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5  Apoptose und zytotoxische Tumortherapien

Nahezu alle nicht-chirurgischen Tumortherapien basieren auf dem Prinzip, Zellzyklus-Arrest oder Apoptose in Tumorzellen auszulösen. Hieraus wird verständlich, dass die Inaktivierung zentraler Regulatoren dieser Signalwege mit Therapie-Resistenz verbunden ist. Jeder der erwähnten Signalwege kann zur Resistenzentstehung beitragen, und die Defekte können auf jeder Ebene der Signalwege auftreten.

Von besonderer Bedeutung für Therapieresistenz sind nach heutigem Erkenntnisstand die folgenden Ereignisse: (1) Störung von Zelltod-Signalwegen. Letztere können durch Funktionsverlust Zelltod-fördernder Gene oder Überaktivität Zelltod-hemmender Signale entstehen. (2) Überaktivität von DNA-Reparatur-Mechanismen und (3) verstärkte Entgiftung zytotoxischer Substanzen, z.B. durch Überexpression von entgiftenden Pumpenproteinen und metabolischer Entgiftungs-Stoffwechselwege wie z.B. Glutathion-Konjugation. Die Wertigkeit der einzelnen Signaldefekte ist derzeit Gegenstand intensiver Diskussionen.

Wie eine Vielzahl zellbiologischer Untersuchungen in vitro und im Tiermodell zeigte, ist die Deregulation von Todesrezeptoren und deren Liganden kein wesentlicher Faktor beim Zytostatika-induzierten Zelltod und der Entstehung von Therapie-Resistenz. So sterben Zellen, in denen Rezeptor-vermittelte Apoptose-Signale mit Hilfe dominant negativer Signalproteine blockiert wurde (z.B. dominant negativem FADD) genauso gut wie Wildtyp-Zellen nach Gabe verschiedenster Zytostatika oder Bestrahlung [258,259,260,261,262].

Von zentraler Bedeutung für die Entstehung von Therapie-Resistenz ist aber die Inaktivierung des p53-Signalwegs und der vor- und nachgeschalteten Regulatoren, also insbesondere von DNA-Reparatur, Zellzyklus-Checkpunkt-Regulatoren und der nachgeschalteten Apoptose-Signalkaskaden [206,263].

Ziel gegenwärtiger neuer Therapie-Ansätze ist daher, diese Resistenz-Mechanismen gezielt zu durchbrechen bzw. zu umgehen. Die genaue Kenntnis der molekularen Grundlagen liefert hierzu neue, erfolgversprechende Ansätze. In einigen dieser Situationen haben solche Erkenntnisse zur Entwicklung bereits klinisch erfolgreicher, spezifischer Strategien geführt, um den resistenten Phänotyp aufzuheben oder zu umgehen, wie z.B. im Fall der Taxane, die bei p53-mutierten Tumoren gute Wirksamkeit zeigen, teils sogar besser zu wirken scheinen im Vergleich zu p53-Wildtyp-Tumoren [264,265,266,267,268,269].

Ein besonders gutes Beispiel für den Erfolg einer solchen gezielten molekularen Behandlungsstrategie ist aber die Hemmung der Abl-Kinase durch den Tyrosinkinase-[Seite 43↓]Inhibitor STI-571 im Fall der chronischen myeloischen Leukämie (CML) und der bcr-abl positiven akuten lymphatischen Leukämie (ALL) [270,271]. Hierdurch werden Proliferations- und Überlebenssignale, z.B. über den Ras-Signalweg [15] und die Akt-Kinase [272] spezifisch abgeschaltet. Die malignen Zellen werden im Wachstum gebremst, sterben spontan oder werden empfindlicher für weitere zytotoxische Therapien. Ähnliche Effekte konnten mittlerweile auch für Hemmer des Ras-Signalwegs wie z.B. Farnesyltransferase-Inhibitoren gezeigt werden [273,274,275,276,277,278]. Allerdings sind auch bei Einsatz dieser Substanzen Resistenzentwicklungen beobachtet worden [279,280,281,282].

Andere Ansätze zielen darauf, Signaldefekte in Tumoren, z.B. bei der Zellzyklusregulation oder durch Überaktivität des EGF-Rezeptors spezifisch zu attackieren und hierdurch normale Zellen vor zytotoxischen Nebenwirkungen zu schützen. Ein Beispiel hierfür ist der Einsatz von Hemmern der Cyclin-abhängigen Kinasen, z.B. durch den Kinase-Inhibitor Flavopiridol [283] bzw. Tyrosinkinaseinhibitoren des EGF-Rezeptors [284,285,286]. Diese Substanzen lösen Zellzyklus-Arrest aus und können, wie auch STI-571, Tumor-spezifisch Apoptose auslösen.

