[Seite 7↓]

2.  Genetische Analyse entwicklungsbiologischer Funktionen des Neuregulin-1/ErbB Signalsystems in der Maus

2.1 Das Neuregulin-1/ErbB Signalsystem

Neureguline (NRG) sind Signalproteine, die sowohl während der Embryogenese als auch im adulten Organismus Zell-Zell Interaktionen im Nervensystem, im Herz und in anderen Organen vermitteln. NRG binden an transmembranäre Tyrosinkinaserezeptoren der ErbB Familie. Über die Aktivierung intrazellulärer Signalwege werden zelluläre Antworten wie z.B. Proliferation, Survival, Migration, oder Differenzierung durch NRG Signale ausgelöst [Adlkofer and Lai, 2000, Buonanno and Fischbach, 2001, Burden and Yarden, 1997, Citri, et al., 2003, Falls, 2003, Garratt, et al., 2000, Lemke, 1996, Yarden and Sliwkowski, 2001].

NRG wurden ursprünglich unabhängig voneinander als Faktoren beschrieben und später kloniert, die (i) ErbB2 aktivieren [Holmes, et al., 1992, Peles, et al., 1993, Wen, et al., 1992], (ii) Gliazell Proliferation [Brockes, et al., 1980, Goodearl, et al., 1993, Lemke and Brockes, 1984, Marchionni, et al., 1993, Raff, et al., 1978], oder (iii) die Bildung von Azetylcholinrezeptoren in Muskelzellen induzieren [Falls, et al., 1993, Jessell, et al., 1979]. Bei allen isolierten Proteinen handelte es sich um unterschiedliche Isoformen, die vom NRG–1 Gen synthetisiert werden [Falls, 2003].

NRG sind durch eine EGF-ähnliche extrazelluläre Domäne gekennzeichnet (Abb.: 2.1-1). Sie genügt für die Rezeptorbindung und Entfaltung der biologischen Aktivität von NRG. Durch alternatives Spleißen können unterschiedliche Varianten (α und β) der EGF Domäne, die sich in ihrer Rezeptor-Affinität unterscheiden, gebildet werden. Durch den Gebrauch unterschiedlicher Promotoren entstehen außerdem unterschiedliche Isoformen des NRG-1 Gens, Type I (neu differentiation factor, NDF; heregulin, HRG; acetylcholine receptor inducing activity, ARIA), Type II (glial growth factor, GGF) und Type III (sensory and motor neuron-derived factor, SMDF; cysteine-rich domain neuregulin-1, CRD-NRG-1). Die synonymen Bezeichnungen der einzelnen Isoformen spiegeln nur bedingt ihre [Seite 8↓]vorherrschende biologische Aktivität in vivo wider. So wird beispielsweise „glial growth factor“ Aktivität in vivo vor allem durch Type III und nicht durch Type II (=GGF) NRG-1 vermittelt. Type I-III Isoformen unterscheiden sich durch ihre extrazelluläre Struktur, N-terminal von der EGF Domäne. So besitzen Type I und II eine Immunglobulin-ähnliche extrazelluläre Domäne, Type I zusätzlich eine stark glykosylierte Domäne. Ausschließlich Type III NRG-1 besitzt eine Cystein-reiche Domäne (CRD) mit interner hydrophober Sequenz, die transmembranär lokalisiert ist und eine haarnadelförmige Anordnung der Type III Isoform in der Zellmembran bedingt (Abb.: 2.1-1). NRG–1 Isoformen werden als primär sezernierte oder transmembranäre Liganden gebildet. Membranassoziierte Formen können außerdem sekundär proteolytisch gespalten und Teile des Liganden extra- bzw. intrazellulär freigesetzt werden (Abb.: 2.1-1). In einer aktuellen Studie wurde jüngst in vitro beobachtet, daß die Interaktion der extrazellulären Domäne von Type III NRG-1 mit ErbB Rezeptoren nicht nur ein antegrades Signal (forward-signalling) auf die Zielzelle vermittelt, sondern außerdem ein retrogrades Signal (back-signalling) induziert, indem es als Folge der Rezeptorbindung zur proteolytischen Abspaltung der intrazytoplasmatischen Domäne des Liganden kommt (Abb.: 2.1-1, vergl. außerdem Kapitel 2.3.2). Diese transloziert in den Zellkern und reprimiert dort Apoptose-induzierende Gene [Bao, et al., 2003].

Die einzelnen Isoformen des NRG-1 Gens unterscheiden sich ebenfalls durch ihr räumlich-zeitliches Expressionsmuster im jeweiligen Organismus: Type I NRG-1 wird vor allem während der frühen Embryogenese exprimiert, Type II findet sich vor allem im ZNS während der späten Embryogenese sowie postnatal, Type III ist neben dem ZNS vor allem in Axonen sensorischer und motorischer Neurone exprimiert [Meyer and Birchmeier, 1994, Meyer, et al., 1997].

In jüngerer Zeit wurden weitere NRG identifiziert, NRG-2, -3, -4, die von unterschiedlichen Genen kodiert werden und sich in ihrer Expression von NRG-1 unterscheiden [Busfield, et al., 1997, Carraway, et al., 1997, Higashiyama, et al., 1997, Zhang, et al., 1997]. So ist beispielsweise NRG-4 im adulten Pankreas und Skelettmuskel jedoch nicht im Nervensystem exprimiert [Harari, et al., 1999]. NRG–4 Signale scheinen hier die Differenzierung von Somatostatin-produzierenden Zellen im endokrinen Pankreas zu steuern [Huotari, et al., 2002].


[Seite 9↓]

Abbildung 2.1-1: Schematische Übersicht über die Struktur der Neuregulin Liganden-Familie. NRG-1, NRG-2, NRG-3 und NRG-4 werden durch unterschiedliche Gene kodiert. Gemeinsames Merkmal aller Neureguline ist eine EGF-ähnliche, extrazelluläre Domäne. Durch alternatives Spleißen in der C-terminalen Region der EGF Domäne entstehen α und β Isoformen mit unterschiedlicher Rezeptor Affinität. Über unterschiedliche Promotoren werden verschiedene Isoformen des NRG-1 Gens gebildet: Type I (NDF, HRG, oder ARIA), Type II (GGF) und Type III (SMDF, oder CRD-NRG-1). Sie unterscheiden sich durch die Struktur ihrer N-terminalen, extrazellulären Regionen. Type I NRG-1 ist durch eine stark glykosylierte Region und eine Immunglobulin-ähnliche Domäne (Ig) charakterisiert, Type II NRG-1 besitzt zudem eine N-terminal davon lokalisierte GGF-spezifische Kringle Domäne (nicht dargestellt), sowie eine N-terminale hydrophobe Region, Type III NRG-1 ist durch eine Cystein-reiche Domäne (CRD, SMDF Domäne) charakterisiert. Die CRD Domäne ist durch eine hydrophobe Region transmembranär lokalisiert, wodurch eine haarnadelförmige Anordnung von Type III NRG-1 in der Zellmembran entsteht. Nach proteolytischer Spaltung im Bereich der juxtamembranären Domäne kann ein membran-assoziierter Ligand in reverser Orientierung gebildet werden. NRG-1 Isoformen werden als primär sezernierte, oder membrangebundene Liganden gebildet, transmembranäre Vorläufer können sekundär proteolytisch freigesetzt werden. Wahrscheinliche, nicht gesicherte Bereiche, in denen Neuregulline proteolytisch gespalten werden, sind ebenfalls markiert. NRG-2 besitzt eine ähnliche Struktur wie Ig-haltige Isoformen von NRG-1. Für NRG-3 und -4 sind keine α und β Isoformen nachweisbar. NRG-4 unterscheidet sich am stärksten von den übrigen Neuregulinen, es besitzt lediglich eine extrazelluläre EGF-ähnliche Domäne und eine kurze zytoplasmatische Domäne. Weitere Details werden im Text dargestellt.


