p=0,0199) im Vergleich mit der Tumorgröße, dem Tumorgrading und der Östrogenrezeptorexpression und neben dem Tumorgrading ein unabhängiger Prognosefaktor. Besonders bei den östrogenrezeptorpositiven Mammakarzinomen war die hohe VEGF-Tumorkonzentration ein negativer Prognosefaktor. Aufgrund der kleinen Zahl bisher publizierter Studien zur prognostischen Bedeutung des VEGF im Tumor und im Serum und zur Vaskularisation von Mammakarzinomen, hat dieser Faktor noch keine praktische Bedeutung für die Einschätzung der Prognose von Mamma-karzinompatientinnen und die Festlegung der adjuvanten oder neoadjuvanten Therrapie. Die etablierten Prognosefaktoren heute sind das Alter der Patientin zum Zeitpunkt der Diagnose Mammakarzinom, die Tumorgröße, die Lymphknotenmetastasierung, das histologische Grading, die Expression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren, eventuell noch die Wachstumsfraktion (S-Phase, KI67), die Ploidie und die Expression des p53 und c-erbB2, besonders bei lymphknoten-negativen Patientinnen (132,133).
Da es gelungen ist, einen Zusammenhang zwischen Durchblutung und Tumorvaskularisation und Tumorvaskularisation und Prognose nachzuweisen, interessiert nun folgerichtig und der Systematik dieser Arbeit folgend, ob sich die Vaskularisationsparameter auch unter einer präoperativen Chemotherapie ändern und sie ebenso wie die Densitometrie (Abschnitt 4.2.3. , (134)) als Methode

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zur Durchblutungsmessung zum Therapiemonitoring genutzt werden können.
Zu Beginn sei aus Gründen der Plausibilität auf die weitestgehende Übereinstimmung der Meßergebnisse zur Vaskularisation in allen drei Studien dieser Habilitationsschrift hingewiesen.
Zur automatisierten, gefäßmorphometrischen Untersuchung der Veränderung der Vaskularisation unter einer präoperativen Chemotherapie wurden 38 prä- und posttherapeutische Gewebsproben von 19 Patientinnen mit CD34-Antikörpern gefärbt und die Veränderung der Vaskularisationsparameter Anzahl der Gefäße, Gefäßinnenfläche, Gefäßinnen- und -außenumfang, Gefäßwanddicke unter der Chemotherapie quantitativ bei den kleinlumigen Gefäße (Durchmesser unter 100 µm) gemessen. Die Messung der Gefäßwanddicke wurde benutzt, um Aussagen zur Veränderung der Gefäßzusammensetzung (präformierte Gefäße, Arteriolen, Tumorgefäße) zu erhalten.
Bei 12 dieser 19 Patientinnen konnte ein histologisches Ansprechen (Regressionsgrade 1-4) auf die Therapie festgestellt werden. Die Vaskularisationsparameter änderten sich jedoch kaum. Die mittlere Gefäßwanddicke blieb unverändert, auch bei den Karzinomen mit einer histologischen Tumorremission. Somit änderte sich die Charakteristik der Gefäße kaum. Die innere Gefäßfläche (oder Lumenfläche), in der Untersuchung zur Korrelation mit den Durchblutungsparametern und zur Prognoseabschätzung aus der Vaskularisation ein sehr guter Parameter, änderte sich ebenfalls nicht signifikant unter der Chemotherapie. Es ließ nur ein Parameter, der äußere Gefäßumfang, unter der Chemotherapie einen Trend erkennen (p=0,09), allerdings nur, wenn histologisch ein Ansprechen auf die Therapie zu erkennen war. Dieser Parameter gibt sehr gut quantitativ die Veränderungen der Form der Blutgefäße im Mammakarzinom wieder. Bei der subjektiven Betrachtung der histologischen Schnitte fällt auf, daß die geschlängelten Gefäße nach einer Chemotherapie, bei der eine histologische Remission erreicht wurde, seltener beobachtet wurden. Das zeigte sich objektiv in der Abnahme der gemessenen Gefäßaußenlänge.
In der Studie von Grischke et al. (125) war die Gefäßlänge ein sehr guter Parameter zur Beurteilung der Unterschiede in der Vaskularisation zwischen malignen und benignen Herdbefunden der Mamma. Und die präoperative Chemotherapie hat zum Ziel, maligne Herdbefunde in „benignes“, tumorfreies Gewebe zu „verwandeln“. Insgesamt kann nach dieser objektiven Feststellung der Vaskularisationsparameter nur die Schlußfolgerung gezogen werden, daß sich die Tumorvaskularisation nur gering unter einer wirksamen Chemotherapie veränderte. Diese Veränderung war geringer ausgeprägt als die histologische Regression und war auch nur bei einem Parameter als Trend nachweisbar. Die Messung der Vaskularisationsparameter eignete sich nach diesen Ergebnissen kaum zur frühen Beurteilung des Ansprechens eines Mammakarzinoms. Die Hypothese dieser Untersuchung muß also widerrufen werden.
