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3  Regulation des Zellzyklus

Zellwachstum entsteht durch Progression der Zelle durch den Zellzyklus [118], der sich aus 4 definierten, voneinander abgrenzbaren Phasen zusammensetzt: G1, S, G2 und M-Phase. Das Fortschreiten einer Zelle aus der G0-Ruhephase in die G1-Phase (Gap-Phase 1) des Zellzyklus und aus der G1-Phase in die S-Phase wird durch den G1-Restriktionspunkt in der späten G1-Phase reguliert [119,120] (Abb. 6). Ist dieser Kontrollmechanismus durch physiologische Stimuli wie z.B. Wachstumsfaktoren (s.u.) oder Deregulation von Kontrollgenen (in Tumorzellen) aufgehoben, geht die Zelle in die S-Phase über und beginnt mit der DNA-Synthese. Ist die S-Phase abgeschlossen, dann gelangt die Zelle nach Durchlaufen der G2-Phase, in der die Segregation der replizierten DNA vorbereitet wird, in die M-Phase, die Mitose. Die Zellteilung wird im Anschluss beendet und die aus der Mitose hervorgegangenen Tochterzellen befinden sich nun wieder in der G1-Phase [121,122,123].

Wesentliche Erkenntnisse zur Regulation der Proliferation wurden in Hefezellen gewonnen, vor allem der Bierhefe Saccharomyces cervisiae und der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe [124,125,126,127]. Defektmutanten führten zur Entdeckung der Cycline als Motor des Zellzyklus. Die Expression dieser Proteine oszilliert und zu bestimmten Phasen des Zellzyklus werden bestimmte Cycline hoch- oder herunterreguliert [123]. Die Cycline [128] regulieren die Enzymaktivität Cyclin-abhängiger Kinasen [120,129,130] (CDK, s.u.), die über die Phosphorylierung von Substratproteinen das Fortschreiten der Zelle im Zellzyklus koordinieren und regulieren.

Zudem regulieren weitere Gene die Aktivität dieser Kinasen und ermöglichen hierdurch die Kontrolle des Fortschreitens der Zelle durch die Phasen des Zellzyklus. Dies erfolgt an bestimmten Zeitpunkten, die bestimmte Schlüsselsignale erfordern um ein Fortschreiten im Zellzyklus zu ermöglichen und daher als Check- oder auch Restriktionspunkte bezeichnet werden [128,131]. Im engeren Sinne sind Checkpunkte „Mechanismen, die eine Abhängigkeit zwischen zwei ansonsten biochemisch nicht miteinander vernetzten Regelwerken herstellen“. Die einzelnen Abschnitte des Zellzyklus setzen sich aus einer ganzen Reihe solcher in festgelegter Folge und zeitlich aufeinander abgestimmter Prozesse zusammen, die letztlich zur Teilung der Zelle in zwei Tochterzellen führen. Hierbei ist die exakte Verdopplung und Verteilung des Genoms in die beiden Tochterzellen zu fordern, um genetische Stabilität zu gewährleisten. Solche Checkpunkte, die mittlerweile in jeder Zellzyklusphase bekannt sind, gestatten das Fortschreiten der Zelle im Zyklus nur dann, wenn bestimmte [Seite 21↓]Signalkombinationen vorliegen. Ist dies nicht der Fall, dann werden Signalwege aktiviert, die zu Zellzyklusarrest und Reparatur oder programmiertem Zelltod, Apoptose, führen [132,133,134,135,136].

Abb. 6: Zellzyklus, mitogene und wachstumshemmende Signale.

Wachstumsfördernde, mitogene Signale lösen den Eintritt ruhender Zellen aus der G0- in die G1-Phase und aus der G1- in die S-Phase aus. Wesentlich ist die Steigerung der Cyclin-Expression, die als Ko-Faktoren Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) aktivieren. Wachstumshemmende Signale wirken z.B. über Steigerung der Expression von CDK Inhibitoren (CDKI). Aktive Cyclin/CDK Komplexe phosphorylieren Mitglieder der Rb-Proteinfamilie, die daraufhin ihren hemmenden Einfluß auf Transkriptionsfaktoren (TF) verlieren. Diese Transkriptionsfaktoren sind zumeist Heterodimere aus TF und Dimerisierungspartnern (Tx), die erst die DNA-Bindung und Promotoraktivierung ermöglichen (z.B. E2F- und Dp-Proteine, Myc und Max, c-Fos und c-Jun). Diese TF induzieren die Expression von Genen, die den Eintritt in die nächste Zellzyklusphase vermitteln. CDKIs vermitteln Zellzyklusarrest.