[Seite 10↓]

NRG übertragen ihre Signale mit Hilfe von ErbB Rezeptoren auf Zielzellen. Die Familie der ErbB Tyrosinkinaserezeptoren umfaßt vier Mitglieder, den EGF-Rezeptor (ErbB1, HER1), ErbB2 (HER2, Neu), ErbB3 (HER3) und ErbB4 (HER4). Alle ErbB Rezeptoren besitzen einen einheitlichen Aufbau, der aus einer extrazellulären Ligandenbindungsdomäne, einer einfachen, transmembranären Domäne und einer zytoplasmatischen Tyrosinkinasedomäne besteht. Die Bindung eines spezifischen Liganden führt zur Homo- (z. B. ErbB1/ErbB1) oder Heteromerisierung (z.B. ErbB2/ErbB3) von ErbB Rezeptoren (Abb.: 2.1-2). In der Folge kommt es zur Tyrosinkinaseaktivierung und zur Phosphorylierung von Tyrosinresten der zytoplasmatischen Domäne, die als Bindungsstellen für intrazellulläre Signalübertragungsmoleküle wie z. B. grb2, grb7, PLCγ, shc oder p85 dienen [Buonanno and Fischbach, 2001, Citri,et al., 2003, Falls, 2003, Schlessinger, 2000, Yarden and Sliwkowski, 2001].

Eine Sonderstellung unter den ErbB Rezeptoren nimmt ErbB2 ein: Trotz intensiver Suche wurde bisher kein Faktor identifiziert, der direkt an diesen Rezeptor bindet und die tyrosinspezifische Phosphorylierung von ErbB2 induziert. Verschiedene Liganden können jedoch indirekt die Phoshorylierung von ErbB2, d.h. die ErbB2 vermittelte Signalübertragung auslösen. So bindet z. B. Neuregulin-1 mit hoher Affinität direkt an ErbB3 und ErbB4 [Carraway, et al., 1994, Plowman, et al., 1993, Tzahar, et al., 1994]. Dies induziert die schnelle tyrosinspezifische Phosphorylierung von ErbB2 in Zellen, die ErbB3 oder ErbB4 koexprimieren [Carraway and Cantley, 1994, Peles,et al., 1993, Sliwkowski, et al., 1994, Wallasch, et al., 1995]. Ähnliches wird bei Liganden des EGF-Rezeptors beobachtet, die zwar direkt an den EGF-Rezeptor jedoch nicht an den ErbB2 Rezeptor binden, aber Autophosphorylierung von ErbB2 induzieren, wenn beide Rezeptoren in der gleichen Zelle koexprimiert werden [King, et al., 1988]. Diese in vitro Beobachtungen deuteten schon früh auf eine zentrale Rolle von ErbB2 als Korezeptor in der Übertragung von Signalen hin, die durch die direkte Bindung eines spezifischen Liganden an EGF-, ErbB3- oder ErbB4 Rezeptoren ausgelöst werden.

Wesentlich für das Verständnis der biologischen Funktionen des NRG–1/ErbB Signalsystems war die Analyse von Mäusen mit gezielten Mutationen (knockout Mäuse) in den einzelnen Rezeptor- und Liganden-Genen. In den vorgestellten [Seite 11↓]Arbeiten [Britsch, et al., 2001, Britsch, et al., 1998, Ozcelik, et al., 2002, Woldeyesus, et al., 1999], sowie in weiteren Arbeiten aus der Gruppe von Frau Prof. C. Birchmeier und anderen Laboren [Adlkofer and Lai, 2000, Buonanno and Fischbach, 2001, Garratt,et al., 2000, Garratt, et al., 2003, Lemke, 1996, Olayioye, et al., 2000, Yarden and Sliwkowski, 2001] wurde gezeigt, daß NRG-1/ErbB Signale essentielle Funktionen bei der Steuerung der Entwicklung des PNS und des Herzens übernehmen. Die genetische Analyse in der Maus konnte außerdem belegen, daß funktionelle NRG-1 Rezeptoren in vivo Heteromere sind, wobei während der Embryogenese NRG-1 Signale im PNS durch ErbB2/ErbB3, im Herz durch ErbB2/ErbB4 Heterodimere übertragen werden.

Abbildung 2.1-2: Schematische Struktur der ErbB Tyrosinkinaserezeptor Familie. Dargestellt sind der Epidermal growth factor receptor (EGFR, ErbB1, oder HER1) und die drei Neuregulin-1 Rezeptoren ErbB2, ErbB3 und ErbB4. ErbB Rezeptoren besitzen einen einheitlichen Aufbau aus jeweils zwei Cystein-reichen extrazellulären Domänen (Cys Box 1 und 2), einer transmembranären Domäne (tm) und einer intrazytoplasmatischen Tyrosinkinase Domäne (TK). Beachte, daß ErbB3 im Gegensatz zu ErbB2 und Erbb4 keine biologisch relevante Tyrosinkinase Aktivität besitzt. Durch Heteromerisierung entstehen funktionelle Neuregulin-1 Rezeptoren (rechte Bildhälfte), wobei ErbB2/ErbB3 Heteromere im PNS, ErbB2/ErbB4 Heteromere u.a. im Herz Neuregulin-1 Signale übertragen.


[Seite 12↓]

2.2  Funktionen von Neuregulin-1/ErbB2/3 Signalen während der Embryogenese der Maus

2.2.1 Entwicklung von Neuralleistenzellen und ihren Derivaten

Neuralleistenzellen (NCC) stellen eine stammzellartige, undifferenzierte Zellpopulation dar, die während der Embryogenese nur transient in Erscheinung tritt. NCC entwickeln sich aus dem primitiven Neuralrohrepithel am Übergang der Neuralfalten in das nicht-neurale Ektoderm. Während ihrer Bildung lösen sich NCC aus dem epithelialen Neuralrohrverband und wandern als mesenchymartige Einzelzellen (epithelio-mesenchymale Transition) entlang charakteristischer Wege durch den Embryo zu ihren Zielstrukturen, wo sie sich in ihre definitiven Zellschicksale differenzieren (Abb.: 2.2.1-1).

Abb. 2.2.1-1: Halbschematischer Querschnitt durch einen Wirbeltierembryo auf Höhe der Nebennierenanlage. In der linken Bildhälfte sind Migrationswege von undifferenzierten NCC und die Besiedlung von Organanlagen während der Neuralleistenzellentwicklung dargestellt. In der rechten Bildhälfte sind Neuralleistenzellderivate dargestellt (Nach Carlson, Patten’s Foundations of Embryology, 6th edition 1996).


