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II.  Die Rolle von CD152 bei der Abschaltung von Immunantworten

II.1. CD152 inhibiert frühe Mechanismen der primären T-Zell-aktivierung

Die Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten unterliegt einer strikten Kontrolle, um Toleranz gegen Selbstantigene, Reaktivität gegen Fremdantigene und Effektivität der Reaktion gegen Pathogene zu gewährleisten. Die Kontrolle wird im wesentlichen durch Antigen-präsentierende Zellen und andere Lymphozyten ausgeübt, durch MHC-Restriktion, Kostimulation und Zytokine. CD152 (CTLA-4) ist das bedeutendste bekannte negativ-kostimulatorische Molekül für T-Lymphozyten.

Abb. II.1.1: CD152-Kreuzvernetzung verhindert die IL-2 Transkription. Es wurden transgene Mäuse verwendet, die den IL-2 Promotor vor einem Luziferasegen tragen. Nach der T-Zellaktivierung von CD4+ T-Zellen in vitro wurde die Luziferaseaktivität gemessen, die der Transkriptionsaktivität des IL-2 Promotors entspricht.

Den Mechanismus der durch CD152 vermittelten Inhibition der T-Zellaktivierung haben wir zunächst in vitro untersucht. Wir konnten zeigen, dass die Kreuzvernetzung von CD152 durch Antikörper die Akkumulation von IL-2 mRNA in den aktivierten T-Zellen verhindert. Dieser Effekt beruht nicht auf einer Destabilisierung der IL-2 mRNA sondern auf einer Inhibition der Initiierung der Transkription des IL-2 Gens (Abb. II.1.1). Der IL-2 Promoter hat 5 Bindungsstellen für [Seite 15↓]Transkriptionsfaktoren der "Nuclear Factors of Activation of T cells" -Familie (NF‑ATp, NF-ATc, NF-AT3 und NF-AT4). Alle Bindungsstellen müssen besetzt sein, damit IL-2 Transkription initiiert wird. Da wir zeigen konnten, dass CD152 Kreuzvernetzung die Translokation von NF-AT in den Zellkern verhindert, könnte die inhibierende Wirkung von CD152 auf die IL-2 Transkription zumindest teilweise durch diese Inhibition der NF-AT Translokation erklärt werden (Brunner et al., 1999).

Die Proliferationsbegrenzung der T-Zellen durch CD152 war ursprünglich allein auf die Inhibition der Expression des autologen, Proliferation-induzierenden Zytokins IL-2 zurückgeführt worden. Wir konnten jedoch zeigen, dass CD152 auch die Expression der Zellzyklusregulatoren Zyklin D3, cdk4 und cdk6 hemmt, wobei zumindest die Expression von CDK6 unabhängig von IL-2 ist. Die IL-2 unabhängige Inhibition der T-Zellproliferation durch CD152 konnten wir dadurch bestätigen, dass sie sich durch Zugabe von IL-2 nicht aufheben ließ. CD152 inhibiert also die aktivierungsinduzierte T-Zellproliferation auf zwei Ebenen: Durch IL-2 Transkriptionsinitiierung und durch die Expression von G1-Kinasen (Abb. II.1.2).

Abb. II.1.2: CD152 inhibiert die Proliferation der T-Zelle auf zwei Ebenen.
Bei einer Stimulation der T-Zelle mit αCD3, αCD28 und αCD152, inhibiert CD152 a) NF-AT Akkumulation im Nukleus und b) die Expression von G1-Kinasen, die für das Fortschreiten des Zellzyklus notwendig sind. Die CD28-induzierte mRNA-Stabilisierung ist durch ein CD152-Signal nicht beeinflusst.