Checkpunkt-Kontrolle muß also vor allem dann stattfinden, wenn ein nachgeschalteter Vorgang auch ohne den korrekten Abschluß des vorigen Prozesses beginnen und hierdurch der Zelle irreparablen Schaden zufügen könnte. Diese Regelwerke sind in malignen Tumoren häufig gestört, was sich in der Aneuploidie und dem häufig komplexen Karyotyp verschiedenster Tumorzellen in Folge genetischer und chromosomaler Instabilität widerspiegelt [131,137,138,139,140,141,142,143].


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3.1 Zellzyklusregulation und der G1-Restriktionspunkt

Mitogene, also wachstumsstimulierende Signale vermitteln den Eintritt der Zelle aus der G0-Ruhephase in die G1-Phase und aus der G1- in die Synthese-Phase (S-Phase), indem sie die Transkription der G1-Phasen Cycline (D-Typ Cycline und Cyclin E) [123,128,139] auslösen und die entsprechenden Cyclin-abhängigen Kinasen aktivieren [122,132,144]. Wachstumshemmende Signale hingegen stimulieren Transkription und Aktivität von Inhibitoren der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKI, s.u.) [120,145] und aktivieren hierdurch Checkpunkte wie den G1-Restriktionspunkt (Abb. 6).

Die Progression von Säugerzellen aus der G1 in die S-Phase ist durch spezifische Veränderungen im Genexpressionsprofil gekennzeichnet[137,144]. Die ersten induzierten Gene sind sogenannte Immediate-Early Gene, deren Transkription wenige Minuten nach mitogener Stimulation beginnt und ihr Maximum innerhalb der ersten 30 bis 60 Minuten erreicht. Immediate-Early Gene sind zumeist Transkriptionsfaktoren, wie z.B. die c-fos und c-jun Protoonkogene, die den AP-1 Faktor bilden. Ihre Transkription, also mRNA-Expression kann nicht durch Hemmer der Proteinbiosynthese wie z.B. Cycloheximid blockiert werden, ist durch präformierte, konstitutiv exprimierte Proteine der entsprechenden Signaltransduktions-Kaskaden vermittelt (Immediate) und erfolgt daher früh nach Aktivierung (Early). Eine zweite Klasse von Genen, die Delayed-Early Gene, wird nach 3 bis 6 Stunden nach mitogener Stimulation exprimiert und wird durch die Immediate-Early Transkriptionsfaktoren vermittelt. Zu diesen Delayed-Early Genen gehören die G1-Cycline (Cyclin D, Cyclin E) und auch E2-F und c-myc. Eine dritte Gengruppe wird erst spät in der G1-Phase exprimiert und diese Gene sind Vorboten der G1/S-Phasen Progression, also des Übergangs von der G1- in die S-Phase. Die Expression dieser Gene wird durch c-myc und Mitglieder der E2F-Familie stimuliert (s.u.) bzw. durch hypophosphorylierte Rb-Familienmitglieder gehemmt.

Neben dem G1-Restriktionspunkt sind zusätzliche Checkpunkte aktiv, die den Fortschritt der Zelle durch jede der Phasen des Zellzyklus kontrollieren [137,146,147]. Zellen sind während des Zellzyklus sehr empfindlich und können wesentlich leichter irreversibel und letal geschädigt werden. Diese Checkpunkte werden z.B. durch ionisierende Bestrahlung oder DNA-Schädigung durch Zytostatika aktiviert, wodurch die Zelle nicht nur in der G1-Phase, sondern auch in der S-, vor allem aber auch in der G2- und den einzelnen Schritten der M-Phase arretiert werden kann, um die entstandenen Schäden zu reparieren. Die Progression der Zelle durch den Zellzyklus wird durch den Rb-Signalweg kontrolliert.


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3.2 Zellzyklus-Hemmung durch die Retinoblastom (Rb) Genfamilie

Die Rb-Familie besteht aus den funktionell und strukturell nahe verwandten Genen pRb, p107 und p130 [132,145,148,149,150,151,152]. Die Inaktivierung beider pRb Allele, vorwiegend durch Keimbahn-Mutationen, ist mit der Entstehung von Retinoblastomen assoziiert. Diese malignen Tumore der Netzhaut treten im frühen Kindesalter auf. Das Spektrum somatischer und hereditärer Keimbahn-Mutationen ist durch Mutation kleiner Genabschnitte geprägt, die sich durch erhebliche Heterogenität auszeichnen und über das gesamte Rb-Gen verteilt gefunden werden. Einige der Mutationen betreffen das Spleißen der mRNA oder führen prämature Stop-Codons ein und resultieren in der Expression trunkierter, verkürzter und somit funktionsdefekter Proteine bzw. hemmen vollständig die Protein-Expression. Mit wenigen Ausnahmen entwickeln die von solchen Mutationen betroffenen Kinder bilaterale, beide Augen betreffende Netzhauttumore. Neben diesen familär, schon im frühen Kindesalter auftretenden Tumoren wird eine Inaktivierung von Rb infolge somatischer Mutationen oder Deletion des Genlokus in einer Vielzahl von Tumoren, auch beim Erwachsenen, beobachtet.

