Dörffel, Yvonne: Rolle peripherer Monozyten bei Patienten mit essentieller Hypertonie

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Kapitel 6. Material und Methoden

6.1 Chemikalien und Reagenzien

Alle Chemikalien und Reagenzien, die für die Isolierungen und Experimente verwendet wurden, waren Endotoxin-frei (Endotoxin < 0,01 ng/ml). Endotoxin-freies fetales Kälberserum (Endotoxin < 0,002 ng/ml) wurde von Biochrom KG/Seromed (Berlin) bezogen. Endothelzellmedium M-199 wurde von Bio Whittaker (Boehringer Ingelheim Bioproducts, Heidelberg) und Endothelzellwachstumsmedium (ECGM) von Promocell (Heidelberg) bezogen. PBS (Phosphate Buffered Saline) wurde von Dulbeco (Biochrom KG/Seromed, Berlin) geliefert. Ficoll-Histopaque wurde von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen. Die AT1-Rezeptorantagonisten Losartan und Eprosartan wurden von MSD (Haar) bzw. Hoechst Marion Roussel (Bad Soden/Taunus) zur Verfügung gestellt. Die IL-1ß und IL-6 ELISA wurden über R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen und der TNF-alpha ELISA über Medgenix Diagnostics (Fleurus, Belgien) bezogen. Na51Cr wurde von Nycomed Amersham (Amersham, UK) geliefert. Der Faktor VIII Kit zur Identifizierung der Endothelzellen kam von der Worthington Biochemical Corporation (Lakewood, NJ, USA). Die Adhäsionsmolekül-Assays wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Fluoreszenzmarkierte und nicht markierte monoklonale Antikörper für die Flusszytometrie wurden von DAKO (Dänemark) bzw. Pharmingen / Becton-Dickinson (Mountainview, CA) bezogen. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde von Boehringer Ingelheim GmbH (Ingelheim) verwendet. Alle übrigen Produkte waren von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA), falls nicht anders angegeben.


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6.2 Periphere Monozyten

6.2.1 Isolierung der Monozyten aus dem peripheren Blut

Die mononukleären Zellen wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit essentieller Hypertonie sowie gesunden Normalpersonen gewonnen und präpariert (Boyum A., 1968; Dörffel-Rückert Y., 1996). Dieses Vorgehen war durch die zuständige Ethikkommission (Charité) gebilligt worden. Es wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes durch Dichtegradientenzentrifugation mittels Ficoll-Histopaque abgetrennt. Dazu wurden jeweils ca. 100 ml heparinisiertes (100 U Heparin/ml) venöses Blut mit PBS (1:1) verdünnt und dann über Ficoll-Histopaque (SG = 1,077) geschichtet und für 40 min bei 400 g zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurde die Zwischenschicht (Interface, Abb. 2) entnommen und mehrfach mit PBS (ohne Ca2+/Mg2+) gewaschen sowie anschließend je nach weiterem Isolierungsverfahren in RPMI 1640 (Roosevelt Park Memorial Institute - Medium) mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS) bzw. PBS mit 0,1 % HSA resuspendiert.

Abb. 2 Abtrennuung der mononukleären Zellen mit Ficoll-Histopaque. Bei der Dichtegradientenzentrifugation setzen sich die Erythrozyten und Granulozyten am Boden des Röhrchens ab, da ihre Dichte höher als die von Ficoll (weiß) ist. Die mononukleären Zellen reichern sich in einer schmalen Zwischenschicht zwischen Plasma (oben, rot) und Ficoll an.


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Zur Isolierung von Monozyten mittels Plastikadhärenz wurden mononukleäre Zellen in Kulturmedium auf positiv geladenen Gewebekulturschalen inkubiert (1h, 37°C, 5 % CO2, 95 % O2). Nicht adhärente Zellen wurden durch vorsichtiges Spülen mit Medium (RPMI 1640, 37°C) abgetrennt und verworfen. Die verbleibenden adhärenten Zellen wurden mechanisch mittels Zellschaber (Nunc, Rosklide, Dänemark) in kaltem HBSS (Hank`s Balanced Salt Solution, ohne Ca2+/Mg2+) gelöst. Anschließend wurden die adhärenten Zellen mehrfach in HBSS gewaschen und in RPMI 1640 (mit 10% FCS, 100 E/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin) für Zellkulturexperimente resuspendiert.

