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2.  Darstellung der einzelnen Studienergebnisse

2.1. Projekt 1: Identifikation von Interaktionspartnern für Bcl-3/IκB

2.1.1. Einleitung: Bcl-3 Struktur und Funktion

Das Onkoprotein Bcl-3 ist seiner Struktur nach mit den IκB Faktoren eng verwandt.106 Es wurde zuerst bei einer chronisch lymphozytären Leukämie identifiziert, die mit einer Translokation (14:19) des Bcl-3 Gens in den Immunglobulin-k-Genlocus einhergeht. Daraus resultiert eine erhöhte Expression des intakten Bcl-3 Proteins.107 Im Gegensatz zu den IκB-Molekülen, die zytoplasmatische Komplexe mit unterschiedlichen Rel-Faktoren (p50, p65, c-Rel) bilden und deren Translokation in den Kern inhibieren, ist Bcl-3 im Zellkern lokalisiert.108 Zudem enthält Bcl-3 im Gegensatz zu den übrigen IκB-Molekülen keine azide Domäne nach dem sechsten Ankyrin-Repeat, stattdessen einen verkürzten siebenten Repeat.109 Die Ankyrin-Repeat-Domäne wird durch eine aminoterminale Prolin-reiche (25 %) und eine carboxyterminale Prolin- und Serin-reiche (23 % und 28 %) Region flankiert, die dem Protein Transaktivator-Eigenschaften verleihen.110 Bcl-3 interagiert über seine Ankyrin-Repeat-Domäne mit der Dimerisierungsdomäne von p50 und p52 Homodimeren.74

In-vivo Experimente zeigen, dass Bcl-3 als Transkriptionsaktivator fungieren kann.111 Über die Wirkung von Bcl-3 in Assoziation mit dem p50- und dem p52-Homodimer gibt es widersprüchliche Daten. Einige Autoren haben einen direkt transkriptionsaktivierenden Einfluss von Bcl-3 in Assoziation mit dem p50- und dem p52-Homodimer gesehen, während p50- und p52- Homodimere allein nicht aktivieren.112 Andere hingegen haben einen reprimierenden Einfluss von Bcl-3 auf p50- und p52- abhängige Aktivierungssysteme beschrieben.113 Die Diskrepanz der Daten bezüglich der funktionellen Spezifität von Bcl-3 kann auf unterschiedlichen experimentellen Bedingungen beruhen, die sich möglicherweise in Form verschiedener Modifikationen von Bcl-3 äußern könnten.114,115 Bei Bcl-3 handelt es sich um ein Phosphoprotein, das mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen [Seite 26↓]besitzt. Phosphoryliertes Bcl-3 inhibiert die DNA-Bindung von nukleärem p50- Homodimer, indem dieses von der κB-Sequenz dissoziiert wird.116 Phosphatasebehandlung inaktiviert die inhibitorische Funktion von Bcl-3, so dass das p50-Homodimer an die DNA gebunden bleibt.117

Bisher sind für Bcl-3 nur wenige Interaktionspartner und Zielgene bekannt. Außer p50 und p52 aus der Rel-Familie bindet das Transmembranprotein Tan-1 an Bcl-3.118 Letzteres erfolgt durch die Interaktion der Ankyrin-Repeat-Domänen von Tan-1 und Bcl-3. Weiterhin wird Bcl-3 mit der Regulation von Muskelzelldifferenzierung in Zusammenhang gebracht. Als Zielgen von Bcl-3 konnte bisher das P-Selektin-Gen nachgewiesen werden, an dessen Promotersequenz p50 bzw. p52 als Homodimer binden kann.119

2.1.2. Fragestellung

Die Familie der NF-κB Transkriptionsfaktoren und ihrer Inhibitoren ist maßgeblich and der Regulation einer Vielzahl von Genen beteiligt, die eine entscheidende physiologische und pathophysiologische Funktion ausüben. Über die physiologische Funktion von Bcl-3 im eukaryontischen Organismus ist bisher wenig bekannt. Aus diesen Gründen ist das Auffinden neuer Interaktionspartner von Bcl-3 von großem Interesse.

In dem vorliegenden Projekt wurden die folgenden Aufgaben bearbeitet:

2.1.3. Ergebnisse

2.1.3.1. Voruntersuchungen

Bei der Klonierung von verschiedenen Fragmenten des humanen Bcl-3-Gens in den Hefeexpressionsvektor pGBT9 (Köderplasmid) stellte sich heraus, dass sowohl das gesamte Bcl-3 Konstrukt (1-447) als auch ein C-terminal-deletiertes Konstrukt Bcl-3∆C (1-289) starke transkriptionsaktivierende Wirkung ausüben (Abbildung 2). Damit scheiden diese Konstrukte für das Screening im Yeast-Two-Hybrid-System aus. Konstrukte, welche nur die Ankyrin-Repeat Domäne von Bcl-3 beinhalten (120-359) zeigen keine transkriptionsaktivierende Aktivität. Die Untersuchung auf stabile Expression der Bcl-3-Konstrukte erfolgte durch zwei Methoden. Zum einen durch den immunologischen Nachweis mit einem polyklonalen Antiserum gegen Bcl-3-Protein im Immunoblot. Zum anderen führte die Co-transfektion von p50, welches in den Vektor pGAD 424 (Beuteplasmid) kloniert wurde, gemeinsam mit dem Bcl-3-ARD (120-359) zur Induktion der beiden Reportergene lacZ und Histidin in das Yeast-Two-Hybrid-System.


[Seite 28↓]

Abbildung 2: verschiede Bcl-3 Konstrukte und ihr transaktivierendes Potential im Yeast-Two-Hybrid-System

2.1.3.2. Screening mit Bcl-3 (120-359) als Köderprotein

Eine Bibliothek aus aktivierten B-Zellen wurde insgesamt 3x mit dem Köderprotein in verschiedene Hefezellen transformiert (Abbildung 3). Die Bibliothek wurde unter stringenten und weniger stringenten Bedingungen durchsucht, um starke und schwache Interaktionen nachzuweisen. Bei jedem Experiment wurden jeweils 2 x 106 Hefekolonien durchgemustert und 8 Klone unter stringenten Bedingungen und 14 Klone unter weniger stringenten Bedingungen isoliert. Zur Verifizierung positiver Klone wurde deren DNA durch Elektroporation in E.coli HB101 isoliert und erneut mit dem Köderprotein Bcl-3 (120-359) co-transformiert. Neben dieser Bestätigungsreaktion erfolgte die Co-transformation mit dem leeren pGBT9 und [Seite 29↓]laminin-pGBT9, um unspezifische Interaktionen auszuschließen. Nach Durchführung dieser Kontrollen verblieben 12 positive Klone.

Abbildung 3: Das Yeast-Two-Hybrid-System ist ein genetischer in vivo-Screen, in dem wir Gal4-DNA-Bcl-3 als "Fänger" benutzt und gegen eine c-DNA Bibliothek, welche aus humanem aktivierten B-Zellen gewonnen und an die Gal4- Transaktivungsdomäne fusioniert wurde, getestet haben. In drei unabhängigen Screenings wurden 1x107 Kolonien analysiert, und nach allen nötigen Kontrollen konnten acht neue mögliche Interaktionspartner für Bcl-3 identifiziert werden.

Die c-DNAs der mit Bcl-3 (120-359) gefundenen Proteine wurden in 5'‑ und 3'‑Richtung sequenziert. Dafür wurden sowohl manuelle als auch automatische Sequenziermethoden nach Sanger eingesetzt. Zur Homologiesuche wurden mit den sequenzierten Bereichen Datenbanken durchsucht. In der Tabelle 1 sind diese Ergebnisse zusammengefasst.


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Tabelle 1: Bcl-3-interagierende Proteine

Klon Nr.

cDNA-Länge 120

kodiertes Protein

Acession Number

1

1900

humanes Trip4, um 103 Aminosäuren N-terminal verlängert

L40371

2

800

EST aus humaner Colon cDNA-Genbank

AA045586

3

2200

unbekannt, Homologie zu Zinkfingermotiv des Proteins ZFP7 (Maus)

M29580

4

2000

humanes p52/NF-kB

X61498

5

850

humanes Pirin

Y07867

6

1250

humanes Jab1

U65928

7

1250

humanes Jab1

U65928

8

1500

humanes Tip60

U40989

9

1600

humanes Skip

U51432

10

900

humanes Bard

U76638

11

2900

humanes p50/NF-kB

M58603

12

2900

humanes p50/ NF-kB

M58603

2.1.3.3. Interaktion der Bcl-3-Bindungsspartner mit verschiedenen Proteinen, die Ankyrin-Repeats enthalten

Um die Spezifität der Interaktion zwischen Bcl-3 und den Bindungspartnern zu testen, haben wir die Ankyrin-Repeats verschiedener Proteine an die Gal4-DNA- bindende Domäne fusioniert und im Yeast-Two-Hybrid-System gegen die Bcl-3- interagierenden Klone untersucht. (Tabelle 2) Dafür haben wir Ankyrin-Repeats mit verschiedener Homologie zu den Ankyrin-Repeats von Bcl-3 verwendet. Ankyrin-Repeats von IκBα, IκBβ und p105 zeigen eine hohe, die von Tan-1, dem humanen Homolog von Notch1, eine geringere und die von Bard1 eine weiter entfernte Homologie zu Bcl-3. Als Positivkontrolle haben wir p50 verwendet, welches mit den Ankyrin-Repeats von p105 und Bcl-3 interagiert. Keiner der Bcl-3-Interaktionspartner interagiert mit den Ankyrin-Repeats von Bard1. Skip und Trip4 interagieren mit allen Ankyrin Repeats, die wir getestet haben mit Ausnahme der von Bard1. Pirin und Tip60 interagieren, analog zu p50, mit einem Mitglied der NF-κB Familie zusätzlich [Seite 31↓]zu Bcl-3: nämlich interagiert Tip60 mit Tan-1, Pirin mit IκBα und Jab1 mit p105. Bard1 interagiert mit zwei weiteren Proteinen: IκBα und p105.

Tabelle 2: Interaktion der Bcl-3-interagierenden Partner mit Proteine, die verwandte Ankyrin-Repeats enthalten(β-Gal Aktivität in arbitrary units)

Kandidat

Bcl-3

IkBα

IkBβ

IkBγ

Tan1-ARD

Tan1-

3-7ARD

Bard1-ARD

leerer Vector

<1

7±1

<1

<1

5±1

<1

<1

Pirin

72 ±6

29±3

<1

3 ±1

4±1

<1

<1

Tip60

10±1

5±1

2±1

3 ±1

35±3

<1

<1

Jab

7±1

6±1

<1

29±2

6±2

<1

<1

Bard

12 ±1

80±4

<1

71 ±4

4±1

<1

<1

Skip

42 ±5

30±2

12±

112 ±8

10±2

8±1

<1

Trip4

48±4

22±2

42 ±2

11±2

7±2

<1

p50

64±4

5±1

<1

74±6

Nicht durchgeführt

<1

<1

p52

++

Nicht durchgeführt

-

+

Nicht durchgeführt

-

-

2.1.3.4. Deletionsmutationen in den Bcl-3-Ankyrin-Repeats und der Einfluß auf das Interaktionsverhalten im Yeast-Two-Hybrid-System

Als nächstes haben wir untersucht, ob die gesamte Struktur der Ankyrin-Repeats von Bcl-3 nötig ist, um an die Interaktionspartner im Yeast-Two-Hybrid-System zu binden. Dazu haben wir mehrere Deletionsmutanten von Bcl-3 hergestellt, in denen alle sieben bzw. fünf, vier oder drei der Ankyrin-Repeats an die Gal-4-DNA-bindende Domäne fusioniert wurden. p50 und Tip60 benötigen die komplette Struktur der Bcl-3 Ankyrin-Repeats für eine Interaktion. Jab1 und Bard1 interagieren ebenfalls mit fünf Ankyrin-Repeats, Trip4 und Skip ebenfalls mit vier Ankyrin Repeats von Bcl-3. Konstrukte, die aus weniger als vier Konstrukte bestehen, interagieren mit keinem der Bindungspartner (Tabelle 3).

Tabelle 3: Deletionsmutanten von Bcl-3 und ihre Fähigkeit, mit den Interaktionspartnern im Yeast–Two-Hybrid-System zu interagieren

2.1.3.5. Überprüfung der Bcl-3-Interaktionen

Zunächst wurde ein β-Galaktosidase-Test in Flüssigkultur mit o-NPG zur Bestätigung und Quantifizierung der Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen exprimiertem Köderprotein und isoliertem Beuteprotein durchgeführt. Dazu wurden die Köderproteine gemeinsam mit dem leeren pGBT9, laminin-pGBT9, Bcl-3 (120-359)-pGBT9 und die Ankyrin-Repeats von p105-pGBT9 co-transformiert. Dabei ließen sich die Interaktionspartner in drei Gruppen einteilen: stark (>50 β-GalU), mittelstark (15-50 β-GalU) und schwach interagierende Partner (5-15 β-GalU). Zudem zeigte dieses Experiment, dass bis auf Pirin und Tip60 die übrigen Klone ebenfalls mit den Ankyrin-Repeats von p105-pGBT9 interagierten.


[Seite 33↓]

Tabelle 4: Reporter-Test mit Bcl-3-interagierenden Klonen, unterteilt nach stark, mittelstark und schwach interagierenden Partnern.

stark interagiende Partner (>50 β-GalU)

Interaktions

partner

Bcl3-pGBT9

(lacZ Aktivität)

Ankyrin-p105-pGBT9 (lacZ Aktivität)

laminin-pGBT9

(lacZ Aktivität)

pGBT9

(lacZ Aktivität)

Pirin

65

10

1

1

Skip

52

167

1

1

Trip4

55

105

5

2

 

mittelstark interagierende Partner (15-50 β-GalU)

Interaktions

partner

Bcl3-pGBT9

(lacZ Aktivität)

Ankyrin-p105-pGBT9 (lacZ Aktivität)

laminin-pGBT9

(lacZ Aktivität)

pGBT9

(lacZ Aktivität)

Bard

16

71

2

0

p50

13

2

1

1

 

schwach interagierende Partner (5-15 β-GalU)

Interaktions

partner

Bcl3-pGBT9

(lacZ Aktivität)

Ankyrin-p105-pGBT9 (lacZ Aktivität)

laminin-pGBT9

(lacZ Aktivität)

pGBT9

(lacZ Aktivität)

Klon 2

7

4

1

1

Klon3

6

15

1

1

Jab

7

29

2

1

Tip60

10

3

1

1

Als nächstes wurden die c-DNAs der verschiedenen Klone mit einem flag-Epitop in Leserichtung in einen Expressionsvektor umkloniert und in Retikulozytenlysate mit radioaktiv markiertem Methionin in vitro translatiert (Abbildung 4). Bcl-3 (120-359) und die Ankyrin-Repeats von p105 wurden als GST-Fusionsproteine in Bakterien exprimiert und an GST-Beads gekoppelt. Die Interaktion mit Bcl-3 konnte mittels GST-Fusionsproteinen bestätigt werden.

Abbildung 4: Beispiel eines GST-Pulldown-Tests

Neben der GST-Fusionsmethode wurde versucht, mittels Co-Immunopräzipitation die Protein-Protein-Interaktionen zu verifizieren (Abbildung 5). Nach in vitro-Translation der cDNAs der potentiellen Interaktionspartner sowie des Köderproteins Bcl-3 in Retikulozytenlysate mit radioaktiv markiertem Methionin, wurde die Co-Immunopräzipitation beider Proteine jeweils mit einem polyklonalen Bcl-3-Antikörper [Seite 34↓](gegen die N-terminale Region) und mit einem monoklonalen Anti-Flag Antikörper durchgeführt.

Abbildung 5: Beispiel einer Co-Immunopräzipitation in vitro nach Translation
(Tip 60 mit Bcl-3)

Nachdem wir eine Interaktion zwischen Bcl-3 und den interagierenden Klonen in vitro und in Hefen nachgewiesen hatten, wollten wir untersuchen. ob diese Interaktion auch in höheren eukaryontischen Zellen in vivo nachzuweisen ist. Da für keinen der interagierenden Klone Antikörper vorhanden sind, entschlossen wir uns, diesen Versuch mit „getaggten“ Proteinen durchzuführen (Abbildung 6). Bcl-3, mit einem G0-Epitop-Tag versehen, und die interagierenden Klone, mit einem Flag-tag versehen, wurden mittels Calciumphosphat Transfektion in die humane Nierenkarzinom-Zell-Linie 293 transfiziert. Sechsunddreißig Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und in einen Lysepuffer überführt. Nachdem der Lysepuffer 1:3 verdünnt wurde, erfolgte eine Immunopräzipitation mit einem monoklonalen G0-Antikörper. Die Präzipitate wurden in Laemmli-Puffer aufgenommen und auf einem 12%-SDS-PAGE- Gel aufgetrennt. Nach Elektroblotting auf eine Nitrocellulosemembran erfolgte die Detektion mittels monoklonalem Anti-Flag-Antikörper, Die GST-Pulldown-Tests sowie die in vitro und in vivo Co-Immunopräzipitation der einzelnen Klone sind in Paper P1 [Seite 35↓]abgebildet. Exemplarisch ist die Co-Immunopräzipitation zwischen Tip60 und Bcl-3 in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 6: Beispiel einer Co-Immunopräzipitation in vivo nach Transfektion mit Tip 60 und Bcl-3.