Die wachstumskontrollierende Funktion von Rb-Proteinen beruht auf ihrer Fähigkeit, reversibel an Transkriptionsfaktoren wie z.B. E2F (s.u.) zu binden [140]. Das Rb-Protein (pRb) ist ein transkriptioneller Repressor, der durch die Interaktion mit diesen E2F-Transkriptionsfaktoren spezifisch die Promotoraktivierung Zellzyklus-regulierender Gene hemmt. Wird pRb durch die Bindung an E2F an einen Promotor gebunden, dann hemmt es ebenfalls umgebende Transkriptionsfaktoren und blockiert hierdurch die Transkriptionsmaschinerie für das betroffene Gen. Hierdurch wird die Transkription Zellzyklus-promovierender Gene gehemmt und die Zelle wird im Zellzyklus (in diesem Fall in der G1-Phase) arretiert.

Die Bindungstasche in pRb (Pocket-Domäne) für diese Transkriptionsfaktoren prägte den Begriff „Pocketproteine“, der häufig synonym für die Rb-Proteinfamilie gebraucht wird [148]. Die A- und die B-Domäne in pRb und seinen Homologen p107 und p130 sind evolutionär konserviert und bilden das Repressormotiv der Bindungstasche, über das die Bindung an E2F und der dominant negative Effekt auf die Transkription von S-Phase-Proteinen vermittelt wird.

Die Bindung von pRb an E2F wird durch den Phosphorylierungsstatus von pRb reguliert (s.u.) [150,151]. In seiner hypophosphorylierten Form inhibiert pRb Transkriptionsfaktoren der [Seite 24↓]E2F/DP Familie und verhindert hierdurch die Hochregulation von Genen, die z.B. für die Aktivierung der DNA-Synthese während der S-Phase benötigt werden. Um im Zellzyklus fortschreiten zu können, muss daher pRb phosphoryliert und hierdurch funktionell inaktiviert werden.

Abb. 7: Regulation der Rb-Phosphorylierung.

In der G1-Phase werden Rb-Proteine in 2 Schritten phosphoryliert: in der frühen G1 Phase durch Cyclin D1, D2 oder D3 und CDK4 oder CDK6. In der späten G1-Phase vermittelt der Cyclin E/CDK2-Komplex den zweiten Phosphorylierungsschritt und löst hierdurch S-Phase-Progression aus. Die CDK Cdc2 (CDK1) erhält Rb über die S-Phase (CDK Ko-Faktor Cyclin A) und die G2-Phase (CDK Ko-Faktor Cyclin B) hinweg im hyperphosphorylierten Zustand. Mit Eintritt in die M-Phase wird Cyclin B herunterreguliert und abgebaut, so dass Rb dann über die Rb-Phosphatase PP1 und auch indirekt über die PTEN Phosphatase dephosphoryliert werden kann und die Tochterzellen erneut in der G1-Phase sind, bis der nächste Zellzyklus aktiviert wird. Rb kann auch hypophosphoryliert werden, indem CDKs durch den Abbau von Cyclin/CDK-Komplexen über das Proteasom inaktiviert werden, wie z.B. durch den APC-Komplex, der die Ubiquitinylierung und den Abbau von B-Typ-Cyclinen auslöst.

Das nun mehrfach phosphorylierte pRb kann nicht mehr mit E2F-Faktoren interagieren, die nun mit den Dimerisierungspartnern der DP-Familie [153], Dp1-1 und Dp1-2, in Wechselwirkung treten und hierdurch biologisch aktive, Transkriptionsfaktoren bilden [140,151]. Vergleichbares gilt für die Interaktion von Myc-Proteinen mit dem Dimerisierungspartner [Seite 25↓]Max [154,155,156]. Die aus der Bindung an Dp-Proteine resultierende Aktivierung von E2F und Aktivierung entsprechender S-Phase-spezifischer Gen-Promotoren löst die G1/S Transition aus und aktiviert die Transkription von Genen, wie z.B. Histonen, PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), Thymidylatsynthase, Dihydrofolatreduktase und Ribonucleotidreduktase [157,158]. Hierdurch wird die Transition der Zelle aus der späten G1-Phase in die S-Phase ermöglicht (s.u.) [140].

Diese Rb-Phosphorylierung wird durch Cyclin-abhängige Kinasen (Cyclin-dependent kinases, CDK) vermittelt [122,130]. Die Aktivität dieser Kinasen wird durch spezifische Ko-Faktoren, die Cycline, reguliert, deren Expression in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus rasch ansteigt und ebenso rasch gegen Ende der jeweiligen Zellzyklusphase wieder abfällt, also oszilliert.

