Dittrich, Sven: Untersuchungen zur Nierenfunktion bei der Behandlung angeborener Herzfehler

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Kapitel 2. Der renale Ischämie-Reperfusionsschaden

In maximaler Ausprägung führt der Ischämie-Reperfusionsschaden zu einem Verlust der Nierenfunktion, in leichter Ausprägung zur Organdysfunktion [ 178 ]. In der Transplantationsmedizin sind die Auswirkungen der Ischämie auf die Funktion und das Langzeitüberleben der transplantierten Niere gut untersucht [ 22 , 26 , 35 , 70 , 84 , 88 , 91 , 96 , 101 , 106 , 119 , 178 ]. Nierentransplantate nach langer Ischämie weisen im Vergleich mit Transplantaten nach kurzer Ischämie vermehrt akute Rejektionsphasen sowie späte vaskuläre und glomeruläre Veränderungen auf [ 83 , 96 , 101 , 155 ]. Eine Ischämie von 30 bis 60 Minuten führt ohne Hypothermieschutz zum akuten Nierenversagen [ 3 ]. Für den erlittenen Schaden ist jedoch nicht allein die mangelnde Sauerstoffzufuhr während der Unterbrechung des Blutflusses verantwortlich, vielmehr handelt es sich um einen komplizierten Komplex aus Ischämie- und Reperfusionsschaden [ 3 , 80 , 185 , 193 ]. Die Phase der Ischämie zeichnet sich durch einen schnellen Abfall der intrazellulären Adenosintriphosphat (ATP) -Konzentration auf Grund einer fehlenden oxidativen Phosphorylierung aus. Da die Versorgung der Zelle mit Energie über die anaerobe Glykolyse nur kurzfristig sicher gestellt werden kann, steigt die intrazelluläre Laktatkonzentration und es kommt zu einem konsekutiven Abfall des pH-Wertes. Die Natrium-Kalium-ATPase fällt aus und Natrium, Calcium und Wasser strömen dem osmotischen Gefälle folgend in die Zelle [ 3 ]. Eine lichtmikroskopisch fassbare vakuolige Degeneration sowie eine hydropische Schwellung aufgrund eines apikalen Ödems der Tubulusepithelien sind die Folgen [ 108 , 135 ]. In der Phase der Reperfusion führen freie Sauerstoffradikale zu einer Peroxidationsreaktion von Lipiden, Depolimerisation von Polysacchariden und Degeneration von Desoxyribonucleotiden [ 80 , 185 ]. Geschädigte Endothelzellen verlieren die Fähigkeit zur Dilatation der glatten Gefäßmuskulatur und setzen potente Vasokonstriktoren frei [ 37 , 193 ]. Eine Reihe weiterer Substanzen wie zum Beispiel Nitroxid, Adenosin, Endothelin, Leukozyten-Adhäsionsmoleküle und heat-shock Proteine steht derzeit im Verdacht, ebenfalls Einfluss auf den Ischämie-Reperfusionsschadenskomplex zu haben [ 3 , 80 , 185 , 193 ]. Zusammenfassend führt die Kombination aus Vasokonstriktion, hydropischer Zellschwellung, extrazellulärem Ödem und schließlich Leukozyten- und Thrombozytenaktivierung durch chemotaktische Stoffe des geschädigten Endothels zu einer gestörten Perfusion und zu einer Organdysfunktion [ 23 , 108 ]. Die eintretenden Organveränderungen sind prinzipiell reversibel, solange es nicht zu Nekrosen gekommen ist. Für den Schweregrad des Ischämie-Reperfusionsschadens sind die Bedingungen der Reperfusion, wie zum Beispiel der initiale


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Blutdruck, von großer Bedeutung [ 63 , 72 , 81 , 85 , 126 , 155 ].

2.1 Untersuchungen an der isoliert hämoperfundierten Schweineniere

2.1.1 Charakterisierung des Ischämie-Reperfusionsschadens

Die porcine Niere hat in ihrer Organgrösse und -physiologie große Ähnlichkeiten mit der humanen Niere und gilt auch als funktionell geeignetes Xenograft für den Menschen [ 39 ]. Sie bietet sich daher für die experimentelle Untersuchung des Ischämie-Reperfusionsschadens besonders an [ 59 , 116 , 194 ]. Ein weiterer methodischer Vorteil der Verwendung der Spezies Schwein für die ex-vivo Perfusion liegt in der ausreichend zur Verfügung stehenden Menge autologen Blutes. Die Ziele der in diesem Kapitel vorgestellten Untersuchungen liegen in der Charakterisierung des postischämischen Reperfusionsschadens unter den Bedingungen extrakorporaler Hämoperfusion und der Entwicklung eines histologischen Scores zur quantitativen Beurteilung des Ischämie-Reperfusionsschadens.

2.1.1.1 Material und Methoden

2.1.1.1.1 Versuchsplanung

Die isolierte Nierenperfusion erfolgte in einem neu entwickelten ex vivo Perfusionsmodell mit normothermem autologen Blut [ 11 ]. Perfundiert und miteinander verglichen wurden Nieren nach einer Ischämiedauer von 15 ± 1 Minute entweder nach Organentnahme aus anästhesierten und intubierten Schweinen oder nach Organentnahme aus frisch geschlachteten Tieren am Schlachthof. Die am Schlachthof entnommenen Nieren wurden im Anschluss an die Entnahme intraarteriell mit kalter Konservierungslösung durchspült. Eine Gruppe von 19 Nieren wurde 3 ± 0,2 Stunden, eine weitere Gruppe von 19 Nieren 7 ± 0,2 Stunden auf Eis gelagert.

2.1.1.1.2 Organ- und Blutgewinnung am Schlachthof

Die Organgewinnung erfolgte unmittelbar nach der Tötung von 80 bis 120 kg schweren Schlachtschweinen (Deutsche Landrasse) im Einzelschlachtungsraum des Schlachthofes (Eberswalder Fleischwarenfabrik GmbH & Co.KG, Britz, Deutschland). Nach einem betäubenden Elektroschock wurden die Tiere an den Hinterläufen aufgehängt und durch Stich in die Karotiden ausgeblutet. Das Stichblut wurde in einer Schale aufgefangen, mit 50 ml Natriumcitrat 20% (Apotheke des Virchow-Klinikums, eigene Herstellung) und


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10.000 E/l Heparin (Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) antikoaguliert, mit 5 mg/500 ml Blut Verapamil (Knoll, Ludwigshafen, Deutschland) versetzt und über einen Glastrichter in Kunststofflaschen gefüllt. Nach Brühen des Schlachtkörpers für 1 Minute, Eröffnung des Abdomens, sowie Entfernung der Baucheingeweide wurden die Ureteren im mittleren Drittel durchtrennt. Nach stumpfer Mobilisation von Aorta abdominalis und Vena cava inferior wurden diese cranial und kaudal der Abgänge der Nierengefäße durchtrennt und die Nieren entnommen. Die Nieren wurden gewogen, arteriell kanüliert und mit einer modifizierten Tyrodelösung (Natriumchlorid 110 mmol/l, Kaliumchlorid 4 mmol/l, Calciumchlorid 1.5 mmol/l, Magnesiumchlorid 1 mmol/l, Natriumbikarbonat 25 mmol/l, Natriumbiphosphonat 0.5 mmol/l, Glukose 144 mg/dl, Harnstoff 30 mg/dl, Kreatinin 5.7 mg/dl) blutfrei gespült. Anschließend wurden die Nieren bei einem Druck von 180 cm Wassersäule mit 500 ml einer auf 4 Grad Celsius gekühlten Konservierungslösung nach einer Rezeptur nach Prof. von Baeyer [ 10 ] perfundiert. Die Lagerung der Nieren erfolgte auf Eis in mit Konservierungslösung gefüllten Kunststoffbeuteln.