2.1.3.6. Bandshiftanalyse von Bcl-3 und interagierenden Klonen

Die Interaktion von an DNA gefundenem p50 mit Bcl-3 hängt von den gewählten experimentellen Bedingungen ab. In der Literatur werden sowohl ternäre Komplexe beschrieben als auch eine Inhibierung der p50-DNA-Interaktion. Um den Einfluss der interagierenden Klone zu untersuchen, wählten wir Bedingungen, bei denen die Zugabe von Bcl-3 zu DNA gebundenem p50 zu der stabilen Formation eines ternären Komplexes führt. Die Untersuchungen wurden in vitro entweder an GST-Fusionsproteinen oder translatierten Proteinen durchgeführt. Zugabe von Tip60, Bard1 und Pirin führten zur Ausbildung eines quartären Komplexes, bestehend aus DNA, p50, Bcl-3 und den interagierenden Klonen (Abbildung 7). Trip4, Skip und Jab1 konnten allerdings keinen Supershift erzeugen. Jab1 und Pirin erhöhten weiterhin noch die DNA-bindende Aktivität (Abbildung 8). Diese Daten zeigen, dass Bcl-3 in-vitro quartäre Komplexe bilden kann, in die jeweils Pirin, Tip60 und Bard1 involviert sind.


[Seite 36↓]

Abbildung 7: NF-κB-Aktivität, quartärer Komplex aus DNA, p50, Bcl-3 und Tip60

Abbildung 8: Modulation der NF-kB durch die Interaktionspartner


[Seite 37↓]

2.1.3.7.  Einfluß der Interaktionspartner auf die endogene NF-κB-Aktivität

Um zu untersuchen, ob die interagierenden Klone die DNA-bindende Aktivität von p50/Bcl-3 in vivo analysieren, testeten wir die Interaktionspartner in einem System, welches von Vigo Heißmeier im Labor von Claus Scheidereit etabliert wurde. In eine Zell-Linie, die stabil Bcl-3 überexprimiert, wurden die Interaktionspartner mittels Calciumphosphat transfiziert. Die DNA-bindende Aktivität von NF-κB ist durch die Transfektion der Interaktionspartner nicht beeinflusst. Anschließend wurde eine Immunopräzipitation mit einem Anti-Bcl-3-Antikörper durchgeführt, der gegen das C-terminale Ende von Bcl-3 gerichtet ist. Die immunopräzipitierten Komplexe wurden mittels des Detergenz DOC dissoziert und erneut mittels Bandshiftanalyse untersucht. Wie zu erwarten, ist nach Immunopräzipitation mit Bcl-3, keine p50/p65 Aktivität nachweisbar. Doch führte die Transfektion von mehreren Interaktionspartnern zu einer Steigerung der endogenen p50/p50-DNA-bindenden Aktivität. Diese Aktivierung ist am stärksten durch das Hinzugeben von Jab1, gefolgt von Trip4, Tip60 und Skip. Diese Untersuchungen zeigen, dass die Interaktionspartner die endogene Aktivität von p50-Homodimeren verstärken (Abbildung 9)..


[Seite 38↓]

Abbildung 9: endogene NF-κB-Aktivität: Gel-shift-Analyse der Extrakte zeigt vergleichbare NF-κB/Rel-DNA-Bindungsaktivität (rechts). Wie erwartet, war nach Präzipitation keine p50/p65 Aktivität nachweisbar. In der mock-transfizierten Gruppe konnte lediglich eine schwache p50/p50-Aktivität nachgewiesen werden. Die Expression von Jab1, Trip4, Tip60 und Skip führte zu einem starken Anstieg der Bcl-3-assoziierten p50/p50-Aktivität.

2.1.3.8. Transiente Transfektionen und Reportergenaktivitäten

Als nächstes wollten wir untersuchen, ob die neuen Interaktionspartner die Transkriptionsaktivität von Bcl-3 modulieren. Dazu haben wir transiente Transfektionen und Reporterassays in verschiedenen Zell-Linien (Schneider Zellen, QT6 und HD3) durchgeführt. Als Reporterplasmide benutzten wir den HIV-Reporter und den P-Selektin Promoter, welcher an das Luciferasegen gekoppelt wurde. Von beiden Plasmiden verwendeten wir auch Versionen, in denen durch eine Punktmutation die NF-κB-Bindestelle zerstört wurde. Von dem cis-regulatorischen NF-κB-Element im P-Selektin-Promoter ist bekannt, dass es von p50 und p52 gebunden wird, und dass dieser Promoter durch p50 und Bcl-3 um den Faktor 3-4 aktiviert wird. Durch Zugabe von Tip60 kommt es zu einer verstärkten Aktivierung, so [Seite 39↓]dass wir in der höchsten Dosierung von Tip60 eine ca. 11-fache Aktivierung des Reporters gesehen haben (Abbildung 10). Eine Mutation in der NF-κB Bindungsstelle des P-Selektin-Promoters verhindert die Aktivierung durch Bcl-3 und Tip 60 (Abbildung 11). Bestimmte Konzentrationen von Bcl-3 und Jab1 führen zu einer 5-fachen Aktivierung.

Abbildung 10: Transiente Transfektionen und Reportergen-Assays mit dem P-Selektin- Promoter

Abbildung 11: Transiente Transfektionen und Reportergen-Assays mit dem P-Selektin Promoter, dessen NF-kB Bindungsstelle durch eine Punktmutation modifiziert wurde.


[Seite 40↓]

In diesem System führen zwei der gefundenen Interaktionspartner, Tip60 und Jab1, zu einer Erhöhung der Transkriptionsaktivität von Bcl-3. Der Effekt von Tip60 ist abhängig von der Intaktheit der NF-κB Bindungsstelle. Im gleichen Testsystem haben wir bereits publiziert, dass es zu einer funktionellen Interaktion zwischen den Transkriptionsfaktoren Sp1 und NF-κB, die ebenfalls von der intakten NF-κB Bindungsstelle des P-Selektin-Promoters abhängt (Abbildung 12). Wir konnten zeigen, dass Sp1 zu einer starken Aktivierung des P-Selektin-Promoters führt (A). Eine Mutation in der NF-κB Bindungsstelle reduziert die ca. 50-fache Aktivierung auf den Faktor 10 (B). Der gleiche Effekt ereignet sich, wenn p50 zu dem System gegeben wird (C). Bcl-3, in Kombination mit p50 und Sp1, führt erneut zu einer 50-fachen Aktivierung. In diesem System haben wir die Interaktionspartner getestet. Tip60 führt in dem System mit Sp1, p50 und Bcl-3 bereits in geringer Konzentration zu einer Repression auf den Basiswert. Den gleichen Effekt haben Bard1 und Jab1, jedoch erst in höheren Konzentrationen. Das Modell für die Interaktion der Transkriptionsfaktoren ist in Abbildung 13 dargestellt.

Abbildung 12: Aktivierung des P-Selektin-Promoters


[Seite 41↓]

Abbildung 13: Schematische Darstellung der Interaktion zwischen p50, Bcl-3, SP-1 und Interaktionspartnern

2.1.3.9. Reprint Paper 1

Dechend R, Hirano F, Lehmann, Vigo Heissmeyer V, Ansieau S,
Wulczyn FG,Scheidereit C,Leutz A
The Bcl-3 oncoprotein acts as a bridging factor between
NF-kB/Rel and nuclear co-regulators
Oncogene 1999;18:3316-23


[Seite 42↓]

2.1.4.  Diskussion und Ausblick

Mit Hilfe des Yeast-Two-Hybrid-Systems haben wir fünf neue Proteine identifiziert, die mit Bcl-3 interagieren. Alle fünf Proteine sind nukleäre Proteine. Obwohl wir kein gemeinsames strukturelles Motiv unter diesen fünf Proteinen gefunden haben, verbindet sie die gemeinsame Funktion. Alle fünf sind in die Genregulations- und Transkriptionskontrolle involviert. Alle Interaktionspartner bilden binäre Komplexe in vitro (Co-Immunopräzipitation und GST-Pulldown) und im Yeast-Two-Hybrid-System, wobei die Interaktionspartner wahrscheinlich verschiedene strukturelle Motive in den Ankyrin-Repeats von Bcl-3 und IκB Proteinen erkennen. Bard1, Pirin und Tip60 bilden quartäre Komplexe mit p50, Bcl-3 und einer NF-κB Bindungsstelle. In diesen Experimenten konnen wir zeigen, dass Bcl-3 mit den Ankyrin-Repeats zur gleichen Zeit mit (mindestens) zwei Proteinen interagieren kann (Abbildung 14). Die endogene Aktivität von p50/Bcl-3 Komplexen wird durch die Transfektion der Interaktionspartner gesteigert. Den größten Effekt hat dabei Jab1. In transienten Transfektionen modulieren Jab1, Tip60, Bard1 und Pirin die Transkriptionsaktivität von Bcl-3 in verschiedenen Zell-Linien und mit verschiedenen Reporterkonstrukten. Den stärksten aktivierenden Effekt auf p50/Bcl-3 übt Tip60 aus. Tip60, Jab1 und Pirin können ebenfalls in vivo mit Bcl-3 co-immunopräzipitiert werden, wenn beide Proteine transient transfiziert werden.


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Abbildung 14: schematische Darstellung der Bindung zwischen Bcl-3 und Interaktionspartnern

Auf Grund dieser Ergebnisse spekulieren wir, dass Bcl-3 eine Adapterfunktion ausübt, die NF-κB-p50/p52 mit anderen Transkriptionsfaktoren (NF-1, c-jun, Schilddrüsen-Rezeptor, HIV-Tat) bzw. basalen Transkriptionsfaktoren (Histonacetylasen, RNA Polymerasen) verbindet. Abbildung 15 fasst diese Adapterfunktionen zusammen. In diesem Zusammenhang ist auch ein Zusammenwirken dieser Proteine in der Regulation von verschiedenen Genen vorstellen, was schematisch in Abbildung 15 dargestellt ist. Gen 1 wird reguliert durch einen Multikomplex, der aus p50, Bcl-3, Bard1, BRCA und der basalen Transkriptionsmaschinerie besteht. Gen 2 wird z.B. durch einem Multikomplex reguliert, der aus p50, Bcl-3, Tip60, TAT und TAR besteht. Gen 3 wird durch einen Komplex, der p50, Bcl-3, Jab1 und AP1 enthält, in seiner Aktivität bestimmt. Ebenso sind Multikomplexe vorstellbar, die zwar durch Bcl-3, jedoch unabhängig von NF-κB [Seite 44↓]reguliert werden. Dieses ist schematisch in Gen 4 dargestellt. Hier besteht der hypothetische Regulationskomplex aus AP-1, Jab1, Bcl-3, Bard1, BRCA und der basalen Transkriptionsmaschinerie.

Abbildung 15: Schematische Darstellung der Interaktion verschiedener Transkriptionsfaktoren über Bcl-3 und die Interaktionspartner


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2.2.  Projekt 2: Infektion von Chlamydia pneumoniae und NF-κB-Aktivierung in Zellen der Gefäßwand

2.2.1. Einleitung

Neben den etablierten Risikofaktoren für die koronare Herzerkrankung gibt es Hinweise, dass ein infektiöses Agens ursächlich an der Pathogenese und Progredienz der Arteriosklerose beteiligt ist.121 Untersuchungen der letzten Jahre haben gezeigt, dass unter den möglichen Erregern Chlamydia pneumoniae das infektiöse Agens sein könnte.122 C.pneumoniae ist ein obligat intrazellulärer Organismus und ein Bakterium, welches häufig bronchopulmonale Infekte hervorruft. Im Alter von 50 Jahren haben 50% der Bevölkerung positive Antikörper gegen C.pneumoniae, was für eine stattgehabte Infektion spricht.123 Neueste Untersuchungen haben eine C.pneumoniae-Infektion mit ischämischem Schlaganfall, Myokardinfarkt und Arteriosklerose assoziiert.124 Ein Anstieg des Titers gegen C.pneumoniae-Antikörper ist in 60% von Patienten mit akutem Myokardinfarkt nachgewiesen worden. Die Assoziation von vorheriger C.pneumoniae-Infektion und Arteriosklerose der Koronar- bzw. der Carotidarterien ist durch mehrere unabhängige epidemiologische Untersuchungen gezeigt worden.125,126 Das Vorhandensein von C.pneumoniae in arteriosklerotischen Gefäßen ist mittels Immunohistochemie, Elektronenmikroskopie und mittels verschiedener DNA-Amplifikationstechniken nachgewiesen worden.127-129 In arteriosklerotischen Koronararterien, gewonnen aus Atherektomien, konnte zu 79 % die Präsenz von C.pneumoniae nachgewiesen werden, während in lediglich 4 % von nicht-arteriosklerotischen Arterien C.pneumoniae vorhanden war. In dieser Studie konnte C.pneumoniae in Makrophagen, Endothel und glatten Muskelzellen nachgewiesen werden.130 Eine weitere immunohistochemische Studie an Autopsiegewebe konnte zeigen, dass C.pneumoniae signifikant häufiger in kardiovaskulärem Gewebe nachweisbar ist als in anderen Geweben. Wenn es jedoch in nicht kardiovaskulärem Gewebe nachweisbar war, war es auch in kardiovaskulärem Gewebe vorhanden. Daraus [Seite 46↓]folgern die Autoren, dass C.pneumoniae eine Präferenz für kardiovaskuläres Gewebe besitzt.131 Tierexperimentelle Untersuchungen, in denen Kaninchen mit einer Cholesterin-reichen Diät gefüttert wurden, zeigten, dass durch C.pneumoniae eine beschleunigte arteriosklerotische Reaktion in den Gefäßen hervorgerufen wurde. Diese konnte erfolgreich durch Makrolidantibiotika verhindert werden.132,133 Vorläufige Ergebnisse aus Interventionsstudien an Patienten mit koronarer Herzerkrankung, die zusätzlich mit Makrolidantibiotika therapiert wurden, zeigen ebenfalls positive Ergebnisse, so dass die Hypothese einer kausalen Genese der C.pneumoniae- Infektion gestützt wird.134,135

Das 1986 bei respiratorischen Infekten beschriebene Bakterium C. pneumoniae wurde als bisher einziger Erreger direkt aus arteriosklerotischen Plaques isoliert.136 Grund für die späte Entdeckung waren Schwierigkeiten, den obligat intrazellulären Erreger anzuzüchten. Es gibt nur ca. 70 lebensfähige Stämme und wenige Labore, die Primärisolationen vornehmen. Trotz der wenigen Isolate ist die Durchseuchung hoch: praktisch jeder Mensch infiziert sich mit dem Erreger.137 Da Chlamydien im Gewebe persistieren können, stellte sich die Frage nach den Konsequenzen einer so häufigen Infektion.138 Serologische Untersuchungen belegten dann die C. pneumoniae-Infektion als Risikofaktor der Arteriosklerose, konnten aber wegen des indirekten statistischen Ansatzes keine Kausalität beweisen.138

2.2.2. Fragestellung

Die Fragestellung der ersten Arbeit war, ob durch eine Infektion mit C.pneumoniae in der Gefäßwand das „lokale Milieu“ so verändert wird, dass ein akutes Koronarsyndrom ausgelöst oder unterhalten wird. Dabei sollte untersucht werden, ob durch C.pneumoniae die intrazelluläre Signaltransduktion so verändert wird, dass eine vermehrte Thrombogenität und Entzündung an Endothel- und glatten Muskelzellen nachgewiesen werden kann. Als wichtigstes intrazelluläres Protein, welches eine Entzündungsreaktion und Thrombogenität einleiten kann, haben wir den Transkriptionsfaktor NF-κB untersucht.


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In der zweiten Arbeit war die Fragestellung, ob C.pneumoniae-infizierte glatte Muskelzellen (VSMC) derart aktiviert werden, dass sie Makrophagen oder T-Lymphozyten stimulieren, so dass der „cross-talk“ zwischen VSMC und Entzündungszellen aktiviert wird. Zudem haben wir untersucht, ob C.pneumoniae infizierte Makrophagen den Erreger in einer Art „lokalen Infektion“ an VSMC weitergeben können. Weiterhin wollten wir untersuchen, ob HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren einen inhibitorischen Einfluß auf die aktivierenden Signaltransduktionswege nach C.pneumoniae-Infektion haben. Dabei hat uns insbesondere die Prenylierung der Rho Familie interessiert. Entscheidend bei diesen Zellkulturarbeiten war, dass wir möglichst physiologische Situationen imitiert haben. Wir haben primäre humane VSMC und C.pneumoniae-Erreger verwendet, die aus humanen arteriosklerotischen Plaques isoliert wurden. Zudem ist die Konzentration der HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren so gewählt worden, wie sie bei Patienten in therapeutisch relevanten Dosierungen vorkommt.

