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1  Einleitung

1.1 Epidemiologische Daten zum Ovarialkarzinom und Mammakarzinom

Das Ovarialkarzinom ist die fünfthäufigste maligne Erkrankung der Frau und macht 4.1% aller malignen Erkrankungen von Frauen aus. Eine von 70 Frauen erkrankt im Laufe ihres Lebens an einem Ovarialkarzinom [1]. In den USA wird für das Jahr 2003 eine Zahl von 14300 Todesfällen in Folge von Ovarialkarzinomen erwartet [2], damit ist das Ovarialkarzinom die fünfthäufigste Todesursache infolge einer Krebserkrankung bei Frauen [3]. Nach den Daten des deutschen Gemeinsamen Krebsregisters (GKR) für das Jahr 1999 wird für die ostdeutschen Bundesländer und Berlin eine Inzidenz von 19,9 Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner angegeben, es ergibt sich ein Lebenszeitrisiko von 1,49% [4]. Die Prognose des Ovarialkarzinoms hängt vom Stadium der Erkrankung zum Zeitpunkt der Diagnose ab. Aufgrund des Fehlens eines effektiven Verfahrens zur Früherkennung von Ovarialkarzinomen werden nach Angaben des nordamerikanischen zentralen Krebsregisters nur 26 % der Fälle in einem Stadium diagnostiziert, in dem der Tumor noch auf das Ovar beschränkt ist [5]. In 53% der Fälle liegt zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Tumorausbreitung ausserhalb des Beckens oder eine Fernmetastasierung vor [5]. Das Risiko, an einem Ovarialkarzinom zu erkranken, wird verringert durch die Einnahme oraler Kontrazeptiva, die Zahl der Schwangerschaften sowie eine verlängerte Stillzeit. Aus diesen epidemiologischen Beobachtungen leitet sich die Hypothese ab, dass eine Verringerung der Zahl an Ovulationen vor Ovarialkarzinomen schützen kann.

Während das Ovarialkarzinom ein relativ seltener Tumor ist, ist die Inzidenzrate des Mammakarzinoms weit höher. Das Mammakarzinom ist in industrialisierten Ländern die häufigste bösartige Tumorerkrankung und die zweithäufigste Krebstodesursache bei Frauen [2]. In den USA erkrankt etwa eine von 7 weissen Frauen im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs [6]. Die Neuerkrankungsrate an Brustkrebs in Deutschland beträgt 121 Fälle je 100000 Einwohner [7]. Nach Schätzungen des Robert-Koch-Institutes erkrankten in Deutschland im Jahre 1998 46300 Frauen an Brustkrebs, dies entspricht einem Anteil von 26% an allen bösartigen Neubildungen bei Frauen. Gemäß den Daten des deutschen Gemeinsamen Krebsregisters (GKR) für die Jahre 1997-1999 wurden 38,4% der [Seite 8↓]Mammakarzinome im Tumorstadium I, d.h. mit einem Tumordurchmesser von kleiner 2cm und fehlenden Lymphknotenmetastasen diagnostiziert [8]. Die 5-Jahres Überlebensrate beim Mammakarzinom ist stadienabhängig und beträgt im Stadium I 88%, im Stadium IV dagegen nur noch 14% [8]. Das Risiko, an einem Mammakarzinom zu erkranken, ist erhöht bei früher Menarche, später Menopause, höherem Alter bei Erstgeburt, niedriger Geburtenzahl sowie bei Adipositas [9].

