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3  Zusammenfassung der Ergebnisse

3.1 Prognosefaktoren für das Ovarialkarzinom

3.1.1  Mitogen-aktivierte Protein Kinase Phosphatase-1 (MKP-1)

Literatur: Carsten Denkert, Wolfgang D. Schmitt, Stefan Berger, Angela Reles, Sören Pest, Antje Siegert, Werner Lichtenegger, Manfred Dietel, Steffen Hauptmann. Expression of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 (MKP-1) in primary human ovarian carcinoma. International Journal of Cancer; 2002; 102(5):507-13, 2002 [64]

Wir haben mehrere Studien zur Evaluation potentieller Prognosemarker im Ovarialkarzinom durchgeführt. In einer ersten Studie identifizierten wir die mitogen-aktivierte Proteinkinase Phosphatase-1 (MKP-1) als Prognosemarker im Ovarialkarzinom. Eine mittelgradige bis starke Expression der MKP-1 fand sich in 58% der invasiven Ovarialkarzinome. Eine positive Expression der MKP-1 war signifikant mit einem kürzeren progressionsfreien Überleben assoziiert.

Parallel zu den immunhistologischen Färbungen haben wir die Regulation der Expression der MKP-1 durch inflammatorische Zytokine in der Zellkultur von humanen Ovarialkarzinomzelllinien untersucht. Hier fand sich in einigen Zellinien eine vermehrte Expression der MKP-1 mRNA im Northern Blot nach Inkubation mit inflammatorischen Zytokinen und dem Tumorpromoter TPA. Zudem wurde die Expression der MKP-1 bei der Zellinie OVCAR-3 stark durch das Chemotherapeutikum Cisplatin induziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MKP-1 eine Rolle bei der Stressreaktion von Ovarialkarzinomzellen und möglicherweise auch bei der zellulären Adaptation and Chemotherapeutika spielt.

3.1.2  CD24

Literatur: Glen Kristiansen, Carsten Denkert, Karsten Schlüns, Edgar Dahl, Christian Pilarsky, Steffen Hauptmann (2002). CD24 is expressed in ovarian cancer and is a new independent prognostic marker of patient survival. American Journal of Pathology. 2002;161(4):1215-21 (geteilte Erstautorenschaft: G.K. und C.D.) [65]

Auch für die Expression des Oberflächenantigens CD24 fand sich eine prognostische Relevanz im Ovarialkarzinom. CD24 wird mit einem membranären [Seite 16↓]Expressionsmuster in 84% der invasiven Ovarialkarzinome exprimiert, unabhängig davon fand sich eine zytoplasmatische Expression in 59% der Ovarialkarzinome. Für die Untergruppe der invasiven Ovarialkarzinome war die zytoplasmatische, nicht aber die membranäre Expression von CD24 signifikant mit einem schlechteren Überleben assoziiert.

Normales ovarielles Oberflächenepithel negativ für CD24, in Borderline-Tumoren fand sich eine membranäre Expression in 75% der Fälle, während nur einer von 8 Fällen zytoplasmatisch positiv war.

3.1.3  Cyclooxygenase-2 (COX-2)

Literatur: Carsten Denkert, Martin Köbel, Sören Pest, Ines Koch, Stefan Berger , Michael Schwabe, Antje Siegert, Angela Reles, Bernd Klosterhalfen, Steffen Hauptmann. Expression of cyclooxygenase 2 is an independent prognostic factor in human ovarian carcinoma. American Journal of Pathology; 2002; 160(3):893-903 [66]