2.1.1.1.3 Organ- und Blutgewinnung im OP

Die in der Tierversuchsabteilung der Charité, Campus Virchow-Klinikum eingestellten Schweine der Deutschen Landrasse wurden durch präoperative intramuskuläre Gabe von Azaperon (200 mg/kg KG i.m.) sediert und mit Atropin (0,0025 mg/kg KG i.m.) zur Reduktion des Speichelflusses und der gastrointestinalen Motalität behandelt. Zur Anästhesie erhielten die Tiere Metomidat i.v. (10 mg/kg/KG/h i.v.), Fentanyl (0,01 mg/kg/KG/h i.v.), (beide Hexal, Holzkirchen, Deutschland), sowie eine Einzeldosis Pancuronium (Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Deutschland) von 0,1-0,2 mg/kg/KG i.v.. Anschließend erfolgte die Intubation und Beatmung der Tiere. Die Tiefe der Narkose wurde mittels Herzfrequenz und arteriellem Blutdruck kontrolliert. Die Beatmung erfolgte maschinell mit einem 40%igen Luft-/Sauerstoffgemisch. Das Atemminutenvolumen schwankte zwischen 120 und 150 ml/kgKG, die Atemfrequenz betrug 10-14/min. Es wurde eine systemische Heparinisierung (250 U/kg/KG i.v.) durchgeführt. Nach einem medianen Bauchschnitt wurden die Nieren dargestellt, freipräpariert und entnommen. 500 ml Blut wurde nach Kanülierung aus einem Jugulariszugang gewonnen, in vorbereiteten Transfusionssystemen (Biopack-Compoflex, Biotrans, Dreieich, Deutschland) gesammelt sowie mit 10.000 I.E. Heparin und 5 mg Verapamil versetzt. Im Anschluss an die Kanülierung von Arterie, Vene und Ureter der explantierten Nieren erfolgte die sofortige


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Reperfusion mit dem autologen Blut.

2.1.1.1.4 Versuchsaufbau

Abbildung 1: Der ex-vivo Perfusionsaufbau

Der Perfusionssaufbau bestand aus zwei Kreisläufen, die über ein Dialysemodul (Kapillardialysator Polysulfone UF 6.4 Hemoflow F7, Fresenius AG, Bad Homburg, Deutschland) miteinander in Verbindung standen. Im Dialysemodul flossen Blut und Dialysat, getrennt durch eine semipermeable Membran im Gegenstromprinzip aneinander vorbei. Dabei wurde das Blut oxygeniert, decarboxyliert und erwärmt. Mit dem Flüssigkeitsaustausch zwischen Blut und Dialysat konnte das Blutvolumen und der Hämatokrit reguliert werden. Im Blutkreislauf förderte eine Rollerpumpe (Multiflow, Typ 10 20 00, Stöckert Instrumente, München, Deutschland) das aus dem Modul kommende, arterialisierte Blut über eine Luftfalle in die Arteria renalis. Zwischen Luftfalle und Niere befand sich die Entnahme - und Druckmessstelle für die regelmässige Abnahme arterieller Blutproben und zur kontinuierlichen Messung des arteriellen Blutdrucks. Ein Temperatursensor (5F Swan-Ganz Thermodilution 0.5cc CAP, 93-132-5F, Baxter, Unterschleissheim, Deutschland) maß an dieser Stelle gleichzeitig die Bluttemperatur vor der Niere. Die Niere lag in einer offenen Organkammer, welche sich ihrerseits in einem auf 38°C erhitzten Wasserbad befand. Die Temperatur der Niere wurde kontinuierlich mit


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einer in der Organkammer liegenden Messsonde überwacht und konstant gehalten. Der während der Perfusion gebildete Urin wurde in einem Messzylinder gesammelt. Aus der Niere floss das Blut über einen in die Vena renalis eingelegten Katheter in ein venöses Blutreservoir zurück. Als Blutreservoir und zur Konstanthaltung des Blutvolumens diente ein Blutbeutel, dessen Gewicht kontinuierlich durch eine Hängewaage anzeigt wurde. Eine zweite Pumpe leitete das Blut weiter in das Dialysemodul. Im Dialysatkreislauf wurde das Dialysat mit einem Fluss von 1,5 l/min durch eine Rollerpumpe aus einem skalierten Behälter in einen auf 39°C eingestellten Wärmetauscher geleitet. Von dort floss es durch das Dialysemodul zurück in den Dialysatbehälter. In das Dialysat wurde mittels Sprudelstein ein Gasgemisch mit 500 ml/min Sauerstoff und 36 ml/min Kohlendioxyd eingeleitet [ 47 ].

2.1.1.1.5 Versuchsablauf und -analytik

Die Vorfüllung des Blutkreislaufes erfolgte mit 500 ml heparinisierter (10000 E/l) physiologischer Kochsalzlösung. Nach Erwärmung des Dialysates erfolgten der Anschluss des Blutreservoirs (500 ml autologes Vollblut) sowie das Schließen des Perfusionskreislaufs. Das Blutes wurde duch 20minütiges Vorbeiführen an der warmen Dialysatlösung auf 37°C erwärmt. Danach erfolgte der Beginn der Organperfusion mit einem initialen Blutfluss von 20 ml/min und einem kontinuierlichen Perfusionsdruck von 80 mmHg. Nach Erreichen einer vollständigen Organerwärmung (45 min) wurden nach 60, 75, 90, 105 Minuten Blutproben entnommen und jeweils das Sammelurinvolumen bestimmt. Gemessen wurden desweiteren das Nierengewicht nativ und nach Perfusion [g], der Fluss der arteriellen Blutpumpe [ml*min-1], der arterielle und venöse Blutdruck [mmHg], die Blutemperatur [°C], Hämoglobin [g*dl-1], Hämatokrit [%], die Sauerstoffsättigung arteriell und venös [%], der Sauerstoffpartialdruck arteriell und venös [mmHg], die Natriumkonzentration in Plasma und Urin [mmol*l-1], und die Kreatininkonzentration in Plasma und Urin [mg*dl-1]. Kreatinin wurde mit einem Kreatinin-Analysator 2 (Beckman, München, Deutschland) bestimmt. Sammelurin wurde zuvor 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um Messfehler durch Urinsediment zu vermeiden. Die Blutgasanalyse, die Bestimmung des Natriums und die Bestimmung des Hämoglobins erfolgte mit dem Blut-Gas-Analysator ABL 505 und dem Hemoximeter OSM 3 (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark). Der Hämatokrit wurde nach Zentrifugation in Glaskapillaren auf einer Skala abgelesen. Zur Analyse der Nierenfunktion wurden die folgenden Werte berechnet:


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Tabelle 1: Funktionsparameter der isolierten Nierenfunktion

