Bunikowski, Rita: Die Bedeutung von S. aureus als Pathogenitätsfaktor bei der atopischen Dermatitis (AD)

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Kapitel 3. Patienten und Methoden

3.1 Studienpopulation

Zur Beantwortung der offenen Fragen wurden im Rahmen einer Querschnittsuntersuchung 74 Kinder aus einem risikoangereicherten Patientenkollektiv (stationärer Bereich) und 25 gesunde altersgleiche nicht-atopische Kinder als Kontrollen rekrutiert. Das risikoangereicherte Kollektiv bot sich für diese Untersuchung an, weil unterschiedlich schwere Manifestationen der AD vorlagen und eine Vielzahl von klinischen und immunologischen Parametern erhoben werden konnten, die eine Einordnung des Krankheitsbilds und die Korrelation mit bakterieller Besiedlung sowie S. aureus-Exotoxin-/Superantigenproduktion zuliessen. Hierzu zählen u. a. die klinischen Parameter des natürlichen Krankheitsverlaufes wie Schweregrad der atopischen Dermatitis, Gesamt-IgE, Sensibilisierungsprofil und klinische Relevanz der Sensibilisierung. Der Schweregrad der Erkrankung wurde mittels SCORAD-Index festgelegt bei dem 0 bis 104 Punkte erreicht werden können. Nach internationaler Übereinstimmung wird ein SCORAD-Score von 1 bis 25 Punkten als leichte Dermatitis, ein SCORAD-Score von 26 bis 50 Punkten als mittelschwere Dermatitis und ein SCORAD-Score > 50 als schwere Dermatis bewertet ( 252 ).

3.2 Mikrobiologische Diagnostik

Der Status der bakteriellen Besiedlung wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Martin Mielke, Institut für Mikrobiologie, UKBF durchgeführt. Hierzu wurden mittels Rodacplatten (5,6 cm Durchmesser) standardisierte Abstriche an Ellenbeuge, Handgelenk und Nacken, sowie vorhanden an erosiven ekzematösen Hautarealen durchgeführt. Die Rodacplatten wurden dann unter Standardbedingungen (48 Stunden bei 32°C) inkubiert. Das S. aureus-Wachstum wurde mit Nachweis von typischen koagulase-positiven Kolonien identifiziert ( 253 ). Die Kolonisierung wurde quantifiziert über das Zählen der Anteile der „colony-forming units (cfu)“ auf einer Agarplatte und anschließender Umrechung auf cm2 Haut. S. aureus-Nasenträger wurden über den Nachweis von S. aureus aus der Nasenschleimhaut identifiziert. Abstriche der Nasenschleimhaut wurden


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mittels steriler Watteträger abgenommen und über Anreicherungsbouillon und Mannitplatten (Inkubation 48 Stunden bei 32°C) aufgearbeitet.

Zum In-vitro-Toxinnachweis wurden S. aureus-Kulturüberstände im Latexagglutinations-test überprüft (TSST-RPLA® bzw. SET-RPLA-Test Kid®) Unipath, Hampshire, United Kingdom. Nach den Angaben des Herstellers wurden mit diesem Test die S. aureus-Exotoxine SEA, SEB, SEC, SED und TSST-1 bestimmt ( 236 ). Bei negativem Testausfall erfolgte noch eine zusätzliche Überprüfung des zellfreien S. aureus-Kulturüberstandes im Lymphozytenproliferationstest ( 254 ).

3.3 Zusammenhang zwischer lokaler T-Zell-Rekrutierung und S. aureus-Exotoxin-Produktion

Um kausalpathogenetische Zusammenhänge im Hinblick auf lokale T-Zell-Rekrutierung in der Haut und S. aureus-Besiedlung/Superantigenproduktion bei chronisch ekzematöser Haut herzustellen, wurde ein umfangreicher Versuchsansatz mit einer Subpopulation von randomisierten Patienten mit schwerster chronischer AD konzipiert. Bei diesen Patienten wurde das S. aureus-Exotoxin identifiziert, isoliert und die individuellen Superantigene wurden in der mikrobiologischen Kultur angereichert. Die autologen PBMCs desselben Patienten wurden dann mit diesem individuellen Superantigen re-stimuliert. Dieser Testansatz hatte das Ziel, das individuelle TZR-Vß-Repertoire zu identifizieren, welches durch patienten-eigene Superantigene aktiviert und zur Expansion getrieben wird. Zeitgleich wurde eine Hautbiopsie aus dem chronisch entzündlichen Areal gewonnen (Frau Dr. Worm/Hautklinik) und immunhistologisch mit gegen TZR-Vß-Strukturen gerichteten Antikörpern gefärbt. Die Analyse des TZR-Vß-Repertoires wurde dann mit den vorher durchgeführten In-vitro-Untersuchungen korreliert. Diese Untersuchungen ließen einen Rückschluss auf die einwandernden T-Zellen in bezug auf die superantigene Reaktivität und Verteilung in die Haut der betroffenen Patienten zu.