Diese Studie befasste sich mit der Expression der COX-1 und COX-2 sowie mit der Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2) in humanen Ovarialkarzinomzelllinien und in primären, humanen Ovarialkarzinomen. Immunhistologisch fand sich eine Expression der COX-2 in 36 (52%) von 86 primären Ovarialkarzinomen sowie eine Expression der COX-1 in 65 (75%) von 75 primären Ovarialkarzinomen. Auf der mRNA Ebene wurde die COX-2 mRNA in 7 von 8 primären, humanen Ovarialkarzinomen exprimiert, alle Fälle waren positiv für die COX-1. Zusätzlich zur Expression der COX-2 im Tumorgewebe fanden sich signifikant erhöhte Werte für PGE2 in Aszitespunktaten von Patientinnen mit Ovarialkarzinomen. In unseren immunhistologischen Untersuchungen war die Expression der COX-2 in Ovarialkarzinomen und Borderline-Tumoren des Ovars erhöht im Vergleich zu normalem ovariellen Oberflächenepithel sowie Zystadenomen. In den invasiven Ovarialkarzinomen stellte die Expression der COX-2 einen negativen prognostischen Faktor in der univariaten und multivariaten Überlebensanalyse dar. Andere prognostische Faktoren waren – wie für Ovarialkarzinome bereits bekannt – das FIGO-Stadium, die histologische Differenzierung, das Alter der Patientinnen sowie ein undifferenzierter histologischer Typ. Zusätzlich zu den Untersuchungen an humanem [Seite 17↓]Tumorgewebe wurden in-vitro Experimente zur Expression der Cyclooxygenasen-1 und -2 an Ovarialkarzinomzellen durchgeführt. Hierbei zeigte die Zellinie OVCAR-3 eine starke Induktion der COX-2 auf mRNA und Proteinebene durch das inflammatorische Zytokin Interleukin-1β sowie eine etwas schwächere Induktion durch den Tumorpromotor und Phorbolester TPA. Dagegen war die Zellinie SKOV-3 negativ für COX-1 und COX-2 Protein. Diese Zellinien, insbesondere die Zellinie OVCAR-3, bei der die COX-2 sehr stark induzierbar ist, wurden als Zellkulturmodell für Folgestudien verwendet (vgl. 3.3).

3.2 Expression der COX-2 als Prognosefaktor beim Mammakarzinom

Literatur: Carsten Denkert, Klaus-Jürgen Winzer, Berit-Maria Müller, Wilko Weichert, Sören Pest, Martin Köbel, Glen Kristiansen, Angela Reles, Antje Siegert, Hans Guski, Steffen Hauptmann. Elevated expression of cyclooxygenase-2 is a negative prognostic factor for disease-free survival and overall survival of patients with breast carcinoma. Cancer 2003, 97, 2978-2987.[67]

Carsten Denkert, Klaus-Jürgen Winzer, Steffen Hauptmann. Prognostic impact of COX-2 in breast cancer. Clinical Breast Cancer, in press.[68]

Wir haben die Expression der COX- 1 und der COX-2 in 221 primären Mammakarzinomen untersucht und sie mit anderen klinischen und pathologischen Parametern sowie mit dem rezidivfreien Überleben und dem Gesamtüberleben korreliert. Es zeigte sich eine Expression der COX-2 in 36% der Mammakarzinome. Die erhöhte Expression der COX-2 war signifikant mit klinischen Parametern wie einer Tumorgröße von mehr als 20mm, dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen, einer geringen Differenzierung sowie einer Gefäßinvasion assoziiert. Dagegen war die Cyclooxygenase-1, die in 45% der Fälle exprimiert wurde, mit einem Tumordurchmesser <20mm und mit einem negativen Nodalstatus assoziiert. In der univariaten Überlebensanalyse fand sich eine signifikante Assoziation zwischen erhöhter COX-2 Expression und vermindertem rezidiv-freien und Gesamtüberleben.


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3.3  Auswirkungen des nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Medikamentes NS-398 sowie von COX-2-spezifischer RNA Interferenz auf humane Ovarialkarzinomzellen

Literatur: Carsten Denkert, Antje Fürstenberg, Peter T. Daniel, Ines Koch, Martin Köbel, Wilko Weichert, Antje Siegert, Steffen Hauptmann. Induction of G0/G1 cell cycle arrest in ovarian carcinoma cells by the anti-inflammatory drug NS-398, but not by COX-2 specific RNA interference. Oncogene, in press [69].

In dieser Studie wurde im Zellkulturmodel an der COX-2 positiven Zellinie OVCAR-3 sowie der COX-2 negativen Zellinie SKOV-3 untersucht, welche Auswirkungen die Inhibition der Cyclooxygenase-2 auf die Zellproliferation hat. Dabei haben wir zwei verschiedene Inhibitionsstrategien verwendet. Zum einen den pharmakologischen Inhibitor NS-398, der vor allem die COX-2, in höheren Konzentrationen aber auch die COX-1 sowie andere Zielproteine inhibiert. Durch Verwendung dieses Inhibitors in unterschiedlichen Konzentrationen kann man abschätzen, ob ein beobachteter Effekt vorrangig durch die COX-2, die COX-1 oder durch ein weiteres, nicht bekanntes zelluläres Zielmolekül erzielt wird.