Parameter

Formel

Einheit

Diurese

U = VU / t / NG*100

ml*min-1*100g-1

Vaskulärer Widerstand

R = (Part - Pven) / RBF

mmHg*ml-1*min-1*100g-1

Renaler Plasmafluss

RPF = RBF * (1 - Hkt)

ml*min-1*100g-1

Art./ven. O2-Gehalt

CxO2 = 1.34*Hb*SxO2 + 0.003*PxO2

ml*dl-1

Sauerstoff Angebot

O2D = RBF * CaO2/100

ml*min-1*100g-1

Sauerstoff-Verbrauch

O2 cons = (CaO2 - CvO2)/100 * RBF

ml*min-1*100g-1

Natrium Transport

TNa = [(NaPl*KC)-(NaU*U)]/ 1000

mmol*min-1*100g-1

Kreatinin-Clearance

KC = (KreaU / KreaPl) * U

ml*min-1*100g-1

Filtrationsfraktion

FF = RPF / KC

%

Abkürzungen: art = arteriell, KC = Kreatininclearance; Hkt = Hämatokrit; Hb = Hämoglobin; Krea = Kreatinin; NG = Nierengewicht nativ; P = Partialdruck; PL = Plasma; RBF = renaler Blutfluss; S = Sättigung; U= Urin; ven = venös, VU = Urinvolumen.

Histologische Methoden

Sieben nicht kältekonservierte und fünf kältekonservierte Nieren wurden nach Versuchsende histologisch untersucht. Sofort nach Abbruch der Hämoperfusion wurden drei maximal 5 mm dicke Gewebescheiben unter Miterfassung von Rinde, Mark sowie Nierenbecken entnommen und in 5 %igem gepufferten Formaldehyd (Herbeta, Berlin, Deutschland) mindestens 12 Stunden fixiert. Die Entnahme erfolgte aus dem oberen und unteren Pol sowie aus der Organmitte, um regionale Unterschiede in der Durchblutung zu erfassen. Die Gewebeproben wurden nach Paraffineinbettung in Stufenserienschnitten aufgearbeitet. Die Färbung der Präparate erfolgte standardmässig nach Hämalaun-Eosin (HE), Masson-Goldner (MG) und der Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS) [ 140 ].

Die Wertung des Ischämie-Reperfusionsschadens erfolgte quantitativ anhand eines im Rahmen dieser Arbeit neu entwickelten Punkteranges: Bewertet wurde der Bürstensaumverlust am proximalen Tubulusepithel (0-3 Punkte), das Ödem der proximalen


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Tubuluszellen (0-3 Punkte), morphometrische Messungen der Dilatation des proximalen Tubulus (0-3 Punkte), die Vakuolisation der proximalen Tubulusepithelien (0-3 Punkte) und Nekrosen der proximalen Tubuluszellen (0-3 Punkte). Die Punkte wurden zu einem Gesamtrang (0-15 Punkte) addiert. Als Referenzhistologie dienten intravitale Biopsien aus gesunden narkotisierten Schweinen. Die Bewertung der verblindeten Präparate erfolgte lichtmikroskopisch (Mikroskop Leitz DL, Wetzlar, Deutschland) in mehreren Untersuchungsgängen.

Leukozyten wurden mit einem allotypischen Mäuse-anti-Schwein CD45 Antikörper [ 18 ] (MCA 1447, Clone Nr. MAC 323, Serotc Ltd., Oxford, England) markiert. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:500 inkubiert. Zur Färbung der gebundenen Antikörper wurde die Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phosphatase (APAAP) -Methode entsprechend der Anleitung „APAAP-Färbemethode“ der Firma (DAKO, Hamburg, Deutschland) verwendet. Um das Färbeergebnis zu optimieren, wurde eine Antigendemaskierung mittels zweiminütigem Kochen im Dampftopf durchgeführt. Die farbliche Markierung erfolgte mit „fast red“ (Dako, Code K 0597). Fibrinogen wurde mittels immunhistochemischer Markierung durch den mit Schwein kreuzreaktiven Antikörper Kaninchen-anti-Mensch Fibrinogen (DAKO, A0080 Lot 097) dargestellt und diente indirekt zum Nachweis aktivierter Thrombozyten. Zur Darstellung des gebundenen Antikörpers wurde wiederum die modifizierte APAAP-Methode verwendet. Nach Abschluss aller Versuche wurden die angefertigten Schnittpräparate verblindet und lichtmikroskopisch begutachtet. Die neutrophilen Granulozyten wurden aus der Gruppe aller CD45 positiven Leukozyten anhand der typischen Morphologie sowie der gut detektierbaren zytoplasmatischen PAS-Positivität unterschieden und in 10 HPF/Präparat ausgezählt (HPF = high power field, entsprechend einem Gesichtsfeld in 400facher Vergrößerung). Differenziert wurde in:

  1. Anzahl der ausschließlich innerhalb des intraglomerulären Schlingenkonvolutes gelegenen neutrophilen Granulozyten.
  2. Anzahl der ausschließlich innerhalb des peritubulären, kapillären Netzwerkes gelegenen neutrophilen Granulozyten.
  3. Anzahl der ausschließlich intraparenchymatös (extrakapillär) gelegenen neutrophilen Granulozyten.
  4. Gesamtzahl aller neutrophilen Granulozyten.

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Das Ausmaß intravaskulärer Fibrinogenausfällungen wurde semiquantitativ eingeschätzt. Dafür wurden die Fibrinogenausfällungen in den Vasa afferentia und in den glomerulären Arteriolen ausgezählt. Ausgewertet wurden in mindestens 10 HPF oder in mindestens 10 Glomerula pro Präparat:

  1. Anzahl intravasaler (Vasa afferentia) Fibrinogenausfällungen pro 10 HPF.
  2. Anzahl intraglomerulärer Fibrinogenausfällungen pro 10 Glomerula.
  3. Anzahl peritubulärer (intravasaler) Fibrinogenausfällungen pro 10 HPF.

2.1.1.1.6 Datenanalyse

In allen Kapiteln der Arbeit wurden ausschliesslich nicht parametrische statistische Tests mit dem PC-Programm „Statistical Package of Social Sciences“ (SPSS, Version 7.5) berechnet. Für den Vergleich unverbundener Stichproben wurde der Mann-Whitney-U-Test, für den Vergleich verbundener Stichproben der Wilcoxon-Test und für die Berechnung von Vierfeldertafeln der Fisher Exakt-Test gewählt. Das Bestehen eines Zusammenhanges zwischen 2 Werten wurde bei einem Korrelationskoeffizienten r > 0,5 im Spearmanschen Korrelationstest angenommen. Alle Unterschiede wurden mit einer Signifikanz p < 0,05 oder p < 0,01 beschrieben. In allen Abbildungen beschreibt das Zeichen „*“ p < 0,05 und das Zeichen „**“ p < 0,01.Wenn nicht anders gekennzeichnet, wurden Daten als Median, Minimal- und Maximalwert angegeben. Zur Verdeutlichung von Unterschieden zwischen Gruppen in Graphiken und Tabellen erfolgt die Datenangabe auch als Mittelwert ± S.E.M.