1.2 Molekulare Prognosefaktoren

Zur Abschätzung der Prognose von Tumorerkrankungen werden klinisch-pathologische Parameter, wie beispielsweise die Tumorgröße, der Differenzierungsgrad und das Ausmass der Metastasierung herangezogen. Diese Parameter werden verwendet, um die für jeden einzelnen Tumor adäquate Therapie zu planen. Neben den klassischen klinisch-pathologischen Parametern können auch molekulare Prognosemarker bestimmt werden, indem die Expression von Proteinen oder von mRNAs im Tumorgewebe untersucht wird. Es ist zu erwarten, dass in Zukunft eine molekulare Tumortherapie, d.h. eine Therapie mit Medikamenten, die gezielt genau definierte Proteine im Tumorgewebe angreifen, eine zunehmende Bedeutung gewinnen wird. Zur genauen Planung dieser Therapie ist es wichtig, die Expression der Zielproteine im Tumorgewebe zu bestimmen, um die Indikation für die Therapie stellen zu können. In der klinischen Praxis wird dieses Verfahren für die Therapie des Mammakarzinoms mit Herceptin bereits angewendet. Hier wird vor Therapiebeginn die Expression des Zielproteins cErbB2 bestimmt, nur wenn eine Überexpression von cErbB2 im Tumorgewebe festgestellt wird, ist eine Herceptin Therapie sinnvoll. Die Bestimmung von molekularen Markern im Tumorgewebe ist auch unter gesundheitsökonomischen Gesichtspunkten sinnvoll, da dadurch nur geeignete und ausgewählte Patienten eine teure Tumortherapie erhalten.

In unseren Studien haben wir vier verschiedene potentielle molekulare Prognosefaktoren im Ovarialkarzinom bzw. teilweise auch im Mammakarzinom untersucht: die Cyclooxygenase-2 (COX-2), das humane ELAV-ähnliche Protein HuR, das Oberflächenantigen CD24 und die mitogen-aktivierte Proteinkinase Phosphatase-1 (MKP-1).


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Die MKP-1 (auch CL100 oder DUSP-1) wird durch mitogene und inflammatorische Signale induziert. Sie ist beteiligt an der Inaktivierung der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAP-Kinase) Signalwege, insbesondere der stress-aktivierten p38MAP Kinase und der Jun-N-terminalen Kinase (JNK). Damit ist sie ein wichtiges Element zur Kontrolle der Stress- und Entzündungsreaktion von Tumorzellen (Review: [10]).

CD24 ist ein kleines muzin-ähnliches Oberflächenmolekül, das physiologischerweise von Granulozyten, prä-B-Zellen, Keratinozyten sowie renalen Tubulusepithelzellen exprimiert wird. CD24 ist ein Ligand für das Oberflächenmolekül P-Selectin, das auf aktivierten Endothelzellen und Thrombozyten gebildet wird. Daraus resultiert eine potentielle tumorbiologische Relevanz des CD24 Proteins, das an der Interaktion zwischen metastasierenden Tumorzellen und Thrombozyten sowie Endothelzellen beteiligt sein könnte (Review:[11]).

Die tumorbiologische Relevanz der COX-2 und des ELAV-ähnlichen Protein HuR wird als Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit in den folgenden Abschnitten genauer erläutert.

1.3 Ähnlichkeiten zwischen entzündlichem Gewebe und Tumorgewebe - die COX-2 als wichtiges Element der tumorassoziierten Entzündung

Die Beobachtung, dass maligne Tumoren häufig im Rahmen von chronischen Entzündungen entstehen, wurde schon im Jahre 1863 von Rudolf Virchow gemacht und führte zu seiner Hypothese, dass chronische Entzündungen eine Prädisposition für Krebserkrankungen darstellen können [12]. Es bestehen viele Ähnlichkeiten zwischen Tumorgewebe und entzündlich verändertem Gewebe. Während aber die normale Entzündungsreaktion in der Regel selbstlimitierend ist, findet man im Tumorgewebe eine persistierende Entzündung. Durch eine vermehrte Angiogenese, die Produktion von Zytokinen und Chemokinen sowie von Proteasen werden im Tumorgewebe gute Bedingungen für Proliferation und Invasion der Tumorzellen geschaffen.(Review: [13]).

Auch bei der Entstehung von Ovarialkarzinomen spielt nach einer von Ness und Cottreau [14] aufgestellten Hypothese eine vermehrte entzündliche Aktivität des [Seite 10↓]ovariellen Oberflächenepithels eine Rolle. Ausgangspunkt für diese Hypothese ist, dass im Rahmen der Ovulation regelmässig eine lokale entzündliche Reaktion induziert wird, dass aber auch andere Erkrankungen mit einer lokalen inflammatorischen Reaktion, wie Endometriose und „pelvic inflammatory disease“ (PID) ein erhöhtes Risiko für die Entstehung von Ovarialkarzinomen mit sich bringen [15,16,17]. Mögliche Mechanismen der Entstehung von Ovarialkarzinomen im Rahmen von Entzündungsreaktionen bestehen in vermehrtem Zellschaden, oxidativem Stress sowie in der Produktion von Prostaglandinen und inflammatorischen Zytokinen.