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3.4 Analysen des T-Zellrezeptor-Vß-Repertoires mittels Durchflusszytometrie

Bei den Patienten wurden native PBMCs hinsichtlich ihrer Vß-Expression analysiert. In einem zweiten Versuchsansatz wurden Patienten-PBMCs mit antiCD3 mABs und eine zweite Probe mit autologem S. aureus-Kulturfiltrat für zwölf Tage restimuliert. Eine dritte Probe wurde nur mit Medium versetzt. Dieser Testansatz hatte das Ziel, das individuelle TZR-Vß-Repertoir zu identifizieren, welches durch patienteneigene Superantigene aktiviert und zur Expansion getrieben wird. Für diese Frequenzanalyse wurde das gesamte, derzeit kommerziell erhältliche anti-TZR-Vß eingesetzt. Folgende FITC-labeled mABS wurden benutzt: anti-Vß2, anti-Vß3, anti-Vß3.1, anti-Vß6.1, anti-Vß6.7, anti-Vß9, anti-Vß11, anti-Vß13.1, anti-Vß14, anti-Vß16, anti-Vß17, anti-Vß18, anti-Vß20, anti-Vß21.3 und anti-Vß22 (Immunotech, Hamburg, Deutschland) und anti-Vß5.1, anti-Vß8, anti-Vß12 (DPC, Bad Nauheim, Deutschland). Die Analyse des T-Zell-Rezeptor-Vß-Repertoires erfolgte mit der FACS-Analyse. Der Anteil der TCR-Vß-Expression wurde als prozentualer Anteil der CD3+-T-Zellen angegeben ( 255 ).

3.5 Hautbiopsie

Es wurde bei den Patienten Haut von chronisch affektierten läsionalen Bereichen mittels 6 mm großer kutaner Stanzbiopsie am Oberschenkel entnommen. Das Bioptat wurde sofort in flüssigem Nitrogen eingefroren und bei -80°C gelagert. Kryoserienschnitte von 5-µm Dicke wurden immunhistologisch mit folgenden Antikörpern gefärbt: anti-CD3 (clone UCHT1 der Firma Dako, Glostrup, Dänemark) und anti-humane Vß3.1, Vß12.1, Vß13.6, Vß16, Vß17, Vß18 T-Zell Rezeptor (TCR) (Immunotech), und Vß5.1 (DPC); alle wurden mit FITC versehen. Die mit FITC versehenen und gebundenen Antikörper wurden mittels APAAP-Methode visualisiert ( 256 ). Die immunhistologische Aufarbeitung wurde in Kooperation mit Herrn Dr. Anagnostopoulos, Institut für Pathologie, UKBF, durchgeführt.


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Die immunhistologische Bewertung wurde durch den Pathologen „verblindet“ vorgenommen d.h., dass ihm die Identität der Biopsien im Hinblick auf die S. aureus-Enterotoxin-Bildung unbekannt war. Die absolute Anzahl der T-Zellen in der Dermis bezog sich auf die nachgewiesen CD3-positiven Zellen. Der Anteil der TCR-Vß-Expression wurde als prozentualer Anteil der CD3+-T-Zellen angegeben. Die visualisierten TCR-Vß-Elemente wurden in dem jeweiligen korrespondierendem Areal der immunhistologisch gefärbten Serienschnitte gezählt.

3.6 Nachweis von Serum-Gesamt-IgE und spezifischen IgE-Anti-körpern

Das Serum-Gesamt-IgE und die spezifischen IgE-Antikörper gegen Inhalations- und Nahrungsmittelallergene wurden mittels Pharmacia® Test-Kids gemessen. Das Vorliegen von spezifischem IgE gegen SEA und SEB wurde per AlaStat System® (DPC Biermann) überprüft .

3.7 Cyclosporin A-Therapie und S. aureus-Besiedlung

Möglicherweise ist aufgrund der immunsuppressiven Therapie mit CyA bei S. aureus-kolonisierten Kindern das Risiko für eine systemische S. aureus-Infektion erhöht. Im Rahmen einer offenen Studie wurde während der Therapiephase mit CyA als Sicherheitsparameter eine mikrobiologische Diagnostik durchgeführt und der Effekt von CyA auf die S. aureus-Besiedlung und auf den Schweregrad der AD analysiert. Das Patientenkollektiv bot sich für diese klinische und mikrobiologische Fragestellung an, da bei den erkrankten Kindern von einer besonders ausgeprägten immunologischen Störung mit schwerer Hautentzündung auszugehen war.

In der prospektiven Studie wurden 11 Kinder mit schwerer AD (SCORAD-Index > 50; objektiver SCORAD Score > 40 an zwei Basismessungen in einem Abstand von zwei Wochen), über 8 Wochen mit CyA behandelt und der Effekt von niedrig dosiertem CyA auf den Schweregrad der AD untersucht. Unter der CyA-Therapie sollte eine SCORAD-Reduktion von über 35% erreicht werden. Wenn


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der Therapieerfolg nicht ausreichend war, wurde die Dosis in zweiten Woche auf 3,5 mg/kg/KG, ggfls. in der vierten auf 4,5 mg/kg/KG und in der sechsten auf 5 mg/kg/KG angehoben. Die topische Steroidtherapie (Betamethason 0,03% oder 0,05% zweimal täglich verabreicht) wurde während des Studienzeitraumes nicht geändert. Es lagen keine Unterschiede in der lokalen Anwendung zwischen der S. aureus-infizierten und der S. aureus-kolonisierten Gruppe vor.