Weitere Strategien zielen auf die Entwicklung niedermolekularer pharmakologischer Substanzen, die mit Zelltodsignalwegen interagieren, z.B. mutiertes und hierdurch missgefaltetes p53-Protein in eine funktionelle Form zurückfalten oder die Hemmung von p53 durch Mdm-2 durch Blockade der Bindungstaschen aufheben [287]. Wieder andere Strategien zielen auf die Inaktivierung von Bcl-2, z.B. durch Antisense-Oligonukleotide, die aktuell bereits in klinischen Studien evaluiert werden, z.B. bei B-Zell-Lymphomen und dem malignen Melanom [288,289,290]. Weitere Therapieansätze wiederum zielen auf die direkte Aktivierung des mitochondrialen Apoptosoms, z.B. durch Substanzen, die an den peripheren Benzodiazepin-Rezeptor binden und mitochondriale Permeabilitätssteigerung auslösen [291,292], oder Peptide mit Sequenzhomologie zur BH3-Domäne bzw. niedermolekulare Substanzen, um hierdurch Bax und seine Homologen aus der Bindung an Bcl-2/Bcl-xL zu befreien [293,294,295,296,297].

Vergleichbare Ziele werden auch durch gentherapeutische Anätze verfolgt, in denen Apoptose-fördernde und Zellzyklus-hemmende Gene mit Hilfe viraler Gentherapie-Vektoren in Tumorzellen eingeschleust werden, um diese im Wachstum zu hemmen bzw. in die Apoptose zu treiben.

Einige dieser Therapiestrategien zeigen bereits Wirksamkeit in klinischen Phase I/II Studien, und es darf mit Spannung erwartet werden, wann sich dies in verbesserten Therapie-Modalitäten für Tumorpatienten im klinischen Alltag niederschlagen wird.


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Wichtig für solche molekulare Therapien ist das genaue Verständnis der betreffenden Signalwege. Biochemische und genetische Analysen haben in den letzten Jahren zu einem erheblich verbesserten Verständnis der Apoptose-Signalwege beigetragen. Wesentliche Aspekte dieser Signalwege sind in ihren Grundzügen aufgeklärt. Allerdings bestehen erhebliche Divergenzen in der Literatur, welche Signalwege entscheidend und in welchem Umfang zum Zelltod durch zytotoxische Tumortherapeutika beitragen. Dies gilt insbesondere für die Rolle Rezeptor-vermittelter Apoptose-Signale und deren Stellenwert im Vergleich zu mitochondrialen Signalen.

Die im Folgenden geschilderten Ergebnisse weisen auf den besonderen Stellenwert der mitochondrialen Apoptose-Signalkaskade im Rahmen des Therapie-induzierten Zelltods und der Prognose maligner Tumoren hin.

Eigene Ergebnisse

5.1 Aktivierung von Caspase-8 beim Zytostatika-induzierten Zelltod in B-Lymphomzellen ist unabhängig von CD95 Rezeptor/Ligand Interaktion und erfolgt im Signalweg unterhalb der Caspase-3 Aktivierung

In dieser Arbeit wurde die Aktivierung der Caspase-8, eines wichtigen Vermittlers im „CD95“-Death-Rezeptor Signalweg, bei der Epirubicin- und Taxol-induzierten Apoptose von B-Lymphomzellen untersucht. Diese Experimente wurden durchgeführt, da die funktionelle CD95/Fas Rezeptor/Liganden Interaktion, die Rekrutierung des FADD Adaptermoleküls und die konsekutive Aktivierung der Procaspase-8 von mehreren Autoren beim Zytostatika-induzierten Zelltod von Tumorzellen gezeigt wurde. Tatsächlich konnte Aktivierung der Caspase-8 in reifen und unreifen B-Lymphomzellen nach Behandlung mit Epirubicin oder Taxol nachgewiesen werden.