Zur Verifizierung des ersten Isolierungsverfahrens wurden die peripheren Monozyten auch mittels magnetischer Trennung durch Dynabeads® (Dynal, Oslo, Norwegen) isoliert. Dazu wurde zu den in PBS resuspendierten mononukleären Zellen Gammaglobulin als blockende Reagenz sowie ein monoklonales Maus Immunglobulin G gegeben und alles für 10 min bei 5°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschvorgang mit PBS (0,1 % HSA) und die Zentrifugation für 8 min bei 500 g. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen resuspendiert und zu den gewaschenen Dynabeads® (100 µl pro 1 Mio mononukleäre Zellen) gegeben. Die Inkubation erfolgte rotierend für 15 min bei 5°C.

Nach Resuspendierung der Rosetten wurde ein Magnetpartikelkonzentrator zur Abtrennung der Lymphozyten verwendet. Die Monozyten befanden sich dann im Überstand.


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Die Vitaltität der Monozyten wurde entweder mit Trypanblaufärbung (lichtmikros-kopische Anwendung) oder Propidiumjodid (Auswertung im fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometer) gemessen. Die Vitalität betrug typischerweise > 95 %.

6.2.2 Identifikation der Monozyten aus dem peripheren Blut mittels fluoreszenzaktiviertem Flusszytometer

Die Monozyten wurden mittels Immunfluoreszenzfärbung von Zelloberflächenantigenen identifiziert. Es wurden monoklonale Mausantikörper von DAKO A/S (Dänemark) verwendet, welche spezifisch waren für humane T-Zellen (CD3; Klon UCHT1, Code F0818, RPE (R-Phycoerythrin)-konjugiert), humane B-Zellen (CD19; Klon HD37, Code F0768, RPE-konjugiert) bzw. humane Monozyten (CD14; Klon TÜK4, Code R0864, FITC (Fluoreszinisothiocyanat)-konjugiert).

Die Monozyten wurden mit den spezifischen (s.o.) fluoreszierenden Antikörpern versetzt und in eine vibrierende Fliesskammer gegeben. Der Zellstrom wurde an einem Laserstrahl vorbeigeleitet, wobei im Durchlicht die Größe jeder einzelnen Zelle, die Granularität in einer 90°-Ablenkung des Lichtstrahls, ferner rote und grüne Fluoreszenz und damit verschiedene Oberflächenmarker gemessen wurden. Durch die Vibration wurde der Zellstrom in feine Tröpfchen verteilt, die aufgeladen und unter Computerkontrolle durch Ablenkungsplatten nach den zu messenden Parametern sortiert wurden. Eine geeignete Antikörperkontrolle lief stets mit, um unspezifische Färbungen anzuzeigen.

Die Analyse erfolgte mittels fluoreszenzaktiviertem Flusszytometer (FACSalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA). Der Computer errechnete nach Subtraktion der Kontrollen von den Fluoreszenzprofilen die relative Frequenz von Zellen, welche die verschiedenen Oberflächenantigene exprimierten.

Die Zellsuspension enthielt in der Regel 2 % CD3 positive Zellen, 3 % CD19 positive Zellen und 93 % CD14 positive Zellen.


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6.2.3 Stimulation peripherer Monozyten und Zellkultur

Periphere Monozyten wurden in einer Konzentration von 106 Zellen/ml in RPMI 1640 (supplementiert mit 10 % FCS, 1 % Pyruvat, 100 E/ml Penicillin, 100 µl/ml Streptomycin und 50µl/ml Gentamycin) bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden in 24 Loch-Gewebekulturplatten (Nunc) entweder mit oder ohne Stimulation kultiviert.

Die optimalen Bedingungen und Konzentrationen für die Stimulation der Monozyten in Kultur mit LPS und Angiotensin II wurden mittels Zeit- und Konzentrationskinetiken ermittelt. In diesen Voruntersuchungen fanden wir, dass die Konzentration der pro-entzündlichen Zytokine im Zellkulturüberstand nach 24 Stunden ein Plateau erreichte, nach 4-6 Stunden war im ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) eine vermehrte Zytokinproduktion nachweisbar.

