4 4. Signaldefekte als prognostische Faktoren

Aufgrund der Schwankungsbreite bei Gebrauch klinisch pathologischer Prognosefaktoren, wie z.B. dem UICC Stadium bei kolorektalen Karzinomen [217] oder dem Binet-Stadium [218] bei der chronischen lymphatischen Leukämie, besteht erheblicher Bedarf, die Prognose der Patienten präziser abzuschätzen. Dies gilt insbesondere auch im Hinblick auf den deutlichen Trend zu risikoadaptierten Tumortherapien und neuen Tumortherapeutika wie z.B. Kinasehemmern. Ein möglicher Weg ist, die zellulären Signalwege zu untersuchen, die an der Tumorentstehung, Tumorprogression und, insbesondere, der Aktivierung und Exekution von Zelltod nach zytotoxischer Tumortherapie beteiligt sind. Die Störung von Zelltod- und Zellzyklus-Signalwegen trägt nicht nur zur Tumorentstehung bei, sondern ist mit verantwortlich für die Tumorbiologie und den klinischen Verlauf der Erkrankung.

So konnten Bcl-2 Familienmitglieder mittlerweile als pathogenetisch und auch prognostisch relevante Faktoren bei nahezu allen Neoplasien identifiziert werden [219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229]. So trägt die Mehrzahl der follikulären Lymphome die t(14;18) Translokation, die das Bcl-2 Gen mit dem Schwerketten-Enhancer des Immunglobulin-Genkomplexes assoziiert [230]. Hierdurch kommt es zur deregulierten, konstitutiven Expression des Bcl-2 Proteins [8,9,231,232,233]. Die t(14;18) Translokation kann auch bei einigen wenigen hochmalignen B-Zell-Lymphomen und [Seite 35↓]chronischen lymphatischen Leukämien (CLL) nachgewiesen werden, ist für sich genommen aber nicht mit einer schlechteren klinischen Prognose assoziiert. Hingegen ist das Proteinexpressionsniveau, vor allem bei hochmalignen B-Zell-Lymphomen, mit einem schlechteren Ansprechen auf aggressive Polychemotherapie verbunden. Hohe Proteinexpression von Bcl-2 wird in diesen Tumoren also anscheinend durch von der t(14;18) Translokation unabhängige Faktoren reguliert.

Die Überexpression von Bcl-2 in B-Lymphozyten in transgenen Mäusen allein führt nur zur B-Zellhyperplasie [6] und nur in einem geringen Prozentsatz zu malignen B-Zell-Lymphomen, in denen dann zusätzlich Deregulation von c-myc nachgewiesen werden kann [14]. Werden jedoch beide Transgene im B-Zell-Kompartiment zur Überexpression gebracht, dann entwickeln alle transgenen Mäuse hochmaligne B-Zell-Lymphome. Bcl-2 ist somit kein Onkogen im eigentlichen Sinne, sondern kooperiert bei der Onkogenese mit solchen Genen die Proliferation deregulieren, für sich allein betrachtet aber Apoptose in der betroffenen Zelle auslösen würden.

Bei der B-CLL wird im Vergleich zu anderen B-Zell-Lymphomen eine konstitutiv hohe Bcl-2 Expression gefunden. Die B-CLL ist durch niedrige Proliferationsrate verbunden mit der Akkumulation nicht teilungsaktiver, jedoch Apoptose-resistenter Lymphozyten charakterisiert. Die hohe Expression von Bcl-2, aber auch von dessen Homolog Mcl-1, könnte somit ein entscheidender pathogenetischer Faktor sein. Individuelle Unterschiede im Proteinexpressionsniveau dieser Regulatoren sind mit einem schlechteren Gesamtüberleben bzw. Therapieansprechen assoziiert [234,235].

Ebenso kann bei einer Vielzahl von Tumoren der Verlust des pro-apoptotischen Bax-Proteins nachgewiesen werden. Eigene Arbeiten konnten bei einer Viezahl von Tumoren zeigen, dass der Verlust von Bax mit schlechterem Therapienansprechen bzw. Prognose einhergeht [47,48,49,50,236,237,238,239]. Die Ursache für den Verlust von Bax ist in den meisten Tumoren noch ungeklärt, liegt aber wahrscheinlich auf transkriptioneller Ebene, da der Bax-Promotor einen extrem hohen Gehalt an CpG Inseln enthält, die aufgrund von Promotormethylierung für den Bax-Verlust verantwortlich sein könnten. Bax-Mutationen sind hingegen nur bei einem Teil der Patienten für den Expressionsverlust verantwortlich. Bax-Mutationen werden vor allem bei gastrointestinalen Tumoren (Magen- und kolorektale Karzinome) mit Defekten des DNA-Mismatch-Reparatursystems beobachtet [240,241], sind aber bei den meisten hämatologischen Neoplasien extrem selten. Allerdings können sie bei den klinisch sehr aggressiven Burkitt-Lymphomen gehäuft nachgewiesen werden [242]. Im Gegensatz zum Bax-Expressionsverlust ist [Seite 36↓]die pathogenetische und klinische Relevanz der Bax-Mutation in diesen Tumoren jedoch noch ungeklärt.