2.1.1.2 Ergebnisse

2.1.1.2.1 Nierenfunktion

Der renale vaskuläre Perfusionswiderstand war in den beiden Versuchgruppen nach kurzer und längerer Kältekonservierung im Vergleich zu der Gruppe der Nieren mit kurzer Ischämie ohne Kältekonservierung erhöht (Abbildung 2). Unterschiede zwischen den kältekonservierten und den nicht kältekonservierten Nieren bestanden für die Parameter Diurese, Kreatininclearance, Filtrationsfraktion, renaler Natriumtransport und renaler Sauerstoffverbrauch (Abbildung 2). Eine Reduktion des renalen Sauerstoffverbrauchs wurde bei den länger konservierten Nieren im Vergleich zu den kürzer konservierten


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Nieren gefunden (Abbildung 2).

Abbildung 2: Postischämische Funktion nicht gekühlter, kurz gekühlter und länger gekühlter Nieren

a - statistischer Vergleich nicht gekühlter mit allen kühl gelagerten Nieren. * = p < 0,05, ** = p < 0,01. b - statistischer Vergleich kurz gekühlter mit allen länger gekühlten Nieren. Ordinate: Perfusionswiderstand 50 x [mmHg*ml-1*min-1*100g-1], Kreatininclearance [ml* min-1*100g-1], Filtrationsfraktion [%], Diurese [ml* min-1*100g-1], renaler Natriumtransport 100x [mmol* min-1*100g-1], renaler Sauerstoffverbrauch [mmol* min-1*100g-1].

2.1.1.2.2 Nierenhistologie

Die quantitative Beurteilung der Präparate im Punkterang ergab einen höheren Ischämie-Reperfusionsschaden für die Präparate nach Kältekonservierung (Abbildung 3). Die Einzelparameter Ödem der proximalen Tubuluszellen, Vakuolisation der proximalen Tubulusepithelien, Bürstensaumverlust und Nekrosen der Tubuluszellen wurden in der Gruppe der kältekonservierten Nieren im Vergleich zu den Nieren nach kurzer Ischämie


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als stärker ausgeprägt bewertet (Abbildung 3). Die Gesamtzahl neutrophiler Granulozyten war in den Nieren nach Kältekonservierung ebenso erhöht wie die Anzahl der neutrophilen Granulozyten in den intraglomerulären Kapillaren, in den peritubulären Kapillaren und im peritubulären Nierengewebe (Abbildung 4). In der Beurteilung der Hämostase und intravasaler Mikroembolien ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen.

Abbildung 3: Histologischer Schaden in reperfundierten Nieren

Vergleich von Nieren nach 135 Minuten Reperfusion, entweder nach 15 Minuten Ischämie oder nach 15 Minuten Ischämie und anschließender Kühllagerung. Jeder der bestimmten Parameter wurde in der Gesamtheit der Präparate entsprechend dem Grad der Ausprägung mit 1-3 Punkten bewertet. Der Punkterang ist auf der Ordinate aufgetragen. Der Gesamtrang ergibt sich daraus mit 5-15 Punkten.


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Abbildung 4: Histologische Analyse neutrophiler Granulozyten in reperfundierten Nieren

Vergleich von Nieren nach 135 Minuten Reperfusion, entweder nach 15 Minuten Ischämie oder nach 15 Minuten Ischämie und anschließender Kühllagerung. PMN = Polymorphonukleäre Neutrophile Granulozyten. Die Zahlenangaben beziehen sich auf jeweils ein Gesichtsfeld im Mikroskop bei einer Vergrößerung x400.


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2.1.2 Einfluss der Blutviskosität während der Reperfusion

Bei kardiochirurgischen Eingriffen an der Herz-Lungen-Maschine verändert sich die Blutviskosität, was Auswirkungen auf die Nierenperfusion hat [ 29 , 181 ]. Die Auswirkungen der Blutviskositätsänderungen auf die Nierenfunktion während einer extrakorporalen Zirkulation wurden bisher nicht untersucht. Rheologisch betrachtet ist Blut ein disperses System. Es kann als eine Suspension aus Plasma und zellulären Bestandteilen aufgefasst werden. Bei einem rein viskösen Material ist gemäß dem Newtonschen Gesetz die Schergeschwindigkeit(D) proportional zur Schubspannung(tau). Proportionalitätsfaktor ist die Viskosität (eta), die sich wie folgt ergibt:

Die Maßeinheit der Viskosität eta beträgt:

Viskosität eta = tau/D [N*s*m-2] oder [Pa*s] oder centiPoise [CPS], 1CPS = 1 mPa*s

Die Blutviskosität (eta(VB)) ist eine Funktion des Hämatokrit (Hkt), der Plasmaviskosität (eta(Pl)), der Erythrozytenflexibilität (EF) und -aggregation (EA).

eta(VB)= f(Hkt, eta(Pl), EF, EA).

Blut verhält sich unterhalb einer gewissen Schubspannung wie ein elastischer Festkörper, oberhalb dieser Schubspannung wie eine visköse Flüssigkeit. Die Viskosität variiert somit in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit. Somit ist die Fluidität des Blutes in den großen Arterien deutlich höher als in den kleinen Gefäßen [ 55 ]. Für den Sauerstoffaustausch, der in den Kapillaren stattfindet, ist die Fluidität des Blutes eine wichtige Bedingung. Die Sauerstofftransportkapazität (STK) des Blutes hängt von der Perfusion (Q) und dem Sauerstoffgehalt (O2Cont) des Blutes ab: STK = Q x O2Cont.

Unter Miteinbeziehung des Hagen-Poiseuilleschen-Gesetz des Flusses folgt:

Der Sauerstoffgehalt (O2Cont) ist bei ausreichendem O2-Angebot an das Blut und intakter Sauerstoffbindungskapazität im wesentlichen eine Funktion der Hämoglobinkonzentration (Hb): O2Cont = f(Hb). Da der durch den Gefäßradius hauptsächlich bedingte vaskuläre Widerstand gleich

ist, so lautet der Zusammenhang


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Wenn die Druckdifferenz ÄP und der vaskuläre Widerstandstonus Rv konstant bleiben, so ist die Sauerstofftransportkapazität (STK) eine Funktion von Hb und Viskosität eta: STK = f ( Hb/eta). Da eta maßgeblich vom Hämoglobingehalt des Blutes beeinflusst wird, ergibt sich ein Maximum für STK, welches von der Schubspannung tau abhängt:

Für sehr niedrige Hämoglobinwerte ist die Sauerstofftransportkapazität niedrig. Nimmt der Hämoglobinwert zu, so steigt auch die Sauerstofftransportkapazität an. Wird ein bestimmter Wert überschritten, so fällt die Sauerstofftransportkapazität wegen der höheren Viskosität und der dadurch verringerten Fluidität wieder ab [ 55 , 58 ]. Der „optimale“ Hämatokrit wird also durch die Fließeigenschaften des Blutes mitbestimmt. Bei niedrigen Scher- und damit Fließgeschwindigkeiten ist er niedriger als bei hohen [ 56 ]. Jedoch ist das Konzept von einem optimalen Hämatokrit per se umstritten, da situationsbedingt und auch interindividuell unterschiedliche Anforderungen bestehen [ 73 ]. Nach der von Sunder-Plasmann aufgestellten Kurve [ 172 ], die die Sauerstoffversorgung des Gewebes als Funktion des Hämatokrits beschreibt, ist die Gewebeoxygenierung von 100% bis zu einem Hämatokritwert von 0,20 gewährleistet. Unterhalb des Wertes von 0,20 fällt die Kurve schnell ab [ 172 ]. In klinischen Untersuchungen ist dargelegt, dass unter normalen Kreislaufbedingungen eine limitierte Hämodilution bis auf Hämatokritwerte von 20% gut toleriert wird und positive Auswirkungen auf die Perfusion der Gewebe hat [ 56 , 111 ]. Aus der Literatur ist aber auch bekannt, dass die Gewebeoxygenierung prinzipiell darüber hinaus auch bei noch niedrigerem Hämoglobingehalt aufrechterhalten ist [ 24 , 56 , 111 ].