Die Rolle von Rb in den späteren Zellzyklusphasen ist weniger gut definiert [132,150,151,152]. Sicher ist, dass Rb in der G2/M-Phase dephosphoryliert wird. Auch in der S-Phase wurde eine hemmende Wirkung von (dephosphoryliertem) Rb auf die DNA-Synthese beschrieben. Rb bleibt daher über die S- und G2-Phase phosphoryliert, bis es dann gegen Ende der Mitose dephosphoryliert wird, und die Zelle hierdurch erneut in der G1-Phase arretiert ist (Abb. 7). Rb-Dephosphorylierung erfolgt unter anderem durch die PP1 Proteinphosphatase [150]. Auch für die PTEN-Phosphatase wurde eine, allerdings indirekte Wirkung auf die pRb-Phosphorylierung beschrieben. Überexpression des PTEN Tumorsuppressorgens kann Proliferation von Tumorzellen hemmen und geht mit einer Dephosphorylierung von pRb einher. Dieser Effekt wird über die PI3- und Akt-Kinase vermittelt.

3.3 Zellzyklus-Regulation durch Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen

Der Übergang von einer in die nächste Phase des Zellzyklus wird durch Cyclin-abhängige Kinasen (Cyclin Dependent Kinases, CDK) reguliert. Diese Enzyme bilden einen Komplex mit jeweils spezifischen Ko-Faktoren, den Cyclinen. Die aktiven Cyclin/CDK-Komplexe phosphorylieren Substratproteine, z.B. die Pocketproteine der Rb-Familie (Abb. 7). Cyclin/CDK-Komplexe regulieren hierdurch die entscheidenden Kontrollpunkte des Zellzyklus (Abb. 8).

Werden ruhende Zellen durch Wachstumsfaktoren stimuliert, dann erfolgt die Regulation der initialen Schritte der Zellvermehrung und der Eintritt in die S-Phase durch D-Typ Cycline (Cyclin D1, D2 und D3) und ihre katalytischen Partner CDK4 und CDK6 [119,139]. Solche [Seite 26↓]proliferationsaktivierenden Signale, z.B. über die Ras-Aktivierung und die MAP-Kinase Kaskade [141,159] oder NF-κB-Aktivierung, stimulieren die Expression von Cyclin D1 [160] bzw. dessen beiden Homologen Cyclin D2 und D3. Die neu gebildeten Cycline binden an CDK4 und CDK6, wodurch deren Kinase-Aktivität angeschaltet wird. Diese Cyclin-CDK Komplexe vermitteln dann die Phosphorylierung von pRb.

Abb. 8:Regulation der Zellzyklusphasen durch Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDK).

In jeder der Zellzyklusphasen sind spezifische Cycline exprimiert, die mit spezifischen CDKs interagieren und sie hierdurch aktivieren. Diese CDK phosphorylieren Rb und ermöglichen den Fortschritt der Zelle durch den Zellzyklus bis Rb gegen Ende des Zellzyklus durch Phosphatasen dephosphoryliert wird und die aus der Mitose hervorgegangenen Tochterzellen nach Ende der M-Phase erneut in der G1-Phase sind. CDKIs können diese Cyclin/CDK Komplexe in jeder Zellzyklusphase hemmen und Zellzyklusarrest auslösen. Die CDKIs der INK4a-Familie hemmen G1-Phase Cycline während die CDKIs der KIP-Familie auch S- und G2-Phase Cyclin/CDK-Komplexe hemmen.

Dieses Prinzip der Aktivierung einer CDK durch ein spezifisches Cyclin findet sich in allen Zellzyklusphasen. So interagiert in der frühen G1 Phase Cyclin D mit CDK4 und CDK6, gefolgt von Cyclin E/CDK2 in der späten G1 Phase, Cyclin A/CDK2 in der S-Phase, Cyclin A/Cdc2 (CDK1) in der späten S-Phase und dem S/G2 Übergang, sowie Cyclin B/Cdc2 [Seite 27↓](CDK1) in der G2-Phase und dem G2/M Übergang (Abb. 7 und 8). Während in epithelialen Zellen vorwiegend D1-Cyclin funktionell relevant ist, sind in hämatopoetischen Zellen besonders D2- und D3-Cyclin exprimiert [161,162]. Eine Ausnahme ist das Mantelzell-Lymphom, das aufgrund der für diese Erkrankung typischen t(11;14) Translokation Cyclin D1 überexprimiert [163,164,165,166].

Die D-Typ Cycline (Cyclin D1, D2, D3) kontrollieren gemeinsam mit Cyclin E [167] den G1 Restriktionspunkt (Abb. 7 und 8). Rb wird durch diese D-Cycline und die assoziierten Kinasen CDK4/6 phosphoryliert, wodurch es zur Hochregulation von Cyclin E kommt, das durch Aktivierung von CDK2 einen zweiten Rb-Phosphorylierungsschritt in der späten G1-Phase auslöst [145,167].