In der 1. Arbeit des vorliegenden Teilprojekts wurden die folgenden Aufgaben bearbeitet:

In der 2. Arbeit des vorliegenden Teilprojekts wurden die folgenden Aufgaben bearbeitet:

2.2.3. Ergebnisse

2.2.3.1. Reprint Paper 2

Dechend R, Maass M, Gieffers J, Dietz R, Scheidereit C, Leutz A, Gulba DC
Chlamydia pneumoniae infection of vascular smooth muscle and endothelial cells activates NF-kappaB and induces tissue factor and PAI-1 expression : A potential link to accelerated arteriosclerosis.
Circulation 1999;100:1369-73


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2.2.3.2.  Signaltransduktion in glatten Muskelzellen nach Infektion mit
C. pneumoniae

Als wichtigstes Regulatorprotein in Entzündungsreaktionen hat sich der Transkriptionsfaktor NF-κB herauskristallisiert. Er aktiviert die wichtigsten Gene, die wir als Mediatoren einer Entzündungsreaktion kennen, wie z.B. TNFα, Chemokine (IL-1, IL-6, IL-8), Adhäsionsmoleküle (Selektine, VCAM-1, ICAM-1) und Gerinnungsfaktoren (Tissue Faktor, PAI-1). Weiterhin gibt es Hinweise, dass NF-κB an Wachstums- und Tumorprozessen sowie an der Apoptoseregulation beteiligt ist. Die Aktivierung von NF-κB nach C.pneumoniae-Infektion beginnt in unseren Untersuchungen nach 4 Stunden und ist auch nach 72 Stunden noch nachweisbar (siehe Reprint P2).

HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren haben gezeigt, dass sie die Plaque-Progression an Koronar- und Carotidarterien verlangsamen und dass sie die Restenoserate sowohl in Tiermodellen als auch an Patienten reduzieren. Diese so genannte Plaquepassivierung hat in einer kürzlich publizierten Studie ähnlich gute Erfolge gebracht wie eine durchgeführte Koronarangioplastie. Eine Sekundärprävention mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren hat die Sterblichkeit signifikant gesenkt. Aus der Analyse sämtlicher Daten geht hervor, dass die etablierte Wirkung auf das Cholesterin nicht der alleinige Mechanismus für den positiven Effekt der Statine ist. Als mögliche Mechanismen werden protektive Einflüsse auf das Endothel und die glatten Muskelzellen diskutiert, an der auch eine anti-inflammatorische Komponente beteiligt sein könnte.

Die Hypothese der weiteren Untersuchungen lautet: Die durch Chlamydia pneumoniae hervorgerufene chronische Entzündungsreaktion in humanen Gefäßmuskelzellen führt zu einer Chemotaxis und Aktivierung von Makrophagen und T-Lymphozyten. Es soll untersucht werden ob beide Prozesse durch NF-κB und RhoA/Rac1 reguliert werden. Wir wollen testen, ob durch HMG-CoA-Reduktase- Inhibitoren, die Chlamydia pneumoniae-induzierte NF-κB-Aktivierung bzw. die durch NF-κB vermittelten Prozesse inhibiert werden können.


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Abbildung 16 zeigt einen Elektro-Mobility Shift Assay für NF-κB 24 h nach Infektion mit C.pneumoniae. Dabei zeigte sich eine deutliche Zunahne der NF-κB-DNA-Bindungsaktivität nach C.pneumoniae-Infektion (Spur 5) gegenüber Mock-Infektion. Eine Therapie mit dem Antibiotikum Moxifloxacin (Spur 2) reduzierte die NF-κB-Aktivität auf den Leerwert. Einen ähnlichen Einfluß hatte eine Infektion mit abgetöteten C.pneumoniae. Die NF-κB-Aktivität in glatten Muskelzellen ist deutlich abgeschwächt. Eine Vorinkubation mit dem HMG-CoA-Reduktaseinhibitor Cerivastatin reduzierte die NF-κB-Aktivität ebenfalls deutlich.

Abbildung 16: NF-κB-DNA-Bindungsaktivität nach Mock Infektion (Spur 1) und 24h nach C.pneumoniae-Infektion (Spur 2-5) im EMSA. Antibiotische Therapie mit Moxifloxacin (Spur 2), Infektion mit abgetöteten C.pneumoniae-Erregern (Spur 3) und Vorinkubation mit dem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Cerivastatin reduzieren die NF-κB-Aktivität im Vergleich zur Infektion mit C.pneumoniae (Spur 5)

In Abbildung 17 konnten wir zeigen, dass HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine) im Zeitverlauf die NF-κB-Aktivität nach C.pneumoniae-Infektion reduzierten (linke [Seite 51↓]Abbildung). Die Hemmung der NF-κB-Aktivität durch Statine ist dosisabhängig. Ab einer Konzentration von 10 µg/ml von Cerivastatin ist eine NF-κB-Hemmung nachweisbar (mittlere Abbildung). Die Plasmakonzentration in Patienten, die Cerivastatin 0,4 erhalten, beträgt ungefähr 50 µg/ml, so dass die beobachteten Effekte klinisch relevant sein könnten. Supershift-Analysen mit Antikörper gegen p50 und p65 zeigen, dass der durchgeführte EMSA spezifisch ist und dass p50 und p65 die aktiven Komponenten der NF-κB-Familie sind (rechte Abbildung). Zudem konnten die spezifischen Banden durch einen 50-fachen Überschuß an nicht radioaktiv markierten Oligonukleotiden kompetiert werden.

Abbildung 17: (linke Abbildung) Zeitverlauf der NF-κB-Aktivität nach C.pneumoniae nach Vorinkubation mit Statin und Placebo. Der Effekt der Statine auf die NF-κB-Aktivität ist dosisabhängig (mittlere Abbildung). Supershift und Kompetition der NF-κB-Aktivität (rechte Abbildung).

Die Expression des Inhibitors IκBα wird nach Infektion mit C.pneumoniae degradiert. Vorinkubation mit Statinen verhindert die Degradation von IκBα nach C.pneumoniae-[Seite 52↓]Infektion (oberer Teil der Abbildung 18). Die Degradation von IκBα wird dosisabhängig durch Statine gehemmt (unterer Teil der Abbildung).

Abbildung 18: Expression von IκBα nach Infektion mit C.pneumoniae. oberer Teil der Abbildung: Zeitverlauf der IκBα-Expression. Vorinkubation mit einem Statin verhindert die Degradation von IκBα. Unterer Teil der Abbildung: Dosisabhängigkeit des Statineffektes auf die IκBα-Expression.

Um herauszufinden, ob der beobachtete Effekt der Statine auf die Inhibition der Geranylisierung von RhoA und Rac1 zurückzuführen ist, haben wir als nächstes untersucht, ob Mevalonat die Effekte von Statinen auf NF-κB und IκBα aufheben kann (Abbildung 19). Mevalonat antagonisiert die Statineffekte auf NF-κB, IκBα und Rac1 nach C.pneumoniae-Infektion. Eine Vorinkubation mit Mevalonat allein hatte keinen Einfluß auf die untersuchten Parameter.


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Abbildung 19: NF-κB-Aktivität, IκBα-Expression und Rac1-Expression nach C.pneumoniae Infektion und nach Vorinkubation mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren(Cerivastatin) und Mevalonat.

Um den weiteren Signaltransduktionsweg in glatten Muskelzellen nach C.pneumoniae-Infektion zu analysieren, haben wir untersucht, ob C.pneumoniae die Prenylierung von Rac1 und RhoA induziert und ob dieser Effekt durch Statine reduziert wird (Abbildung 20). Die Expression von Rac1 und RhoA an der Membran werden nach C.pneumoniae-Infektion gesteigert, während die zytoplasmatische Expression gleich bleibt oder leicht abnimmt. Dies ist ein biochemischer Hinweis auf eine Aktivierung der beiden Proteine. Statine in therapeutisch relevanter Dosierung hemmen die Prenylierung von Rac1 und RhoA. Aus dem Verhältnis der membranösen zur zytoplasmatischen Expression läßt sich die Aktivität von Rac1 und RhoA berechnen (Abbildung 20, unten).


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Abbildung 20: membrangebundene und zytoplasmatische Expression von Rac1 und RhoA nach C.pneumoniae-Infektion. Beide Proteine werden vermehrt an der Membran gebunden. Aus dem Verhältnis der membrangebundenen und der zytoplasmatischen Expression läßt sich die Aktivität von Rac1 und RhoA berechnen. Statine verhindern die C.pneumoniae-induzierte membrangebundene Expression von Rac1 und RhoA und damit die Aktivität der beiden Signaltransduktionswege.

Da die Expression von RhoA, die eine Untereinheit der vaskulären NADPH-Oxidase ist, durch C.pneumoniae induziert wurde, haben wir als nächstes untersucht, ob vermehrt Sauerstoffradikale durch C.pneumoniae-Infektion freigesetzt werden (Abbildung 21). Dazu haben wir die Cytochrome-C-Methode verwendet. Nach C.pneumoniae-Infektion kommt es zu einer Zunahme von Sauerstoffradikalen. Dieser [Seite 55↓]Effekt ist bereits 4 Stunden nach Infektion nachweisbar. Vorinkubation mit einem Statin reduziert die Sauerstoffradikalfreisetzung signifikant.

Abbildung 21: Cytochrome-C-Test zur Detektion von Sauerstoffradikalen. Bereits 4h nach C.pneumoniae-Infektion kommt es zu einer Zunahme von Sauerstoffradikalen in glatten Muskelzellen. Eine Vorinkubation mit Statinen reduziert die C.pneumoniae-induzierte Sauerstoffradikalfreisetzung.

Anschließend haben wir untersucht, ob die Expression von Zytokinen in glatten Muskelzellen induziert wird, die für die Chemotaxis und Aktivierung von Makrophagen und T-Lymphozyten verantwortlich sind. Deshalb haben wir Interleukin-6, Interleukin-8, RANTES und MCP-1 untersucht. Interleukin-6 wird im Überstand durch C.pneumoniae induziert (Abbildung 22, linke Abbildung). Bereits 10 µg/ml von Cerivastatin reduzieren die Expression im Überstand. Die IL-6-Induktion ist noch nach 24h nachweisbar. Auch zu späteren Zeitpunkten senken die Statine die IL-6-Expression (mittlere Abbildung). Analoge Ergebnisse haben wir erhalten, wenn wir mittels TaqMan die m-RNA-Expression gemessen haben. Geringe Dosierungen [Seite 56↓]von Statinen reduzieren die C.pneumoniae-induzierte Interleukin-6-Expression (rechte Abbildung)

Abbildung 22: linke Abbildung: IL-6-Expression im Überstand nach Mock und C.pneumoniae-Infektion (ELISA). Statine reduzieren die IL-6 Induktion. Mittlere Abbildung: Zeitverlauf der IL-6-Expression nach Vorinkubation mit Statinen. rechte Abbildung: mRNA-Expression (TaqMan) von IL-6 nach C.pneumoniae-Infektion und Statin-Vorinkubation

Die Expression von MCP-1 (Abbildung 23), Interleukin-8 (Abbildung 24), und RANTES (Abbildung 25), intrazellulär auf mRNA-Ebene und auf Proteinebene im Zellkulturüberstand nach C.pneumoniae-Infektion, zeigt ein ähnliches Profil wie bereits für Interleukin 6 beschrieben. Ähnlich verhält sich der Effekt der Statine. 10 µg/ml Cerivastatin hemmen deutlich die C.pneumoniae-induzierte Expression des Zytokin auf Proteinebene im Überstand. Konzentrationen von 50 – 250 µg/ml reduzieren die Expression auf, bzw. unterhalb der Expression der unstimulierten Zelle. Dies gilt für alle 4 untersuchten Parameter. In der TaqMan-Analyse zeigt sich, dass tendenziell höhere Konzentrationen des Statins nötig sind, um die C.pneumoniae-induzierte Expression zu inhibieren. Auffällig ist, dass zur Hemmung von T-Lymphozyten-aktivierenden Zytokinen (RANTES und IL-8) höhere Statin-Konzentrationen benötigt werden als für die Inhibition von Makrophagen-aktivierenden Zytokinen (IL-6 und MCP-1).


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Abbildung 23: linke Abbildung: MCP-1-Expression im Überstand nach Mock und C.pneumoniae-Infektion (ELISA). Statine reduzieren die MCP-1-Induktion. Mittlere Abbildung: Zeitverlauf der MCP-1 Expression nach Vorinkubation mit Statinen. rechte Abbildung: mRNA-Expression (TaqMan) von MCP-1 nach C.pneumoniae-Infektion und Statin-Vorinkubation.

Abbildung 24: linke Abbildung: IL-8-Expression im Überstand (ELISA). Mittlere Abbildung: Zeitverlauf der IL-8-Expression. rechte Abbildung: mRNA-Expression (TaqMan).von IL-8

Abbildung 25: linke Abbildung: RANTES-Expression im Überstand (ELISA). Mittlere Abbildung: Zeitverlauf der RANTES-Expression. rechte Abbildung: mRNA-Expression (TaqMan).von RANTES


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2.2.3.3.  Reprint Paper 3

Dechend R, J Gieffers, R Dietz, A Joerres, J Rupp, FC Luft, M Maass
HMG-CoA Reductase Inhibition Reduces Chlamydia pneumoniae-induced Cell Interaction And Activation,
Circulation 2003, 108; 261-265


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2.2.4.  Diskussion und Ausblick

Neben den klassischen Risikofaktoren für die Entstehung einer Arteriosklerose mehren sich die Berichte über eine Beteiligung verschiedener infektiöser Agenzien in der Induktion und Pathogenese dieser Erkrankung, wie Chlamydia pneumoniae oder auch Herpesviren.138-140

Seit kurzem wird die mögliche Beteiligung des obligat intrazellulären Bakteriums Chlamydia pneumoniae an der Pathogenese der Arteriosklerose diskutiert. Statistisch bedeutet die immunologische Auseinandersetzung mit dem Pathogen ein erhöhtes Risiko für koronare Herzkrankheit und Myokardinfarkt.141 Der direkte Nachweis von Erregerstrukturen und die Isolierung replikationsfähiger Chlamydien aus atheromatösen Plaques haben diesen Zusammenhang erhärtet und bereits erste klinische Studien zum Einsatz von Antibiotika bei koronarer Herzkrankheit veranlasst.136 Der experimentelle Beweis eines kausalen Beitrags der endovaskulären Infektion zur Pathogenese der Arteriosklerose läßt sich wegen Fehlens eines etablierten Tiermodells und eines Systems zur genetischen Rekombination des Erregers aber nicht unmittelbar erbringen.142 Das Fehlen eines verlässlichen Laborparameters für das Risiko einer koronaren Infektion erschwert das Verständnis des Krankheitsbildes zudem erheblich. Ob Chlamydia pneumoniae arteriosklerotische Veränderungen initiiert und zu ihrer Progression beiträgt oder lediglich bestehende Plaques kolonisiert, ist somit noch unklar.139 Der Beweis einer atherogenetischen Relevanz der Chlamydieninfektion könnte die Therapiekonzepte für die führende Todesursache in Industrieländern revolutionieren. Die Datenlage rechtfertigt jedoch bisher eine experimentelle Antibiotikatherapie arteriosklerotischer Grunderkrankungen ausschließlich im Rahmen gut kontrollierter klinischer Studien.140

Als chronisch-entzündliche Reaktion ist Arteriosklerose durch gesteigerte Synthese von Adhäsionsmolekülen und Zytokinen, Zellproliferation und Makrophagen-Migration charakterisiert.24 Ob diese Gefäßschäden die C. pneumoniae-Ansiedelung ermöglichen oder durch sie verursacht werden, ist unklar. Menschliches Hitzeschock-Protein (HSP60) wird mit der Entzündung im Plaque assoziiert. Seit kurzem ist [Seite 60↓]bekannt, dass auch das Analog bei Chlamydien (cHSP60) eine Gefäßzellaktivierung induziert und mit humanem HSP60 im Atherom co-lokalisiert.33 Die Gruppe von P. Libby konnte eine Co-Lokalisation des humanen Hitzeschockproteins 60 und dem von C.pneumoniae in arteriosklerotischem Material aufzeigen. Beide Hitzeschockproteine induzieren pro-inflammatorische Zytokine, wie TNFα, sowie matrix-degradierende Metalloproteinasen.143 Weitere Kandidatenproteine zur Induktion der Inflammation sind nur präliminär charakterisiert und bedürfen weiterer proteinchemischer Aufarbeitung, bevor ihre Funktion erfaßt werden kann.144 Arteriosklerotische Läsionen sind durch Veränderungen der Interaktion von Integrinen, Integrinrezeptoren und Matrixmolekülen gekennzeichnet.31 Unklar ist, ob C. pneumoniae diese Veränderungen hervorrufen kann. Die Expression einzelner als pathogenetisch relevant vermuteter Gene kann mit herkömmlichen Techniken zwar detailliert beschrieben werden, einen umfassenden Überblick über die Veränderungen der Genexpression in der Endothelzelle unter Chlamydieninfektion könnte aber die Mikroarray-Technologie geben (Endothel-Chip).145

Zirkulierende Monozyten können persistierend infiziert werden, d.h. die Chlamydien vermehren sich nicht und sind daher gegenüber Standard-Antibiotika refraktär.146 Ob ein entsprechender Persistenzstatus auch in der Gefäßwand etabliert wird, ist unbekannt. Die exakte Analyse des genetischen Hintergrunds der Chlamydien-Persistenz ist vordringlich, da von unmittelbarer konzeptioneller Bedeutung für die laufenden Antibiotika-Studien bei Arteriosklerose.142 Da für den Persistenz- und Resistenzmechanismus kein Target-Gen bekannt ist, ist der umfassende Zugriff auf die differentielle Genexpression im replizierenden und persistierenden Zustand des Pathogens, dessen Genom seit kurzem vorliegt, über die Konstruktion eines C. pneumoniae-DNA-Chips erforderlich.145

Die bei Hypercholesterinämie obligaten Lipidsenker reduzieren die Letalität in etwa 30 % der Fälle, nicht aber bei den übrigen 70 % („The forgotten majority“, P. Libby).33 Der Nutzen dieser Statine ist weitgehend unabhängig vom Cholesterinspiegel im Blut. Statine inhibieren die IL-8- und MCP-1-Synthese C. pneumoniae-infizierter [Seite 61↓]Gefäßzellen, womit sich direkte Bezüge zur vaskulären Infektion ergeben.147 Auch kann C. pneumoniae-LPS durch TNFα-induzierte Proteinlipase-Inhibition jene Lipidveränderungen hervorrufen, die als Arteriosklerose-Risikofaktoren definiert sind. Kontinuierliche LPS-Freisetzung, z.B. aus infizierten zirkulierenden Monozyten, könnte also eine atherogene Modifikation der Lipidmuster bewirken.148 Ein integrierendes Modell zur Interaktion von Lipidmetabolismus, Lipidsenkung und Infektion fehlt.