Es ist also davon auszugehen, dass Hämatokrit und Viskosität bei der extrakorporalen Zirkulation am kardiopulmonalen Bypass wesentlich zur Qualität der Organversorgung beitragen. Das Auftreten struktureller Organveränderungen während der extrakorporalen Zirkulation ist für das Gehirn [ 15 , 16 , 50 , 54 , 114 ] und für die Lunge [ 37 , 89 , 159 ] beschrieben. Für die Niere gibt es ebenfalls einzelne Beschreibungen, die das Auftreten mikrovaskulärer Schäden während der extrakorporalen Perfusion belegen [ 37 , 129 ]. Besonders die marknahen Regionen der Nierenrinde sind hochgradig ischämieempfindlich [ 78 ]. In der Niere besteht eine unterschiedliche regionale Blutflussverteilung in den einzelnen Nierenkompartimenten. Es existiert die anatomische Besonderheit der Versorgung der tief in der Nierenrinde gelegenen peritubulären Kapillaren durch


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langstreckig durch die Nierenrinde verlaufende Aa. rectae [ 78 , 109 , 129 ]. Dies führt zu der Überlegung, dass unter den im Vergleich zu physiologischen Bedingungen eingeschränkten Flussbedingungen eines kardiopulmonalen Bypasses die renale Gewebeversorgung durch hämodilutionsbedingte Flussverbesserungen gesteigert werden könnte. Dies gilt insbesondere für den peritubulären Plexus mit den niedrigsten Fluss- und Scherstressraten der Niere [ 109 ]. Unsere Studie untersucht daher den Einfluss des Hämatokrits und der Blutviskosität während der extrakorporalen Zirkulation im ex-vivo Perfusionsmodell. Unsere Arbeitshypothese besagt, dass eine Verringerung der Blutviskosität die postischämischen Perfusionsbedingungen und die Funktion der Niere in der Reperfusionsphase verbessert.

2.1.2.1 Material und Methoden

Die Organgewinnung und -konservierung erfolgte wie im Kapitel 2.1.1.1.2. beschrieben. Nach einer warmen Ischämiezeit von 17,2 ± 8,9 min und einer Konservierungsdauer von 5,1 ± 2,4 Stunden wurden 28 Nieren für die Untersuchung verwendet und in 2 Gruppen mit je 14 Nieren aufgeteilt. In der ersten Gruppe, im folgenden als Standardgruppe bezeichnet, erfolgte die Reperfusion mit mässig dilutiertem Blut, wie in der Technik eines kardiopulmonalen Bypasses in der Humanmedizin üblich: Das Perfusionssystem wurde wie im Kapitel 2.1.1.1.4. beschrieben mit heparinisierter Kochsalzlösung vorgefüllt und für die Reperfusion des Organes dann mit 500 ml autologem Vollblut bestückt. In der 2. Gruppe, im folgenden als Dilutionsgruppe bezeichnet, wurde das Vollblut vor Reperfusion des Organes zusätzlich mit 400 ml isotonischer Tyrodelösung aus dem Dialysatreservoir verdünnt. Die Analyse der Nierenfunktion erfolgte ebenfalls analog den im Kapitel 2.1.1.1.5. aufgeführten Methoden. Die Viskosität des Vollblutes und des Plasmas wurden bei 37°C und bei Schergeschwindigkeiten von 11s-1 und 225s-1 mit einem Kegel-Platten-Viskosimeter (Wells-Brookfield, Massachusetts, USA) gemessen. Das Plasma wurde vorher bei 3000 U/min 10min zentrifugiert und abpipettiert. Das Prinzip der Viskositätsmessung mit dem Kegel-Platten-Viskosimeter beruht auf der Messung des Widerstandes, den die Flüssigkeit, die sich zwischen dem bei definierter Geschwindigkeit rotierenden Kegel und der festen Kammerplatte befindet, dem Kegel entgegenbringt. Je zäher die Flüssigkeit ist, um so höher ist der Widerstand. Die Verzögerung des Kegels ist proportional der Viskosität. Die Angabe der Viskosität erfolgt in centiPoise (CPS). Bei in-vitro Messungen können die Fließbedingungen in großen und kleinen Arterien durch verschiedene Schergeschwindigkeiten simuliert werden, wobei angenommen wird, dass


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unter physiologischen Umständen in der Aorta eine Schergeschwindigkeit von etwa 230 s-1 und in Arteriolen und Venolen von etwa 11,5 s-1 vorherrscht [ 57 ].

2.1.2.2 Ergebnisse

2.1.2.2.1 Blutanalysen

Die gemessenen Vollblutviskositäten waren während der Perfusion in der Gruppe „Dilution“ sowohl bei hoher Schergeschwindigkeit von 225s-1 als auch bei niedriger Schergeschwindigkeit von 11s-1 geringer als in der Vergleichsgruppe „Standard“. (Abbildung 5). Die Senkung des Hämatokrit zeigte eine positive Korrelation mit der reduzierten Vollblutviskosität bei beiden Schergeschwindigkeiten. (r = 0,807, p < 0,01 bei 11 s-1 und r = 0,747 , p < 0,01 bei 225 s-1). Die gemessenen Plasmaviskositäten unterschieden sich nicht (Abbildung 5). Die dilutionsbedingten Unterschiede der Thrombozytenkonzentration (122 ± 33 versus 343 ± 33) und der Leukozytenkonzentration (3,8 ± 1,1 versus 7,7 ± 4,4) waren nicht signifikant.


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Abbildung 5: Blut- und Plasmaviskositäten in den Gruppen „Standard“ und „Dilution“

Abkürzungen: bv = Blutviskosität; pv = Plasmaviskosität; gemessen bei den Scherraten 11s-1 und 225s-1.

2.1.2.2.2 Hämodynamik und Sauerstoffangebot

Der gemessene renale vaskuläre Widerstand war in der stärker hämodilutierten Gruppe im Vergleich zur Standardgruppe geringer (Abbildung 6). Der Gefäßwiderstand der Nieren korrelierte positiv mit der Vollblutviskosität (r=0,62, p<0,05 bei einem Schergrad 11s-1 und r = 0,671, p < 0,05 bei einem Schergrad 225-1), aber nicht mit dem Hämatokrit (r = 0,47, p < 0,01). Der im Trend sichtbar gesteigerte Perfusionsfluss in der hämodilutierten Gruppe erreichte keine statistische Signifikanz (Abbildung 5), ebensowenig wie der renale Plasmafluss (Abbildung 5). Das Sauerstoffangebot an die Niere war in der Gruppe mit reduziertem Hämatokrit geringer als in der Standardgruppe (Abbildung 6).