Die CDKs zeigen im Verlauf des Zellzyklus eine relativ lange Halbwertszeit. Im Gegensatz hierzu oszillieren die Expressionsspiegel der Cycline in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus, und die Phasen-spezifischen Cycline werden rasch beim Übergang in die nächste Phase des Zellzyklus nach Export aus dem Zellkern in das Zytoplasma ubiquitinyliet und über das Proteasom abgebaut, begleitet vom Anstieg des Expressionsniveaus des nächsten Cyclins [140,168]. Demzufolge führt die Herunterregulation der Cyclin B Spiegel am Ende der G2- und Beginn der M-Phase zur Hypophosphorylierung von Rb und ermöglicht somit, im Zusammenspiel mit dem APC/Mad-Signalweg und Deaktivierung des Anaphase-Checkpunkts, das Ende des Zellzyklus nach Abschluss der Mitose [169].

3.4 Inhibitoren der Cyclin-abhängigen Kinasen

Die Aktvität der CDKs wird durch spezifische Inhibitoren negativ reguliert. Diese Inhibitoren werden als CDKI bezeichnet (Cyclin-dependent kinase inhibitors). Bisher konnten 2 Unterfamilien der CDKIs identifiziert werden: (1) die CIP/KIP Familie, die multiple verschiedene Cyclin/CDK-Komplexe hemmen kann und (2) die INK4-Familie, die spezifisch CDK4 und CDK6 hemmt (Abb. 8).

Die Aktivität von CDK2 (assoziiert mit Cyclin E) kann durch Cip/Kip CDKI Proteine gehemmt werden (p21Waf1/Cip1, p27Kip1 und p57Kip2). Diese Cip/Kip-Faktoren verfügen über eine konservierte, homologe Domäne, die die Bindung und Hemmung von CDK2 und CDK4 vermittelt. Diese Proteine wirken stöchiometrisch und hemmen bevorzugt CDK2-Komplexe, obwohl sie in vitro mit allen in der G1-Phase gebildeten CDK-Komplexen interagieren können.


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Die INK4-Familie (Inhibiert CDK4) besteht aus 4 nahe verwandten Faktoren: p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c und p14INK4d (p19INK4d in der Maus) [142]. Die INK4 Familienmitglieder verhindern die Progression aus der G1-Phase in die S-Phase des Zyklus, indem sie die Phosphorylierung von Rb verhindern. Dies erfolgt durch Hemmung der D-Cyclin-abhängigen CDK4 und CDK6. Das somit hypophosphorylierte Rb hemmt wiederum die Aktivität von Transkriptionsfaktoren (z.B. E2F) und verhindert hierdurch die Expression von Cyclin E und weiteren für die S-Phase-Progression benötigten Faktoren (Abb. 8). Dies erklärt auch, warum INK4 CDKIs für ihre Wirkung Rb benötigen.

3.5 G1/S-Transition und S-Progression durch E2F und c-Myc

Die E2F-Familie von Transkriptionsfaktoren besteht aus 6 Mitgliedern (E2F-1 bis –6) [140,170]. Zur Bildung des aktiven Transkriptionsfaktors wird jedoch, wie auch bei anderen Transkriptionsfaktoren, wie z.B. c-myc, c-fos/c-jun oder NF-κB, ein Dimerisierungspartner benötigt: die DP1-Proteine (Abb. 9) [153,171]. Die Rb-Familienmitglieder assoziieren in unterschiedlicher Affinität mit diesen E2F-Faktoren [132,151]. PRb bindet hauptsächlich E2F-1 bis -4, wohingegen p130 und p107 bevorzugt an E2F-4 und –5 binden. Hypophosphorylierung von Rb führt zur Freisetzung und Aktivierung der E2F-Faktoren. Transkriptionelle Zielgene von E2F sind weitere Zellzyklus-regulierende Gene (Cyclin E, Cyclin A, Cdc2, der CDKI p21, das proto-Onkogen c-myc) und Faktoren, die im DNA-Metabolismus eine Rolle spielen (Dihydrofolatreduktase, Thymidinkinase, Thymidylatsynthase, etc.) [172]. Hierdurch wird die G1/S-Progression ausgelöst, also der Übergang aus der späten G1- in die S-Phase. Die Akkumulation von D-Cyclinen während der G1-Phase sequestriert zudem CDK2-Inhibitoren der Cip/Kip-Genfamilie, wodurch die Wirkung von E2F-abhängigen Regulationsschritten, z.B. vermittelt durch Cyclin E/CDK2 verstärkt und die G1/S-Transition erleichtert wird.

