Daser, Angelika : Untersuchungen zur Beteiligung zellulärer und genetischer Mechanismen bei Immunregulation und -modulation

Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie
Charité
Campus Virchow Klinikum
Humboldt Universität zu Berlin


Direktor: Prof. Dr. E. Köttgen

Untersuchungen zur Beteiligung zellulärer und genetischer Mechanismen bei Immunregulation und -modulation
Habilitationsschrift

zur Erlangung der Venia legendi für das Fach Pathobiochemie

an der Medizinischen Fakultät Charité

vorgelegt von ,
Dr. med. Angelika Daser

Januar 2000


2

Zusammenfassung

Durch Immunregulation und -modulation sorgt das Immunsystem dafür, daß von außen in den Organismus gelangende Agentien nicht zu dauerhaften Schäden führen. Wesentliche Funktionen des Immunsystems stützen sich dabei auf die zelluläre Immunität. Gerät dieses komplizierte Regelwerk aus dem Gleichgewicht, können schwere Erkrankungen autoimmuner oder atopischer Genese resultieren.

Der erste Teil der Arbeit befaßt sich mit zwei Aspekten der zellulären Immunantwort. Allergische Immunantworten sind durch die Typ 2 T Zellantwort charakterisiert. Für die Induktion einer Typ 2 Antwort wird Interleukin-4 benötigt, dessen Herkunft nicht geklärt ist. NK1.1 positive T Zellen als Quelle des initialen IL-4 konnten durch in vivo und in vitro Messung von allergie-spezifischen Parametern ausgeschlossen werden.

Der MHC-Komplex präsentiert T Zellen Antigene in Form von Peptiden. Pathologische T Zellantworten können durch fortwährende Antigenpräsentation unterhalten werden. Durch Untersuchungen zur molekularen Charakteristik der MHC - Peptid Interaktion ließen sich Bindungsmotive so verfeinern, daß Peptide mit sehr starker Bindung an den MHC ohne gleichzeitige Erkennungssequenz für den T Zellrezeptor entwickelt werden konnten. Peptide dieser Art könnten zur Blockierung einer pathologischen T Zellantwort genutzt werden.

Für viele immunologische Erkrankungen ist die Beteiligung genetischer Faktoren beschrieben worden. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit der Bedeutung genetischer Disposition bei Allergien im Mausmodell. Homozygote Inzuchtstämme konnten als High- und Low-Responder für den Phänotyp "allergische Soforttypreaktion der Haut" gegenüber


3

Birkenpollenextrakt definiert werden. Die Phänotypisierung der F1 Generation wies auf dominante Vererbung hin, die informative Rückkreuzung auf die Beteiligung von mindestens zwei Genen für die Ausprägung des Merkmals. Wie die Analyse MHC congener Mäuse zeigte, entspricht einer dieser Loci dem MHC Komplex. Durch eine genomweite Kartierung mit Mikrosatelliten wurde als weiterer Kandidat der IL-5 Rezeptor identifiziert. Die detaillierte Analyse des Gens in High- und Low-Respondern weist auf eine Anzahl funktionell bedeutsamer Polymorphismen hin. Dabei imponiert das Low-Responder Allel als Suszeptibilitätsallel. Die Unterschiede haben Auswirkung auf Transkription/Translation und Spleißvorgänge, die zu quantitativer Differenz der Genprodukte führt. Die Daten weisen damit auf einen regulatorischen Mechanismus hin, da die Proteinstruktur des Rezeptors bei High- und Low-Respondern identisch ist.

Schlagwörter:
zelluläre Immunantwort, MHC, Th1/Th2 Polarisierung, Autoimmunität, Atopie, genetische Disposition, ausmodell, Kandidaten-Gen, Interleukin-5 Rezeptor, alternatives Spleißen

Abstract

Immune deviations can lead to serious autoimmune or atopic disorders. Two possible candidates for such pathological immune responses have been investigated: (i) the MHC class I allele HLA-B27, which is strongly linked to ankylosing spondylitis and reactive arthritis. Ist presentation of potentially pathogenic peptides and therapeutical modifications of peptidic ligands have been studied. (ii) Interleukin-4 (IL-4), which is the key player in the induction and maintenance of allergic immune responses. A subpopulation of natural killer (NK1.1) cells have been discussed as a source of initial IL-4. Through experiments with NK1.1 deficient mice we could demonstrate, that such immune resonses are not dependent on the presence of NK1.1 cells.