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II.2.  Die heterogene Expression von membranständigem CD152 auf aktivierten T-Zellen führt zu einer Diversifikation der klonalen T-Zellproliferation

Auf T-Lymphozyten ist membranständiges CD152 durch konventionelle Immunfluoreszenz selbst 48 Stunden nach Beginn der T-Zellaktivierung kaum nachweisbar (Krummel et al., 1996, siehe Abb. II.2.1 A). Wir wissen jedoch, dass CD152, obwohl es zu diesem Zeitpunkt kaum nachweisbar ist, die Proliferation der T‑Zellen bereits inhibieren kann. Wir haben eine hochsensitive Färbemethode für den immunfluoreszenten Nachweis von Oberflächenproteinen entwickelt, den magnetofluoreszenten Liposomen (Scheffold et al., 1996). Diese Technologie erlaubt den Nachweis von weniger als 100 Molekülen einer Art pro Zelle (Scheffold et al., 1999) und bietet damit gegenüber konventioneller Immunfluoreszenz eine mehr als 100fach empfindlichere Nachweisgrenze. Liposomen-Färbungen von aktivierten T‑Lymphozyten auf CD152 (Abb. II.2.1 B) zeigen, dass CD152 von diskreten Subpopulationen exprimiert wird. Wir sind erstmals in der Lage, individuelle CD152-exprimierende Zellen auch zytometrisch darzustellen und für funktionelle Untersuchungen zu isolieren.

Milzzellen wurden für 48 Stunden mit 1μg/ml ConcavalinA stimuliert (Abb. II.2.1). Es sind die B220- T-Zellen dargestellt, die sich hauptsächlich aus CD4+ und CD8+ T‑Zellen zusammensetzen. A) Diese T-Zellen wurden mit αCD152 Dig und einem αDig FITC gekoppelten Antikörper markiert und zytometrisch analysiert. Es waren 2% CD152+ Zellen erfasst worden (weiße Kurve). Es ist nicht erkennbar, ob die gesamte Population angefärbt ist. B) Die T-Zellen wurden mit αCD152 Dig und αDIG besetzten mangnetofluoreszenten Liposomen gefärbt. Es ist eine CD152+ Zellpopulation erkennbar, die 15% der T-Zellen ausmacht. C) Die Färbung in B) wurde durch unmarkierten αCD152 Antikörper im Überschuss geblockt.


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Abb. II.2.1: Zytometrische Darstellung von individuellen T-Zellen mit membrangebundenem CD152 (siehe Text).

Naive OVA-TZRtg T-Zellen (CD62L+, CD4+) wurden mit magnetischer Zellsortierung (MACS) isoliert (Abb. II.2.2), für 48 h mit bestrahlten Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) und OVA323-339 aktiviert und mit unserer sensitiven Färbung für CD152 markiert (oben), isoliert und in getrennten Fraktionen mit APZ und Antigen restimuliert (unten). Zwei Tage nach Restimulation wurde die Proliferation der Fraktionen anhand der CFSE-Färbung detektiert. CD152+ T-Zellen (rechts unten) waren im Gegensatz zu CD152- T-Zellen (links unten) refraktär gegenüber einer Antigen-spezifischen Restimulation.

Die unterschiedliche Expression von membranständigem CD152 auf aktivierten T‑Zellen lässt vermuten, dass CD152+ und CD152- T-Zellen verschiedene funktionelle Bestimmungen auszuführen haben. Dies könnte besonders wichtig für die adaptive Immunantwort sein, denn die Generierung von T-Zellen mit verschiedenen Effektorfunktionen ist eine grundlegende Eigenschaft der adaptiven Immunantwort. Isolierte, aktivierte CD152+ T-Zellen waren im Gegensatz zu aktivierten CD152- T-Zellen bei Restimulation in ihrer Proliferation inhibiert. Diese heterogene Expression von CD152 auf aktivierten T-Zellen gewährleistet die Mannigfaltigkeit einer klonalen T-Zellantwort.

Unsere Daten zeigen auch, dass CD152 tatsächlich in der Lage ist, bereits aktivierte, individuelle T-Zellen zu inhibieren. CD152 könnte demnach sehr wohl auch etablierte, „laufende“ Immunantworten, wie sie bei chronischen Entzündungen vorliegen, regulieren.