[Seite 13↓]

Wenngleich NCC als eingenständige embryonale Struktur nur passager in Erscheinung treten, sind sie von außerordentlich großer Bedeutung für die Entwicklung des Embryos, da sich aus NCC nahezu sämtliche Strukturen des peripheren Nervensystems (PNS) differenzieren: Sympathisches (SNS) und parasympathisches Nervensystem (PSNS), enterisches Nervensystem (ENS), sensorische Spinalganglienzellen, Mechanorezeptoren (Merkel Zellen) der Haut, sowie die gesamte periphere Gliazellpopulation (d.h. Schwannzellen im Bereich peripherer Nerven und Satellitenzellen im Bereich von sensorischen und autonomen Ganglien). NCC tragen außerdem zur Bildung von Melanozyten und von Binde- und Stützgeweben im Bereich des Kopfes bei [Halata, et al., 2003, Le Douarin and Kalcheim, 1999, Szeder, et al., 2003].

Die Entwicklung von NCC ist also u. a. durch Prozesse wie Zellproliferation, Zellmigration, Determinierung alternativer Zellschicksale oder zelluläre Differenzierung gekennzeichnet. Die molekularen Steuerungsmechanismen, welche diesen Prozessen zugrunde liegen wurden in den vergangenen Jahren intensiv beforscht [Anderson, et al., 1997]. So wurde z.B. in jüngeren Untersuchungen gezeigt, daß die Festlegung des Zellschicksals „Neuralleistenzelle“ in prämigratorischen NCC-Vorläuferzellen des dorsalen Neuralrohrs u.a. durch die Transkriptionsfaktoren FoxD3 und Sox9 gesteuert wird [Dottori, et al., 2001, Spokony, et al., 2002]. Außerdem steuern Mitglieder der TGF–β Familie (BMP-2, -4, -7) die Entwicklung von NCC während unterschiedlicher Phasen ihrer Entwicklung: Einerseits sind BMP Signale essentiell für die Etablierung von Progenitorpopulationen im dorsalen Neuralrohr, aus denen sich u.a. emigrierende NCC rekrutieren. Zum anderen werden BMPs in den Zielregionen des primären SNS exprimiert und induzieren dort in NCC nach deren Ankunft die spezifische Differenzierung zu sympathischen Neuronen [Howard, et al., 2000, Lee and Jessell, 1999, Reissmann, et al., 1996, Schneider, et al., 1999, Shah, et al., 1996].

In meinen Arbeiten konnte ich zeigen, daß das NRG-1/ErbB Signalsystem zentrale Funktionen bei der Steuerung der Entwicklung von NCC besitzt: Eine der frühesten Funktionen in der Entwicklung von NCC stellt die Kontrolle der Migration von sympathogenen NCC dar. Mausembryonen mit homozygot mutiertem erbB2, [Seite 14↓]erbB3 oder NRG-1 Gen entwickeln eine schwere Hypoplasie des primären sympathischen Nervensystems im Bereich des Rumpfes [Britsch,et al., 1998]. Homozygot mutante erbB2 oder NRG-1 Embryonen sterben während der Entwicklung am Tag E10 aufgrund einer Entwicklungsstörung des Herzens, die ebenfalls NRG-1 signalabhängig ist und die im nächsten Kapitel ausführlich diskutiert wird [Britsch,et al., 1998, Lee, et al., 1995, Meyer and Birchmeier, 1995]. Um den Einfluß von NRG-1 Signalen auf die spätere Entwicklung des sympathischen Nervensystems analysieren zu können, wurden daher Mausembryonen mit einer homozygoten Mutation des erbB3 Gens eingesetzt [Riethmacher, et al., 1997]. ErbB3 wird während der Embryogenese nicht im Herz exprimiert, diese Mäuse überleben daher bis zur Geburt. Allerdings setzt um den Tag E12,5 eine progrediente embryonale Letalität ein, so daß nur wenige Mutanten den Zeitpunkt der Geburt erreichen [Riethmacher,et al., 1997]. In erbB3 mutanten Mäusen konnte ich den totalen Verlust des Nebennierenmarks sowie einen subtotaler Verlust von prä- und paravertebralen sympathischen Ganglien beobachten. Sympathische Neurone synthetisieren bereits intraembryonal Katecholamine. Entsprechend konnte ich am Entwicklungstag E12,5 in homozygot mutanten erbB3 Embryonen eine ca. 15-fache Reduktion der Gewebe-Katecholaminspiegel nachweisen [Britsch,et al., 1998]. In den vergangenen Jahren wurden unterschiedliche Komponenten des Katecholaminsyntheseapparats, wie z.B. Tyrosinhydroxylase oder Dopamin-β-Hydroxylase, durch Gene targeting in der Maus inaktiviert [Thomas, et al., 1995, Zhou, et al., 1995]. Interessanterweise zeigen diese Mäuse ein embryonales Letalitätsprofil das jenem von erbB3 Mutanten sehr ähnlich ist. Es kann daher angenommen werden, daß der intraembryonale Mangel an Katecholaminen zumindest partiell deren embryonale Letalität verursacht [Britsch,et al., 1998].

Anhand von Zellproliferationsuntersuchungen, Apoptose-Assays und der systematischen Analyse der Verteilung undifferenzierter sympathogener NCC im Embryo konnten wir den zellulären Mechanismus weiter aufklären, der zu der beschriebenen Entwicklungsstörung des sympathischen Nervensystems in mutanten Tieren führt: In Mausembryonen mit Mutationen des NRG-1 Signalsystems sind sympathogene NCC nicht in der Lage, in ihre spezifischen Zielregionen (zu beiden Seiten der dorsalen Aorta) einzuwandern. Sie verharren [Seite 15↓]unmittelbar nach ihrer Bildung in ursprungsnahen Regionen des Embryos als undifferenzierte NCC [Britsch,et al., 1998]. Wir konnten darüber hinaus keine Veränderungen von Zellproliferation und Überleben in den Mutanten nachweisen. NRG-1 Signale beeinflußen daher direkt das Migrationsverhalten von sympathogenen NCC. Diese Befunde werden unterstützt durch das Expressionsmuster der beteiligten Komponenten des NRG-1/ErbB Signalsystems: ErbB3 wird in undifferenzierten NCC exprimiert, die zur Bildung des PNS beitragen, während sein Korezeptor ErbB2 in der frühen Embryogenese ubiquitär im Embryo exprimiert ist. Mit Hilfe einer Knockin Mauslinie, die das Reportergen lacZ unter der Kontrolle des NRG-1 Genlocus exprimiert [Meyer and Birchmeier, 1995] konnte ich außerdem zeigen, daß der Ligand NRG-1 dynamisch vom umgebenden Mesenchym entlang des Migrationsweges und im Zielgebiet sympathogener NCC exprimiert wird [Britsch,et al., 1998].

Ich habe den Einfluß von NRG-1 Signalen auf das Migrationsverhalten von NCC ebenfalls in vitro analysiert. Wird der Ligand NRG-1 in einem sog. Streifenassay in alternierenden Streifen auf einer Zellkulturoberfläche immobilisiert so emigrieren NCC aus Neuralrohrexplantaten bevorzugt und schneller auf NRG-1-beschichteten Streifen (Britsch und Birchmeier, unpublizierte Daten). Übereinstimmende Befunde wurden ebenfalls in einer Arbeit von Mahantappa berichtet [Mahanthappa, et al., 1996].