Myc-Proteine sind Transkriptionsfaktoren, deren Aktivität durch Dimerisierung mit gewebespezifischen Ko-Faktoren vermittelt wird [173,174]. Für die Regulation hämatopoetischer Zellen und deren maligne Transformation ist vor allem das c-myc-Gen entscheidend [175,176]. Über ein Leucin-Zipper-Motiv dimerisiert c-Myc mit dem im Überschuß vorliegenden Max Protein und bildet hierdurch das DNA-bindende Myc/Max Heterodimer, das die Transkription S-Phase-spezifischer Gene induziert [177], hierdurch die S-Phase unterhält und weiter vorantreibt [154,155,156,178]. Wie auch E2F wird c-myc Aktivierung durch Bindung an unphosphoryliertes Rb gehemmt [151,152,171]. C-myc Expression wird unter anderem von E2F-[Seite 29↓]Transkriptionsfaktoren induziert und amplifiziert die G1/S-Phasen-Transition durch transkriptionelle Aktvivierung von S-Phase-Genen, aber auch der Cyclin E Expression [140,171].

Abb. 9: Regulation der S-Phase Progression durch E2F.

Nach mitogener Stimulation werden Rb-Proteine in 2 Schritten phosphoryliert. Der erste Phosphorylierungsschritt wird durch D-Cycline und CDK4 und CDK6 vermittelt. Der zweite Phosphorylierungsschritt erfolgt durch den Cyclin E/CDK2-Komplex. Das nun mehrfach phosphorylierte Rb kann Transkriptionsfaktoren wie E2F nicht mehr inhibieren und die nun freien E2F/Dp Heterodimere können Promotoraktivierung vermitteln und Gene aktivieren, die S-Phase Progression auslösen (S-Phase-Promotoren).

Die Expression von c-myc ist bei einer Vielzahl maligner Tumore dereguliert [175,178]. Dies kann durch Genamplifikation oder, wie im Falle der hochmalignen Burkitt-Lymphome, bevorzugt in Folge einer t(8;14) Translokation erfolgen, die das c-myc Gen unter die Kontrolle des Schwerketten-Enhancers bringen und zu deregulierter Expression führen [178]. Eine weitere Ursache für erhöhte c-myc Aktivität sind Punktmutationen, die die Bindung des p107 Rb Proteins inaktivieren. Ähnlich wie bei E2F genügt die Überexpression von c-myc allein, um Zellen in die S-Phase zu treiben.

Liegen keine adäquaten Aktivierungsbedingungen vor, dann lösen E2F und c-myc nicht G1/S-Phasen Transition, sondern Apoptose aus [172,179]. Ein Fortschreiten im Zellzyklus erfordert, dass gleichzeitig Zelltod-hemmende Signale aktiviert werden, z.B. durch Hemmung [Seite 30↓]des mitochondrialen Apoptose-Signalwegs [180,181]. Dieses Prinzip der gleichzeitigen Aktivierung von Zelltodsignalwegen schützt vor ungehemmter Zellproliferation und zwar vor allem dann, wenn neben dem mitogenen, Zellzyklus-aktivierenden Signal, entsprechende Zelltod-hemmende Ko-Signale fehlen. Wie im Fall von E2F kann die deregulierte Aktivierung von c-myc also Apoptose auslösen, wenn nicht gleichzeitig die Apoptose-Signalkaskade gehemmt wird, z.B. durch hohe Expression des Apoptose-hemmenden Bcl-2 oder Bcl-xL oder Inaktivierung des p53-Signalwegs, z.B. durch p53-Mutation, p14ARF-Verlust oder Mdm-2 Überexpression [182,183]. Auch die Deregulation des Ras-Signalwegs (s.u.) [15] kann solche anti-apoptotischen Ko-Signale vermitteln. Eine Reihe von Untersuchungen zeigte, dass die c-myc-induzierte Apoptose über einen p14ARF und p53-abhängigen Mechanismus vermittelt wird (s.u.) [182,184].

3.6 Vernetzung der Signalwege von Zellzyklus und Apoptose

Signale, die den Progress von Zellen im Zellzyklus auslösen, aktivieren immer auch Zelltodsignale. Nur durch die Koordination mit Überlebens-Signalen bzw. bei Vorliegen von Zellzyklus-arretierenden Signalen kann die normale Zelle bzw. die Tumorzelle überleben [3].