LPS wurde als Monozytenstimulans gewählt, da es in Vorversuchen erheblich stärker stimulierte als Pokeweed-Mitogen (Gibco) oder Concanavalin A. Die Konzentrations-kinetiken zeigten bereits eine massive Stimulierung der pro-entzündlichen Zytokine ab 10 ng LPS/ml, welche bis zu 1000 ng LPS/ml noch steigerbar war. Aufgrund der toxischen Eigenschaften von LPS verwendeten wir die niedrigere Konzentration.

Angiotensin II stimulierte die Monozyten ab einer Konzentration von 10-10 mol/l minimal und bei Konzentration von 10-6 bis -8 optimal.

In zusätzlichen Experimenten wurden die Monozyten in Gegenwart der AT1-Rezeptorantagonisten Losartan (10-8 mol/l) bzw. Eprosartan (10-6 mol/l) für 30 min vorinkubiert.

Nach 20 Stunden wurden die Kulturüberstände von den Zellen durch Zentrifugation separiert, schockgefroren (Flüssigstickstoff) und bei - 70°C bis zur Bestimmung der Zytokinkonzentrationen aufbewahrt.


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6.3 Zytokinassays

Die Konzentrationen von Interleukin-1ß und Interleukin-6 wurden in Kulturüberständen mittels spezifischer Sandwich ELISA (R&D Systems) bestimmt, der Gesamtgehalt an TNF-alpha wurde mit einem ELISA von Medgenix Diagnostics bestimmt (Dörffel Y., 1999).

Das Prinzip des Sandwich ELISA besteht darin, dass die Testplatten bereits mit einem spezifischen, immobilisierten Zytokinantikörper beschickt wurden. Die Standards oder Proben werden nun in die Plattenlöcher pipettiert, dabei bindet das darin vorhandene Zytokin an den immobilisierten Antikörper. Nach Auswaschen von allem ungebundenen Protein, wird ein polyklonaler Antikörper, welcher an ein Enzym gebunden ist und spezifisch für das entsprechende Zytokin ist, zugegeben. Damit wäre das sogenannte Sandwich komplett. Das Enzym führt nach Zusetzen einer Reagenz zur Farbreaktion je nach Zytokinkonzentration, welche photometrisch ermittelt wird.

Alle Proben wurden zumindest in Duplikaten analysiert. Kreuzreaktivitäten wurden durch Probenverdünnungsstudien abgeschätzt. Die Spezifität der ELISA-Systeme wurde durch Zusatz von bis zu 100 pg/ml Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-8, Interleukin-10 und TNF-alpha untersucht (Bienvenu J., 1993). Die Intra- und Inter-Assaypräzision lag über 97 %. Die Sensitivität lag zwischen 0,3 pg/ml für IL-1ß und 3,0 pg/ml für TNF-alpha.

6.4 Zytokin mRNA Bestimmungen

6.4.1 Extraktion der RNA

Die RNA wurde nach 4-6 Stunden mittels eines kommerziellen Kits (RNAeasy, Quiagen GmbH, Hilden), welcher modifiziert der Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktion nach Chromczynski entspricht, gewonnen (Chromczynski P., 1987).


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Zusammenfassend wurden die Zellen - nach Entfernung des Kulturüberstandes und Waschen - in Guanidium Lösung lysiert (4 M Guanidiumthiocyanat, 25 mM Na-Zitrat, 0,5 % Sarcosyl, 0,1 M 2-Mercaptoethanol, pH 7,0). Nach Entfernung der zellulären DNA wurden 0,1 Volumenteile 2 M Na-Acetat (pH 4,0) und 1 Volumenanteil H2O-gesättigtes Phenol sowie 0,2 Volumenanteile Chloroform:Isoamylalkohol (49:1) sequenziell hinzugefügt. Diese Lösung wurde auf Eis inkubiert (15 min) und anschließend zentrifugiert (5 min, 12000g). RNA ist in der wässrigen Phase enthalten. Nach erneuter Zentrifugation wurde mittels Quiagen-Säule die RNA von der wässrigen Phase extrahiert und mit Ethanol über Nacht präzipitiert (- 20°C).