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Abbildung 6: Renale Hämodynamik in den Gruppen „Standard“ und „Dilution“

Ordinate: Perfusionswiderstand 10x [mmHg*ml-1*min-1*100g-1], Blut- und Plasmafluss [ml*min-1*100g-1], Perfusionsdruck [mmHg].

2.1.2.2.3 Nierenfunktion

Die Diurese war in der hämodilutierten Gruppe höher als in der Standardgruppe (Abbildung 7). Neben den höheren Werten fiel eine größere Spannweite des Urinflusses auf. Der Maximalwert betrug in der hämodilutierten Gruppe 30,3 ml*min-1*100g-1, während der höchste Wert der Vergleichsgruppe bei 8,5 ml*min-1*100g-1 lag. Alle untersuchten Nieren produzierten eine für die weitere Analyse ausreichende Menge Urin. Die Kreatininclearance war in der hämodilutierten Gruppe gegenüber der Standardgruppe erhöht (Abbildung 7). Bei Betrachtung der Filtrationsfraktion ergaben sich keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Beide untersuchten Gruppen unterschieden sich nicht im Bezug auf das Verhältnis zwischen O2-Verbrauch und Natriumtransport. Der basale Sauerstoffverbrauch betrug in der Standardgruppe 0,097 mmol*min-1*100g-1 und in


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der hämodilutierten Gruppe 0,111 mmol*min-1*100g-1. Über der basalen Umsatz hinaus transportierten die „Standard“-Nieren, wie auch die „Dilutions“-Nieren je mmol Sauerstoff 22,7 mmol Natrium. Die tubulären Funktionsparameter Natriumtransport und Sauerstoffverbrauch wiesen eine gesteigerte Funktion der Nieren in der mit reduzierter Viskosität perfundierten Gruppe 2 aus. Sowohl die tubuläre Natriumresorption, als auch der O2-Verbrauch waren in Gruppe 2 höher (Abbildung 7).

Abbildung 7: Nierenfunktion in den Gruppen „Standard“ und „Dilution“

Ordinate: Diurese [ml* min-1*100g-1], Krea-Clear = Kreatininclearance [ml* min-1*100g-1], Na-Transp. = renaler Natriumtransport 3x [mmol* min-1*100g-1], O2-Ver. = renaler Sauerstoffverbrauch 3x [mmol* min-1*100g-1], O2-Ang. = Blutsauerstoffangebot an die Niere [mmol* min-1*100g-1].


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2.2 Untersuchungen zum hypothermen Kreislaufstillstand an neugeborenen Ferkeln

Bei einer Herzoperation am kardiopulmonalen Bypass mit Kreislaufstillstand erfährt die Niere eine Ischämiephase. Anders als bei der Explantation des Organes beginnt die Ischämie aber erst nach effektiver Perfusionskühlung des Organes. Es ist unklar, welches Ausmaß der renale Ischämie-Reperfusionsschaden unter Anwendung des Hypothermieschutzes annimmt. Zur Klärung dieser Fragestellung wurde der renale Ischämie-Reperfusionsschaden in einem neonatalen Ferkelmodell untersucht und mit den Ergebnissen der ex-vivo perfundierten Nieren verglichen.

Die prophylaktische Anwendung von Cortikosteroiden ist bei der Durchführung einer Herzoperation am kardiopulmonalen Bypass seit Jahrzehnten weit verbreitet [ 183 ], obwohl ein positiver Effekt nicht eindeutig nachgewiesen ist. Einige Studien beschreiben eine Senkung des gesamt-vaskulären Gefäßwiderstandes in Untersuchungen an Patienten und sehen darin einen Hinweis auf eine verbesserte Mikrozirkulation [ 41 , 60 , 122 ]. Eine postoperativ erhöhte Diurese ist ebenfalls beschrieben [ 60 ]. Andererseits verschlechtert die Steroidapplikation die Glukosetoleranz [ 107 , 122 ] und bewirkt eine Immunsuppression mit Erhöhung der Zahl der “natural killer cells“ und Suppression der Interleukin-2 Produktion [ 107 ]. Glukocortikoide schienen bei einer Untersuchung in Patienten keinen Einfluss auf die Endotoxinproduktion am kardiopulmonalen Bypass zu haben [ 86 ]. Eine nephroprotektive Wirkung könnten Glukocortikoide einerseits durch Blockade proapoptotischer Signalstrecken haben, was kürzlich an bovinen glomerulären Endothelzellen dokumentiert wurde [ 112 ] oder durch die in einem Rattenmodell dokumentierte Aktivierung glomerulärer antioxidativer Enzyme [ 87 ]. Andererseits sind nach Glucocortikoidgaben und warmer renaler Ischämie in einem Rattenmodell nach Reperfusion sogar vermehrt Nekrosen im Pars recta des proximalen Tubulus beschrieben worden [ 68 ]. Eine Erklärung für die unterschiedlichen Studienergebnisse könnten die verschiedenen gewählten Applikationsdosen und -zeiten sein. In unserem Modell entschieden wir uns für eine Hochdosisapplikation mit Beginn 24 Stunden vor der Operation . Ziel dieses Teiles der Untersuchung war es, die Hypothese einer nephroprotektiven Wirkung der Glukocoricoidprophylaxe am kardiopulmonalen Bypass zu überprüfen.


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2.2.1 Material und Methoden

2.2.1.1 Versuchsplanung

Herzgesunde neonatale Ferkel wurden einer Herz-Lungen-Maschinen-Operation in tiefer Hypothermie mit Kreislaufstillstand unterzogen. Zur Beurteilung der Nierenfunktion wurden in 5 Messperioden Urin- und Blutproben analysiert. Der Versuchsplan sah eine postoperative Reperfusionsperiode von 7 Stunden Dauer vor, in deren Anschluß die Nieren zur histologischen Untersuchung entnommen wurden. Miteinander verglichen wurden die Ergebnisse von 3 Versuchgruppen: nach 60 Minuten Kreislaufstillstand, nach 120 Minuten Kreislaufstillstand und nach 120 Minuten Kreislaufstillstand unter Cortisontherapie.