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Abb. II.2.2:Aktivierte, individuelle CD152+ T-Zellen sind refraktär gegenüber einer Antigen-spezifischen Restimulation (siehe Text).


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II.3.  Resistenz gegen Zelltod in T Helfer (Th)1- und Th2- Effektorzellen wird durch CD152 vermittelt

Eine Kinetik der Expression von Zellmembran-gebundenem CD152 auf Th1- und Th2-Zellen zeigte, dass Th2-Zellen nach Restimulation wesentlich häufiger CD152 exprimieren als Th1-Zellen, vor allem nach Restimulation (Abb. II.3.1). Die differentielle CD152-Expression auf Th1- und Th2-Zellen lässt auf eine wichtige Rolle von CD152 bei Th2-Zellen schließen.

Abb. II.3.1: Th2-Zellen exprimieren nach Restimulation häufiger CD152 auf ihrer Oberfläche als Th1-Zellen. Die Zellen wurden unter Th1-, bzw. Th2-Bedingungen kultiviert und die CD152-exprimierenden T-Zellen mit Hilfe unserer sensitiven Färbemethode identifiziert. Die Häufigkeit CD152 exprimierender T-Zellen ist in einer primären (links) und sekundären (rechts) Stimulation über der Zeit angegeben.

Da ein wichtiger Unterschied in der Regulation der Th1-Th2 Hoemeostase der Aktivierungs-induzierte Zelltod ist, wurde die Rolle von CD152 beim Aktivierungs-induzierten Zelltod untersucht. Es ist bereits bekannt, dass Th1-Zellen empfänglich für Aktivierungs-induzierten Zelltod sind, wohingegen Th2-Zellen resistent sind. Wir konnten zeigen, dass eine CD152-Blockade zu verstärkter Apoptose in Th‑Zellen führt. Die ermittelten Prozentzahlen der Zellen, die nun für Zelltod empfänglich sind, korrelieren mit den ermittelten Prozentzahlen der CD152-Oberflächen-exprimierenden T-Zellen.


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Diese Daten konnten wir bestätigen, indem wir aktiv ein CD152-Signal in Th2-Zellen induziert haben (Abb. II.3.2.). Die Überlebensrate der Zellen wurde dadurch um 25% gegenüber Th2-Zellen ohne initiiertes CD152-Signal gesteigert. Wir konnten zeigen, dass der Effekt nicht indirekt war: 1. Eine veränderte IL-2 Produktion durch CD152-Kreuzvernetzung konnte als Grund für die Steigerung der Überlebensrate der Th2-Zelle ausgeschlossen werden. 2. Da ein Zellzyklusarrest in der G1-Phase zu Resistenz gegen Apoptose führen kann und CD152 diesen G1-Arrest vermitteln kann, wurde auch dieser indirekte Effekt zur Resistenzinduktion von Th2-Zellen mit Hilfe der Zellzyklusinhibitoren db cAMP und Mimosin ausgeschlossen.

Abb. II.3.2: Kreuzvernetzung von CD152 während einer Stimulation von polarisierten Th2-Zellen mit CD3 und CD28 führt zu Resistenz gegen Zelltod (Apoptose). Am Tag 2 nach Restimulation von Th2-Zellen mit αCD3 und αCD28 wurden die T-Zellen unter CD152-Kreuzvernetzung oder wie angegeben stimuliert. Apoptotische Zellen wurden durch PI und Annexin-V Färbung identifiziert. Die Spezifität der Ca2+-abhängigen Annexin-V Färbung wurde durch EGTA Zugabe kontrolliert. Lebende Zellen sind in Prozent angegeben. Die CD152-vermittelte Resistenz gegen Apoptose ist blockierbar durch die PI3´Kinase-Inhibitoren Wortmannin und Ly294002.


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Eine Blockade der Fas/FasL-induzierten Apoptose in Th1- und Th2-Zellen verhinderte den gesamten, durch CD152-Blockade-induzierten Zelltod. Die Abhängigkeit vom Fas/FasL System der CD152-induzierten Resistenz der Th2‑Zellen gegen Apoptose konnte durch eine reduzierte FasL-Expression erklärt werden (Abb. II.3.3).