Steuerung von Zellmotilität durch NRG-1 Signale ist nicht nur bei sympathogenen NCC beobachtbar. In genetischen Untersuchungen an Mausembryonen mit einer gezielten Mutation des NRG-1 Gens wurde beobachtet, daß die Zahl von auswandernden Schwannzellvorläufern - die sich aus undifferenzierten NCC entwickeln (s.o.) - entlang auswachsender Spinalnerven gegenüber Kontrollembryonen verringert ist [Meyer and Birchmeier, 1995]. Der gleiche Phänotyp wird außerdem in Mausembryonen mit einer Mutation des erbB2 und erbB3 Gens beobachtet [Britsch,et al., 2001, Britsch,et al., 1998, Morris, et al., 1999, Riethmacher,et al., 1997, Woldeyesus,et al., 1999]. In Explantatkulturen von erbB2 mutantem Gewebe konnte die Gruppe um Kuo-Fen Lee zeigen, daß die Migrationskapazität mutanter Schwannzellvorläufer gegenüber normalen Zellen verringert ist [Morris,et al., 1999].


[Seite 16↓]

Embryonen mit Mutationen im erbB2 oder NRG-1 Gen sterben aufgrund einer gestörten Kardiogenese am Tag E10 (s.u.). Um die Entwicklung von NCC und ihren Derivaten während späterer Entwicklungsstadien untersuchen zu können, wurde von Mas Woldeyesus aus der Gruppe von Carmen Birchmeier durch einen Knockin die cDNA von erbB2 unter der Kontrolle des Nkx2.5 Gens exprimiert. Nkx2.5 wird spezifisch im embryonalen Herzmuskelgewebe exprimiert. Wird diese Mutation in homozygot mutante erbB2 Tiere eingekreuzt (erbB2-/-R), so wird die durch erbB2 Mutation bedingte, embryonal letale Entwicklungsstörung des Herzens spezifisch kompensiert [Woldeyesus,et al., 1999]. Diese Tiere überleben bis zur Geburt und können für die Analyse späterer Phänotypen herangezogen werden. In Kooperation mit Mas Woldeyesus haben wir in diesen Tieren die Entwicklung des peripheren Nervensystems untersucht. In den mutanten Tieren ist die einsetzende Differenzierung peripherer Glia aus NCC, sowie die oben beschriebene Migrationsstörung von Schwannzellvorläufern nachweisbar. Während der weiteren Embryogenese kommt es allerdings zum vollständigen Verlust von Schwannzellen entlang peripherer Nerven [Britsch,et al., 2001, Woldeyesus,et al., 1999]. Die zellulären Mechanismen, die zu diesem Schwannzellverlust führen, sind bisher nicht vollständig aufgeklärt. NRG-1 Signale beeinflussen jedoch stadienabhängig nicht nur das Migrationsverhalten sondern auch Proliferation und Überleben von Schwannzellen während der Embryogenese [Dong, et al., 1995, Morris,et al., 1999, Woldeyesus,et al., 1999, Wolpowitz, et al., 2000].

Neben dem Verlust von Schwannzellen tritt in Mausembryonen mit erbB2R (d.h. gleichzeitigem Rescue des Herzphänotyps) oder erbB3 Mutationen zeitlich verzögert eine progrediente Degeneration von sensorischen und motorischen Nerven auf [Britsch,et al., 2001, Riethmacher,et al., 1997, Woldeyesus,et al., 1999]. Die betroffenen peripheren Nerven sind u. a. durch ausgeprägte Defaszikulation und Störung ihres Verzweigungsmusters gekennzeichnet. Sie projezieren jedoch in ihre Zielstrukturen und bilden Synapsen aus. Die betroffenen Nerven exprimieren normalerweise keine ErbB2 oder ErbB3 Rezeptoren, es handelt sich also bei der neuronalen Degeneration um keine direkte Folge des [Seite 17↓]Verlustes von ErbB2/ErbB3 vermittelten, möglicherweise essentiellen (Überlebens-) signalen, sondern um einen indirekten, nicht-zellautonomen Effekt. Dies kann mit Hilfe von Chimärenanalysen belegt werden. In solchen Tieren liegt ein Mosaik aus Geweben mit homozygoter Mutation z. B. des erbB3 Gens und Wildtypgeweben vor. Werden chimäre Tiere erzeugt, mit einem hohen Anteil mutanter Zellen und einem kleinen Anteil Wildtypzellen innerhalb des peripheren Nervensystems, so läßt sich in diesen Tieren keine neuronale Degeneration beobachten [Riethmacher,et al., 1997]. Dies bedeutet, daß unter dem Einfluß von Signalen einiger Wildtypzellen der mutante Phänotyp normalisiert werden kann, also die neuronale Degeneration indirekte Folge des Verlustes von ErbB2/ErbB3 vermittelten Signalen in nicht-neuronalen Zellen ist. Aufgrund dieser Befunde lag die Hypothese nahe, daß die Neurodegeneration Folge des Verlustes von peripheren Schwannzellen ist, die sowohl erbB2 als auch erbB3 exprimieren und in den jeweiligen Mausmutanten mutiert sind. Diese Schwannzellen könnten ihrerseits trophische Signale an die begleitenden Nerven übermitteln. Zwar ist in der Literatur etabliert, daß Schwannzellen in vitro unterschiedliche neurotrophe Faktoren, wie z.B. CNTF, BDNF, GDNF, LIF, PDGF, FGFs, IGF, oder NT3 produzieren [Bunge, 1993, Jessen and Mirsky, 2002], die neuronales Survival beeinflußen, eine derartige Funktion konnte jedoch bisher in vivo nicht direkt demonstriert werden. ErbB2 und erbB3 werden außerdem von den neuronalen Targets (innervierter Muskel) der betroffenen Nerven exprimiert. Es konnte daher nicht ausgeschlossen werden, daß der Verlust dieser ErbB2/ErbB3 vermittelten Signale in den Mutanten indirekt – z.B. über eine Beeinflussung von sog. target-derived neurotrophins – zur beschriebenen Neurodegeneration beiträgt [Bibel and Barde, 2000]. Mit Hilfe unabhängiger Experimente in Sox10 mutanten Mäusen konnten wir jedoch die trophische Funktion peripherer Gliazellen für begleitende Nerven belegen. Ich werde auf diese Experimente im Kapitel 2.3.2 ausführlich eingehen.

Die Degeneration von Motoneuronen in erbB2 und erbB3 mutanten Tieren wurde von uns systematisch und quantitativ in unterschiedlichen Höhenlokalisationen des Rückenmarks untersucht. Interessanterweise ist das Ausmaß der Motoneurondegeneration abhängig von ihrem axialen Niveau: Am Tag E18,5 ist ein Großteil zervikaler und lumbaler Motoneurone untergegangen, während sich [Seite 18↓]keine signifikante Degeneration thorakaler Motoneurone beobachten läßt [Britsch,et al., 2001, Woldeyesus,et al., 1999]. Dies deutet darauf hin, daß sich Motoneuronsubpopulationen in ihrer Abhängigkeit von trophischen Signalen voneinander unterscheiden. Die molekularen Mechanismen, die dieser unterschiedlichen Sensitivität zugrunde liegen, sind bisher nicht aufgeklärt. Es ist jedoch in der Literatur gut etabliert, daß spinale Motoneurone in ihrem Verhalten außerordentlich heterogen sind und sich beispielsweise in ihren Expressionsprofilen von Transkriptionsfaktoren der Lim Familie, oder von Cadherinen unterscheiden [Jessell, 2000, Price, et al., 2002]. In vitro Untersuchungen haben außerdem gezeigt, daß Motoneuronsubpopulationen sich in ihrer Expression des Tyrosinkinaserezeptors c-met und in ihrem Überleben in Gegenwart seines spezifischen Liganden HGF/SF voneinander unterscheiden [Yamamoto, et al., 1997].