Die Immunantwort gegen einen intrazellulären Erreger wie C. pneumoniae ist vorwiegend zellulär. Dennoch sind T-Zell-Epitope bisher kaum charakterisiert.149 Eine Verbindung zur Arteriosklerose ergibt sich aus der nicht erklärten Akkumulation von T-Zellen im Plaque. Aus Plaques konnten bereits C. pneumoniae-spezifische T-Zellklone propagiert werden.138 Zur Charakterisierung chlamydienspezifischer T-Zell-Epitope aus Gefäßmaterial von Patienten bzw. aus dem Tiermodell bietet sich die hochsensitive Tetramer-Technologie an.150 Die Charakterisierung der zellulären Immunantwort ist zugleich Voraussetzung für eine eventuelle Impfstoffentwicklung.149

Ein mikrobieller Befall arteriosklerotischer Plaques ist zweifelsfrei abgesichert, eine Infektgenese der Arteriosklerose ist damit jedoch nicht bewiesen: Kolonisation ist ebenso möglich wie Initiation oder Förderung der Progression.151 Die Bestimmung des Stellenwertes der vaskulären Infektion ist an zellbiologische Untersuchungen von Wirt und Pathogen, Charakterisierung der zellulären Immunität und ein Tiermodell gebunden.152

Als eine mögliche (Mit-)Ursache entzündlicher Veränderungen werden Infektionen diskutiert, vor allem bei akuten koronaren Syndromen.153 An größeren Populationen konnte aber kein eindeutiger Zusammenhang zwischen Ereignissen und serologischen Befunden für z.B. Chlamydia pneumoniae, CMV oder Helicobacter pylori gezeigt werden. Andererseits lassen sich im Plaquematerial lebende Erreger nachweisen.141 Möglicherweise ist die entzündliche Gesamtbelastung („infectious burden“) als Trigger oder Promoter des entzündlichen Gefäßwandprozesses entscheidend.154 Eine Infektion kann eine Ursache für eine Aktivierung der [Seite 62↓]Monozyten mit Freisetzung prokoagulatorischer Substanzen sein. Eine weitere Möglichkeit ist die initiale Stimulation der Monozyten durch aktivierte Thrombozyten mit konsekutiver Freisetzung von Gewebefaktor und proinflammatorischen Substanzen einschließlich Interleukin-6.155 Dadurch könnte zusätzlich die Akute-Phase-Reaktion verstärkt werden, wenngleich ischämisches Myokard vor Monozyten und geschädigter Gefäßwand als bedeutendste Interleukin-6 Quelle angenommen werden muss: Eine Akute-Phase-Reaktion lässt sich entsprechend nur bei Troponin-positiven akuten Koronarsyndromen zeigen. Monozyten sind außer durch CRP u. a. durch Fibrinogen und lymphozytenmoduliert prokoagulatorisch aktivierbar.156

Die Anzucht des obligat intrazellulären Bakteriums Chlamydia pneumoniae aus arteriosklerotischen Plaques hat die Frage nach einer infektiösen Genese der Arteriosklerose aufgeworfen.127 Chlamydien sind persistierende epitheliale Pathogene. Arteriosklerose ist jedoch eine chronisch-inflammatorische Erkrankung mesenchymaler Gefäßwandzellen. Eine bakterielle Beteiligung an der Entstehung der Arteriosklerose erscheint daher plausibler, wenn diese mesenchymalen Zellen eine C.pneumoniae-Infektion dauerhaft unterhalten können.138 Daher wurden primäre und immortalisierte mesenchymale Zellen mit einem vaskulären und einem respiratorischen Chlamydia pneumoniae-Isolat inokuliert. Primäre humane Koronarendothelzellen, Gefäßmuskulaturzellen und Fibroblasten waren ebenso wie immortalisierte Zellen in der Lage, kontinuierliches Wachstum der Chlamydien zu unterhalten. Somit können die Zellen der Gefäßwand, die den atheromatösen Plaque bilden, eine kontinuierliche produktive Chlamydia pneumoniae-Infektion unterhalten.132,157 Immortalisierte monozytäre Zellen und Monozyten des peripheren Bluts konnten ebenfalls infiziert werden, jedoch nur über fünf Passagen. Monozyten/Makrophagen sind keine gefäßwandständigen Zellen, haben aber eine aktive Rolle in der Plaquebildung. Durch ihre Fähigkeit zu Zirkulation und transendothelialer Migration stellen sie potentielle Vektoren zur systemischen Verbreitung der Chlamydien dar.158 Die Hypothese einer chronisch infektiösen Komponente in der multifaktoriellen Genese der Arteriosklerose wird durch diese [Seite 63↓]Resultate erhärtet. Folgestudien müssen die Zielzellen in vivo exakt definieren und zwischen einer Infektion permanent gefäßwandständiger Zellen und transmigrierter Makrophagen unterscheiden.155 Eine endovaskuläre Infektion könnte zusätzliche Erklärungsmodelle für eine Reihe unklarer Phänomene der Arteriosklerose, wie mesenchymale Zellproliferation und die ausgeprägte inflammatorische Komponente, bieten.159

Arteriosklerotische Gefäßerkrankungen wie Herzinfarkt bleiben trotz der Erfolge in der Bekämpfung bekannter Risikofaktoren die führende Todesursache. Neue Therapiekonzepte für diese chronisch-entzündliche Gefäßerkrankung sind notwendig.137 Die Assoziation von Arteriosklerose und vaskulärer Infektion mit dem Bakterium Chlamydia pneumoniae eröffnet hier neue Zugänge wie den Einsatz von Antibiotika oder Impfstoffen, sofern sich eine Kausalität der Infektion für die Atherogenese belegen läßt. Voraussetzung ist das Verständnis der pathogenetischen Vorgänge auf Seiten des Erregers und des Wirts.26 Die Erregerbiologie in den beteiligten Zelltypen, die Reaktionen der infizierten Gefäßzellen, die Interaktion mit eukaryonten Grenzflächen (Alveolarepithel und Gefäßendothel) als auch in vivo ein Tiermodell und die zelluläre Immunantwort sind Ansatzpunkte der weiteren Forschungen.144


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2.3.  Projekt 3: Der Einfluss des Transkriptionsfaktors NF-kB sowie von Entzündungsreaktionen auf den Angiotensin II- vermittelten kardiovaskulären Endorganschaden

2.3.1. Einleitung

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die Haupttodesursache in Industrieländern. Bluthochdruck - in Deutschland gibt es etwa 16 Millionen Hypertoniker - ist ein Hauptrisikofaktor für die Entstehung von Endorganschäden, die zum Versagen der Nieren- und Herzfunktion führen können.160 Die genaue Ursache des Bluthochdruckes und seine Entstehung sowie die molekularen Pathomechanismen der Entstehung der Folgeerkrankungen sind bis heute nicht vollständig geklärt.161 Klinische Studien haben eine Verbindung zwischen der Aktivität des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) und dem Auftreten ischämischer Ereignisse belegt. Studien mit ACE-Hemmern zeigten deren protektiven Effekt für das kardiovaskuläre System. 162 Die dieser Beobachtung zugrunde liegenden Mechanismen werden aber noch nicht vollständig verstanden.

Das Renin-Angiotensin-System (RAS) spielt eine bedeutende Rolle bei der Regulation des Blutdrucks, der Elektrolyt- und Volumenhomöostase sowie bei pathomorphologischen Veränderungen bestimmter Organe. Neben seinen vasoaktiven und wachstumsfördernden Wirkungen aktiviert Ang II zirkulierende Leukozyten und Endothelzellen und fördert dadurch entzündliche Veränderungen sowie die extrazelluläre Matrix-Bildung.163

Neben dem klassischen zirkulierenden humoralen RAS konnten in den letzten Jahren auch lokale Gewebe-RAS unter anderem in Herz und Niere identifiziert werden.164 Dies führte dazu, dass Angiotensin (ANG) II nicht nur als ein im Blutkreislauf zirkulierendes Hormon, sondern auch als ein auto- und parakrin wirksames Gewebshormon angesehen wird, dessen Bildung in den einzelnen Zielorganen selbst reguliert werden kann.165 Lokal gebildetes und freigesetztes Ang I und Ang II kann zu den zirkulierenden Plasmaspiegeln beitragen und direkt zu einer [Seite 65↓]Vasokonstriktion führen. Diese lokale ANG-Bildung ist hauptsächlich von Renin abhängig.35

Als Modell für einen erhöhten Ang II-Spiegel verwendeten wir doppelt-transgene Ratten (dTGR). Dieses Modell wurde von Ganten et al. und Fumikazu et al. entwickelt.166,167 Das humane AOGEN-Konstrukt besteht aus dem gesamten humanen AOGEN-Gen (5 Exons und 4 Introns), flankiert von 1.3 kB am 5' Ende und 2.4 kB am 3' Ende; das humane Reninkonstrukt aus dem gesamten genomischen Bereich des humanen Reningens (10 Exons und 9 Introns) mit 3.0 kB der 5' Region des Promoters und zusätzlichen 1.2 kB der 3' Sequenz.168 Die Tiere gehen aus der Kreuzung der homozygoten humanen AOGEN-Linie und der homozygoten humanen Renin-Linie hervor. Die dTGR-Ratten exprimieren neben ihrem eigenen RAS das humane Renin - und humane AOGEN-Gen. Ratten, die nur einzeln transgen für humanes AOGEN oder humanes Renin sind, sind normoton. Humanes Renin spaltet nur humanes AOGEN, während Ratten-AOGEN nur als Substrat für Ratten-Renin dient. Das aus den beiden Systemen entstehende Ang I ist identisch und wird auf gleiche Weise zu Ang II umgewandelt.169 Unbehandelte dTGR-Ratten entwickeln Bluthochdruck, Niereninsuffizienz mit einer ausgeprägten Albuminurie, Vaskulopathie und schwere linksventrikuläre Hypertrophie mit fokalen Nekrosearealen. Sie sterben bereits im Alter von 7-8 Wochen.170,171 Aufgrund des Schweregrades der Nieren-, Herz- und Gefäßschädigung eignet sich das Modell in besonderer Weise zur Untersuchung der Pathogenese und der Ang II-bedingten Organschäden, aber auch für die Untersuchung der Wirksamkeit von Inhibitoren.89,172

2.3.2. Fragestellung

Ziel dieser Arbeit ist es, neue molekulare Mechanismen bei der Pathogenese Ang II-vermittelter Endorganschäden herauszufinden. Dabei sollen durch Intervention pharmakologischer Inhibitoren Erkenntnisse über molekulare Signaltransduktionswege bei Ang II-induzierten Nieren-, Herz- und Gefäßschäden gewonnen werden. Im Detail sollen untersucht werden:

2.3.3. Ergebnisse und Darstellung einzelner Studienergebnisse

2.3.3.1. Die Wirkung von Renin-Inhibitoren, ACE-Hemmern, AT1-Rezeptor-antagonisten sowie blutdrucksenkenden Substanzen auf Tissue Faktor und den Ang II-vermittelten Endorganschaden (Reprint P4)

Lokale Ang II-Wirkungen sind für Herz-, Nieren- und Gefäßschädigungen von besonderer Bedeutung.173 Wir haben daher in den letzten Jahren ein transgenes Tiermodell (dTGR) untersucht, welches das humane Renin- und AOGEN-Gen überexprimiert.171 Unbehandelte dTGR-Ratten entwickeln Bluthochdruck, Niereninsuffizienz, Vaskulopathie und schwere linksventrikuläre Hypertrophie mit fokalen Nekrosearealen, die wahrscheinlich auf der Basis von fibrinoiden Nekrosen und Gefäßverschlüssen entstanden sind. dTGR-Ratten entwickeln eine über 100-fach erhöhte Albuminurie. Die Ang II-Spiegel im Plasma, im Herz und in der Niere sind, verglichen mit nicht-transgenen Sprague-Dawley (SD)-Ratten, 3- bis 5-fach erhöht (Abbildung 26).89,174-176


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Abbildung 26: Schema des doppelt-transgenen Rattenmodells

Wir konnten in verschiedenen Studien am dTGR-Modell zeigen, dass Renininhibitoren mit ACE-Hemmern und AT1-Rezeptorblockern vergleichbare Erfolge bei der Prävention von Organschäden brachten.170,177-179 Sämtliche Inhibitoren verhinderten die Entstehung von Myokardinfarkten und Nierenschädigungen, die bei unbehandelten Tieren zum Tod führten. Die Endorganschadenprotektion war nicht primär von der Höhe des Blutdruckes abhängig. Eine Vergleichsstudie eines Renininhibitors mit der klassischen antihypertensiven Dreier-Therapie (Reserpin, Dihydralazin und Hydrochlorothiazid) zeigte, dass bei Normalisierung des Bluthochdruckes nur der Renininhibitor in der Lage war, die Entstehung des Endorganschadens zu verhindern.170 Wir konnten ferner nachweisen, dass Ang II die Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1 stimuliert und somit verschiedene durch NF-κB und/oder AP-1 regulierte Proteine beeinflusst, die eine Rolle bei der Entstehung des kardiovaskulären Endorganschadens spielen. In unbehandelten transgenen Tieren kam es zu einer Aktivierung sowohl der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 als auch des Chemokins MCP-1. Alle 3 Moleküle führten schließlich zu einer erhöhten Infiltration von Leukozyten (Abbildung 27).


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Abbildung 27: Leukozytenadhäsion und Transmigration in dTGR-Ratten

Makrophagen, Granulozyten und T-Zellen setzen daraufhin zytotoxische Stoffe frei, die dann wiederum die Transkriptionsfaktoren aktivieren (Circulus vitiosus). Zu weiteren zytotoxischen und pathologischen Parametern, die in dTGR-Ratten stimuliert waren, zählen die induzierbare NO-Synthase und der Tissue Faktor. Beide Gene besitzen in ihrer Promoterregion ebenfalls NF-κB- und AP-1- Bindungsstellen. Sämtliche Inhibitoren verhinderten die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren sowie die Aktivierung der durch NF-κB und/oder AP-1 regulierten Gene. Auch die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen und Fibrosierung sowie die Bildung von prokoagulativen Substanzen im Herzen und der Niere konnten vermindert werden.

Tissue Faktor ist ein Schlüsselprotein, welches sowohl Gerinnungsprozesse initiiert als auch eine intrazelluläre Signaltransduktion einleitet.180 Somit kommt diesem Protein eine besondere Bedeutung zu. Wir haben in mehreren Studien die Expression von Tissue Faktor untersucht.175,176,181 Die Expression und Aktivität von Tissue Faktor ist erhöht in Gefäßen, Nieren und am Herzen von dTGR ist deutlich erhöht gegenüber SD Organen. Wir konnten ebenfalls zeigen, dass in den gleichen [Seite 69↓]Organen jeweils die Aktivität und Expression der Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1 erhöht sind.