Bereits vor über 20 Jahren wurde beobachtet, dass viele maligne Tumoren einen sehr hohen Gehalt an Prostaglandinen aufweisen. Im Jahre 1976 wurde die bovine Cyclooxygenase-1 (COX-1) erstbeschrieben [18], darauffolgend wurde im Jahre 1989 die Cyclooxygenase-2 (COX-2) beschrieben [19,20]. Diese Enzyme katalysieren den limitierenden Schritt in der Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen, nämlich die Synthese von Prostaglandin G2 und die darauffolgende Umwandlung in Prostaglandin H2. (Review: [21,22,23,24]). Prostaglandin H2 ist das Ausgangsprodukt für die weitere Prostaglandinsynthese. Die verschiedenen Typen von Prostaglandinen werden durch andere Enzyme synthetisiert, die zelltyp-spezifisch exprimiert werden. So wird z.B. in Thrombozyten durch die Thromboxan-Synthase vor allem TXA2 produziert, während Endothelzellen vor allem PGI2 durch die Prostaglandin-Synthase bilden.

Beide Cyclooxygenase-Isoformen haben unterschiedliche Funktionen. Die COX-1 wird in vielen Geweben konstitutiv exprimiert und reguliert physiologische Vorgänge wie beispielsweise den Schutz der Magenmukosa [25]. Dagegen ist die COX-2 im allgemeinen nicht konstitutiv exprimiert, sondern wird durch Wachstumsfaktoren, Tumorpromotoren und entzündliche Reize induziert [26,27] und produziert Prostaglandine im Rahmen von Entzündungsreaktionen. Dabei hat die COX-2 eine überwiegend pro-inflammatorische Funktion, in der Spätphase der Entzündung wurde jedoch auch eine entzündungsbegrenzende Wirkung beschrieben [28]. Die Struktur der COX-1 und COX-2 ist in vielerlei Hinsicht ähnlich, ein wesentlicher Unterschied zwischen beiden Isoformen besteht in der größeren Substratbindungsstelle der COX-2 [29,30].


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Durch Studien an knock-out Mäusen, in denen einerseits das COX-1 Gen und andererseits das COX-2 Gen durch homologe Rekombination ausgeschaltet wurden, konnten weitere, teilweise überraschende Erkenntnisse über die Funktion der beiden Isoenzyme gewonnen werden [31]. So fand sich bei COX-1-Null Mäusen eine verringerte Thrombozytenaggregation und eine vermehrte perinatale Sterblichkeit bei normaler Fertilität. Jedoch zeigten COX-1-Null Mäuse keine vermehrte Rate von Magenulzera oder von gastrointestinalen Blutungen und hatten eine normale Nierenfunktion. Dieser überraschende Befund deutet darauf hin, dass andere Mechanismen bei Fehlen der COX-1 die gastroprotektive und nephroprotektive Wirkung kompensieren können.

COX-2-Null Mäuse wiesen eine schwere Nierenfunktionsstörung mit glomerulärer Sklerose auf, die sich in den ersten sechs Lebenswochen entwickelte [32,33]. Zudem zeigten sich multiple Störungen der Reproduktion, u.a. bei der Ovulation, Fertilisierung, Implantation und Dezidualisierung [34]. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass die COX-2 eine wichtige Rolle bei der Funktion des Ovars spielt und sind damit ein Ausgangspunkt für unsere Untersuchungen zur Expression der COX-2 im normalen Ovar sowie in Ovarialtumoren.

Die Cyclooxygenasen sind die Hauptangriffspunkte der nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Medikamente (NSAID) [35]. Dabei unterscheiden sich die verschiedenen NSAIDs in ihrer Selektivität für die COX-1 oder die COX-2 Isoform. Während Medikamente wie Celecoxib oder Rofecoxib vor allem die COX-2 Isoform inhibieren, sind Aspirin, Ibuprofen und Indomethacin relativ unselektive COX-Inhibitoren, die beide Isoformen inhibieren können. Zusätzlich zu diesen Wirkungen auf die Cyclooxygenase wurden verschiedene andere zelluläre Zielproteine beschrieben, die durch COX-Inhibitoren beeinflusst werden können. Diese Zielproteine bilden die Gruppe der sogenannten non-COX-targets. Dazu zählen der nukleäre Rezeptor PPAR-δ, die Transkriptionsfaktoren NFκB und AP-1 sowie eine Reihe weiterer Signaltransduktionsmoleküle (Review: [36]).