Jedoch konnte in diesen Zellkulturen keine konstitutive oder induzierte Expression des CD95/Fas Liganden nachgewiesen werden. Weiterhin konnte die Überexpression einer dominant-negativen FADD-Mutante (FADDdn) die Aktivierung der Caspase-8 und apoptotische DNA-Fragmentierung nicht blockieren. Dies zeigt, dass Caspase-8 Aktivierung nach Zytostatika-Exposition unabhängig von CD95 und FADD erfolgt. Aktivierung der [Seite 45↓]Caspase-3 ging der Aktivierung der Caspase-8 voraus. Dies legte nahe, dass Caspase-8 Aktivierung in B-Lymphomzellen ein sekundäres Ereignis ist und durch andere, zuvor aktivierte Caspasen vermittelt wird. Diese Annahme konnte durch 2 experimentelle Systeme bestätigt werden: (1) zDEVD-fmk, ein zellpermeabler Inhibitor der Caspase-3 blockierte die Zytostatika-induzierte Caspase-8 Spaltung und (2) die Depletion der Caspase-3 aus Zellextrakten verhinderte vollständig die Aktivierung der Caspase-8 in einem zellfreien in vitro System nach Zugabe von Cytochrom c und dATP. Diese Ergebnisse belegen nicht nur, dass der Zytostatika-induzierte Zelltod unabhängig von CD95 und seinem Liganden ist, sondern deuten auch darauf hin, dass die Caspase-8 neben ihrer Funktion als Inducer-Caspase beim Rezeptor-vermittelten Zelltod auch als im Signalweg nachgeschaltete Effektor-Caspase wirken kann. In diesem Fall erfolgt die Prozessierung der Procaspase-8 zum aktiven Holoenzym nach der Aktivierung der Mitochondrien und der Capase-3 [258].

5.2 Bax-Expression korreliert mit zellulärer Zytostatika-Sensitivität gegenüber Doxorubicin, Cyclophosphamid und Chlorambucil aber nicht für Fludarabin, Cladribin oder Glukokortikoiden bei B-zellulärer chronischer lymphatischer Leukämie

Neben der deregulierten Proliferation spielt bei der B-zellulären chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) die Akkumulation nicht-proliferierender maligner Zellen in Folge von Apoptosedefekten eine wesentliche Rolle. Zytotoxische Tumortherapien wiederum aktivieren Apoptosesignale, und die Störung solcher Signalwege resultiert in Therapieresistenz. Neben gesteigerter Expression des Apoptose-hemmenden Bcl-2 Proteins kann Therapieresistenz, wie bereits in soliden Tumoren gezeigt (s.o.), durch Verlust des Bax Proteins entstehen. Basierend auf diesen Daten wurde daher das Expressionsniveau von Bax und Bcl-2 mit Chemoresistenzprofilen von B-CLL Zellen korreliert. Hierfür wurden Tumorzellen von 39 Patienten mit B-CLL in vitro mit einem Panel von Zytostatika inkubiert. Apoptose-Induktion und Dosiswirkungskurven wurden mittels eines morphometrischen Tests (DISC-Test) bestimmt. Hohe Bax-Spiegel korrelierten mit Chemosensitivität für Anthrazykline, Alkylantien und Vincristin. Hingegen wurde keine Korrelation zur Aktivität von Nukleosidanaloga (Fludarabin, Cladribin) und Glukokortikoiden gefunden. Interessanterweise ergab sich keine Korrelation mit dem bei B-CLL generell hohen Expressionsniveau von Bcl-2. Hieraus ergibt sich, dass Bax ein wesentlicher Regulator für einige, aber nicht alle [Seite 46↓]Zytostatika ist, die in der Therapie der CLL Anwendung finden. Neben dem besseren Verständnis von Therapieresistenz-Mechanismen bei CLL liefern diese Daten eine erste molekulare Rationale für die Gabe von Substanzen, die solche Apoptose-Defekte umgehen können, wie z.B. die Nukleosid-Analoga, bei bestimmten Resistenz-Typen, wie z.B. dem Verlust von Bax [50].

5.3 Expression des Zelltodgens Nbk/Bik sensibilisiert Glukokortikoid-resistente T Lymphomzellen für Zytostatika-induzierte Apoptose und hemmt Tumorwachstum in Mäusen mit schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID)

Die Beteiligung von Mitgliedern der Bcl-2 Genfamilie beim Zytostatika-induzierten Zelltod wurde in einer Vielzahl von Systemen gezeigt. Bei B-Zellymphomen ist die hohe Expression von Bcl-2 ein unabhängiger negativer prognostischer Faktor und die Überexpression von Bcl-2 löst Resistenz gegen Zytostatika aus, da die Zytostatika-induzierte Apoptose gehemmt wird. Umgekehrt war unklar, ob die Überexpression von Apoptose-födernden Mitgliedern der Bcl-2 Genfamilie Zytostatika-Resistenz durchbrechen kann. Als Modellsystem wurde die T-Lymphomlinie H9 (CD3/CD4-positiv, CD8-negativ) verwandt, die Glukokortikoid-resistent ist und kein endogenes Nbk/Bik (Natural born killer/Bcl-2 interacting killer) exprimiert. Überexpression von Nbk in H9 Zellen erhöhte die Empfindlichkeit für Epirubicin, Taxol und Etoposid um das 10- bis 39-fache. Weiterhin wurde die Sensitivität für Hitzeschock-induzierte Apoptose gesteigert. Die komplette Hemmung des Tumorwachstums in einem Xenotransplantationsmodell in SCID Mäusen legt nahe, dass Nbk/Bik, wie auch Bax, als Tumorsuppressorgen wirken könnte [298].