In einer Interventionsstudie mit dem Endothelin-Antagonisten Bosentan konnten wir zeigen, dass der kardiovaskuläre Endorganschaden deutlich reduziert wurde, obwohl der Effekt auf den Blutdruck nur gering war.181 Dihydralazin hatte bei gleichem Effekt auf den Blutdruck keinen positiven Einfluß auf den kardiovaskulären Endorganschaden. In der Studie haben wir die Expression und Aktivität von NF-κB, AP-1 und Tissue Faktor untersucht. Die immunohistochemische Analyse mit Phasenkontrastmikroskop zeigt die Lokalisation von aktiviertem NF-κB/p65 in der Niere. Die Expression von p65 ist erhöht im Endothel, in glatten Muskelzellen der kleinen Gefäße, Glomeruli, Entzündungszellen und Tubuli von unbehandelten dTGR Tieren (Abbildung 28). In nicht-transgenen SD Tieren war eine Expression von aktiviertem p65 nicht nachweisbar.

Abbildung 28: Expression von aktiviertem NF-kB/p65 in Nieren von dTGR Tieren (obere Reihe) und nicht transgenen SD-Tieren (untere Reihe).


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Parallel zur einer erhöhten Expression von NF-κB war die Aktivität von NF-κB in den Nieren von unbehandelten dTGR im Vergleich zu SD erhöht. Bosentan reduziert die NF-κB-Aktivität deutlich. Dihydralazin-behandelte Nieren zeigen weiterhin eine erhöhte NF-κB-Aktivität , vergleichbar mit unbehandelten dTGR (Abb. 29 A - C). Die Expression des wichtigsten Inhibitors für NF-κB, IκBα, ist reduziert in dTGR (Abb. D). Bosentan-Therapie verhindert die Degradation von IκBα, während Dihydralazin keinen Einfluss hat. Die Abbildungen E - G zeigen die DNA-Bindungsaktivität von AP-1 im Herzen. AP-1 Aktivität war erhöht in dTGR im Vergleich zu SD und konnte durch Bosentan reduziert werden.

Abbildung 29: NF-κB-Aktivität in Nieren (Abb. A), Kompetition mit unmarkierten Oligonukleotiden (Abb. B), Quantifizierung des NF-κB Bandshift (Abb. C), Expression von IκBα (Abb. D), AP-1-Aktivität im Herzen (Abb. E), Kompetition mit unmarkierten Oligonukleotiden (Abb. F), Quantifizierung der AP-1- Bandshift (Abb. G)


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Abbildung 30 A-D zeigt die Expression von NF-κB, Abbildung E-G die Expression von Tissue Faktor in konsekutiven Schnitten. Die Expression von Tissue Faktor ist erhöht in unbehandelten und Dihydralazin behandelten dTGR (Abb. 30E und G), während Bosentan die Tissue Faktor Expression deutlich reduzieren kann (Abb. F). Die Regionen, in denen eine vermehrte Tissue Faktor Expression aufweisen, zeigen auch eine erhöhte NF-κB Expression.

Abbildung 30: A – D: Expression von NF-κB, in konsekutiven Schnitten (Abb. 30 E – H) ist die Expression von Tissue Faktor dargestellt.


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In einer weiteren Inhibitorstudie mit einem Endothelin-Converting-Enzyme- (ECE) Inhibitor konnten wir zeigen, dass der kardiovaskuläre Endorganschaden durch diese Therapie positiv beeinflusst wird, während der renale Schaden unbeeinflusst bleibt.181 Die Mortalität wurde durch den ECE-Inhibitor signifikant gesenkt. Dabei zeigte sich, dass die extrazelluläre Matrixbildung durch den ECE-Inhibitor reduziert wird. Die Expression von Collagen I und Fibronektin sind in der Adventitia und um die Gefäße herum besonders hoch in dTGR, werden aber durch den ECE-Inhibitor deutlich gesenkt. Weiterhin haben wir die kardiale Expression von Tissue Faktor untersucht. In dTGR ist die Expression von Tissue Faktor am höchsten in der Gefäßwand, der Adventitia und in Entzündungszellen. Abbildung 31 zeigt die Expression in dTGR sowie die Reduktion der Expression durch den ECE-Inhibitor. Die Expression in ECE-Inhibitor behandelten dTGR ist jedoch noch immer höher als in nicht-transgenen SD-Tieren.

Abbildung 31: Tissue Faktor-Expression in kardialen Gefäßen


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2.3.3.2.  Reprint P 4

Dechend R*, DN Müller*, EMA. Mervaala*, A Fiebeler, JK Park, F Schmidt, J Theuer, V Breu, N Mackman, T Luther, DC Gulba, D Ganten, H Haller, FC Luft
AT1 receptor blockade reduces tissue factor via inhibition of NF-kB and AP-1 in angiotensin II-induced cardiac damage
Am J Pathol. 2000;157:111-22

*shared co-author (contributed equally)


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2.3.3.3.  Die Wirkung von anti-entzündlichen und immunsuppressiven Inhibitoren auf NF-kB, Entzündung und den Ang II-vermittelten Endorganschaden (Reprint P5 und P6)

Die Erkenntnis, dass verschiedene Behandlungen, die indirekt immer wieder die Leukozyteninfiltration verhindert hatten, Organschäden verbessern, führte zu der Hypothese, dass in dem untersuchten Tiermodell Entzündungsreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Endorganschäden spielen könnten.

Wir haben daher Studien mit anti-entzündlichen Inhibitoren (PDTC, Aspirin, Etanercept (löslicher TNFα-Rezeptor)), die die Aktivierung von NF-κB verhindern, sowie mit immunsuppressiven Substanzen wie Cyclosporin, Dexamethason und Mykophenolat-Mofetil durchgeführt.182,183 Sämtliche Inhibitoren verbesserten den Ang II-vermittelten Organschaden. Es war besonders erstaunlich, dass eine immunsuppressive Therapie, in einem per se nicht-immunologischen Modell, eine derart organprotektive Wirkung ergab. Es zeigte sich auch hierbei immer wieder, dass die Organprotektion nicht direkt mit der Höhe des Blutdruckes korreliert.

Wir haben 2 Interventionsstudien mittels PDTC und Aspirin mit dem Ziel durchgeführt, NF-κB und die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen am Herzen und in der Niere zu hemmen.93,98 Eine chronische Behandlung der dTGR-Ratten mit dem Antioxidans Pyrrholidondithiocarbamat (PDTC), einem unspezifischen NF-κB-Inhibitor, reduzierte die Albuminurie um mehr als 95% und verbesserte die Herzhypertrophie signifikant, obwohl der Blutdruck mit 168 mm Hg immer noch deutlich höher lag als bei nicht-transgenen Kontrolltieren.93 PDTC hemmte die NF-κB-Aktivität am Herzen und in der Niere, nicht jedoch die von AP-1. Die Makrophagen-Infiltration war unter PDTC geringer als bei unbehandelten dTGR-Ratten. Die Ergebnisse sind in Reprint P5 dargestellt.

In einer weiteren Studie behandelten wir dTGR-Ratten mit einer niedrigen, thrombozytenaggregationshemmenden und einer hohen anti-rheumatischen Dosis Aspirin.98 Yin et al. zeigten, dass Aspirin in Zellkuturexperimenten die I-κB-Kinase (IKK)-beta, die NF-κB-Aktiviert, hemmen kann. Wir untersuchten deshalb, inwieweit [Seite 75↓]Aspirin die IκKβ in vivo inhibiert und so den Ang II-vermittelten Endorganschaden verbessern kann.184

Überraschenderweise reduzierte nur die hohe Dosis von Aspirin (ASS 600) die Mortalität signifikant, während die geringe Aspirin-Dosis (ASS 25) keinen Einfluss auf die Mortalität hatte. Beide Aspirin-Dosierungen hatten keinen Einfluss auf die arterielle Hypertonie im Vergleich zu Placebo-behandelten dTGR. Die Herzhypertrophie ebenfalls wurde mittels Echokardiographie untersucht. Es zeigte sich, dass die Herzhypertrophie durch ASS 600 deutlich reduziert wurde, während ASS 25 keinen Einfluß hatte. Auch der Nierenschaden (z.B. Albuminurie) wurde durch ASS 600 signifikant geringer. Die niedrige Dosis schien unwirksam zu sein. Anschließend untersuchten wir die Thromboxanspiegel. Wir fanden, dass dTGR-Ratten mit hohen wie auch niedrigen Dosen Aspirin, im Vergleich zu unbehandelten dTGR-Ratten, signifikant niedrigere Thromboxan-B2-Spiegel hatten. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die organprotektive Wirkung von Aspirin nicht durch die Thrombozytenaggregation erklärt werden kann.

Wir untersuchten deshalb die Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1. Beide Transkriptionsfaktoren wurden am Herzen und in der Niere nur durch die hohe Dosis Aspirin signifikant gesenkt. Als nächstes untersuchten wir, ob die NF-κB-Aktivierung durch chronische aktivierte IκB-Kinasen entsteht. Die IκK-Aktivität aus Nieren war erhöht in dTGR Ratten und wurde durch Aspirin gesenkt. Neben der Aktivität war auch die Expression des IKK-Komplexes in den Nieren von dTGR erhöht. Als wichtiges NF-κB- und AP-1-reguliertes Protein in der Entzündungsreaktion haben wir das Adhäsionsprotein VCAM-1 untersucht. Es zeigte sich, dass die Expression in Gefäßen von Herz und Nieren der Placebo-behandelten dTGR Ratten erhöht ist. Nur die hohe Dosis Aspirin inhibiert die erhöhte Expression von VCAM-1. Weiterhin wurde die Expression des natürlichen Liganden von VCAM-1: VLA-4 ebenfalls durch die hohe Dosis Aspirin gesenkt.


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2.3.3.4.  Reprint P 5

Dechend R*, Müller DN*, Mervaala EMA, Schmidt F, Park J-K, Fiebeler A, Theuer J, Breu V, Ganten D, Haller H, Luft FC.
Inhibition of NF-kB protects against end-organ damage in rats with human renin and angiotensinogen genes.
Hypertension 2000, 35: 193-201

*,shared co-author (contributed equally)


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2.3.3.5.  Reprint P 6

Dechend R*, Muller DN*, Heissmeyer V*, Hampich F, Park JK, Fiebeler A, Shagdarsuren E, Theuer J, Pilz B, Breu V, Schroer K, Ganten D, Dietz R, Haller H, Scheidereit, C, Luft FC.
Aspirin inhibits NF-kappaB and protects from angiotensin II-induced organ damage.
FASEB J. 2001 ;15:1822-4

*,shared co-author (contributed equally)


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2.3.3.6.  Die Untersuchung des cholesterinunabhängigen Wirkmechanismuses von Statinen in-vivo und in-vitro (Reprint P7)

HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren haben protektive Wirkung bei Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.185 Die cholesterinsenkende Wirkung scheint nicht der alleinige Mechanismus für den positiven Effekt der Statine zu sein.147 Wir wollten deshalb untersuchen, welchen Einfluss der HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Cerivastatin in vivo auf den Ang II-vermittelten Endorganschaden hat. Die Sterblichkeit betrug in der dTGR-Gruppe nach 7 Wochen 45%; Cerivastatin reduzierte die Mortalität signifikant auf 20%. Auch die Herzhypertrophie ging unter Cerivastatintherapie signifikant zurück, war jedoch gegenüber gesunden, nicht-transgenen SD-Ratten erhöht. Die Plasmacholesterinwerte der drei Therapiegruppen unterschieden sich nicht. Albuminurie, Plasmaharnstoff und Plasmakreatinin, die in dTGR-Ratten stark erhöht sind, wurden durch Cerivastatin ebenfalls signifikant gesenkt, ebenso der Blutdruck. Wir glauben aber, dass dies kein direkter Effekt von Statinen auf den Blutdruck, sondern ein sekundärer Effekt durch Verhinderung einer terminalen Niereninsuffizienz ist. Letztendlich können wir aber einen direkten Effekt mit dieser Studie nicht ganz ausschließen. Im übrigen wurde die extrazelluläre Matrixproduktion wie auch die zelluläre Infiltration und Expression der Adhäsionsproteine ICAM-1 und VCAM-1 im Herzen und in der Niere durch Cerivastatin deutlich gesenkt, wobei jedoch alle Werte höher waren als in gesunden SD-Ratten (Abbildung 32)


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Abbildung 32: ICAM 1 Expession in der Niere

Als nächstes haben wir die Signaltransduktionskaskade untersucht. dTGR-Ratten zeigen eine erhöhte Expression von aktivierter phosphorilierter ERK 1/2 (extrazelluläre signalregulierte Kinase), insbesondere in der Gefäßwand, im Interstitium und in den Glomeruli. p-ERK wurde durch Cerivastatin stark reduziert (Abbildung 33).

Abbildung 33: ERK 1/2 Expression in der Niere

Auch die NF-κB- und AP-1- Aktivität wurde in der Niere durch Cerivastatin reduziert. Um zu zeigen, dass die Effekte des Cerivastatins tatsächlich unabhängig vom Blutdruck und Cholesterin sind, haben wir die Signaltransduktionin vitro untersucht. Ang II-Stimulation führte zur ERK 1/2-Phosphorilierung und konnte durch Cerivastatin [Seite 80↓]gehemmt werden (Abbildung 34). Um zu zeigen, dass Proteine wie Ras, Rho und Rac involviert sind, haben wir den hemmenden Effekt von Cerivastatin durch Mevalonat oder Farnesylphosphat aufgehoben.

Abbildung 34: pERK Phosphorilierung in VSMC nach Stimulation mit Ang II

2.3.3.7. Reprint Paper 7

Dechend R, Fiebeler A, Park J-K, Müller DN, Theuer J, Mervaala EMA, Bieringer M, Gulba D, Dietz R, Luft FC, Haller H:
Amelioration of angiotensin II-induced cardiac Injury by an HMG-CoA reductase inhibitor.
Circulation 2001;104:576-81.


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2.3.4.  Diskussion und Ausblick

Arterielle Hypertonie stellt einen der wichtigsten Risikofaktoren für vaskuläre, renale und kardiale Organschäden dar.34 Dass eine erhöhte kardiovaskuläre und renale Morbidität und Mortalität durch eine konsequente antihypertensive Therapie gesenkt werden können, ist durch viele Studien belegt.4 Die pathophysiologischen und molekularen Mechanismen, die zum renalen Endorganschaden führen, sind jedoch noch weitgehend ungeklärt.6 Aus pathologisch-anatomischen Untersuchungen ist bekannt, dass die ersten Schäden an den Nierengefäßen stattfinden, gefolgt von einer Nephrosklerose mit sekundären Schäden an Glomeruli und Tubuli. Die Spätstadien gehen mit einer Einschränkung der Nierenfunktion bis zur dialysepflichtigen Niereninsuffizienz einher.186

Einer der wichtigsten Faktoren in diesem Prozess ist das Oktapeptid Angiotensin II, das Schlüsselenzym des lokalen und zirkulierenden Renin-Angiotensin-Systems. Die physiologische und zelluläre Wirkung von Ang II wird über zwei verschiedene Ang II-Rezeptoren (AT1 und AT2) vermittelt.187 Ang II ist ein multifunktionelles Peptid, das stark vasokonstriktiv wirkt und an Herz und Gefäßen zu einer Hypertrophie führt. Ang II wirkt als direkter Wachstumsfaktor und induziert die Fibrogenese.188 Zusätzlich stimuliert Ang II zirkulierende Leukozyten und endotheliale Zellen und fördert dadurch entzündliche Veränderungen sowie die Akkumulation von extrazellulärer Matrix und Gerinnungsproteinen.189 Beide biologischen Effekte werden durch verschiedene Signaltransduktionswege vermittelt, die durch Ang II-vermittelte Entzündungsreaktion scheint als pathogenetisch wichtigster Mechanismus in den Vordergrund zu treten.190

Wir haben zeigen können, dass die Reduktion des Endorganschadens an Niere und Herz nicht primär von der Beeinflussung des Blutdrucks abhängt. Eine Inhibierung des Renin-Angiotensin-Systems (durch ACE-Hemmer, AT1-Blocker oder Reninantagonsten) führte teilweise unabhängig von deren Effekt auf den Blutdruck zu einer Reduktion bzw. Beseitigung des Endorganschadens.170,174 Demgegenüber senkte die Dreier-Therapie aus Hydralazin, Reserpin und Hydrochlorothiazid effektiv [Seite 82↓]den Blutdruck, doch führte diese Therapie nicht zu einer Abnahme der Mortalität und des Endorganschadens. Dieses "Uncoupling" von hypertoniebedingtem Endorganschaden und Senkung des arteriellen Blutdrucks hat dazu geführt, dass wir vermehrt das lokale RAS untersucht haben, um die zellulären Mechanismen aufzuklären, die für die Entstehung des Endorganschadens verantwortlich sind. Dabei konnten wir zeigen, dass die Aktivität und Expression von NF-κB in den Gefäßen, im Herz und in der Niere von dTGR stark gesteigert sind.