Abb. II.3.3: CD152-Blockade verstärkt die Expression von FasL in Th2-Zellen. Polarisierte Th2-Zellen wurden Antigen-spezifisch mit (untere Quadranten), bzw. ohne CD152 Blockade restimuliert (obere Quadranten). Anschließend wurde FasL auf Th-Zellen zytometrisch detektiert.


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II.4.  Ausblick: Experimentelle Inaktivierung von CD152 zu beliebigen Zeitpunkten chronischer Entzündungen

Durch genetische Inaktivierung könnte CD152 gezielt in Zellen ausgeschaltet werden, die definierte Stadien der T-Zellontogenese repräsentieren. Um CD152 zu beliebigen Zeitpunkten in beliebigen Zelltypen genetisch inaktivieren zu können, wollen wir eine konditionelle CD152-Mutation in der Maus herstellen. So sollte die Rolle von CD152 in wiederholten, polarisierten und/oder chronischen T‑Zellreaktionen klar werden. Die genetische Inaktivierung hat gegenüber der serologischen Inaktivierung durch Antikörper oder lösliche Liganden wesentliche Vorteile. Zum einen wird CD152 als Membranbestandteil von sekretorischen Vesikeln in den Aktivierungskomplex auf der Grenzfläche zwischen Antigen-präsentierende Zelle und T-Zelle gebracht (Linsley et al., 1996; Alegre et al., 1996; Shiratori et al., 1997), so dass nicht klar ist, inwieweit αCD152 Antikörper überhaupt CD152 effizient blockieren können. Zum anderen ist nicht klar, ob die Bindung von Liganden an CD152 aktivierend, blockierend oder beides ist, abhängig von der jeweiligen Situation (Krummel et al., 1996; Walunas et al., 1996; Wu et al., 1997; Zheng et al., 1998; Horspool et al., 1998). Zum dritten ist es nicht möglich, in vivo nur bestimmte Zellen serologisch zu blockieren, während eine genetische Inaktivierung zelltypspezifisch sein kann und auf ein bestimmtes Differenzierungsstadium dieser Zelle begrenzt sein kann (Lakso et al., 1992; Rickert et al., 1997; Jacob und Baltimore, 1999).

Um CD152 konditionell genetisch ausschalten zu können, haben wir zunächst loxP Signale in das murine CD152 Gen eingeführt (II.4.1). Gleichzeitig benötigen wir Mäuse, die transgen die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle induzierbarer oder Zelltyp-spezifischer Promotoren exprimieren können. Wir planen Mäuse zu verwenden wie die Tetrazyklin- und IFN-γ-abhängigen Cre-Mäuse und die GranzymB-Promotor Cre-Mäuse (Jacob und Baltimore, 1999). Aktivierte T-Zellen mit definierten Phänotypen würden wir magnetisch isolieren, ihre CD152-Expression zytometrisch analysieren und ihren Genotyp mit quantitativer, “real time" PCR bestimmen.


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Abb.II.4.1: Eingeführte loxP- und BamH1-Signale in das CD152-Gen.
Die 3´-eingeführte loxP Sequenz in das CD152-Gen hat ein BamH1-Signal integriert. Dadurch entsteht bei einer Restriktionsanalyse (A) des mutagenisierten CD152 Gens mit BamH1 ein um 500bp verkürztes Fragment verglichen mit dem ursprünglichen Gen (WT), wenn man im folgenden Southernblot die Sonde im Exon 4 hybridisiert (B). So zeigen ES Zellen, bei denen durch homologe Rekombination loxP Signale in ein Allel von CD152 eingeführt wurden, bei einer Restriktionsanalyse mit BamH1 und folgender Southernblotanalyse mit Hybridisierungssonde im Exon 4 zwei Fragmente (B; Klone B7, B8 und H8) (Dreieck: loxP Signal; B: BamH1; grünes Viereck: Exon).


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22.07.2004