2.2.1.2 Anästhesieologische und kardiotechnische Methoden

Ferkel mit einem Alter von 2 - 10 Tagen und einem Gewicht von 0,9 bis 2,7 kg wurden am Morgen des Versuchtages in die Tierexperimentelle Forschungseinrichtung der Charité, Campus Virchow Klinikum eingeliefert. Die Anästhesieeinleitung erfolgt unmittelbar nach der Ankunft durch eine intramuskulären Injektion von Ketanest (25 mg/kgKG) und Dormicum (1 mg/kgKG). Nach Punktion einer Ohrvene wurde die Narkose intravenös mit Fentanyl (50 µg/kgKG) und Midazolam (0,2 mg/kgKG) bei Relaxierung mit Pancuronium (0,2 mg/kgKG) mit bedarfsadaptierter Supplementierung zur Sicherung einer guten chirurgischen Toleranz vertieft und fortgeführt. Die kontrollierte Beatmung erfolgt nach endotrachealer Intubation mit einem Sauerstoff-Luft-Gemisch (Baby-Log Ventilator, Dräger, Lübeck, Deutschland). Arterielle und venöse Katheter wurden in die Arteria femoralis und in die Vena subclavia gelegt. Ein Urinkatheter wurde suprapubisch in die Blase gelegt und mit einem Flowmeter verbunden. Bei den Tieren der Cortison-Therapiegruppe wurden 24 und 5 Stunden vor Operationsbeginn jeweils 30 mg/kg Methylprednisolon (Urbason®, Hoechst Marion Roussel, Bad Soden, Deutschland) i.v. verabreicht. Die extrakorporale Zirkulation bestand aus einer Rollerpumpe (Stöckert, München, Deutschland) und einem neonatalen Oxygenatorensystem (SaveMicro, Polystan, Vaerlose, Dänemark). Die Herz-Lungen-Maschine wurde vor Versuchsbeginn mit frischem Schweinespenderblut mit einem Hämoglobinwert von über 7 mg*dl-1 vorgefüllt. Nach Thorakotomie und Öffnung des Perikards wurden die Aorta ascendens und das rechte Herzohr mit U-Nähten (6.0 Prolene) versehen. Die Aorta wurde mit einer neonatalen Aortenkanüle (8 Fr) und der rechte Vorhof mit einer venösen Kanüle (14 Fr) an die extrakorporale Zirkulation angeschlossen. Nach Beginn des kardiopulmonalen Bypasses


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wurde das Tier 20 Minuten mit vollem Fluss (200-250 ml*kg-1*min-1) normotherm perfundiert (rektale Temperatur 38 °C). Nach dieser Stabilisierungsphase wurde das Tier innerhalb von 30 Minuten auf eine rektale Temperatur von 13-14 °C gekühlt (Flussrate 200-250 ml*kg-1*min-1) und die Perfusion für 60 oder 120 Minuten unterbrochen. In der Reperfusionsphase wurde wiederum bei vollem Fluss des kardiopulmonalen Bypasses eine Erwärmung auf 38 °C innerhalb von 30 Minuten angestrebt. Die Tiere wurden dann von der extrakorporalen Zirkulation entwöhnt. Die Gefäßkanülen verblieben in situ, der offene Thorax wurde mit einem feuchten Verband abgedeckt. In den folgenden 7 Stunden wurde der mittlere arterielle Blutdruck mittels Volumentherapie (isotone Elektrolytlösung oder Vollblutkonserve) und Dopamin (2,5-20 µg*kg-1*min-1) bei über 60 mmHg gehalten. Die Beatmungsparameter wurden entsprechend den Blutgasanalysen korrigiert.

2.2.1.3 Messperioden und Analysen

Urin- und Blutentnahmen erfolgten in fünf aufeinander folgenden Untersuchungsphasen:

  1. Legen des suprapubischen Blasenkatheters bis zum Beginn der extrakorporalen Zirkulation
  2. Beginn der extrakorporalen Zirkulation bis zum Beginn des Kreislaufstillstandes
  3. Beginn der Reperfusion bis zum Ende des kardiopulmonalen Bypasses
  4. Ende des kardiopulmonalen Bypasses bis zum Ende der 2. postoperativen Stunde
  5. Beginn der 3. bis Ende der 6. postoperativen Stunde

Die Kreatininkonzentration [mg*l-1], die Natriumkonzentration [mmol*l-1] und die Osmolarität [mosmol*l-1] wurden in Serum und Urin gemessen. Im Urin wurde zusätzlich die Gesamtproteinkonzentration, die Albuminkonzentration und die Aktivität der N-acetyl-ß-D-glucosaminidase bestimmt. Die Analysemethoden sind detailliert im Kapitel 3.1.1.3. aufgeführt. Aus abgemessener Urinmenge und Dauer der Sammelperiode wurde die Diurese [ml*h-1*kg-1] berechnet. Die nach Standardformeln berechnete Kreatininclearance wurde auf die Körperoberfläche bezogen [ml*min-1*1,73m-2]. Gesamtprotein- und Albuminkonzentration sowie die Aktivität der N-acetyl-ß-D-glucosaminidase im Urin wurden auf die Kreatininkonzentration im Urin bezogen [mg*gKrea-1].


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2.2.1.4 Histologie

Die Organentnahme und die histologische Aufarbeitung des Gewebes erfolgte wie im Kapitel 2.1.1.1.6. beschrieben. Die Organe von 5 nicht operierten Tieren dienten als Kontrolle.

2.2.2 Ergebnisse

2.2.2.1 Operatives Überleben

Nach 60 Minuten Kreislaufstillstand überlebten 7 Ferkel die Operation mit einer postoperativen Überlebensdauer von im Median 90 (10 - 420) Minuten, wobei nur 3 Tiere die fünfte Messperiode (120 - 360) Minuten postoperativ erreichten. In der Gruppe nach 120 Minuten Kreislaufstillstandsdauer (n=9) betrug die Überlebenszeit im Median 275 (40 - 420) Minuten, fünf Ferkel lebten nach dem Ende des kardiopulmonalen Bypasses länger als 120 Minuten. Nach Cortisongabe (n=5) überlebten die Tiere im Median 355 (187 - 375) Minuten postoperativ und gelangten alle in die letzte Messperiode.

2.2.2.2 Nierenfunktion

2.2.2.2.1 Nach 60 Minuten Kreislaufstillstand

Alle Ferkel hatten eine Polyurie, wobei die Diurese während des gesamten Verlaufes im Vergleich zu den Initialwerten keine signifikanten Unterschiede zeigte. Verglichen mit den Basiswerten verringerte sich die Kreatininclearance während der Operation bis zu einem signifikanten Minimum in der frühen Postperfusionsphase. Die Urinnatriumkonzentration und die fraktionelle Natriumexkretion waren während der Reperfusion und nach Beendigung des kardiopulmonalen Bypasses erhöht. Die Urinosmolarität blieb während des gesamten Verlaufes annähernd konstant (Tabelle 2). Die Urinkonzentration des Gesamtproteins war während der Reperfusion erhöht und nahm während der ersten zwei postoperativen Stunden im Mittelwert weiterhin zu. Auch die Albuminausscheidung zeigte während des kardiopulmonalen Bypasses und in der frühen postoperativen Phase einen im Vergleich zu den präoperativen Messwerten signifikanten Anstieg und blieb im weiteren Verlauf erhöht. Die Aktivität der N-acetyl-ß-D-glucosaminidase im Urin war während der Reperfusion im Vergleich zu den Ausgangswerten erhöht (Abbildung 8).

2.2.2.2.2 Nach 120 Minuten Kreislaufstillstand

Die Diurese war zu Beginn des kardiopulmonalen Bypasses im Vergleich zu den


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Initialwerten vermindert. Zwei der Tiere hatten in der Reperfusionsphase eine Anurie, welche bei einem der Ferkel zwei Stunden postoperativ bestehen blieb. Die übrigen Ferkel dieser Gruppe waren in der Reperfusionsphase polyurisch. Die Kreatininclearance war zu Beginn der Herz-Lungen-Maschine vermindert, im Mittelwert in der Reperfusionsphase höher als präoperativ und zeigte bis zum Ende des Versuches eine abfallende Tendenz. In der Reperfusions- und der Postperfusionsphase gab es einen Anstieg der fraktionellen Natriumexkretion, während die Natriumkonzentration im Urin während des gesamten Verlaufes relativ konstant blieb. Die Osmolarität des Urins war während der Reperfusion im Vergleich zum Versuchsbeginn verringert (Tabelle 2). Von der Reperfusionsphase an nahm die Gesamtproteinkonzentration im Urin verglichen mit den Basismesswerten kontinuierlich zu. Auch die Albuminkonzentration stieg während der Reperfusion an und blieb im weiteren Verlauf gegenüber den Anfangswerten erhöht. Die Aktivität der N-acetyl-ß-D-glucosaminidase war in der frühen postoperativen Phase gegenüber den Ausgangswerten erhöht (Abbildung 8).