Die Bedeutung der Ang II-induzierten NF-κB-Aktivierung und konsekutiv unterhaltenen Entzündungsreaktion wurde durch pharmakologische Interventionsstudien gestärkt. Die Gabe des Antioxidants PDTC senkte die Mortalität um 40 % und verringerte den Endorganschaden an Herz und Niere.93 Die Albuminurie unter PDTC nahm um 95 %, die Infiltration von Makrophagen in der Niere um 70 % und im Herzen um 60 % ab. Wie bereits in der Literatur beschrieben, konnten wir eine verringerte Expression und Aktivität von NF-κB durch PDTC aufweisen, während AP-1 unverändert blieb. Demgegenüber war der Effekt auf den Blutdruck durch PDTC zu vernachlässigen. Dies ist für uns ein wichtiger Hinweis, dass der Blutdruck per se nicht die einzige Determinante für die Entstehung des Endorganschadens ist. Weitere pharmakologische Interventionen mit Cyclosporin A, Aspirin in hoher Dosierung und Dexamethason führten trotz höherem Blutdruck als in der dTGR-Gruppe durch ihre anti-inflammatorische Potenz zu einer Reduktion des Endorganschadens.98,182,183 Im einzelnen sahen wir bei allen drei Therapieansätzen eine Abnahme der Albuminurie, der Nephrosklerose (Abnahme von Collagen I, IV, Laminin und Fibronektin), eine Reduktion der Mortalität, der Herzhypertrophie und der Makrophageninfiltration, sowie eine verringerte Expression von Adhäsionsmolekülen, NADPH-Oxidase, iNOS und Gerinnungsproteinen. Aufgrund der Tatsache, dass alle untersuchten Proteine, von denen bekannt ist, dass sie an der Entstehung eines Endorganschaden beteiligt sind, durch NF-κB reguliert werden und wir bei allen erfolgreichen Therapiestrategien eine Reduktion der Expression und [Seite 83↓]Aktivität von NF-κB gefunden haben, sind wir der festen Überzeugung, dass NF-κB eine Schlüsselrolle bei Ang II-induzierten Endorganschäden spielt.

Ziel dieses Projektabschnittes war es, neue molekulare Mechanismen bei der Pathogenese Ang II-vermittelter Endorganschäden herauszufinden. Die Entstehung von Ang II-vermittelten Endorganschäden ist durch komplexe Interaktionen verschiedener endo- und parakriner Systeme bedingt.191 Das lokale Gewebe-Renin-Angiotensin-System war, wie auch Endothelin-1, Aldosteron sowie die RAS-Signaltransduktion, an der Pathogenese des Ang II-vermittelten Endorganschadens beteiligt.192 Die Organschädigung war nicht primär durch den hohen Blutdruck bestimmt. In vivo stellt sich die Differenzierung von hämodynamischen und nicht-hämodynamischen Ang II-Wirkungen nicht ganz einfach dar. Griffin et al. zeigten, dass Ang II bei Ratten, zum Teil über blutdruckunabhängige Mechanismen, zu Gefäßhypertrophie führt.193 Eine gleichzeitige Infusion von Ang II und dem Vasodilatator Dihydralazin führte zu einer blutdruckunabhängigen Proliferation von Zellen in den Mesenterialgefäßen und Karotiden. In transgenen Mäusen, die Ratten-Aogen lokal im Herzen überexpremieren, kam es zu einer lokalen Ang II-Produktion, die wiederum, blutdruckunabhängig, eine Myokardhypertrophie auslöste.194 Bei einer Vielzahl der in dieser Arbeit untersuchten Inhibitoren (Endothelin-Rezeptorblocker, Statin, Aldosteron-Antagonist, Aspirin, PDTC, Etanercept, Dexamethason, Mycophenolat-Mofetil) war der Blutdruck signifikant höher als in nicht-transgenen SD-Ratten.93,98,170,175,178,181-183,195,196 Die in vitro Wirkung von Statinen zeigte bei unseren Zellkulturexperimenten zur Ang II-stimulierten ERK1/2-Phosphorilierung ebenfalls einen blutdruckunabhängigen Einfluss.197

Ein weiterer Hauptbefund war, dass entzündliche Prozesse eine Schlüsselrolle in der Entstehung des kardiovaskulären Endorganschaden spielen.198 Vor wenigen Jahren ist NF-κB als ein essentieller Transkriptionsfaktor, der Entzündungsreaktionen aktiviert und reguliert, beschrieben worden.80 NF-κB ist in Makrophagen, Endothelzellen, glatten Gefäßmuskelzellen, Glomeruli und Tubuli existent. Im Gegensatz zu den meisten Transkriptionsfaktoren liegt NF-κB im unaktivierten [Seite 84↓]Zustand komplexgebunden an seinem Inhibitor IκB im Zytoplasma vor.199 Durch eine Vielzahl von externen Stimuli (TNFα, IL-1, PDGF) kommt es über den IκK-Komplex zur Phosphorilierung und Degradation von IκB. Nach der IκB-Degradation können die NF-κB-Dimere in den Nukleus gelangen, sich an κB-Stellen binden und somit die Aktivierung von Zielgenen induzieren.66 Dazu gehören neben vielen anderen IL-1, IL-6, IL-8, Interferon-γ, TNFα, die Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1, die Gerinnungsproteine Tissue Faktor und PAI-1 sowie das Chemokin MCP-1.65 Ang II kann NF-κB über den AT1- wie auch über den AT2-Rezeptor aktivieren.200 Eine klassische Hemmung mit RAS-Inhibitoren konnte - ebenso wie eine Blockade von Endothelin-1 oder die Signaltransduktionshemmung durch Statine bzw. TNFα Hemmung mit Etanercept - die NF-κB-Aktivierung in dTGR-Nieren und am Herzen reduzieren.98,175,179,201 Alle Inhibitoren waren außerdem in der Lage, die Leukozyten-Infiltration zu reduzieren sowie verschiedene durch NF-κB-regulierte Gene zu hemmen. Ein möglicher Signaltransduktionsweg, wie Ang II NF-κB aktivieren könnte, ist die Stimulation der membrangebundenen NAD(P)H-Oxidase und eine daraus resultierende Sauerstoffradikalbildung.202,203 Unsere Studie mit PDTC ergab, dass ein Antioxidans in vivoNF-κB und so auch die Entzündungsreaktion unterdrückt.93 Dexamethason-Behandlung konnte in vitro die Sauerstoffradikalbildung sowohl bei Ang II-stimulierten Makrophagen als auch in dTGR-Nieren hemmen.183 Verschiedene Autoren haben gezeigt, dass NF-κB auch bei kardiovaskulären Erkrankungen von Bedeutung ist. Morishita et al. konnten durch NF-κB-Inhibition mit der “Decoy”-Methode den Infarkt nach Reperfusionsschaden verringern.84 So konnten auch Tomita et al. die Organschädigung durch “NF-κB-Decoys“ bei Glomerulonephritis und bei entzündlichen Transplantationsschäden verringern.204 Ruiz-Ortega et al. und andere Arbeitsgruppen haben ebenfalls zeigen können, dass NF-κB durch Blockade des RAS gehemmt werden kann.87,205,206 Die Arbeitsgruppe von Remuzzi hat beschrieben, dass Albumin NF-κB auch bei Zellkulturexperimenten in Tubuluszellen aktivieren kann.207 Bei Nierenschäden mit Albuminurie könnte somit eine erhöhte Belastung der Tubuli durch Albumin zu einem NF-κB-vermittelten entzündlichen [Seite 85↓]Schaden führen. Wir können diesen Mechanismus für unsere dTGR-Ratten zwar nicht komplett ausschließen, wir meinen aber, dass er eher unwahrscheinlich ist, da unveröffentlichte Daten unserer Gruppe belegen, dass 4-5 Wochen alte dTGR-Ratten noch keine ausgeprägte Albuminurie, aber schon eine signifikant erhöhte Entzündungsreaktion zeigen.

Kopp et al. und Pierce et al. konnten mit Asprin bzw. Salicylat die Aktivierung von NF-κB verhindern.208,209 Unsere Studie mit Aspirin bestätigte in einem in vivo Modell die in vitro Ergebnisse von Pierce. Wie in den Zellkulturexperimenten konnten auch in vivonur sehr hohe Aspirindosen NF-κB hemmen und die Herz- und Nierenschäden verringern. Allerdings hemmten hohe Dosen Aspirin nicht nur NF-κB, sondern auch AP-1. AP-1, ein weiterer wichtiger Transkriptionsfaktor, der bei Herzhypertrophie von Bedeutung ist, reguliert verschiedene Matrixmoleküle wie Kollagen I und IV sowie Fibronektin. Die Matrixbildung ist in unbehandelten dTGR-Ratten stark ausgeprägt und konnte durch Aspirin, aber auch durch RAS-Blockade, Endothelin-Rezeptorblocker, Statine und Aldosteronantagonisten reduziert werden.

Auch die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen, die Fibrosierung sowie die Bildung von prokoagulativen Substanzen im Herzen und der Niere konnten vermindert werden (Abbildung 35).


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Abbildung 35: schematische Darstellung der pathophysiologischen Mechanismen, die zu dem Ang II-vermittelten Endorganschaden führen


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2.4.  Projekt 4: Die Bedeutung aktivierender Autoantikörper gegen den Angiotensin 1-Rezeptor und der Entzündungsreaktion in der Präeklampsie

2.4.1. Einleitung

2.4.1.1. Allgemeines

Präeklampsie ist definiert als ein Anstieg des Blutdrucks nach der 20. Schwangerschaftswoche auf (>140/90 mm Hg) mit Proteinurie (> 300 mg/l) in Patientinnen, die vorher keine Hypertonie oder Nierenveränderungen aufgewiesen haben210. Unter Eklampsie versteht man das Auftreten von Krämpfen bei Patientinnen mit Präeklampsie. Es kommt zu charakteristischen Veränderungen in Plazenta, Niere und Leber.211 Präeklampsie hat die höchste Inzidenz in der ersten Schwangerschaft. Insgesamt 5-10 % aller Schwangerschaften weltweit entwickeln eine Präeklampsie. Die Unterschiede sind aber regional sehr groß und variieren von 2-5% bis maximal 19%. Nach neuesten Untersuchungen gehen in Deutschland 25% aller maternalen und fetalen Komplikationen in der Schwangerschaft/Geburt auf eine Präeklampsie zurück.212 Damit ist die Präeklampsie eine Hauptursache für mütterliche Morbidität und Mortalität sowie die Hauptursache für kindliche Frühgeburtlichkeit und Morbidität.43 Die Häufigkeit der Präeklampsie nimmt mit jeder folgenden Schwangerschaft ab und ist so bei der zweiten Schwangerschaft um das 6-8fache niedriger.213 Dieser relative Schutz in den folgenden Schwangerschaften ist nicht mehr vorhanden, wenn die Kinder mit verschiedenen Vätern gezeugt werden, was die Bedeutung der väterlichen Gene in der Pathogenese unterstreicht.44 Die Inzidenz von Präeklampsie ist erhöht bei jungen Schwangeren, Mehrlingsschwangerschaften, Diabetes mellitus, Übergewicht und anderen Erkrankungen, die mit einer Autoimmunkrankheit assoziiert sind (wie Anti-Cardiolipin Antikörper-Syndrom).214 Die Häufigkeit einer Präeklampsie steigt mit dem Fortschreiten der Schwangerschaft und beginnt selten vor dem Ende des 2. Drittels [Seite 88↓]der Schwangerschaft. Die Symptome einer Präeklampsie verschwinden rasch nach Beendigung der Schwangerschaft.215

Auch die initiale Hoffnung, dass durch rapide Blutdrucksenkung sowie durch Gabe von Aspirin und Kalzium bzw. durch konsequente Behandlung von Schwangerschaftshypertonie die Inzidenz und der Schweregrad der Präeklampsie verringert werden könnten, hat sich nicht erfüllt.216 Bisher konnten die pathophysiologischen Veränderungen und die molekularen Mechanismen in der Präeklampsie in vivo nicht untersucht werden.42 Aus diesem Grund ist weitere wissenschaftliche Erforschung der Mechanismen und der Therapie der Präeklampsie erforderlich. Die Ursache für Präeklampsie ist trotz intensiver Forschung noch ungeklärt.217 Nach dem jetzigen Stand der Wissenschaft sind aber eine immunologische Komponente und eine Fehlregulation des Renin-Angiotensin Systems in dem Krankheitsprozess involviert.47,218

2.4.1.2. Pathologische Veränderungen sowohl der Plazenta und des präplazentaren Gefäßbettes als auch extraplazentarer Organe

Es wird ein akuter arteriosklerotischer Prozeß der Basalarterien, und zwar in ihrem myometrialen Abschnitt und am Übergang zur intradezidualen Spiralarterienstrecke beobachtet.219 Dabei treten fibrinoide Wandnekrosen, eine diffuse Fibrininsudation, Lipidakkumulation, Makrophagen und perivaskuläre monozytäre Infiltrate sowie zusätzliche Fibrinthromben auf. Was die Plazenta anbelangt, handelt es sich um eine Veränderung, die als Folge einer chronischen bzw. akuten Durchblutungsstörung anzusehen ist. Charakteristisch hierbei ist als erstes das vermehrte Auftreten von Proliferationsknospen am Chorionepithel als Antwort auf einen durch die intervillöse Hypoperfusion bedingten Sauerstoffmangel.45 Bei anhaltender Durchblutungsinsuffizienz gehen die Knospen in regressiv veränderte Epithelknoten mit Kern-und Zelluntergang über. Die hypoxische Schädigung des Epithels führt lokal zur Hyperkoagulabilität mit inter-und perivillöser Fibrinbildung und herdförmiger Verödung des Intervillosums, zu Konfluenz dieser Herde und zu mikro- und [Seite 89↓]makroskopisch erkennbaren Gitterinfarkten mit progressiver Einschränkung der plazentaren Austauschfläche.220 Die intervillöse Mangeldurchblutung hat herdförmig eine Minderung auch des intravillösen fetalen Blutdurchflusses zur Folge.221 Dies führt zu Fibrintranssudation in das Zottenstroma (intravillöses Fibrin, fibrinoide Zottendegeneration) und zu einer fortschreitenden Fibrose des Zottenstromas. Häufige Zeichen einer kompensatorischen reaktiven Blutraumgewinnung in der Plazenta sind eine Angiomatose oder eine Zottenfrühreife.222 Infolge einer vorzeitigen Lösung und einer akuten Durchblutungsinsuffizienz treten akute hämorrhagische Infarkte auf, die durch Alterung in chronische Herde übergehen können.223 Weitere wesentliche pathologische Veränderungen sind in folgenden Organen nachweisbar.

Niere: Auf Grund der pathophysiologischen Veränderungen kommt es zu einer Schwellung der Endothelzellen mit Einengung bis Obliteration der Glomerulumkapillarlichtungen224 und zu herd- und bandförmigen Fibrinablagerungen zwischen Basalmembran und Endothelzelle.225 Bei präexistenter Hypertonie entsteht dabei eine Gefäßsklerose. Postpartal kommt es zu einer Rückbildung dieser Veränderungen.226

Leber: Im Frühstadium der Präeklampsie ist sie nicht betroffen.210 Bei präeklamptischen Todesfällen jedoch findet man in 80-90% der Fälle eine Organminderdurchblutung aufgrund von Gefäßspasmen sowie fibrinreicher Gefäßwandnekrosen mit Lumeneinengung und disseminierten Fibrinthromben. Makroskopisch sieht man eine große bunte Leber mit Wechsel blasser anämischer und rötlicher hämorrhagischer Partien. Mikroskopisch findet man Parenchymnekrosen, Blutungen, Blutseebildungen und subkapsuläre Hämatomausbreitung.42

Gehirn:Man beobachtet Gefäßwandnekrosen, Fibrinthromben, petechiale Blutungen, Rindennekrosen und Marklagererweichungen.


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2.4.1.3.  Hypothesen der Präeklampsieentstehung

Da die Ursache der Präeklampsie noch nicht bekannt ist, gibt es verschiedene Theorien.42 Diese lassen sich in drei Kategorien einordnen.