Hierdurch wird verständlich, warum die Überexpression von Zellzyklus-stimulierenden Transkriptionsfaktoren wie E2F-1 und dessen Homologen [185,186] oder c-myc [179] oder auch von Cyclin D1 [187] Apoptose auslöst. Werden hingegen gleichzeitig Überlebenssignale wie z.B. durch Bcl-2 oder Bcl-xL oder andere Apoptose-Hemmer vermittelt, dann überlebt die Zelle das Proliferationssignal [181], geht nicht in die Apoptose und schreitet im Zellzyklus fort [180,188]. Möglicherweise soll durch die gleichzeitige Aktivierung von Proliferations- und Zelltodsignalen die akzidentelle Aktivierung der Zellproliferation vermieden werden. Solche fehlerhaft proliferierenden Zellen würden dann über Apoptose absterben. Dies erklärt zum Teil, warum Tumoren häufig Inaktivierungen von Zelltodsignalwegen aufweisen.

Ebenso kann die Aktivierung von Zelltodsignalen im Zellzyklus gehemmt werden, indem die Zelle in der jeweiligen Zellzyklusphase zum adäquaten Zeitpunkt arretiert wird. Zellzyklusinhibitoren wie die CDKs, vor allem p21Cip/Waf, können daher anti-apoptotische Wirkung zeigen [189]. Allerdings kann auch die kontinuierliche Arretierung von Zellen im Zellzyklus in Phasen außerhalb der G0/G1-Phase Zelltodsignalwege aktivieren. Hierdurch wird garantiert, dass nur solche Zellen überleben, die den Zellzyklus korrekt durchlaufen haben. Dies erklärt, warum langanhaltender Zellzyklus-Arrest an verschiedenen [Seite 31↓]Checkpunkten Apoptose-Programme aktiviert [134]. Dies gilt insbesondere für Zellen in denen gleichzeitig Proliferations-aktivierende und Zellzyklus-arretierende Signale aktiv sind, also divergierende, konkurrierende Signalwege aktiviert wurden. Dies könnte erklären, warum für alle CDKIs (vor allem p16 [190,191], p21 [192] und p27 [193]) nach adenoviralem Gentransfer (der gleichzeitig auch die DNA-Replikationsmaschinerie der S-Phase aktiviert) eine Zelltod-fördernde Wirkung gezeigt werden konnte.

Neben den o.g. Genen , die vor allem die Kontrolle des G1-Restriktionspunkts und Zelltod vermitteln, existieren Apoptose-kontrollierende Checkpunkte auch in anderen Phasen des Zellzyklus [194,195,196,197,198]. Für die S-Phase ist bekannt, dass Zellen in dieser Phase am empfindlichsten für DNA-Schädigung sind [199]. Allerdings gibt es bisher kaum gesicherte Daten dafür, dass Zellen direkt aus dieser Phase heraus in die Apoptose gehen. Vielmehr führt die Mehrzahl der genotoxischen Noxen zur Aktivierung von Checkpunkten und Arretierung der Zelle in der G2 bzw. der M-Phase, die häufig als G2/M-Restriktionspunkt zusammengefaßt werden [200,201]. Neuere Daten, erneut aus dem experimentellen System in der Hefe, haben einzelne Signalkomponenten identifiziert und einen raschen Wissensfortschritt in den letzten Jahren ermöglicht (Abb. 10).

Der S-Phase-Checkpunkt und die regulierenden Faktoren stehen in engem funktionellem Zusammenhang mit dem G2-Checkpunkt. Für beide Checkpunkte wird häufig synonym der Begriff DNA-Schädigungs-Checkpunkt verwendet. Hierbei handelt es sich aber um einen funktionell definierten Begriff, der nicht völlig kongruent mit den individuellen Zellzyklus-Checkpunkten ist, da DNA-Schädigung Checkpunkte in allen Zellzyklusphasen aktivieren kann.

Die ATM und DNA-PK Proteinkinasen, die bei DNA-Schädigung im Rahmen der DNA-Reparatur-Mechanismen aktiviert werden, können über Phosphorylierung von Chk2 und die G2-Restriktionspunkt-Kontrolle Zellzyklusarrest [202,203] und, über p53-abhängige und -unabhängige Signalwege, Zelltod auslösen [204,205].


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Abb. 10: Regulation von M-Phase-Progression und G2-Arrest

Der Komplex aus der aktiven CDK Cdc2 und Cyclin B vermittelt den Eintritt in die M-Phase des Zellzyklus. Um enzymatisch aktiv zu sein, muß Cdc2 dephosphoryliert werden. Ist die Cdc2 phosphoryliert, dann wird der Cyclin B/Cdc2 Komplex über das Proteasom abgebaut. Die Dephosphorylierung wird durch die Cdc25C Phosphatase vermittelt. Genotoxische Schäden z.B. nach Bestrahlung oder chemischer DNA-Schädigung und Hemmung der DNA-Replikation aktiviert über Rad-Proteine wie z.B. rad51 und rad9, die ATM und ATR-Kinasen, die dann die Chk1 und Chk2 Kinasen phosphorylieren und hierdurch aktivieren. Chk1 aktiviert die Wee-Kinasen und hemmt hierdurch die M-Phase-Progression (nicht in der Abbildung hervorgehoben). Chk1 und Chk2 phosphorylieren Cdc25C und hemmen hierdurch die Phosphatase, die im phosphorylierten Zustand an 14-3-3σ bindet und nach Ubiquitinylierung über das Proteasom abgebaut wird. Hierdurch wird die Dephosphorylierung von Cdc2 gehemmt und G2-Arrest ausgelöst. ATM und ATR aktivieren zudem p53 und vermitteln hierdurch einen Anstieg der 14-3-3σ Expressionsspiegel, wodurch die Cdc25 Inaktivierung verstärkt wird. Chk1 kann auch p53 phosphorylieren.