Vor Studienbeginn mit CyA lag bei 6/11 Patienten eine S. aureus-Hautinfektion vor ( 200 ), die eine systemische antibiotische Therapie erforderte. Die Patienten wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen mit folgenden Antibiotika behandelt: Cefuroxim Axetil (80 mg/kg/KG); Erythromycin (50 mg/kg/KG) und Amoxicillin-Clavulansäure (60 mg/kg/KG). Die nachgewiesenen S. aureus-Isolate waren im Antibiogramm im Hinblick auf die eingesetzten Antibiotika gut sensibel. Bei vier der Patienten war die antibiotische Therapie bei Eintritt in die CyA-Studie abgeschlossen. Bei zwei der S. aureus-infizierten Kinder war es wegen der Schwere der Erkrankung nicht möglich, das Antibiotikum abzusetzen. Bei Beginn der Studie lag bei 5/11 Patienten eine massive Kolonisierung der Haut mit S. aureus vor. Klinische und mikrobiologische Befunde wurden vor und nach CyA-Therapie erhoben. Die mikrobiologische Diagnostik ist ausführlich unter Punkt 3.2 dieses Abschnittes beschrieben worden.


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3.8 Untersuchungen zur Lebensqualität der Eltern von Kindern mit schwerer AD

Eltern von Kindern mit schwerer AD sind aufgrund von ausgeprägten und lang anhaltenden Erkrankungsphasen ihrer Kinder, die mit massivem Juckreiz, Schlaflosigkeit und Konzentrationsschwierigkeiten einhergehen können, häufig schwer belastet und in ihrem sozialen Leben eingeschränkt. Aus diesem Grund wurde bei den Eltern von erkrankten Kindern während der Therapiephase mit CyA die Entwicklung sozialer Faktoren anhand eines Lebensqualitäts-Fragebogens evaluiert.

Der Schweregrad der AD wurde mittels SCORAD-Score festgelegt und bezogen auf die zwei Untergruppen (objektiver und subjektiver SCORAD-Score) ausgewertet. Der objektive SCORAD-Score beinhaltet die Ausbreitung der allergischen Hautentzündung und die Intensität der Entzündung (Erythem, Ödem/Papeln, Krusten, Exkorationen, Lichenifizierung und Trockenheit der Haut). Mit dem subjektiven SCORAD-Score wurden Juckreiz und Schlafstörung der Kinder erfasst. Der subjektive SCORAD-Score wurde entweder von den Patienten selbst oder deren Müttern angegeben. Es konnten maximal 10 Punkte auf einer visuellen Analog-Skala für den höchsten Grad des Juckreizes oder den höchsten Grad der Schlafstörungen vergeben werden ( 252 ).

Bei Kindern mit AD werden überdurchschnittlich häufig Hautinfektionen mit S. aureus beobachtet, die klinisch durch Auftreten von Pusteln, Krusten, Eiter und erhöhtem Juckreiz der Haut charakterisiert sind. Die Hautinfektionen sind oft mit einer Exazerbation der AD verbunden, die Kinder müssen nicht selten mit einem S. aureus-wirksamen Antibiotikum systemisch behandelt werden ( 200 ). Diese infektiologische Komplikation kann für die Eltern belastend sein. Aus diesem Grund wurde geprüft, ob bei den AD-Patienten die an einer bakteriellen Hautinfektion litten, sich dieser Umstand in der Lebensqualität der betroffenen Mütter widerspiegelt

Für die Untersuchung zur Lebensqualität betroffener Eltern wurde der „Fragebogen zur Lebensqualität von Eltern neurodermitiskranker Kinder“ eingesetzt, der von Ursula von Rüden und Mitarbeitern ( 257 ) im Rahmen einer Public


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Health Studie entwickelt und validiert wurde. Im folgenden werden Beispiele für die fünf abgefragten Subgruppen des Elterfragebogens angegeben:

3.9 Statistische Auswertung

Statistische Analysen wurden mittels Chi-Quadrat Test, Pearson Test, dem Fisher‘s exact Test und dem Wilcoxon 2-sample Test für unabhängige Stichproben durchgeführt. Mit der linearen Regression wurden Zusammenhänge zwischen 1) SCORAD-Score und S. aureus-Besiedlung, 2) SCORAD-Score und S. aureus-Exotoxinbildung, 3) spezifischen SEA/SEB-IgE-Antikörpern und S. aureus-Besiedlung, 4) spezifischen SEA/SEB-IgE-Antikörpern und S. aureus-Hautinfektionen, 5) SCORAD-Score und Serum-Gesamt-IgE und 6) SCORAD-Score und spezifischen SEA/SEB-IgE-Antikörpern analysiert.

Die statistische Beratung erfolgte durch Herrn Prof. Dr. H. Skarabis, Abteilung für Statistik, Soziologisches Institut, FU Berlin.


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Mon Sep 23 14:10:21 2002