Genetische Ursachen: Verschiedene Autoren haben auf eine genetische Prädisposition bei der Entstehung der Präeklampsie hingewiesen.46 Chesley beobachtete vor einigen Jahren, dass Töchter und Schwestern von präeklamptischen Frauen ein 30%iges Risiko besitzen, an Präeklampsie zu erkranken, gegenüber 5 % in der Normalbevölkerung.227 Somit könnte die Präeklampsie durch einen rezessiven bzw. einen dominanten Erbgang mit unvollständiger Penetranz erklärt werden. Diese Penetranz könnte vom fetalen Genotyp abhängen.210 Alternativ zeigen andere Experimente, dass die väterlichen Gene für die unvollständig Penetranz verantwortlich gemacht können.228 Die Arbeitsgruppe von Ward hat zeigen können, dass ein Polymorphismus im Angiotensin-Gen zu einer erhöhten Inzidenz von Präeklampsie führt. Diese Mutation führt ebenfalls zu einer erhöhten Expression des Angiotensin-Proteins in der Plazenta.229

Plazentare Ischämie45 : Um ein ausreichendes Nährstoffangebot für das ungeborene Kind zur Verfügung zu stellen, muss die Plazenta auf ein "Niederdruck"-System umgestellt werden, d.h. die Arterien in der Plazenta müssen umgebaut werden.230 Sie dürfen - im Gegensatz zu den anderen Gefäßen im Körper der Schwangeren - nicht auf vasokonstriktorische Stimuli reagieren.45 Die potentesten vasokonstriktorischen Stimuli sind Angiotensin (ANG) II, Thromboxan und Endothelin.221 Die Plazenta erreicht die Nicht-Ansprechbarkeit auf solche Reize, indem die glatte Muskelschicht und die Endothelzellen durch einwandernde Trophoblasten zerstört und ersetzt werden. Eine wichtige Voraussetzung für diesen Vorgang ist die Differenzierung der Trophoblasten, die dadurch einen anderen Phänotyp (vaskulärer Phänotyp) annehmen.231 Durch eine plazentare Ischämie kommt es zu einer Unterfunktion dieser Trophoblasten. Anders als ein vaskulärer Phänotyp exprimiert der ischämische Trophoblast Zytokine, Gerinnungsproteine und [Seite 91↓]Sauerstoffradikale, was zu einer endothelialen Dysfunktion führt.232 Die Ursache für die plazentare Ischämie ist noch nicht identifiziert. Viele Autoren sehen eine ursächliche Beteiligung des Renin-Angiotensin-Systems an der Ischämie, indem das RAS eine vermehrte Vasokonstriktion ausübt.233 Es konnte gezeigt werden, dass die Konzentration von Renin in der Plazenta von präeklamptischen Schwangeren erhöht war. Gant et al. stellten eine Hypersensitivität bei präeklamptischen Frauen gegenüber Angiotensin II fest.

Immunologische Ursachen47: Die Interaktionen zwischen dezidualen Leukozyten und dem invasiven Cytotrophoblast ist essentiell für die normale Trophoblastentwicklung.234 Auffällig dabei ist, dass in der gesunden Plazenta eine einzigartige immunologische Konstellation vorliegt, die Toleranz gegen die kindlichen Antigene ermöglicht.234 Was genau diese immunologische Toleranz bewirkt, ist unklar. Sowohl der HLA-Typus der Trophoblasten als auch die vorhanden Entzündungszellen (sogenannte "large granular Lymphocytes") sind einzigartig im Körper.235 Bei der Präeklampsie ist die Interaktion zwischen Trophoblast und Leukozyt gestört. Statt der "schwangerschafts-schützenden" Zytokine wie Interleukin- 8, Interferon-γ werden die Cytokine gebildet, die die oben beschriebenen endotheliale Dysfunktion verstärken.232 Eine mögliche Ursache für das gestörte Zusammenspiel könnte das Auftreten von Autoantikörpern sein. Dadurch wird die protektive Immunantwort in eine aggressive moduliert.236

2.4.1.4. Vorarbeiten

Wahrscheinlich spielen frühe Störungen der Plazentation eine wesentliche Rolle für die Entwicklung der Präeklampsie.237 Die verminderte Throphoblasteninvasion in den myometrialen Anteil der Spiralarterien führt zu einem verminderten intervillösen Blutfluss und einer damit verbundenen Hypoxie der fetoplazentaren Einheit.238 Die plazentare Hypoperfusion führt wahrscheinlich über eine Endothelzellschädigung zu einem abnormalen Prostaglandinmetabolismus, der intervaskulären Aktivierung des Gerinnungssystems und einer erhöhten vaskulären Sensitivität auf pressorisch [Seite 92↓]wirksame Substanzen wie Angiotensin II.233 Eine Reihe von Untersuchungsbefunden spricht dafür, dass zirkulierende Faktoren für diese Endothelzelldysfunktion verantwortlich sind.238 Wir konnten zeigen, dass Serum von Präeklampsiepatientinnen auf kultivierten endothelialen Zellen aus humanen Nabelschnurvenen zu einer gesteigerten Expression von ICAM-1 Adhäsionsmolekülen führt, verbunden mit einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration.239 Dieser Effekt war nach der Geburt nicht mehr nachweisbar. Weiterhin beobachteten wir, dass Serum von Präeklampsiepatientinnen die Permeabilität endothelialer Zellkulturen für Albumin erheblich steigert.240 Auch dieser Effekt war postpartal signifikant vermindert. Serum von normotensiven Schwangeren, schwangeren Frauen mit essentieller Hypertonie, altersentsprechenden Patientinnen mit essentieller Hypertonie und gesunden nicht schwangeren Frauen hatten keinen Einfluss auf die endotheliale Permeabilität und die Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle. Bei der Suche nach dafür verantwortlichen zirkulierenden Faktoren konzentrierten wir uns nachfolgend auf ebenfalls seit längerem diskutierte immunologische Mechanismen in der Pathogenese der Präeklampsie.241 Ausgehend von der Beobachtung, dass Patientinnen mit primärer Hypertonie in einem relativ hohen Prozentsatz agonistisch wirksame Autoantikörper gegen Alpha-1-Rezeptoren entwickeln, testete unsere Arbeitsgruppe die Hypothese, dass Präeklampsiepatientinnen funktionell wirksame Antikörper gegen vaskuläre Hormonrezeptoren bilden. Da eine erhöhte vaskuläre Sensitivität gegenüber Angiotensin II typisch für die Entwicklung einer Präeklampsie ist,218 waren Angiotensin II-Rezeptoren von vorrangigem Interesse. Mittels des Bioasseys der spontanpulsierenden kultivierten neonatalen Rattenherzmuskelzellen, Westernblot und konfokaler Mikroskopie konnten wir zeigen, dass Immunglobuline von Patientinnen mit Präeklampsie einen Faktor enthalten, der den Angiotensin AT1-Rezeptor stimuliert.242

In der initialen Studie wurden 25 Patientinnen mit Präeklampsie (erstmaliges Auftreten einer arteriellen Hypertonie > 140/90 mmHg und einer Proteinurie > 300 [Seite 93↓]mg/l im 24-h-Urin) untersucht. Die Studie zeigte, dass die Immunglobulinfraktion von Patientinnen mit Präeklampsie einschließlich HELLP-Syndrom Antikörper enthält, die an den Angiotensin-1-Rezeptor binden. Diese Antikörper wirken agonistisch, d. h. sie aktivieren den AT1-Rezeptor. Nach Entbindung ist eine rasche Verminderung der Antikörperaktivität zu beobachten. Affinitätschromatographische Reinigung und Inkubation mit antihumanem IgG- und IgM-Antikörpern belegen, dass es sich um einen IgG-Autoantikörper gegen den AT1-Rezeptor handelt. Die Untersuchungsergebnisse mit Peptidsequenzen der 2. Schleife des Rezeptors sprechen dafür, dass diese die Bindungsstelle für den Antikörper enthält. Mittels kurzer überlappender Peptide dieser 2. Schleife konnte die Aminosäuresequenz AFHYESQ als Bindungsstelle bestimmt werden. Bei einigen Präeklampsiepatientinnen war zusätzlich ein geringer agonistisch wirksamer Antikörpereffekt gegen den Alpha-1-Rezeptor nachweisbar, ebenso wie bei schwangeren Patientinnen mit einer präexistenten essentiellen Hypertonie. Dieser Befund entsprach Untersuchungsergebnissen, wie wir sie bei Patientinnen mit essentieller Hypertonie beschrieben hatten. Doch konnten wir bei keiner schwangeren Patientin mit unkomplizierter essentieller Hypertonie Antikörper gegen den Angiotensin-1-Rezeptor nachweisen. Die mittels des Bioasseys der spontanpulsierenden Rattenherzmuskelzellen gewonnenen Befunde zur Identifizierung von Antikörpern gegen den AT1-Rezeptor wurden durch Westernblot und konfokale Mikroskopie an vaskulären glatten Muskelzellen bestätigt. Die durch den AT1-Antikörper vermittelte intrazelluläre Signalübertragung war durch den PKC-Inhibitor Calphoszin C vollständig zu inhibieren, was für die Involvierung der Proteinkinase C in die Zellaktivierung spricht. Die dargestellten Befunde stützen die Hypothese, dass Autoantikörper gegen Angiotensin-1-Rezeptoren eine Rolle in der Pathogenese der Präeklampsie spielen.


[Seite 94↓]

2.4.2.  Fragestellung

Ziel der Untersuchungen ist:

2.4.3. Ergebnisse

2.4.3.1. Aktivierung des Tissue Faktors

Unsere Vorarbeiten haben gezeigt, dass die gereinigten Autoantikörper (AT1-AA) funktionell an den AT1-Rezeptor binden. Als erstes haben wir durch eine biochemische Methode (Co-Immunopräzipitation) die Bindung zwischen Autoantikörper und Rezeptor bestätigt. Wir konnten ein Extrakt aus glatten Muskelzellen nach Präzipitation mit einem AT1-Rezeptor-Antikörper erfolgreich mit den Autoantikörpern detektieren. Der umgekehrte Ansatz, die Präziptiation mit den Autoantikörpern und die anschließende Detektion mit einem kommerziellen Antikörper gegen den AT1-Rezeptor war ebenfalls erfolgreich. Autoantikörper von Patientinnen mit Präeklampsie, die nicht an die spezifische Säule mit dem AT1-Rezeptor-Peptid (ns IgG) binden, können keine Co-Immunopräzitation mit dem AT1-Rezeptor hervorrufen.

Als nächstes haben wir die Signaltransduktion der AT1-AA in glatten Muskelzellen untersucht. Wir konnten eine p42/p44 MAP-Kinase-Aktivierung durch Ang II und die [Seite 95↓]AT1-AA nachweisen, die durch den AT1-Rezeptor-Blocker Losartan blockiert werden konnte. Anschließend haben wir die DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors AP-1 aktiviert. AT1-AA und Ang II aktivieren AP-1, was durch Losartan inhibiert werden konnte. Durch Supershift-Analyse mit Antikörpern gegen c-jun und Kompetition mit nicht-radioaktiv markierten Oligonukleotiden konnten wir die Spezifität des Elektro-Mobility-Shift-Assay nachweisen. IgG-Präparationen von gesunden Schwangeren (npIgG) und IgG-Präparationen von präeklamptischen Patientinnen, die nicht die spezifische Fraktion (nsIgG) enthalten, zeigen keinen Effekt auf p42/p44-MAP-Kinase-Aktivierung, sowie auf die DNA-Bindungsaktivität von AP-1.

Als wichtiges AP-1-und NF-kB-reguliertes Protein haben wir den Einfluss der AT1-AA auf den Tissue Faktor untersucht. Als erstes haben wir mittels Luciferase-Untersuchungen zeigen können, dass AT1-AA und Ang II den Tissue Faktor- Promoter in glatten Muskelzellen aktivieren. Eine Mutation, die die AP-1- und NF-κB- Bindungsstelle deletiert, verhindert den Effekt von Ang II und AT1-AA. In CHO-Zellen, die keinen AT1-Rezeptor besitzen, zeigen AT1-AA und Ang II ebenfalls keine Aktivierung des Tissue Faktor-Promoters. Wird jedoch der AT1-Rezeptor stabil in CHO Zellen transfiziert, ist die Tissue Faktor-Aktivierung durch AT1-AA und Ang II erneut nachweisbar. Diese Aktivierung ist durch Losartan blockierbar. In beiden Zellen haben np IgG und ns IgG keinen Einfluss auf den Tissue Faktor-Promoter. Parallel zur Expression des Tissue Faktor-Promoters haben wir die Tissue Faktor- Aktivität gemessen. AT1-AA und Ang II, nicht aber np IgG und ns IgG, erhöhten die Tissue Faktor Aktivität in glatten Muskelzellen. Somit konnten wir zeigen, dass die Expression und die Aktivität des Tissue Faktors parallel sind.

Dann haben wir die Expression und Aktivität des Tissue Faktors in den Plazenten von gesunden Schwangeren und präeklamptischen Patientinnen untersucht. Sowohl die Expression als auch die Aktivität des Tissue Faktors sind in den präeklamptischen Plazenten erhöht. Die Expression ist vor allenm in Trophoblasten und in Gefäßen in den präeklamptischen Plazenten erhöht, doch zeigen auch die [Seite 96↓]Gefäße in unauffälligen Plazenten eine geringe Tissue Faktor-Expression.

In dieser Arbeit haben wir mit einer biochemischen Methode zeigen können, dass AT1-AA direkt an den AT1-Rezeptor binden. AT1-AA induzieren eine p22/p42 MAP-Kinase-Aktivierung. Weiterhin erhöhen die AT1-AA die DNA-Bindungsaktivität von AP-1. Der Tissue Faktor-Promoter wurde durch die AT1-AA aktiviert. Die Aktivierung des Tissue Faktor-Promoters ist abhängig von der Intaktheit der AP-1 und NF-κB im Promoter und der Präsenz des AT1-Rezeptors. Die Expression und die Aktivität des Tissue Faktor ist erhöht in den Plazenten von präeklamptischen Patientinnen.

2.4.3.2. Reprint Paper P8

Dechend R, V Homuth, G Wallukat, J Kreuzer, JK Park, J Theuer, A Juepner, DC Gulba, N Mackman, H Haller, FC. Luft
AT1 Receptor agonistic antibodies from preeclamptic patients cause vascular cells to express tissue factor
Circulation 2000 ;101:2382-2387


[Seite 97↓]

2.4.3.3.  Aktivierung der NADPH-Oxidase und redoxsensitive Signaltransduktion

In der jetzigen Arbeit haben wir die in vitro-Effekte der über die spezifische Säule gereinigten Autoantikörper (AT1-AA) untersucht und begonnen, in vitro mögliche relevante Signaltransduktionswege aufzuzeigen, die in der Pathophysiologie der Präeklampsie eine wichtige Rolle spielen könnten. AT1-AA induzieren intrazelluläre Sauerstoffradikalfreisetzung, gemessen mit der DCF-Methode. Der Effekt ist dem von Angiotensin II vergleichbar. Die beiden Kontrollen, IgG von gesunden Schwangeren (np IgG) und die IgGs von den Präekampsiepatientinnnen, die nicht an unsere spezifische Säule binden (ns IgG), haben keinen induzierenden Effekt. Durch die Vorinkubation mit verschiedenen Inhibitoren läßt sich zeigen, dass der Effekt der AT1-AA AT-1-Rezeptor-vermittelt ist (Hemmung durch Losartan), dass Superoxiddismutase den Effekt aufhebt und dass Cox-2 (Indometacin hat keinen Effekt), die Xanthinoxidase (kein Effekt durch Allopurinol) und NOS nicht involviert sind. Diphenyliumjodid (DPI), ein Hemmstoff für Flavin-haltige Oxidasen, deren wichtigster Vertreter die NADPH-Oxidase ist, hemmt einen bedeutenden (signifikanten) Anteil der AT1-AT1-AA-induzierten intrazellulären Sauerstoff (ROS)- Generation. Da es keinen spezifischen Inhibitor für die NADPH-Oxidase gibt, haben wir über Antisense-Technik eine der Untereinheiten der NADPH-Oxidase (p22 phox) funktionell blockiert und sehen die gleichen Effekte wie bei DPI, nämlich eine signifikante, aber nicht komplette Hemmung der ROS-Generation. Neben den glatten Muskelzellen, die in einer normalen Schwangerschaft in der Plazenta zerstört werden, bei der Präeklampsie jedoch persistieren, spielen Trophoblasten eine wichtige Rolle in der Präeklampsieentstehung. Bevor wir testen konnten, welchen Effekt die AT1-AA auf Trophoblasten haben, mussten wir erst nachweisen, ob primäre humane Trophoblasten ein lokales Renin-Angiotensin-System exprimieren. Den Nachweis haben wir mittels quantitativer PCR (Taq-Man) erbracht und gefunden, dass Trophoblasten während jedes Stadiums der Differenzierung alle 5 Komponenten des lokalen Renin-Angiotensin-Systems expremieren. Zu unserer Überraschung war die Expressionsstärke, verglichen mit primären humanen [Seite 98↓]Adipozyten, wo die Bedeutung eines lokalen RAS mittlerweile etabliert ist, deutlich höher. Als nächstes haben wir zeigen können, dass auch Trophoblasten mit einer vermehrten intrazellulären ROS-Freisetzung auf AT1-AA und Ang II reagieren, jedoch in der Quantität geringer als VSMC. Durch partielle Hemmbarkeit des Effektes durch DPI gab es erneut Hinweise, dass die NADPH-Oxidase ein wichtiges Glied in der Signaltransduktionskaskade ist. In weiteren Experimenten konnten wir zeigen, dass AT1-AA, nicht jedoch ns IgG und np IgG die NADPH-Oxidase-Untereinheiten p22 phox (membranständig), p47 phox und p67 phox (zytosolisch) in VSMC und Trophoblasten induzieren. Als wichtigen redox-regulierten Transkriptionsfaktor, der Inflammation, aber auch Apoptose und Proliferation reguliert, haben wir NF-κB in beiden Zelltypen angeschaut. AT1-AA induzieren in beiden Zellen NF-κB. Durch Supershift mit p50 und p65 konnten wir zum einen die Spezifität des Bandshifts demonstrieren, zum anderen die relevanten Untereinheiten der NF-κB-Familie identifizieren. Losartan und DPI hemmen die AT1-AT1-AA-induzierte NF-κB-Freisetzung.