Für APAF-1 bisher nur ansatzweise eine pathogenetische Relevanz nachgewiesen werden. Mutationen von APAF-1 wurden bisher bei Tumoren mit DNA-Mismatch-Reparatur-Defizienz beschrieben, bei denen Frameshift-Mutationen mit Verschiebung des Leserasters gezeigt wurden, für die bisher aber kein Bezug zum Therapieansprechen bzw. Resistenzverhalten gezeigt werden konnte [243]. Expressionsunterschiede von APAF-1 korrelieren nicht mit der klinischen Prognose und knock-out Mäuse zeigen keine erhöhte Tumorinzidenz. Dies macht die Existenz weiterer, komplementärer Gene wahrscheinlich, die die Funktion von APAF-1 ersetzen können. In der Tat resultiert der kombinierte Ausfall von APAF-1 in Kombination mit gleichzeitiger Überexpression von c-myc in einer hohen Rate von Tumoren im Maussystem [12]. Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass kürzlich in Melanomen die Inaktivierung von APAF-1 durch Promotormethylierung gezeigt wurde [244].

Inaktivierung von APAF-1 und Störung der Rekrutierung der Procaspase-9 kann ebenfalls mit Resistenz gegenüber Zytostatika-induziertem Zelltod einhergehen [244,245]. Ob dies von Relevanz für das klinische Ansprechen von malignen Tumoren auf zytotoxische Therapien ist, muß jedoch noch geklärt werden. Dies gilt auch für das SMAC/DIABLO Protein, das während der Apoptose aus Mitochondrien freigesetzt wird und IAPs inhibiert, somit also Apoptose-fördernd wirkt [67,68,69,70,246,247,248]. Unklar ist jedoch noch, ob SMAC/DIABLO-Verlust mit Therapieresistenz assoziiert ist.

Ebenso gibt es bisher kaum Hinweise für die Beteiligung von Caspase-Defekten an der Therapieresistenz von Tumoren. Die Mutation des Caspase-3 Gens resultiert in der MCF-7 Mammakarzinomlinie in einer nahezu vollständigen Hemmung der Zytostatika- und Bestrahlungs-induzierten Apoptose [249,250]. Die Überexpression der Procaspase-3 kann diesen resistenten Phänotyp überwinden [249]. Ebenso vermag die Überexpression der Procaspase-3 eine erworbene Resistenz gegenüber Zytostatika-induzierter Apoptose in Mammakarzinomzellen mit geringer Wildtyp-Caspase-3 Expression zu durchbrechen (s.u.). [250].

Die einzige Caspase, für die bisher eine signifikante Rate von Mutationen in Tumoren gezeigt werden konnte, ist die Caspase-5, für die, wie auch für das Bax, APAF-1 und Bcl-10 Gen, bei Tumoren mit defektem DNA-Mismatch-Reparatur-System in Folge von Lesefehlern und „Verrutschen“ der DNA-Polymerase Mutationen beobachtet werden, die zur Verschiebung des Leserasters führen [251]. Mutationen der Caspase-10 hingegen wurden beim Canale-Smith [Seite 37↓]Syndrom, einem mit Autoimmunität assoziierten lymphoproliferativen Syndrom (ALPS) beschrieben und scheinen durch die Störung von Death-Rezeptor-Signalwegen an der Entstehung dieses Syndroms ursächlich beteiligt zu sein [252,253,254,255]. Hinweise auf Caspase-10 Mutationen in Tumoren liegen bisher allerdings nicht vor. Caspase-8 hingegen kann durch Promotormethylierung, z.B. in Neuroblastomen, inaktiviert werden und dieser Expressionsverlust scheint mit einem aggressiveren Verlauf der Erkrankung einherzugehen [256,257]. Eigene Daten zeigten einen Defekt der Aktivität der Caspase-3 in rezidivierten kindlichen akuten lymphoblastischen Leukämien [237] (s.u.). Bisher wurde jedoch außerhalb von Zellinienmodellen bzw. den genannten Beispielen kein signifikanter Bezug zwischen dem Expressionsniveau oder potentieller Mutation von Caspasen und der Tumorbiologie bzw. dem Therapieansprechen von Tumoren nachgewiesen.