Es ist bemerkenswert, daß auch beim Menschen neurologische Erkrankungsformen, die mit einer Degeneration von Motoneuronen einhergehen, durch unterschiedliche Befallsmuster und –schwerpunkte gekennzeichnet sein können. Möglicherweise sind daher während der Embryogenese und bei Erkrankungen im adulten Organismus ähnliche molekulare Mechanismen involviert [Suter and Scherer, 2003].

2.2.2 Herzentwicklung

Komponenten des NRG-1/ErbB Signalsystems werden ebenfalls im embryonalen Herzen exprimiert. Während der Embryogenese wird NRG-1 vom Endokard, die spezifischen Rezeptoren ErbB2/ErbB4 vom unmittelbar benachbart angrenzenden Myokardgewebe exprimiert [Gassmann, et al., 1995, Lee,et al., 1995, Meyer and Birchmeier, 1994, Meyer and Birchmeier, 1995]. NRG-1 kann also als parakrines Signal agieren. Im Gegensatz zum PNS wird im embryonalen Herzen kein ErbB3 exprimiert. Die Funktion von NRG-1 Signalen während der Kardiogenese konnte durch die Analyse von Mäusen mit gezielter Mutation einzelner Elemente des NRG-1/ErbB Signalsystems aufgeklärt werden. Homozygot mutante NRG-1, erbB2 und erbB4 Mäuse zeigen übereinstimmende Entwicklungsdefekte des [Seite 19↓]Herzens, die durch das Fehlen der normalen Trabekulierung, die Ausdünnung der embryonalen Herzwände und eine starke Erweiterung der primitiven Ventrikel gekennzeichnet sind [Britsch,et al., 1998, Erickson, et al., 1997, Gassmann,et al., 1995, Kramer, et al., 1996, Lee,et al., 1995, Liu, et al., 1998, Meyer and Birchmeier, 1995]. Diese kardialen Entwicklungsdefekte sind embryonal letal: Homozygot mutante NRG-1, erbB2 und erbB4 Mäuse sterben in einem Zeitfenster um den Entwicklungstag E10,5. Die essentielle Funktion von NRG-1/ErbB Signalen für die Embryogenese des Herzens konnte in eleganten, genetischen Experimenten aus den Arbeitsgruppen von Carmen Birchmeier und von K.F. Lee erhärtet werden: Wird in Mäusen mit homozygoter Mutation des erbB2 Gens erbB2 cDNA als Transgen spezifisch im Herz reexprimiert (erbB2-/-R), so besitzen diese Tiere eine normale Kardiogenese und überleben über den 10. Entwicklungstag hinaus [Morris,et al., 1999, Woldeyesus,et al., 1999]. Allerdings sterben alle erbB2-/-R Tiere bis zur Geburt. Die zeitliche Dynamik der embryonalen Letalität entspricht dabei jener von erbB3-/- Tieren [Britsch,et al., 1998, Riethmacher,et al., 1997, Woldeyesus,et al., 1999]. Untersucht man das PNS in erbB2-/-R Embryonen, so finden sich wiederum die gleichen Entwicklungsdefekte wie in erbB3-/- Tieren, Verlust von Schwann Zellen, Degeneration von sensorischen und Motoneuronen und subtotale Hypoplasie des SNS (vergl. Kapitel 2.2.1). Diese Beobachtungen belegen damit - jenseits der Analyse herzspezifischer Funktionen von NRG-1/ErbB Signalen - genetisch, daß ErbB2 als essentieller Korezeptor von erbB4 im Herzen und von ErbB3 im PNS fungiert [Morris,et al., 1999, Woldeyesus,et al., 1999].

Zelluläre und molekulare Mechanismen der Trabekulierung des Myokards sind bisher nicht exakt bekannt. Ebenso ist unklar, über welche Mechanismen NRG-1/ErbB2/4 Signale die Trabekulierung steuern. Genetische und in vitro Untersuchungen deuten allerdings darauf hin, daß NRG-1 Signale Proliferation und Überleben von Kardiomyozyten und/oder die Koppelung von Erregung und Kontraktion im Myokard zu beeinflussen vermögen. So führt z.B. die Mutation des spannungsabhängigen Na-Kanals SCN5a in Mäusen, der eine wichtige Rolle bei der elektromechanischen Koppelung spielt, ebenfalls zu einer gestörten Trabekulierung des Myokards [Garratt,et al., 2003, Papadatos, et al., 2002].


[Seite 20↓]

Interessanterweise sind NRG-1 Signale auch für die funktionelle Integrität des adulten Herzens bedeutsam. So werden ErbB2 und ErbB4 im T-Tubulus System und NRG-1 im Endokard auch des adulten Herzens exprimiert [Ozcelik,et al., 2002]. Die konditionelle Mutation des erbB2 Gens im Herzen mit Hilfe des Cre-loxP Systems [Lewandoski, 2001] hat gezeigt, daß homozygot mutante Mäuse postnatal das klinische und histopathologische Bild einer dilatativen Kardiomyopathie entwickeln, wobei der exakte molekulare Mechanismus über den ErbB2 die Physiologie des adulten Myokards beeinflußt, bisher unklar ist [Ozcelik,et al., 2002].

2.3 Funktionen des Transkriptionsfaktors Sox10 in der Entwicklung des peripheren Nervensystems

Bisher liegen nur sehr wenige Daten über Moleküle vor, die genetisch mit Komponenten des NRG-1/ErbB Signalsystems interagieren [Buonanno and Fischbach, 2001, Citri,et al., 2003, Falls, 2003, Yarden and Sliwkowski, 2001]. In meinen eigenen Untersuchungen konnte ich mit dem Transkriptionsfaktor Sox10 ein Molekül identifizieren, das genetisch mit erbB3 interagiert und dessen Expression in NCC kontrolliert [Britsch,et al., 2001]. Sox10 wurde erstmals in einem PCR-Screen für neue SRY-like HMG-Box Gene von der Arbeitsgruppe um Michael Wegner beschrieben [Kuhlbrodt, et al., 1998]. Sox10 ist durch seine hochkonservierte SRY-Box-DNA-Bindungsdomäne und seine Transaktivierungsdomäne charakterisiert (Abb.:2.3-1). Gegenwärtig sind in Säugern mehr als 20 Mitglieder innerhalb der Sox Genfamilie bekannt, die in unterschiedlichen Gruppen gegliedert werden und je nach Mitglied transkriptionelle Repressoren oder Aktivatoren darstellen. Sox10 ist ein transkriptioneller Aktivator der Gruppe E [Kamachi, et al., 2000, Wegner, 1999]. Transkriptionsfaktoren der Sox Familie üben vielfältige kritische Funktionen während der Embryogenese aus, so z. B. bei der Chondrogenese (Sox6, 9), der Geschlechtsdeterminierung (Sox9), der Neurogenese (Sox2, 3), oder der Lymphopoese (Sox4) [Pevny and Lovell-Badge, 1997, Wegner, 1999]. Charakteristischerweise sind Sox Proteine multifunktional, d.h. sie können [Seite 21↓]sequentiell unterschiedliche entwicklungsbiologische Funktionen ausüben [Akiyama, et al., 2002, Wilson and Koopman, 2002].