5.4 Die Apoptose-fördernden Bcl-2 Homologe Bak und Nbk/Bik überwinden Zytostatika-Resistenz in Mdr-1 negativen und Mdr-1 überexprimierenden Mammakarzinom-Zellinien

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob durch Manipulation der Apoptose-Signalkaskade durch Überexpression Apoptose-fördernder Bcl-2 Homologe verschiedene Resistenztypen durchbrochen werden können. Dies sollte in folgenden Modellen untersucht werden: (1) der MT1-Adr Linie, in der die Aktivierung der mitochondrialen Apoptose durch hohe Spiegel an [Seite 47↓]Bcl-2 gestört ist und (2) der MT3-Adr Linie, die P-Glycoprotein/Mdr-1 überexprimiert und somit verschiedene Zytostatika aufgrund der hohen Aktivität dieses ATP-abhängigen ABC-Transporters entgiften kann.

Die Überexpression des Apoptose-fördernden Bax Homologs Bak (enthält wie auch Bax eine BH1, BH2 und BH3 Domäne) oder des BH3-only Proteins Nbk/Bik (enthält nur die BH3 Domäne und ist somit ein minimales „Apoptose-Modul“) revertierte, wie erwartet, den resistenten Phänotyp der MT1-Adr Zellen. Während Bak die Resistenz vollständig aufhob, konnte Nbk die Resistenz nur partiell revertieren. Weiterhin konnten sowohl Bak als auch Nbk die Resistenz in MT3-Adr Mammakarzinom-Zellen für Epirubicin-induzierten Zelltod teilweise aufheben. Weder die Aktivität der Mdr-1 Pumpe noch die Aufnahme der Zytostatika in die Zelle wurde durch Bak oder Nbk/Bik verändert. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass Bak und Nbk nicht nur Defekte in der mitochondrialen Apoptose-Signalkaskade überwinden können, sondern auch „klassische“ Zytostatikaresistenz durchbrechen, die durch verstärkte Entgiftung und Efflux von Zytostatika vermittelt wird [299]. Bak und Nbk könnten somit Zielstrukturen zur Entwicklung neuer Tumortherapeutika darstellen [298].

5.5 Überexpression von Caspase-3 vermittelt Sensitivität für Zytostatika-induzierten Zelltod in Mammakarzinomzellen mit erworbener Zytostatikaresistenz

Analog zur Überexpression von Nbk und Bak in MT1-Adr Mammakarzinom-Zellen wurde die Frage untersucht, ob die Überexpression von Caspase-3, einem zentralen Effektormolekül in der Exekution der Apoptose, Mammakarzinom-Zellen mit erworbener Resistenz (MT1-Adr) für Zytostatika-induzierten Zelltod sensibilisieren kann. Als Kontrollsystem wurden MCF-7 Zellen verwandt, die aufgrund einer Mutation im Caspase-3 Gen die Expression von Caspase-3 vollständig verloren haben. Während Casase-3-negative, kontrolltransfizierte MCF-7 Zellen Apoptose-resistent gegenüber Epirubicin, Etoposid und Taxol waren, lösten die gleichen Zytostatika starke Apoptose-Induktion und Fragmentierung der genomischen DNA aus. MT1-Adr Zellen exprimieren nur geringe Mengen an Caspase-3 und zeigen nach Behandlung mit Zytostatika keine intakte Casase-3 Aktivierung. Augrund der endogenen hohen Bcl-2 Expression zeigen die MT1-Adr Zellen ebenfalls eine verminderte Aktivierbarkeit der Mitochondrien, gemessen durch Messung des mitochondrialen Membranpotentials. MT1-Adr Klone, die mit Hilfe eines retroviralen LSXN-Caspase-3 [Seite 48↓]Vektors transfiziert wurden und Caspase-3 2.8-fach überexprimierten, zeigten eine 3.7-fach erhöhte maximale Caspase-3 Aktivierbarkeit nach Aktivierung in einem zellfreien in vitro System. Procaspase-3 Überexpression war nicht toxisch und war auch nicht mit einer erhöhten Hintergrundapoptose der Tumorzellen verbunden. Die Caspase-3 Transfektanten zeigten jedoch eine höhere Empfindlichkeit für Zytostatika-induzierten Zelltod und erreichten nahezu dieselbe Empfindlichkeit der Zytostatika-sensitiven MT1 Mutterlinie. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression von Procaspase-3 Zytostatika-Resistenz durchbrechen kann und zwar auch in solchen Situationen, in denen die Aktivierung des mitochondrialen Apoptosoms gestört ist [250].


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28.09.2004