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1.4  Tumorbiologische Bedeutung der COX-2

Cyclooxygenasen, insbesondere die COX-2, spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Progression maligner Tumoren. Nach epidemiologischen Studien ist das Risiko einen malignen Tumor, z.B. ein Kolonkarzinom oder ein Mammakarzinom zu entwickeln bei langjähriger Einnahme von NSAIDs um etwa 20-50% reduziert [37,38]. In tierexperimentellen Studien konnte sowohl die Entstehung von Tumoren als auch das Wachstum bereits vorhandener Tumoren durch Therapie mit COX-2 Inhibitoren verringert werden [39,40,41,42,43]. Cyclooxygenasen sind besonders interessante potentielle Angriffspunkte für eine molekulare Tumortherapie, da gut charakterisierte Inhibitoren, die NSAIDs, zur Verfügung stehen und bereits klinisch verwendet werden. Derzeit wird Celecoxib in den USA zur Prophylaxe der Entstehung kolorektaler Adenome bei Patienten mit familiärer adenomatöser Polypose (FAP) eingesetzt und führt dort zur Reduktion der Zahl an Adenomen [44,45]. Klinische Phase II oder III Studien zur Untersuchung zur Wirksamkeit von NSAIDs bei Kolonkarzinomen und Mammakarzinomen werden derzeit durchgeführt bzw. sind in Vorbereitung.

1.5 Regulation der COX-2 Expression über die mRNA Stabilität

Verschiedene Mechanismen können zur Überexpression der COX-2 im Tumorgewebe beitragen. Die Expression der COX-2 kann durch inflammatorische Reizen induziert werden, so z.B. durch Interleukin-1β, Tumor-Nekrose-Faktor-αund Lipopolysaccharid [46]. An der Regulation der COX-2 sind unter anderem der Wnt sowie der Ras Signalweg beteiligt [47,48,49].

Des weiteren spielen die Transkriptionsfaktoren NF-κB [50,51], CREB und AFT-1 [52] sowie PEA3 [53] für die Regulation der COX-2 eine wichtige Rolle. Einige Arbeiten beschreiben zudem die Hemmung der COX Transkription durch Hypermethylierung der 5’CPG Insel im COX-2 Gen [54, 55].

Neben der transkriptionalen Regulation spielen auch post-transkriptionale Regulationswege der COX-2 eine wichtige Rolle. Diese werden u.a. durch die stress-aktivierte p38MAPK gesteuert [56,57]. Verschiedene neuere Arbeiten zeigen, dass an der post-transkriptionalen Regulation das Protein HuR beteiligt ist [58,59,60]. Dieses Protein gehört zur Familie der sogenannten ELAV-ähnlichen [Seite 13↓]Proteine, die auf Grund ihrer hohen Homologie zum Drosophilaprotein ELAV (embryonic lethal abnormal vision) benannt ist. Zu dieser Familie gehören die 4 Proteine HuR, Hel-N1, HuC, HuD. Während drei der Hu-Proteine (Hel-N1, HuC und HuD) überwiegend im Nervengewebe exprimiert sind, ist HuR ubiquitär vorhanden [61]. Die Funktion von HuR liegt in der Stabilisierung von mRNAs. Dabei bindet das Protein bevorzugt an solche mRNAs, die ein AU-reiches Element (ARE) im Bereich des 3' Anteiles aufweisen. Ein solches ARE findet sich auch im 3' Anteil der COX-2 mRNA und trägt zur Stabilisierung der COX-2 mRNA bei [62]. Neben der COX-2 werden auch andere mRNAs durch HuR stabilisiert, darunter die mRNAs von VEGF und IL-8 [62]. Das HuR Protein ist typischerweise nukleär lokalisiert und transloziert unter bestimmten Bedingungen ins Zytoplasma. Die zytoplasmatische Expression von HuR ist mit einer vermehrten mRNA stabilisierenden Aktivität verbunden [63].


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01.06.2005