Sox10 wird von undifferenzierten NCC unmittelbar nach ihrer Bildung exprimiert. Seine Expression wird in NCC, die sich zu peripheren Gliazellen oder Melanozyten differenzieren aufrechterhalten [Britsch,et al., 2001, Herbarth, et al., 1998, Kuhlbrodt,et al., 1998, Pusch, et al., 1998].

Abbildung 2.3-1: A, schematische Darstellung des Wildtyp Sox10 Proteins mit HMG-Box DNA-Bindungsdomäne (rot) und Transaktivierungsdomäne (TAD, blau) und des vom Dom Allel synthetisierten trunkierten Proteins. B, korrespondierende Aminosäuresequenzen beider Proteine. Die HMG-Box kodierenden Sequenzen wurden hellrot unterlegt. Beachte den Frameshift an Position 194 und das resultierende veränderte Leseraster mit vorzeitiger Termination an Position 292 (grün unterlegt) beim Dom Allel.

1984 wurde in den Jackson Laboratories erstmals das Auftreten einer Spontanmutation in Mäusen beobachtet, die in heterozygotem Zustand durch [Seite 22↓]einen weißen Bauchfleck und ein wechselnd stark ausgeprägtes Megakolon charakterisiert ist. Diese neue Mutation wurde daher Dom (für dominantes Megakolon) bezeichnet [Lane and Liu, 1984]. Postnatal wurden keine Mäuse mit homozygoter Mutation beobachtet, woraus geschlossen werden konnte, daß das Dom Allel in homozygotem Zustand letal sein muß.

Die Arbeitsgruppen von Bill Pavan am NIH und von Michael Wegner, Universität Erlangen, konnten 1998 unabhängig voneinander zeigen, daß dem Dom Allel in Mäusen eine Frameshift-Mutation im sox10 Gen zugrundeliegt [Herbarth,et al., 1998, Southard-Smith, et al., 1998]. Als Folge dieser Mutation werden zwar stabile Transkripte gebildet, sie kodieren jedoch für ein funktionsloses, trunkiertes Protein mit deletierter Transaktivierungsdomäne (Abb.: 2.3-1).

2.3.1 ErbB3-abhängige entwicklungsbiologische Funktionen von Sox10

Vergleicht man systematisch die Expression von erbB3 und sox10 während der Embryonalentwicklung von Mäusen, so wird deutlich, daß beide Gene in nahezu identischem Muster in sich entwickelnden NCC exprimiert sind. Beide Gene werden in NCC erstmals unmittelbar nach ihrer Bildung durch das dorsale Neuralrohr exprimiert. Expression ist außerdem in allen primären NCC-Derivaten des PNS nachweisbar: Sox10 und erbB3 sind am Tag E10,5 koexprimiert in den Anlagen der Spinalganglien, der Anlage des SNS, in vagalen NCC, die in das primitive Darmrohr einwandern und die Anlage des ENS bilden, in den Anlagen kranialer Ganglien, wie z. B. dem Trigeminusganglion, sowie in Schwannzellvorläufern entlang auswachsender Spinalnerven [Britsch,et al., 2001]. Beide Gene besitzen darüber hinaus nicht-überlappende, eigenständige Expressionsdomänen, so ist erbB3, nicht aber sox10 am Tag E10,5 im Myotom, sox10 jedoch nicht erbB3 in Melanozytenvorläufern exprimiert. Aufgrund dieser Befunde haben wir die Hypothese formuliert, daß beide Gene genetisch miteinander interagieren. Um dies in vivo zu analysieren, haben wir die Expression beider Gene in Mäusen mit homozygoter Mutation des erbB3 Gens [Riethmacher,et al., 1997] und mit homozygotem Dom Allel (s. o.) bestimmt. Die Expression von [Seite 23↓]sox10 ist in homozygot mutanten erbB3 Mäusen unverändert in NCC nachweisbar. Demgegenüber ist am Tag E10,5 in homozygot sox10 mutanten Mäusen keine erbB3 Expression in NCC nachweisbar. In früheren Entwicklungsstadien konnten wir darüber hinaus beobachten, daß erbB3 in neu gebildeten NCC exprimiert wird. Die Expression wird jedoch abgeschaltet, unmittelbar nachdem diese Zellen begonnen haben von ihrem Ursprungsort, dem dorsalen Neuralrohr, zu emigrieren. ErbB3 Expression kann daher zwar unabhängig von Sox10 in NCC initiiert werden, die Aufrechterhaltung der Expression ist jedoch abhängig von Sox10 [Britsch,et al., 2001]. Unsere in vivo Beobachtungen konnten in Kooperation mit der Gruppe von Michael Wegner in vitro bestätigt werden: Transfektion mit Sox10-Wildtyp cDNA nicht aber mit Sox10Dom oder Sox11 cDNA führt zur Hochregulation der endogenen erbB3 Expression in N2A Zellen [Britsch,et al., 2001]. Gegenwärtig ist unklar, ob Sox10 und erbB3 direkt oder indirekt miteinander interagieren. Die sehr rasche Induktion in vitro legt eine direkte Interaktion nahe. In Reporter Assays konnte allerdings bisher innerhalb des genomischen Locus von erbB3 kein sox10 responsives Element nachgewiesen werden (Wegner, Peirano und Riethmacher, unpublizierte Daten; vergl. Britsch et al., 2001). Dies kann verschiedene Gründe haben. Zum einen können Promotor- und Enhancerelemente von Genen außerordentlich weit vom eigentlichen Genlocus entfernt liegen. Sie sind in solchen Fällen in einfachen Reporter Assays nur sehr schwer nachweisbar. Zum anderen wurde mehrfach gezeigt, daß Interaktionen von Sox10 mit Zielgenen komplexen Determinanten unterliegt. So variieren die Sequenzen identifizierter DNA-Bindungsregionen von Sox10 untereinander erheblich. Dies deutet darauf hin, daß flankierende Regionen, Protein-Protein Interaktionen, oder die Kooperation mit anderen DNA-Bindungspartnern die Bindungsspezifität und –stabilität beeinflußen [Kamachi,et al., 2000, Mollaaghababa and Pavan, 2003]. Im Falle der Bindung von Sox10 an sein direktes Target-Gen P0, das für ein Myelin-assoziiertes Glykoprotein kodiert, wurde nachgewiesen, daß flankierende DNA-Sequenzen und die Bindung von Sox10 als Dimer wichtig sind für die Spezifität der Target-Gen Interaktion [Peirano, et al., 2000, Peirano and Wegner, 2000]. Interessanterweise wird auch die Entwicklung des ENS von Sox10 durch komplexe Interaktion mit dem Target-Gen c-ret gesteuert. Der Tryrosinkinaserezeptor c-ret vermittelt essentielle [Seite 24↓]Überlebenssignale an NCC, die das primitive Darmrohr besiedeln und sich zu enterischen Nervenzellen differenzieren. Sowohl Mäuse mit homozygoter c-ret als auch sox10 Mutation entwickeln ein Megakolon als Folge untergegangener enterischer Nervenzellen [Durbec, et al., 1996, Herbarth,et al., 1998, Kapur, 1999, Schuchardt, et al., 1994, Southard-Smith,et al., 1998]. Sox10 kontrolliert die Expression von c-ret allerdings nicht alleine sondern muß direkt mit einem weiteren Transkriptionsfaktor, Pax3, interagieren, der in unmittelbarer Nachbarschaft von sox10 an ein c-ret Enhancerelement bindet [Lang, et al., 2000, Lang and Epstein, 2003].