Eigene Ergebnisse:

4.1 Analyse des p53/Bax Signalwegs bei Patienten mit primär reseziertem kolorektalen Karzinom: niedrige Bax-Expression ist ein negativer prognostischer Faktor

Tumore des Kolorektums gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen in Europa und Nordamerika. Das Auftreten ist, bis auf wenige familiäre Syndrome, sporadisch und nur bei einem kleinen Teil der Patienten ist genetische Veranlagung die Ursache für die Tumorentstehung wie z.B. beim HNPCC-Syndrom (hereditäres, nicht polypöses Kolonkarzinom) bzw. dem FAP-Syndrom (familiäre adenomatöse Polypose des Kolons). Erfolgt die Diagnose in einenm frühen Stadium, dann ist die Mehrzahl der Patienten durch chirurgische Tumoresektion heilbar. Zur klinischen Prognoseabschätzung wird die Klassifikation der UICC (union internationale contre le cancer) eingesetzt, die auf der TNM Klassifikation aufbaut. Die 5-Jahres-Überlebensrate mit nodal negativem Kolonkarzinom beträgt, je nach Studie und Stadium, 97 bis 63 %, wohingegen Patienten mit lokalem Lymphknotenbefall ein 5-Jahres-Überleben von 74 bis 38 % aufweisen. Patienten mit metastasierter Erkrankung versterben früh und die 5-Jahres-Überlebensrate ist unter 10%.

Ziel dieser Studie war, den prognostischen Wert der Bax-Expression und Mutation von p53, einem Aktivator des Bax Gens bei Patienten mit primär behandeltem kolorektalem Karzinom [Seite 38↓]zu untersuchen. Durchgeführt wurde eine retrospektive Analyse von Tumoren von 116 Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren, d.h. im Stadium UICC III (59 Patienten) und IV (57 Patienten), die primär operiert wurden. Die Tumore wurden mittels Immunhistochemie für Bax-Expression und mittels SSCP-PCR für p53-Mutationen untersucht. Das mediane Gesamtüberleben des Kollektivs betrug zum Zeitpunkt der Analyse 17 Monate. Wie erwartet, zeigten Patienten mit UICC III Stadium ein besseres medianes Überleben als Patienten mit Stadium UICC IV: 69 Monate gegenüber 8 Monaten (p<0.0001). UICC III Tumore mit hoher Bax-Expression waren mit einem deutlich besseren Gesamtüberleben assoziiert (p=0.009) im Vergleich zu Tumoren mit niedriger Bax-Expression. P53-Mutation konnte bei UICC Tumoren nicht signifikant zwischen gutem und schlechtem Überleben differenzieren. Durch Kombination von Bax und p53 konnte jedoch eine Patientengruppe im UICC III Stadium mit besonders schlechter Prognose identifiziert werden: Patienten mit Inaktivierung sowohl von Bax als auch p53 zeigten das schlechteste Überleben (p=0.004). Bei der heterogenen Patientengruppe im Stadium UICC IV hingegen zeigten weder Bax-Expression noch p53-Mutation einen signifikanten Einfluss auf das Überleben.

Insgesamt zeigte diese Studie erstmals eine prognostische Bedeutung der Störung des p53/Bax Signalwegs bei Patienten mit primärem kolorektalem Karzinom (Manuskript eingereicht).

4.2 Analyse des p53/Bax Signalwegs in kolorektalen Karzinomen: Verlust von Bax ist ein negativer prognostischer Faktor für Patienten mit resezierten Lebermetastasen

Untersucht wurde in dieser Studie die prognostische Wertigkeit des Apoptose-Regulators Bax bei 42 Patienten mit Lebermetastasen kolorektaler Karzinome. Alle Patienten unterzogen sich einer Metastasenchirurgie mit kurativer Intention. Bei diesem Patientenkollektiv wurde retrospektiv die Expression der Proteinexpression von Bax, p21, p53 mittels Immunhistochemie und Bax- bzw. p53-Mutation mittels Fragmentlängen-Analyse bzw. SSCP-PCR (single stranded conformational polymorphism-polymerase chain reaction) analysiert.