Diese interessanten in vitro-Befunde haben wir auf die ex vivo-Situation an der präeklamptischen Plazenta zu übertragen versucht. Wir haben mittels Immunohistochemie, Western-Blot und Taq-Man Untersuchungen gezeigt, dass die bereits vorher untersuchten Untereinheiten der NADPH-Oxidase, p22, p47 und p67 phox, in der präeklamptischen Plazenta vermehrt exprimiert werden, während ihre Expression in der gesunden Plazenta nur sehr gering ist. Ebenso ist die Expression von intrazellulären Sauerstoffradikalen in der Präeklampsie deutlich höher als in der gesunden Plazenta. Gemessen haben wir die ROS mit der oxidativen Fluoroskopie (Dihydroethidin). Um zu zeigen, dass auch in der Plazenta VSMC und Trophoblasten die maßgeblichen Produzenten der Sauerstoffradikalen sind, haben wir eine Co-Lokalisation für den Trophoblasten-Marker (Cytokeratin 7) und p22 phox sowie in seriellen Schnitten die oxidative Fluoroskopie und smooth-muscle-α-actin Färbung durchgeführt. Parallel zu den Experimenten haben wir zeigen können, dass NF-κB in [Seite 99↓]der präeklamptischen Plazenta vermehrt aktiv ist (Bandshift) und vermehrt exprimiert wird (Immunohistochemie mit einem Antikörper, der nur aktiviertes p65 erkennt).

Zusammenfassend läßt sich sagen, dass wir interessante und potentiell wichtige in vitro Effekte an primären humanen VSMC und Trophoblasten der gereinigten Autoantikörper aufzeigen konnten. Diese beinhalten die intrazelluläre Sauerstofffreisetzung, die Aktivierung der NADPH-Oxidase und die konsekutive Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB. Diese Effekte sind bisher in der Präeklampsie noch nicht beschrieben worden.

Deshalb haben wir in einem zweiten Schritt untersucht und gefunden, dass in der präeklamptischen Plazenta Sauerstoffradikale, NADPH-Oxidase und NF-κB deutlich erhöht sind im Vergleich zur gesunden Plazenta. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass die Autoantikörper gegen den AT-1 Rezeptor in die Pathophysiologie der Präeklampsie involviert sind. Einen Beweis können wir mit dieser Arbeit jedoch nicht liefern, dazu sind weitere Studien nötig. So testen wir die Autoantikörper zur Zeit im Tiermodell, und seit 4 Monaten werden Patientinnen mit einer schweren Präeklampsie in einer ersten Pilotstudie einer Immunadsorption unterzogen.

2.4.3.4. Reprint Paper P9

Dechend R, Viedt C , Müller DN, Ugele B, Brandes RP, Wallukat G, Park JK, Janke J, Barta P, Theuer J, Fiebeler A, Homuth V , Dietz R, Haller H, Kreuzer J, Luft FC
AT1 receptor agonistic antibodies from preeclamptic patients stimulate NADPH-Oxidase
Circulation, 2003 1;107:1632-9.


[Seite 100↓]

2.4.3.5.  Reprint Editorial

Zu dieser Arbeit ist in der gleichen Ausgabe der Zeitschrift „Circulation“ ein Editorial erschienen.

Editorial
zu der Arbeit von Dechend et al.: Circulation 2000 ;101:2382-2387
Von
James M. Roberts
Angiotensin-1 Receptor Autoantibodies -A Role in the Pathogenesis of Preeclampsia?


[Seite 101↓]

2.4.4.  Diskussion und Ausblick

Das Krankheitsbild der Präeklampsie ist mit ausgeprägten Veränderungen im Renin-Angiotensin-System verbunden, die sich vorwiegend in einer Verminderung der Plasmareninaktivität und einer erhöhten pressorischen Angiotensin II-Sensitivität äußern.233 Aus letzterer resultiert der Angiotensin-Sensitivitätstest als Prädiktor für die Entwicklung einer Präeklampsie. Eine spezifische Überempfindlichkeit auf Angiotensin II wurde an isolierten Widerstandsgefäßen von Frauen mit Präeklampsie dokumentiert. Im Einklang damit steht die Beobachtung, dass Thrombozyten von Präeklampsiepatientinnen im Vergleich zur normotonen Schwangerschaft mit gesteigerter intrazellulärer Kalziumfreisetzung auf Angiotensin II reagieren.243 Mit der erhöhten Angiotensin II-Sensitivität gehen fallende Angiotensin II-Plasmakonzentrationen einher, die wiederum für eine verminderte Produktion vasodilatatorisch wirksamer Prostanoide verantwortlich sein könnten.244 Insbesondere die Hochregulation von Angiotensin II-Rezeptoren,245 nachgewiesen mittels Angiotensin II-Bindungsstudien an Thrombozyten, könnte die verstärkte Angiotensin II-Blutdruckreaktion bei Präeklampsiepatientinnen erklären.246

Im fetoplazentaren Kreislauf wurden bei Präeklampsie divergierende Befunde zur mütterlichen Zirkulation erhoben. Normale und erhöhte Spiegel von Komponenten des RAS in Plazenta und fetalen Geweben sind wahrscheinlich Ausdruck der Aktivierung des lokalen RAS infolge der plazentaren Minderperfusion.247 Ebenso steht die verminderte plazentare Expression von Angiotensin-AT1-Rezeptoren im Gegensatz zu den mütterlichen Befunden, kann aber als sekundäre Herabregulation bei aktiviertem plazentarem RAS interpretiert werden.248 Diese Befunde stehen im Einklang damit, dass eine verminderte plazentare Perfusion eine zentrale Rolle in der Pathogenese der Präeklampsie spielt.249 Weitere Hinweise dafür, dass das Renin-Angiotensin-System in die Pathogenese der Präeklampsie involviert ist, liefern genetische Untersuchungen.250 So konnte bei Patientinnen mit Präeklampsie im Vergleich zu normotonen Schwangeren eine Variation auf dem Angiotensin-Gen-Lokus nachgewiesen werden, die auch bei Patientinnen mit essentieller Hypertonie [Seite 102↓]assoziiert zu sein scheint. Es handelt sich dabei um die M235T-Variante des Angiotensinogen-Gens, die durch den Einbau von Threonin anstelle von Metionin als 235. Amminosäure im Angiotensinogenmolekül gekennzeichnet ist.233 Eine vermehrte lokale Expression von Angiotensinogen in uterinen Spiralarterien könnte ebenfalls für die Entwicklung einer Präeklampsie bedeutsam sein. Darauf weisen Untersuchungsbefunde hin, die in dezidualen Spiralarterien von Angiotensinogen-T235M-heterozygoten schwangeren Frauen im 1. Trimenon eine erhöhte Expression der T235-Angiotensinogenvariante fanden.229 Daraus ableitbare Störungen von physiologischen schwangerschaftsspezifischen Umbauprozessen der Spiralarterien könnten die Entwicklung einer Atheromatose mit konsekutiver plazentarer Hypoxie initiieren.223 Der Angiotensin II-AT1-Rezeptor-Genotyp war ebenfalls Gegenstand molekulargenetischer Untersuchungen zur Genese der Präeklampsie. Bisher fand sich kein Anhalt dafür, dass Polymorphismen des mütterlichen AT1-Rezeptors mit einer Präeklampsie assoziiert sind.251 Möglicherweise spielen aber Polymorphismen des AT1-Rezeptors auf der fetalen Seite eine Rolle für die Ätiologie der Präeklampsie.

Gegen Rezeptoren gerichtete Autoantikörper sind bei verschiedenen Krankheitsbildern bedeutsam, wie z. B. bei Myasthenia gravis pseudoparalytica oder Morbus Basedow. Diese Antikörper können agonistisch wirken. So stimulieren bei Morbus Basedow Antikörper gegen den TSH-Rezeptor spezifisch die Schilddrüsenaktivität. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie wurden Autoantikörper gegen adrenerge Beta-1-Rezeptoren nachgewiesen.252 Bei Patienten mit essentieller Hypertonie fanden wir agonistisch wirksame Antikörper gegen Alpha-1-Rezeptoren. Für die klinische Relevanz der Autoantikörper gegen vaskuläre Hormonrezeptoren spricht die Beobachtung, dass die Entfernung von Antikörpern gegen Beta-1-Rezeptoren mittels Immunadsorption bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie zu einer deutlichen Besserung der Herzfunktion führte.253,254 Unsere Bindungsstudien sprechen dafür, dass die Autoantikörper gegen den AT1-Rezeptor gegen die 2. extrazelluläre Schleife des Rezeptors gerichtet sind und [Seite 103↓]diesen, in ähnlicher Weise wie sein natürlicher Agonist Angiotensin II, aktivieren. In der Pathogenese der Präeklampsie werden seit langem auch immunologische Mechanismen postuliert. So sprechen erhöhte Spiegel von TNFa im Plasma und Fruchtwasser von Patientinnen mit Präeklampsie für eine abnormale Aktivierung des Immunsystems.255 Im Einklang damit steht der Nachweis von Interleukin II in Deziduazellen von Patientinnen mit Präeklampsie. Autoantikörper gegen Phospholipide oder Throphoblastenbestandteile sprechen dafür, dass Autoimmunmechanismen eine Rolle für die Genese der Präeklampsie spielen können.255 Wir wissen nicht, welche Mechanismen zur Bildung von Antikörpern gegen den AT1-Rezeptor bei Präeklampsie führen. Der AT1-Rezeptor scheint bei der Präeklampsie hochreguliert zu sein. Verschiedene Untersuchungsbefunde sprechen dafür, dass zirkulierende Faktoren bei Präeklampsie zu einer ausgeprägten Aktivierung von Endothelzellen führen.256 So auch zu einer starken Erhöhung der endothelialen Permeabilität, wie von uns beschrieben. Wahrscheinlich gehören die Autoantikörper gegen AT1-Rezeptoren zu diesen zirkulierenden Faktoren, da auch Angiotensin II einen permeabilisierenden Effekt auf Endothelzellen hat. Wir wissen aber nicht, welche Mechanismen zur Bildung der Autoantikörper gegen den AT1-Rezeptor führen. Vorstellbar ist, dass die mit dem Krankheitsbild verbundene plazentare Hypoperfusion zu einer veränderten AT1-Rezeptor-Expression führt, die die Bildung von Autoantikörpern stimuliert.

Ebenso ist die klinische Relevanz der Autoantikörper gegen AT1-Rezeptoren bisher noch ungeklärt. Behandlungsmöglichkeiten zur Verlängerung der Schwangerschaft, insbesondere unter dem Aspekt der Verbesserung der kindlichen Prognose beim Auftreten der Präeklampsie vor der 30. Schwangerschaftswoche, könnten daraus resultieren. Vorstellbar sind Strategien zur Entfernung der Autoantikörper, wie das Blutauswaschverfahren, die Plasmapharese oder spezifische Immunadsorption, die Anwendung von Glukokortikoiden zur Suppression des Antikörpereffektes, ein vermehrter Katabolismus der Autoantikörper durch Gabe von Immunglobulinen, oder die Anwendung von niedermolekularem Heparin zur Minderung prokoagulatorischer [Seite 104↓]Effekte der Antikörper. Die vom Wirkmechanismus sich anbietende Anwendung von AT1-Rezeptor-Antagonisten ist in der Schwangerschaft streng kontraindiziert, wäre aber bei postpartalen Formen der Präeklampsie und des HELLP-Syndroms ebenfalls denkbar

Das Auftreten einer Präeklampsie ist an das Vorhandensein einer Plazenta gebunden.223 Klassischerweise wird eine gestörte Plazentaentwicklung als Hauptrisikofaktor für die Entwicklung des klinischen Krankheitsbildes angesehen. Ausgehend von einer fehlimplantierten und/oder unterversorgten Plazenta käme es zu einer Freisetzung von Partikeln oder Substanzen in die mütterliche Zirkulation, die zu einer generalisierten Endothelzellaktivierung bzw. Endothelzellschädigung führen.217 Folgen der endothelialen Schädigung sind u.a. ein generalisierter Vasospasmus, eine gesteigerte Gefäßpermeabilität sowie eine disseminierte Aktivierung der Gerinnungskaskade. Welche zirkulierenden Faktoren die endotheliale Schädigung vermitteln, ist ebenso wenig geklärt wie ihr genauer Ursprung. Die Liste von Kandidaten umfaßt u.a. zytotoxische Zytokine, reaktive Sauerstoffmetabolite und Lipidperoxidationsprodukte, Trophoblastmembranpartikel sowie Antikörper bzw. zirkulierende Immunkomplexe.217

Wir haben festgestellt, dass Schwangere mit Präeklampsie spezifische agonistische Antikörper gegen den Angiontensin-II-AT1-Rezeptor (AT1-AA) entwickeln. Dieser Autoantikörper ist gegen die zweite extrazelluläre Schleife des AT1-Rezeptors gerichtet. Vorläufige Untersuchungen deuten darauf hin, dass er um die 20. SSW erscheint und 4-8 Wochen nach der Entbindung wieder verschwindet. Ähnliche aktivierende Autoantikörper wurden auch bei Patientinnen mit maligner Hypertonie nachgewiesen. Bei Patientinnen mit Präeklampsie sind bereits andere Autoantikörper nachgewiesen worden, u.a. gegen Endothelzellen und Gerinnungsfaktoren, denen eine mögliche Rolle bei der Entstehung des klinischen Krankheitsbildes zugeschrieben wurde.

Für den von uns beschriebenen AT1-AA konnten wir u.a. zeigen, dass er in vitro eine Aktivierung der Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-κB bewirkt und die Freisetzung [Seite 105↓]des Tissue Faktors aus glatten Gefäßmuskelzellen fördert, womit er u.a. eine Aktivierung der Gerinnungskaskade hervorrufen könnte. In einem weiteren Schritt konnten wir zeigen, dass AT1-AA in glatten Gefäßmuskelzellen und in Trophoblasten in vitro die Generation von reaktiven Sauerstoffmetaboliten (ROS) induzieren und dass dieser Prozess über die NADPH-Oxidase vermittelt ist. Ein vermehrter Anfall von ROS bzw. ein Überschreiten der mütterlichen Neutralisationskapazität für ROS wird als ein wesentlicher endothelialer Schädigungsmechanismus bei Präeklampsie diskutiert. Präeklamptische Plazenten weisen eine stärkere Produktion von ROS auf als gesunde Kontrollplazenten. Wir konnten zeigen, dass in Trophoblasten präeklamptischer Plazenten eine vermehrte Expression der NADPH-Oxidase stattfindet und dass glatte Gefäßmuskelzellen an der vermehrten Freisetzung von ROS in diesen Plazenten ebenfalls beteiligt sind. Gleichzeitig konnten wir nachweisen, dass in Trophoblasten und in glatten Gefäßmuskelzellen präeklamptischer Plazenten vermehrt Tissue Faktor exprimiert wird. Ob diese Befunde u.a. durch eine spezifische Bindung von AT1-AA an Trophoblasten und/oder glatte Gefäßmuskelzellen vermittelt werden, ist derzeit noch nicht untersucht.

Der Gold-Standard zum Nachweis der AT1-AA beruht derzeit auf einem Bio-Assay mit isolierten neonatalen Rattenkardiomyozyten, die bei Vorhandensein des AT1-AA eine erhöhte Kontraktilität zeigen. Wir entwickeln derzeit einen spezifischen AT1-AA-ELISA, um den klinischen Nachweis der AT1-AA zu erleichtern.

Eine Therapie mit AT-1 Blockern in der Schwangerschaft ist auf Grund der fetalen Nierenentwicklung kontraindiziert. Eine therapeutische Entfernung der AT1-Antikörper ist jedoch mittels Immunadsorption möglich. Immunadsorptionsverfahren dienen der Entfernung von Antikörpern und sind erfolgreich bei immunologisch bedingten Krankheitsbildern eingesetzt worden, vereinzelt auch in der Schwangerschaft. Unsere Hypothese ist, dass die Entfernung der AT1-Antikörper zu einer Besserung der klinischen Symptomatik, zumindest zu einer Progredienzverzögerung führt. Damit wäre eine Verlängerung der Schwangerschaft möglich und eine deutliche Verbesserung der kindlichen Überlebenschancen zu [Seite 106↓]erreichen, insbesondere bei einem Auftreten der Präeklampsie vor der 30. Schwangerschaftswoche. Eine Studie ist in Planung, in der wir bei Patientinnen, die eine Präeklampsie vor der 30. Schwangerschaftswoche entwickeln, eine antikörperbasierte Immunadsorption zur Entfernung der AT1-Antikörper durchführen. Geprüft werden soll die Hypothese, dass eine spezifische Immunadsorption mittels antikörperbasierter Immunapharese zusätzlich zur Standardtherapie zur Verbesserung der mütterlichen und kindlichen Prognose führt (Morbidität und Mortalität).


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17.06.2004