Da Sox10 die Expression von erbB3 in NCC kontrolliert, haben wir erwartet, in beiden, homozygot sox10 und erbB3 mutanten Tieren ähnliche, bzw. identische Phänotypen zu beobachten. In der Tat finden wir in beiden Mutanten identische Defekte in der Entwicklung von kranialen Ganglien [Britsch,et al., 2001, Britsch,et al., 1998, Erickson,et al., 1997, Riethmacher,et al., 1997], beide Mutanten weisen eine hochgradige Hypoplasie der Anlage des SNS auf, und in beiden ist die Zahl von Schwannzellvorläufern entlang auswachsender Spinalnerven reduziert [Britsch,et al., 2001]. Der Schweregrad der Störungen in der Migration von NCC ist dabei bemerkenswerterweise in sox10 Mutanten etwas geringer als in erbB3 Mutanten. Dies wird verständlich, aufgrund der passageren Expression von erbB3 in sox10 Mutanten. Betrachtet man also lediglich diese erbB3-abhängige entwicklungsbiologische Funktion, so stellt die homozygote Mutation des sox10 Gens in der Maus in gewisser Weise eine hypomorphe Rekapitulation des Phänotyps erbB3 mutanter Mäuse dar [Britsch,et al., 2001].

Neben den beschriebenen, ErbB3-abhängigen entwicklungsbiologischen Funktionen besitzt Sox10 weitere, ErbB3-unabhängige entwicklungsbiologische Funktionen. So ist Sox10 unabhängig von ErbB3 essentiell für die normale Entwicklung des ENS (s.o.) und die Entwicklung von Melanozyten [Britsch,et al., 2001, Mollaaghababa and Pavan, 2003, Wegner, 1999]. In unseren eigenen Untersuchungen konnten wir eine neue, ErbB3-unabhängige entwicklungsbiologische Funktion von Sox10 identifizieren: Sox10 besitzt eine Schlüsselfunktion bei der Etablierung der peripheren Gliazell Lineage.


[Seite 25↓]

2.3.2 Sox10 als Schlüsselmolekül in der Entwicklung peripherer Gliazellen

Im Kapitel 2.2.1 wurde dargestellt, daß NRG-1/ErbB2/3 Signale essentiell sind für die Schwannzellentwicklung: Anhand der Expression von charakteristischen Markergenen wie B-FABP [Kurtz, et al., 1994] oder Notch-1 [Jessen and Mirsky, 2002, Morris,et al., 1999, Weinmaster, et al., 1991] sind differenzierende Schwannzellen entlang von Spinalnerven und differenzierende Satellitenzellen im Bereich von Spinalganglien am Tag E11,5 der Embryogenese in NRG-1 Signalmutanten nachweisbar. Periphere Gliazelldifferenzierung per se findet also in diesen Mutanten statt. NRG-1 Signale sind jedoch essentiell für die Migration, das Überleben und die Proliferation von Schwannzellen und ihren Vorläufern. Als Folge kommt es in den Mutanten zum progredienten Verlust von Schwannzellen im gesamten PNS [Britsch,et al., 2001, Meyer and Birchmeier, 1995, Riethmacher,et al., 1997, Woldeyesus,et al., 1999, Wolpowitz,et al., 2000]. Sox10 kontrolliert die Expression von erbB3 auch in jenen NCC Populationen, aus denen sich periphere Gliazellen differenzieren. Wir haben daher zunächst erwartet, in sox10 Mutanten ebenfalls eine Rekapitulation des peripheren Glia Phänotyps von NRG–1 Signalmutanten zu beobachten. Überraschenderweise läßt sich jedoch in sox10 Mutanten keinerlei Differenzierung von peripherer Glia aus undifferenzierten NCC beobachten [Britsch,et al., 2001]. Sox10 exprimierende NCC sind jedoch im Bereich von Spinalganglien, einem Ort der Gliadifferenzierung, nachweisbar. In Koexpressionsanalysen konnten wir demonstrieren, daß diese sox10 exprimierenden NCC in homozygoten sox10 Mutanten keine alternativen Zellschicksale annehmen und als undifferenzierte, stammzellartige NCC verharren. Während der weiteren Entwicklung werden sie durch Apoptose eliminiert. Unsere Befunde werden bestätigt durch in vitro Untersuchungen an NCC, die aus homozygot mutanten Sox10 Embryonen etabliert wurden: In Zellkultur ist Sox10 ebenfalls essentiell für die Gliadifferenzierung aus undifferenzierten NCC [Paratore, et al., 2001].

Die molekularen Mechanismen, welche die Etablierung und Differenzierung der peripheren Gliazell Lineage aus undifferenzierten NCC steuern, waren bisher nur anfänglich verstanden. In unseren Untersuchungen konnten wir mit Sox10 [Seite 26↓]erstmals in vivo ein Schlüsselmolekül in der Steuerung dieser Prozesse identifizieren. In sox10 Mutanten läßt sich in NCC im Bereich von Spinalganglien keine Expression von Notch-1 oder des intrazellulären Effektors von Notch-1 Signalen, Hes-5, nachweisen [Britsch,et al., 2001]. In der Literatur ist vielfach etabliert, daß Delta/Notch Signale die Determinierung alternativer Zellschicksale im sich entwickelnden Nervensystem steuern [Artavanis-Tsakonas,et al., 1999, Baker, 2000, Wang and Barres, 2000]. Interessanterweise konnte in vitro gezeigt werden, daß die transiente Aktivierung des Delta/Notch Signalweges in undifferenzierten NCC zu irreversibler glialer Differenzierung zu Ungunsten neuronaler Differenzierung führt [Morrison, et al., 2000, Wakamatsu, et al., 2000]. Es dürfte daher interessant sein, in zukünftigen Untersuchungen zu analysieren, ob Sox10 durch Interaktion mit Komponenten des Delta/Notch Signalweges periphere Gliogenese steuert. Aktuelle Untersuchungen, bei denen Sox10 in vitro überexprimiert wurde deuten darauf hin, daß Sox10 mehrere, unabhängige Funktionen während der Entwicklung von NCC ausübt. So scheint Sox10 (i) in vitro ebenfalls die Kapazität undifferenzierter NCC zu glialer und neuronaler Differenzierung in Gegenwart induzierender Faktoren aufrechtzuerhalten und (ii) den TGF-β induzierten Proliferationsstop von NCC zu hemmen, damit also den Stammzellcharakter von NCC zu erhalten [Kim, et al., 2003].

Auf weitere, unabhängige Funktionen von Sox10 während der späten Differenzierung von Schwannzellen deuten Untersuchungen hin, wonach Myelinogenese-assoziierte Gene wie P0, oder Differenzierungsgene wie Connexin 32 direkte Targets von Sox10 sind [Bondurand, et al., 2001, Peirano,et al., 2000]. Interessanterweise werden auch beim Menschen Sox10 Mutationen beobachtet, die mit Myelinisierungsstörungen und peripheren Neuropathien einhergehen, welche Ähnlichkeit mit einem Charcot-Marie-Tooth Syndrom Typ I aufweisen, einem Krankheitssyndrom das typischerweise mit Schwannzelldefekten einhergeht [Bondurand, et al., 1999, Inoue, et al., 1999, Kuhlbrodt, et al., 1998, Pingault, et al., 1998, Pingault, et al., 2001, Pingault, et al., 2000, Touraine, et al., 2000].