Als zweite Inhibitionsstrategie wurde die Methode der RNA-Interferenz (RNAi) gewählt. Hier wird durch Transfektion der Zellen mit 21 Basenpaaren langen, doppelsträngigen siRNAs eine zelluläre Antwort induziert, die zur selektiven Zerstörung der doppelsträngigen siRNA, aber auch eventuell vorhandener homologer zellulärer mRNAs führt. Da dieser Mechanismus sequenzspezifisch ist, kann selektiv eine einzelne mRNA in der Zelle ausgeschaltet werden. Wir haben diese Methode an der Ovarialkarzinomzellinie OVCAR-3, zunächst unter Verwendung einer Kontroll-siRNA gegen das Kernprotein Lamin A/C, getestet. Es ergab sich bei einer Transfektionseffizienz von ca. 90% eine starke Verringerung der Menge an Lamin A/C Protein. Daraufhin wurde eine spezifisch gegen die COX-2 gerichtete siRNA verwendet, die Proteinexpression der COX-2 wieder auf den Kontrollwert herunterregulierte und zu einer Verringerung der PGE2 Produktion um 60% führte. Im Proliferationsassay führte die spezifische Inhibition der COX-2 durch RNA-Interferenz nicht zu einer verminderten Zellproliferation.


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Dagegen fand sich eine starke Verringerung der Proliferation durch NS-398 in Konzentrationen von 50 bis 500µM, dies ging mit einem G0/G1 Zellzyklusarrest einher. Des weiteren fiel auf, dass der Inhibitor NS-398 die Prostaglandinproduktion, und damit die Aktivität der COX-2 schon bei einer Inhibitorkonzentration von 1µM vollständig hemmt. Dies steht im Gegensatz zu den Auswirkungen auf die Zellproliferation, die erst bei relativ hohen Inhibitorkonzentrationen auftreten. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Untersuchungen schlussfolgern, dass NS-398 eine anti-proliferative Wirkung auf Ovarialkarzinomzellen hat. Im Zellkulturmodell scheint diese Wirkung jedoch nicht über die Cyclooxygenase-2 vermittelt zu sein, sondern möglicherweise durch Inhibition von weiteren zellulären Proteinen, die z.B. eine Rolle bei der Zellzyklusregulation spielen.

3.4 Assoziation zwischen zytoplasmatischer Expression des ELAV-ähnlichen Proteins HuR und erhöhter COX-2 Expression

Literatur: Carsten Denkert, Wilko Weichert, Sören Pest, Ines Koch, Dirk Licht, Martin Köbel, Angela Reles, Jalid Sehouli, Manfred Dietel, Steffen Hauptmann. Overexpression of the ELAV-like protein HuR in ovarian carcinoma is a prognostic factor and is associated with increased COX-2 expression. Cancer Research, in press.[70]

Als Ursache der Überexpression der COX-2 in malignen Tumoren kommen verschiedene Mechanismen in Frage. Einer dieser Mechanismen ist die vermehrte Stabilisierung der COX-2 mRNA. Verschiedene in-vitro Studien haben gezeigt, dass das humane RNA stabilisierende Protein HuR an sogenannte AU- reiche Elemente (AREs) im nicht translatierten 3’ Anteil der COX-2 mRNA bindet und damit die mRNA stabilisieren kann. Ausgehend von diesen Studien haben wir die Expression von HuR im Ovarialkarzinom und eine mögliche Assoziation mit erhöhter COX-2 Expression untersucht. In dieser Studie wurden 83 primäre Ovarialkarzinome, 16 Borderline-Tumoren des Ovars sowie 3 normale Ovarien untersucht. Es zeigte sich eine nukleäre Expression von HuR in 81% der Ovarialkarzinome, zusätzlich trat in 45% der Ovarialkarzinome eine zytoplasmatische Expression von HuR auf. Sowohl die nukleäre als auch die [Seite 20↓]zytoplasmatische HuR Expression war im Ovarialkarzinom im Vergleich zu Borderline-Tumoren oder normalen Ovarien signifikant erhöht. Die zytoplasmatische HuR Expression war signifikant mit vermehrter COX-2 Expression sowie vermehrter mitotischer Aktivität assoziiert. In der univariaten Überlebensanalyse war die zytoplasmatische, nicht aber die nukleäre, Expression von HuR ein signifikanter prognostischer Faktor für das progressionsfreie Überleben sowie für das Gesamtüberleben. Aus diesen Versuchen ergibt sich, dass möglicherweise im Tumorgewebe eine Dysregulation des mRNA stabilisierenden Proteins HuR besteht, die zu einer vermehrten Stabilisierung bestimmter mRNAs führt. Zu diesen mRNAs gehört die COX-2, aber evtl. auch die mRNAs für VEGF sowie für Zytokine und Wachstumsfaktoren. Damit bestünde die Möglichkeit über ein einzelnes mRNA-stabilisierendes Protein eine ganze Reihe von mRNAs und Proteinen im Tumor heraufzuregulieren.


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01.06.2005