Das mediane Gesamtüberleben betrug 41.1 Monate. Patienten mit starker zytoplasmatischer Bax-Expression zeigten ein medianes Überleben von 53.6 Monaten gegenüber 30.3 Monaten der Patienten mit niedriger Bax-Expression im Tumor (p=0.04). Dieser Unterschied wurde [Seite 39↓]noch deutlicher bei Betrachtung von Patienten mit Wildtyp p53. Das mediane Überleben von Patienten mit Wildtyp p53 und starker Bax-Expression im Tumor lag bei 53.9 Monaten, wohingegen Patienten mit p53 Wildtyp und niedriger Bax-Expression ein medianes Überleben von nur 23.3 Monaten zeigten (p=0.011). Die multivariate Analyse ergab, dass niedrige Bax-Expression ein unabhängiger negativer prognostischer Faktor ist und Patienten mit niedrigem Bax ein 4.9-fach höheres Risiko haben, früh zu versterben. Hingegen zeigten p53-Expression und Mutation und p21-Expression keinen Einfluß auf den klinischen Verlauf [48].

4.3 4.3Analyse des p53/Bax/p16 Signalwegs beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus: Hohe Expression von Bax und p16 identifiziert Patienten mit guter Prognose.

In den oben beschriebenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Bax-Expression bzw. die kombinierte Inaktivierung von Bax und p53 ein negativer prognostischer Faktor bei Adenokarzinomen des unteren Gastrointestinaltrakts ist. Um diese Studien fortzuführen, wurden Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für Inaktivierung von Bax und p53 untersucht. Da für den Cyclin-abhängigen-Kinase-Inhibitor p16INK4a eine Kooperation mit p53 im Zellzyklusarrest und in der Apoptose-Induktion gezeigt werden konnte, wurde die p16 Proteinexpression mittels Immunhistochemie untersucht und in die Überlebensanalysen einbezogen. Durchgeführt wurde eine retrospektive Analyse von Tumoren von 53 Patienten mit Plattenepithelkarzinom, bei denen unter kurativer Intention eine R0 Resektion des Tumors geplant war. Bax, p53 und p16 wurden mittels Immunhistochemie untersucht, der p53-Mutationsstatus wurde mittels SSCP-PCR bestimmt, Bax-Mutationen (Frameshift-Mutationen im G8 Trakt) wurden mit Hilfe der Fragmentlängenanalyse von PCR-Produkten bestimmt.

Das mediane Gesamtüberleben des Patientenkollektivs betrug 13.7 Monate nach Operation. Patienten mit hoher Bax-Expression zeigten ein medianes Überleben von 19.5 Monaten gegenüber 8 Monaten bei Patienten mit niedriger Bax-Expression im Tumor (p < 0.005). Ebenso war eine hohe p16-Expression mit einem medianen Überleben von 23.8 Monaten verknüpft gegenüber 9.7 Monaten für Patienten mit niedriger p16-Expression im Tumorgewebe (p=0.011). Das beste Überleben wurde in einer Untergruppe von Patienten beobachtet, deren Tumore beide günstige Phänotypen zeigten, also sowohl intakte Bax als auch p16-Expression (medianes Überleben 45.8 Monate). Der p53-Mutations- bzw. Expressionsstatus konnte nicht zwischen guter und schlechter Prognose unterscheiden. Bax-[Seite 40↓]Mutationen konnten, im Gegensatz zu kolorekatalen und Magenkarzinomen, nicht nachgewisen werden. Zusammenfassend konnte bei dieser retrospektiven Analyse mit Hilfe von Bax und p16 zwischen Patienten mit sehr guter (hohe Expression von Bax/p16) bzw. schlechter Prognose (Verlust von Bax und/oder p16) unterschieden werden [239].

4.4 Mutation von p53 bei B-CLL: Bezug zu Vortherapie mit alkylierender Chemotherapie, Krankheitsprognose und Einfluß auf Zytostatika-induzierten Zelltod