Wenngleich Sox10 und ErbB2/3 über unterschiedliche molekulare Mechanismen die Entwicklung von Schwannzellen steuern, führt die Mutation beider Gene zu [Seite 27↓]identischen entwicklungsbiologischen Konsequenzen, nämlich dem vollständigen Verlust von Schwannzellen in der späteren Embryogenese. Es war daher von großem Interesse, sox10 Mutanten auf das Vorliegen einer peripheren Neuropathie, wie wir sie in erbB2/erbB3 Mutanten beobachtet haben zu analysieren (vergl. Kapitel 2.2.1). Der Vergleich beider, erbB3 und sox10, Mutanten hat gezeigt, daß in beiden Tieren eine motorische Neuropathie auftritt mit identischem zeitlichem Verlauf und identischer axialer Verteilung betroffener Neuronenpopulationen [Britsch,et al., 2001]. Sox10 wird im Gegensatz zu Komponenten des NRG-1 Signalsystems innerhalb dieses biologischen Systems ausschließlich in Gliazellen exprimiert. Unsere Beobachtungen konnten damit nachweisen, daß die Degeneration von Motoneuronen direkte Folge eines Verlustes von Schwannzellen und damit möglicherweise von Schwannzell-abkünftigen Signalen ist. Eine der interessantesten Aufgaben auf diesem Feld wird zukünftig sein, diese Signale molekular zu identifizieren.

Schwannzellentwicklung verläuft in Mausmutanten mit spezifischer Deletion der Type I und II Isoformen von NRG-1 [Kramer,et al., 1996] im Gegensatz zu Mäusen mit einer Nullmutation aller NRG-1 Isoformen [Meyer and Birchmeier, 1995], oder Mäusen mit spezifischer Mutation der Type III Isoform [Wolpowitz,et al., 2000] normal. Type III NRG-1 scheint daher funktionell entscheidend für die Übertragung von NRG-1 Signalen in Schwannzellen zu sein [Meyer,et al., 1997]. Type III NRG-1 wird als transmembranärer Ligand an der Axonoberfläche sensorischer und motorischer Neurone des PNS exprimiert [Bermingham-McDonogh, et al., 1997, Yang, et al., 1998]. Interessanterweise wurde In vitro beobachtet, daß diese Isoform als bi–direktionales Signalmolekül agieren kann: So kann Type III NRG-1 als klassischer ErbB2/ErB3 Rezeptor Ligand Signale auf eine Zielzelle übertragen (forward signalling). Rezeptor-Liganden Interaktion kann jedoch außerdem zur proteolytischen Abspaltung des zytoplasmatischen Teils von Type III NRG-1 und dessen Translokation in den Nukleus führen(back signalling), wo er die Expression pro-apoptotischer Gene reprimiert [Bao,et al., 2003]. Diese Befunde deuten auf ein Modell hin, bei dem (i) axonale Type III NRG-1 Signale Entwicklung und Survival von begleitenden Schwannzellen steuern, die ErbB2/ErbB3 exprimieren und (ii) Rezeptor-Liganden Interaktion gleichzeitig ein kritisches Survival Signal in Neuronen induziert, das retrograd über den Liganden [Seite 28↓](Type III NRG-1) vermittelt wird [Bao,et al., 2003]. NRG-1/ErbB2/ErbB3 Signale wären daher kritisch, sowohl für Entwicklung und Überleben von Schwannzellen, als auch für das Überleben begleitender Nerven.

2.4 Neuregulin-1/ErbB Signalmutanten als genetische Werkzeuge

Mäuse mit Nullmutationen bestimmter Gene (knockout Mäuse oder natürliche Mausmutationen) können nicht nur zur Analyse spezifischer Funktionen des inaktivierten Gens eingesetzt werden, sie können darüber hinaus als genetische Werkzeuge zur Untersuchung unabhängiger, oder assoziierter biologischer Prozesse verwendet werden. Im Vorausgegangenen wurde dies am Beispiel der Entwicklung peripherer Gliazellen dargestellt: NRG-1/ErbB2/3 Signale und der Transkriptionsfaktor Sox10 steuern unterschiedliche Ereignisse in der Entwicklung peripherer Glia und sind beide essentiell für die Bildung von Schwannzellen während der Embryogenese. Beide Mutationen gehen mit dem Verlust von Schwannzellen im Laufe der Embryonalentwicklung einher und können daher als Modelle, oder Werkzeuge eingesetzt werden, um Embryogenese in Abwesenheit von peripherer Glia zu untersuchen. Mit Hilfe dieser Modelle konnten wir erstmals in vivo demonstrieren, daß Schwannzellen bzw. von diesen generierte Signale essentiell sind für das Überleben begleitender Neurone [Britsch,et al., 2001, Woldeyesus,et al., 1999].

In einer Kooperation mit dem Labor von David Anderson (Caltech, Pasadena) wurde das Fehlen von Schwannzellen in erbB3-/- Mäusen außerdem ausgenutzt, um den Einfluß peripherer Nerven auf Entwicklung und Musterbildung begleitender Blutgefäße zu untersuchen [Mukouyama, et al., 2002]. Sensorische Nerven und Blutgefäße der Haut bilden im Laufe der Embryogenese jeweils komplexe Verzweigungsmuster aus. Bisher war unklar ob die Musterbildung in beiden Systemen durch intrinsische, voneinander unabhängige Faktoren, durch wechselseitige Interaktionen, oder durch übergeordnete Umgebungssignale gesteuert wird [Shima and Mailhos, 2000]. Arterielle Gefäße, nicht jedoch venöse [Seite 29↓]Gefäße folgen in ihrem eigenen Verzweigungsmuster mit beginnender Expression arterieller Differenzierungsmarker (ephrinB2, NP1, Connexin 40) bevorzugt dem Verzweigungsmuster peripherer sensorischer Nerven. In Mäusen mit gleichzeitiger homozygoter Mutation der bHLH Transkriptionsfaktoren Neurogenin1 und Neurogenin2 kommt es zum fast vollständigen Verlust von Spinalganglien und peripheren sensorischen Nerven [Ma, et al., 1999]. In solchen Mäusen, d.h. in Abwesenheit peripherer sensorischer Nerven ist die arterielle Differenzierung und Gefäßmusterbildung gestört und es findet kein Rearrangement des primitiven embryonalen Gefäßmusters statt. In Mäusen mit homozygoter Mutation des axonalen Wegfindungsmoleküls Semaphorin3A [Kolodkin, 1998] ist das Projektionssmuster peripherer sensorischer Nerven gestört [Taniguchi, et al., 1997]. Interessanterweise folgen in diesen Mäusen differenzierende arterielle Blutgefäße dem gestörten Verzweigungsmuster sensorischer Nerven – hieraus konnte geschlossen werden, daß arterielle Gefäßmusterbildung unter dem Einfluß von Signalen begleitender Nerven erfolgt. Wird schließlich Gefäßmusterbildung in erbB3-/- Mäusen, d.h. in Anwesenheit peripherer sensorischer Nerven aber in Abwesenheit von Schwann Zellen [Britsch,et al., 2001, Riethmacher,et al., 1997, Woldeyesus,et al., 1999] untersucht, so zeigen diese ebenfalls eine gestörte arterielle Differenzierung und Gefäßmusterbildung, woraus geschlossen werden kann, daß Schwann Zellen essentiell sind für die Induktion ortstypischer Musterbildung und arterieller Differenzierung von Blutgefäßen durch begleitende sensorische Nerven [Mukouyama,et al., 2002].


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
21.06.2005