Both, autoimmunity and atopy belong to the large group of multifactorial diseases, i. e. genetic and environmental factors influence the expression of the various phenotypes. To dissect the genetics of allergic diseases systematically, a mouse model of immmediate cutaneous hypersensitivity (ICHS) upon birch pollen sensitization has been etablished. Phenotyping of the F1 progeny of high- and low-responder mice revealed ICHS as a dominant trait with incomplete penetrance. Mice

from a backcross to the low-responder strain did split into the three classes of high-, intermediate and low-response. Genotyping of these mice revealed a strong candidate gene on chromosome 6: the interleukin-5 receptor (IL-5R). Analysis of the IL-5R gene resulted in the detection of genetic variance of the high- and low-responder allele in non-coding regions with functional relevance. Additional regulatory variance is implicated through differential alternative splicing of the three receptor isoforms. A second gene cluster contributes to the expression of the allergic phenotype: MHC class II alleles, as has been demonstrated for other immunologic disorders in mice and humans.

Keywords:
cellular immune response, MHC, Th1/Th2 polarisation, autoimmunity, atopy, genetic predisposition, mouse model, candidate gene, Interleukin-5 receptor, alternative splicing


Seiten: [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur Beteiligung zellulärer und genetischer Mechanismen bei Immunregulation und -modulation
1 Aspekte der Regulation und Dysregulation zellulärer Immunität
1.1Einleitung
1.2NK1.1 T Zellen sind nicht die Quelle des initialen IL-4
1.3Durch Intervention im trimolekularen MHC - Peptid - TCR - Komplex sollte eine pathologische Immunantwort blockiert werden können
2 Genetik immunologischer Erkrankungen
2.1Einleitung
2.2Die allergische Sofortreaktion gegen Birkenpollen in der Maus: Definition zweier Mausinzuchtstämme als High- und Low-Responder und Phänotypisierung informativer Nachkommen
2.3Der MHC ist auf homozygotem Hintergrund immundominant.
2.4Der Genomscan weist auf ein Kandidatengen auf Chromosom 6 hin
2.5Das Interleukin-5 Rezeptor Gen ist polymorph mit funktioneller Implikation für High- und Low-Response
2.6Strukturelle und regulatorische Varianz sind an der Expression des allergischen Phänotyps beteiligt
2.7Genomanalysen zeigen Cluster und spezifische Loci bei unterschiedlichen immunologischen Erkrankungen
Bibliographie Referenzen