Die Endothelzellen sind offensichtlich unempfindlicher als die Tumorzellen gegenüber der Chemotherapie. Die Gefäße bleiben wie ein Gerüst innerhalb des nach der Chemotherapie nekrotischen oder fibrosierten Tumorareals stehen. Eine mögliche Erklärung ist die im Gegensatz zu den Tumorzellen sehr geringe Zellteilungsrate. Die von uns eingesetzten Chemotherapeutika wirken nur während der Zellteilung. Sie schädigen nur Zellen mit einer hohen Teilungsrate wie Tumorzellen, Haarwurzelzellen, Schleimhautzellen, kaum jedoch verhornende Epithelzellen, Nerven- und eben Endothelzellen.
Unsere Ergebnisse befinden sich auf den ersten Blick im Widerspruch zu den bisher publizierten Studien. Makris et al. (59) haben histologische Schnitte von 90 in einer randomisierten Studie mit einer neoadjuvanten chemoendokrinen Therapie behandelten Patientinnen mit einem Mammakarzinom mit denen von 105 in der gleichen Studie adjuvant behandelten Patientinnen nach CD34-Färbung in bezug auf die microvessel density in einem 250x Gesichtsfeld verglichen. In diesem nur indirekten Vergleich, da nicht die histologischen Schnitte vor und nach der Therapie einer Patientin miteinander verglichen wurden, war die microvessel density nach der Chemotherapie auch nur schwach signifikant niedriger (median 5,7 vs. 6,3, p=0,025) bei den neoadjuvant behandelten Patientinnen als bei den adjuvant behandelten ohne eine chemoendokrine Therapie. Die Autoren erklären diese Reduktion der Gefäßzahl durch einen sekundären Effekt durch die histologische Regression oder durch die direkte antiangiogenetische Wirkung der eingesetzten Medikamente. Durch das Ausbleiben oder die Verringerung der VEGF-Synthese durch die Tumorzellen kann durch ein physiologisches Absterben der Endothelzellen und deren fehlende Neubildung nach einer längeren Zeit mit einer Reduktion der Vaskularisation gerechnet werden. Das in dieser Studie neben der Chemotherapie eingesetzte Tamoxifen ist außerdem (in Kombination mit Retinoidsäure und Interferon alpha (135)) antiangiogenetisch wirksam. Die antitumorale Hormontherapie, z.B. mit Tamoxifen oder Letrozol, ist offensichtlich auch antiangiogenetisch wirksam, wie die Studie von Marson et al. (136) zeigt. Sie konnten eine signifikante Reduktion der mit Faktor VIII angefärbten Tumorgefäße in Karzinomen, die auf diese 3-6 Monate dauernde, präoperative Therapie angesprochen haben, im Gegensatz zu denen mit einem NC oder PD nachweisen.
Da unter einer Chemotherapie die Tumorgefäße nahezu unbeeinflußt bleiben, muß diese Therapie durch eine antiangiogenetische unterstützt werden, um eine dauerhafte Rückbildung des Karzinoms

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zu erreichen. Die gegenseitige Beeinflussung von Tumor- und Endothelzellen (two-cell-compartment-model) wurde bereits in der Einleitung (Abschnitt 1) dieser Arbeit beschrieben. Die antiangiogenetisch wirksamen Medikamente (insbesonders die Anti-VEGF-Medikamente wie SU5416) verringern außerdem den hydrostatischen Druck im malignen Tumor und verbessern damit die Diffusion der Chemotherapeutika in den Tumor und damit deren Wirksamkeit. Die Ergebnisse der vorliegenden Habilitationsschrift bestätigen damit die Forderung nach dem klinischen Einsatz von Antiangiogenese-Medikamenten, kombiniert mit einer Hormon- und Chemotherapie. Antiangiogenese-Medikamente bewirken einen Wachstumsstillstand (22), verlängern die dormancy der Tumorzellen und erzeugen keine Resistenz (24). Sie sind damit auch als Konsilidierungstherapie nach der Chemo- oder Hormontherapie geeignet.
Eine vielversprechende, die Patientin wenig belastende, schnelle und objektive Methode zum Monitoring unter präoperativer Chemotherapie soll die Messung der Angiogenese-Faktoren im Serum als Surrogatmarker für eine antiangiogenetisch wirksame Therapie sein (67). Die Erfahrungen mit der Messung des VEGF im Serum unserer Arbeitsgruppe (137) bestätigen, daß die Serumkonzentration des VEGF abhängig ist von der Dignität und damit der angiogenetischen Aktivität des Tumors. Eine Reduktion seiner angiogenetischen Potenz durch eine Chemotherapie (Störung der gegenseitigen parakrinen Beeinflussung der Tumorzelle und des umgebenden Stromas) müßte durch eine Absenkung der VEGF-Konzentration im Serum meßbar sein. Außerdem könnte diese Methode zum Monitoring einer gegen VEGF gerichteten antiangiogenischen Therapie eingesetzt werden.
Auf dem 21st San Antonio Breast Cancer Symposium im Dezember 1998 wurde z.B. das vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1 (78)) im Serum als brauchbar für das Therapiemonitoring unter primärer Hormon- oder Chemotherapie eingeschätzt. VCAM (Steuerung der Endothel-Endothel-Interaktion) im Serum korrelierte in der Studie von Byrne et al. (78) mit dem klinischen Ansprechen (55 Patientinnen unter primärer Hormontherapie, p<0,001), VEGF im Serum jedoch nicht.
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