2.2.2.2.3 Nach 120 Minuten Kreislaufstillstand und Cortisongabe

Die Diurese verringerte sich mit dem Operationsbeginn und zeigte im weiteren Operationsverlauf keine signifikanten Unterschiede zu den Ausgangsmessungen. Die Kreatininclearance war in der ersten Phase des kardiopulmonalen Bypasses im Vergleich zu den Basiswerten vermindert. Die fraktionelle Natriumexkretion, die Urinnatriumkonzentration und die Urinosmolarität zeigte im Vergleich zu den präoperativen Werten keine signifikanten Veränderungen (Tabelle 2). Die Konzentration des Gesamtproteins nahm nach Kreislaufstillstand zu und war auch in den beiden postoperativen Messperioden verglichen mit den Initialwerten erhöht. Auch die Albuminkonzentration war ab der Reperfusionsphase erhöht. Ein statistisch signifikanter Anstieg der Aktivität der N-acetyl-ß-D-glucosaminidase gegenüber den Basismessungen war zu keinem Zeitpunkt nachzuweisen (Abbildung 8).


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Tabelle 2: Nierenfunktionsmessungen nach 60 und 120 Minuten Kreislaufstillstand mit und ohne Cortisonvorbehandlung

 

Prä OP

HLM

Kühlung

HLM

Reperfusion

2 Stunden post OP

7 Stunden post OP

Diurese

60 min

120 min

120 min+Cortison

14,3 ± 3,1

6,3 ± 1,8

19,8 ± 10,7

16,1 ± 3,6

3,88 ± 1,1 *

7,8 ± 4,6 *

24,2 ± 9,4

17,2 ± 6,0

10,9 ± 2,0

16,9 ± 4,0

9,0 ± 2,5

7,6 ± 1,1

10,5 ± 2,9

3,8 ± 1,2

5,8 ± 1,4

Kreatininclearance

60 min

120 min

120 min+Cortison

126 ± 29

49 ± 17

108 ± 56

88 ± 43

22 ± 8 *

20 ± 9 *

65 ± 36

58 ± 15

48 ± 15

26 ± 6

24 ± 10

15 ± 2

26 ± 9

11 ± 4

19 ± 6

Urinnatriumkonz.

60 min

120 min

120 min+Cortison

73 ± 9

83 ± 12

99 ± 14

87 ± 8 *

82 ± 11

100 ± 16

104 ± 7 *

101 ± 6

97 ± 9

93 ± 8 *

105 ± 4

89 ± 8

83 ± 16

95 ± 10

83 ± 13

FENa

60 min

120 min

120 min+Cortison

2,4 ± 0,4

3,4 ± 0,7

4,7 ± 1,0

9,0 ± 3,6 *

7,0 ± 2,5

7,5 ± 2,5

19,3 ± 7,5 *

13,4 ± 5,3 *

11,0 ±5,2

28,8 ± 15,3*

20,8 ± 7,2 *

15,1 ± 4,3

11,4 ± 5,1

9,1 ± 1,6

10,1 ± 3,3

Urinosmolarität

60 min

120 min

120 min+Cortison

327 ± 44

237 ± 56

210 ± 52

309 ± 49

252 ± 56

286 ± 40

362 ± 61

116 ±13 *

213 ± 27

322 ±85

162 ± 21

258 ± 69

303 ± 98

172 ± 34

274 ± 56

FENa = fraktionelle Natriumexkretion, HLM = Herz-Lungen-Maschine. Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M. angegeben. Einheiten: Diurese [ml/h/kg], Kreatininclearance [ml*min-1*1,73m-2], Urinnatriumkonzentration [mmol*l-1], FENa [%], Urinosmolarität [mosmol*l-1]. * kennzeichnet einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu der präoperativen Messung (p < 0,05)


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2.2.2.2.4 Vergleich der Versuchsgruppen

Bezüglich der Diurese, der Kretaininclearance, der Urinnatriumkonzentration und der fraktionellen Natriumexkretion ergaben sich nach dem Kreislaufstillstand keine Unterschiede zwischen den 3 Versuchsgruppen. Die Urinosmolarität war nach 120 Minuten Kreislaufstillstand in der Reperfusionsphase niedriger als nach 60 Minuten Kreislaufstillstand und als nach Vorbehandlung mit Cortison (Tabelle 2). Das Ausmaß der Proteinurie unterschied sich nach 60 und nach 120 Minuten Kreislaufstillstand nicht. Nach Cortisonbehandlung war die Urinproteinkonzentration in der Reperfusionsphase und in den ersten 2 Stunden postoperativ höher als ohne Cortisonvorbehandlung (Abbildung 8). In der Analyse der Albuminkonzentration zeigte sich ein größeres Ausmaß der Albuminurie bei cortisonvorbehandelten als bei nicht behandelten Tieren bereits zu Beginn des kardiopulmonalen Bypasses (Abbildung 8). Ebenso war die Aktivität der N-acetyl-ß-D-glucosaminidase bei den Tieren nach Cortisonvorbehandlung bereits präoperativ erhöht, während sich wiederum im Vergleich der Gruppen nach 60 und 120 Minuten Kreislaufstillstand keine Unterschiede ergaben (Abbildung 8).

2.2.2.3 Nierenhistologie

In den mit Cortison prämedizierten Nieren fand sich nach 120 Minuten Kreislaufstillstand im Tubulusepithel ein erhöhter Prozentsatz an Vakuolen sowohl im Vergleich mit der Kontrollgruppe als auch im Vergleich mit der Gruppe nach 120 Minuten Stillstandsdauer ohne Cortisongabe. Bei allen übrigen im vorangegangenen Kapitel beschriebenen histologischen Parameter unterschieden sich die Operationspräparate nicht von den Kontrollnieren. Nekrosen waren in keinem der Präparate zu finden (Abbildung 9).


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Abbildung 8: Nierenfunktion im Gruppenvergleich

= p< 0,05 im Vergleich der Gruppen 120 Kreislaufstillstand mit und ohne Cortisonvorbehandlung


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Abbildung 9: Histologische Bewertung des Ischämie-Reperfusionsschadens

* die Vakuolenbildung im Tubulusepithel von Nieren nach 120 Minuten Kreislaufstillstand nach vorangegangener Cortisongabe weist einen statistisch signifikanten Unterschied zu den Kontrollen und zur Gruppe der Nieren nach 120 Minuten Kreislaufstillstand ohne vorangegangene Cortisongabe auf. BS-Verlust = Bürstensaumverlust, Tubulus-D = Tubulusdilatation. Auf der Ordinate sind Epithelhöhe und Tubulusdurchmesser in nm, der Bürstensaumverlust mit einem Punktrang von 1-3 Punkten und die Vakuolenbildung im Tubulusepithel in % angegeben.


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Tue Oct 16 13:48:41 2001