Der CDKI p21 wiederum kann den Zellzyklus in der G1-, S- und G2-Phase arretieren und hierdurch die Progression geschädigter Zellen im Zellzyklus verhindern [206,207,208]. Hierdurch ermöglicht p21 die Reparatur ansonsten fataler Schäden. Wird p21 inaktiviert, z.B. durch Verlust von p53 oder durch Gen-spezifischen knock-out in experimentellen Systemen, dann [Seite 33↓]kommt es nach DNA-Schädigung zur Entkopplung von S-Phase (also DNA-Synthese) und Mitose [189,209,210]. Ohne sich zu teilen, akkumulieren solche Zellen DNA und werden hyperploid. Dies wird als Entkopplung von S-Phase und Mitose bezeichnet. Manche Autoren sprechen in diesem Zusammenhang auch, nicht ganz korrekt, von einer mitotischen Katastrophe, die letztlich zur Apoptose der betroffenen Zelle führt.

Abb. 11: Der Mad Signalweg

Der Eintritt der Zelle aus der G2-Phase in die Mitose wird durch die Aktivierung des APC-Proteins (Anaphase-Promovierender Complex) und die Inaktivierung von Cyclin B vermittelt. APC wirkt, indem es den Abbau regulatorischer Proteine über Ubiquitinylierung und Abbau über das Proteasom auslöst. APC inaktiviert hierdurch Pds1. Pds1 ist ein Inhibitor von Cdc20, Esp1 und Cdc14. Fällt die Hemmung durch Pds1 weg, in Folge der Sequestrierung von Pds1, dann assoziiert Cdc20 mit APC. Dieser Komplex vermittelt den Abbau von Cyclin B über das Proteasom und löst Eintritt in die Anaphase aus. Der Wegfall der Hemmung von Esp1 aktiviert die Trennung der Schwesterchromatiden in der Anaphase. Der Wegfall der Hemmung von Cdc14 führt zur Dephosphorylierung von Cdh1, das nun mit APC einen Komplex bilden kann. Dies gibt das Signal zur Beendigung der Mitose. Die APC/Cdc20- und APC/Cdh1-Komplexe inaktivieren mitotische B-Typ Zykline, indem sie deren Ubiquitinylierung und den Abbau über das Proteasom stimulieren. Sind zu Beginn der Mitose freie Kinetochore vorhanden oder liegt eine anderweitige Störung des Spindelapparats vor, dann werden Mitose-hemmende Signale aktiviert. Diese werden über Bub-Kinasen, Mad-Proteine und Pds1 vermittelt, die M-Phase Zellzyklusarrest vermitteln und den M-Phase Checkpunkt aktivieren.


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Nach Abschluß der G2-Phase beginnt die Mitose charakterisiert durch Trennung der Schwesterchromatiden und Entstehung der beiden Tochterzellen. In dieser Phase erfolgt die Anaphase-Checkpunkt-Kontrolle [211,212]. Die Chromatiden werden über die Kinetochoren an die mitotische Spindel gekoppelt, die aktiv die Segregation der verdoppelten Chromatiden vermittelt. Sind Kinetochore unbesetzt, wird der Mad-Signalweg aktiviert (vgl. Abb. 11). Freie Kinetochore rekrutieren Bub-Kinasen, die die Aktivierung des APC/C-Komplexes verhindern [213,214,215,216]. Die permanente Blockade dieser Signalmechanismen und permanenter Arrest der Zelle im Anaphase-Checkpunkt, z.B. durch dominant negative Mutanten von Signalproteinen, wie der Bub1-Kinase, aktiviert die Apoptose-Signalkaskade und die Zelle stirbt über Apoptose [214].

Durch diese strenge Kontrolle von Zellzyklusarrest sowie von Apoptose oder Zellüberleben wird in normalen Zellen dereguliertes Wachstum verhindert. Die Koordination einer Vielzahl komplexer, nachgeschalteter Regulationswege war somit aus evolutionsgeschichtlicher Sicht die Basis für die Entwicklung komplexer vielzelliger Organismen.


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28.09.2004