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Allelzusammensetzung verschiedener H-2 Haplotypen. Die Loci K und D sind Klasse I Loci, A und E Klasse II Loci.
Tabelle 2: Ergebnisse von neun Mikrosatellitenanalysen von Chromosom 6. Hinter den Abkürzungen verbergen sich die folgenden Phänotypen: CIA Collagen induzierte Arthritis, AK Antikörperkonzentration, ICHS allergische Soforttypreaktion der Haut, BHR bronchiale Hyperreagibilität, BPHS Bordetella pertussis Toxin Hypersensitivität, Susc CI Suszeptibilität Coccidioides immitis. (1) Yang et al 1999, (2) McIndoe et al 1999, (3) Puel et al 1995, (4) Daser et al, 1999, unpublished, (5) Ewart et al 1996, (6) Meeker et al 1999, (7) Fierer et al 1999, (8) Melanitou et al 1998, (9) Todd et al 1996.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Induktion und Funktion der Th Immunantworten. Durch Erstantigenkontakt werden naive T Zellen aktiviert und sezernieren IL-2. Durch das sie umgebende Zytokinmilieu entwickeln sie sich dann weiter in Th1 oder Th2 Effektorzellen, die die Qualität der resultierenden Immunantwort bestimmen. Die Zytokine der jeweiligen Th Subpopulation wirken inhibierend auf die andere Subpopulation, d.h. IFN-? wirkt inhibierend auf die Proliferation von Th2 Zellen und IL-4 inhibierend auf Th1 Zellen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Nonamerpeptides (P1 - P9) in der Bindungsgrube von MHC Klasse I, exemplifiziert an HLA-B27. HLA-B27 enthält 6 Bindungstaschen A - F, in die mehr oder weniger restringierte Ankerseitenketten des Peptids hineinragen. Hauptanker sind die Taschen B und F mit den Seitenketten 2 und 9, weitere Ankerpositionen mit etwas größerer Flexibiltät sind die Seitenketten P1, 3, 5 und 7. Kontakte zum TCR sind angedeutet durch senkrechte Linien nach oben, d.h. die Positionen P1, 3, 4, 5, 6, 7 und 8, während P2 und P9 so tief in der Grube liegen, daß sie nicht an der Interaktion teilnehmen. Besonders zugänglich für den TCR ist der mittlere Teil des Peptids, der sich entsprechend für Modifikationen anbietet.
Abbildung 3: Immediate Cutaneous Hypersensitivity Scores von 39 A/J und 32 B6 Mäusen. Der Score ist die Summe der Hautreaktionen nach Injektion von vier verschiedenen Konzentrationen von Birkenpollenextrakt und ist auf der y Achse aufgetragen. Auf der x Achse ist die Anzahl der Mäuse angegeben.
Abbildung 4: ICHS von 27 F1 Hybriden und 152 Backcross Mäusen.
Abbildung 5: Verteilung der Mikrosatelliten auf den Autosomen und Chromosom X, die informativ sind für folgende Mausstämme: A/J, AKR BALB/c, C3H, C57BL/6, C57BL/10, DBA/2, SJL, 129/J, JF1 und PWB.
Abbildung 6: Kosegregationsanalyse von 24 High-Respondern und 21 Low-Respondern aus der Backcross Generation. Auf der x-Achse ist die biologische Lokalisation der Mikrosatelliten auf Chromosom 6 in Centimorgan (cM) angegeben, auf der y-Achse die Anzahl der Tiere in %, die homozygot sind für den jeweiligen Mikrosatelliten.
Abbildung 7: Genetische Organisation des murinen IL-5R. Jede Box repräsentiert ein Exon. Exon 1 und 12 Nukleotide von Exon 2 bilden die 5' untranslatierte Region (UTR). Die verschiedenen Grautöne sollen die verschiedenen translatierten Bereiche des Rezeptors verdeutlichen: Signalpeptid, extrazelluläre Region, Transmembranregion und cytoplasmatische Region, die in Exon 11 endet und gefolgt wird von der 3' UTR. Die gestrichelten Linien veranschaulichen das alternative Spleißen mit den resultierenden beiden Isoformen (sIL-5R1, sIL-5R2) des löslichen IL-5R.
Abbildung 8: Genomische Organisation der 5' untranslatierten Region. Im Intron 1 liegen die vier Pseudoexons phi1 (94 Nukleotide), phi2 (122 Nukleotide), phi3 (62 Nukleotide) und phi4 (37 Nukleotide). Da phi2 eine Spleißacceptor- und Branch Site enthält, wird es in A/J und B6 alternativ gespleißt.
Abbildung 9: Luziferaseaktivität der Exon1 - Exon2 Konstrukte von A/J und B6. B6 enthält einen Basenaustausch T -> C an Position 12 vor dem ATG Start. Die Konstrukte wurden in murine A20 Zellen transfiziert; zur Normalisierung der Transfektionseffiziens wurde ein beta-Galaktosidase plasmid cotransfiziert. Der Quotient aus beiden Aktivitäten ist auf der y-Achse aufgetragen.

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Sep 3 16:18:56 2002