Mutationen des p53 Tumorsuppressorgens werden bei etwa 10 % der Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie vom B-Zelltyp (B-CLL) gefunden. Sowohl für B-CLL Patienten mit p53-Mutation als auch für Patienten mit einer Deletion des Chromosoms 17p, der chromosomalen Lokalisation des p53 Gens, wurde eine schlechte Prognose gezeigt. Defekte des p53 Gens gehen in einer reihe von Tumormodellen mit einem schlechteren Ansprechen auf zytotoxische Therapien, wie Chemotherapie und Bestrahlung, einher. Allerdings entstammen die meisten dieser Daten Zellinienmodellen und nur wenige Berichte konnten bisher einen solchen Effekt in primären Tumorzellen zeigen. So existierten keine klaren Daten zum Einfluß von p53-Mutationen auf die Empfindlichkeit von CLL Zellen gegenüber einem Panel therapeutisch eingesetzter Zytostatika und Bestrahlung. Aus diesem Grund wurde der p53-Mutationsstatus von 138 Patienten bestimmt und mit dem Chemosensitivitätsprofil für Alkylantien, Fludarabin, Anthrazykline, Steroide und Vincristin von B-CLL Zellen verglichen. Chemosensitivität und Apoptose-Induktion in den CLL Zellen wurde mit Hilfe eines sensitiven morphometrischen Tests, dem DISC Test, in vitro bestimmt. Die Korrelation der p53-Mutation mit klinischen Daten ergab, dass p53-Mutationen bei den Patienten nachgewiesen werden konnten, die zuvor eine Chemotherapie, und zwar mit Alkylantien (Chlorambucil, Cyclophosphamid) erhalten hatten. Weiterhin ergaben die Analysen, dass die Apoptose-Induktion durch Alkylantien, Bestrahlung und, zu einem geringeren Grad, durch Fludarabin bei p53-mutierten Patienten gestört ist. Hingegen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Antwort gegen Doxorubicin, Steroide und Vincristin. Diese Analysen zeigen erstmals, dass Vortherapie mit Alkylantien mit dem Auftreten von p53-Mutationen assoziiert sind. Mögliche Ursachen sind direkte Mutagenes aber auch Selektion präexistenter, p53-mutierter Subklone. Diese Ergebnisse können zumindest teilweise die Entwicklung von Resistenzen gegenüber Zweit- und Drittlinien-Therapien erklären (Manuskript eingereicht).


[Seite 41↓]

4.5 Das Rezidiv der akuten lymphatischen Leukämie des Kindesalters ist mit einem Abfall der Bax/Bcl-2 Ratio und dem Verlust der spontanen Caspase-3 Prozessierung in vivo assoziiert

Wie bereits diskutiert, ist die Störung des p53/Bax Signalwegs an der Tumorgenese, Tumorprogression und der Entstehung von Therapieresistenz beteiligt. Die niedrige Expression des Apoptose-induzierenden Bax korreliert mit erworbener Zytostatika-Resistenz. Wie gezeigt, korreliert Bax-Verlust mit schlechterem Ansprechen auf Therapie und kürzerem Gesamtüberleben bei Patienten mit soliden Tumoren. Basierend auf diesem Hintergrund wurde der p53/Bax/Caspase-3 Signalweg bei gepaarten und ungepaarten Zellproben von Kindern mit akuter lymphoblastischer Leukämie analysiert. Verglichen wurden Proben von Patienten mit Primärdiagnose und von Patienten im Rezidiv der Erkrankung.

Die Analysen zeigten einen Verlust der Bax-Expression und einen Abfall der Bax/Bcl-2 Ratio im Rezidiv im Vergleich zur initialen Diagnose (p = 0.013, Wilcoxon Signed Rank-Test für gepaarte Proben, p = 0.0039, Mann-Whitney U-Test für ungepaarte Proben). Der Verlust der Bax-Expression war nicht die Folge von Bax-Frameshift Mutationen des G8 Trakts im Bax Gen und auch p53-Mutationen konnten als Ursache für den Bax-Verlust ausgeschlossen werden. Die Analyse der Caspase-3 Expression zeigte den Verlust der spontanen Caspase-3 Prozessierung im Rezidiv. Während 9 von 14 (64%) der gepaarten Proben bzw. 37 von 77 (48%) der ungepaarten Proben spontane Caspase-3 Prozessierung als Ausdruck hoher Apoptose-Empfindlichkeit zeigten, konnte dies bei keiner der gepaarten Proben und nur bei einem Patienten (1 aus 34 Patienten (2.9%)) aus den ungepaarten Proben zum Zeitpunkt des Rezidivs nachgewiesen werden. Inaktivierung von Bax korrelierte mit dem Verlust der Caspase-3 Prozessierung. Diese Ergebnisse zeigen, dass zum Zeitpunkt des ALL Rezidivs schwere Störungen des Apoptose-Signalwegs auf der Ebene von Bax und Caspase-3 auftreten, die möglicherweise ursächlich an der im Rezidiv beobachteten Therapieresistenz beteiligt sind [237].


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28.09.2004