Nach Zentrifugation (20 min, 12000g) wurde das Pellet in 70 % Ethanol gewaschen und die RNA in sterilem H2O (mit 0,1 % Diethyl-Pyrocarbonat vorbehandelt) resuspendiert. Die RNA-Menge und Reinheit wurden mittels Spektrophotometrie und Agarose-Gel-Elektrophorese (1 %) bestimmt.

6.4.2 Reverse Transkription (RT)

Für die semiquantitative RT-PCR wurde ein cRNA Standard (Perkin Elmer Cetus, NJ, USA) verwendet, der eine Vielzahl von Primer-Bindungsstellen (u.a. TNF-alpha und IL-1ß) enthält. Das Gewicht des co-amplifizierten internen Standards (ca. 300 bps) erlaubte über die Größe des Amplifikationsproduktes eine einfache Unterscheidung des Standards vom PCR-Produkt der Wild-Typ (authentischen) Zytokin mRNA der Probe. Zelluläre RNA, die wie oben beschrieben isoliert worden war und die authentische (Wild-Typ) RNA für TNF-alpha und IL-1ß enthielt, wurde mit verschiedenen Konzentrationen des synthetischen cRNA Standards gemischt. Aliquots dieser Mischung wurden revers transkribiert.


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Die Einzelstrang-cDNA wurde transkribiert aus 3 µg RNA mit 500 ng Oligo(dT)12-18 Primer (Gibco-BRL, Life-Technologies GmbH, Eggenstein) in einem Gesamtvolumen von 20 µl: 50 mmol/l Tris-HCl, 75 mmol/l KCl, 3 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l DTT und 1 mmol/l jedes Desoxyribonukleotides sowie 200 E Superscript II reverse Transkriptase (Gibco-BRL) enthaltend. Anschließend erfolgte die Inkubation der Reagenzien bei 42°C für 1 Stunde zur Gewinnung der komplementären DNA.

In Vorexperimenten war bestätigt worden, dass äquimolare cDNA Konzentrationen aus authentischen Zytokin RNA und synthetischen Standard über die relevante Zahl von Zyklen mit gleicher Effizienz amplifiziert werden (Abb. 3). Die Voruntersuchungen zur Amplifikationskinetik wurden bei verschiedenen Konzentrationen und für jedes der untersuchten Zytokine durchgeführt.

Abb. 3 Amplifikationskinetik TNF-alpha-Primer. Über der relevanten Zykluszahl finden sich parallele Amplifikationskinetiken für authenitisches TNF-alpha und synthetischen Standard


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6.4.3 Semiquantitative Polymerasekettenreaktion

Die Amplifikation erfolgte in Anlehnung an die von Wang beschriebene Methode (Wang A.M., 1989). Es wurde eine Amplifikation mit 25 Zyklen für beide Zytokine ausgewählt, da über den relevanten Bereich eine lineare und parallele Verstärkung vorlag (24-27 Zyklen für TNF-alpha (Abb. 3) und 23-27 Zyklen für IL-1ß). Die folgenden Primer-Paare (Perkin Elmer Cetus) wurden verwendet:

TNF-alpha:

5`-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3` und

 

5`-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3`

IL-1ß:

5`-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3` und

 

5`-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3`

Es wurden 2 µl der komplementären DNA (entsprechend ca. 300 ng RNA) zu einer Lösung aus: 10 µl PCR-Puffer (200 mmol/l Tris-HCl (pH 8,4), 500 mmol/l KCl), 3 µl MgCl2 (50 mmol/l), 2 µl dNTP (10 mmol/l), je 1 µl der 5`und 3` Primer (25 µM), 5 E Taq DNA Polymerase und 80 µl destilliertes Wasser gegeben.

Die PCR-Bedingungen waren die Folgenden: Die Doppelstrang-DNA wurde bei 94°C aufgetrennt, die Annealingtemperatur (komplementäre Anlagerung der Primer an Zielregion) lag bei 62°C für je 1 min, die Verlängerung der Primer entlang der DNA-Matritze erfolgte bei 72°C.

Der Upstream Primer wurde am 5`Ende an ein Fluoresceinmolekül gekoppelt. Das PCR Produkt wurde in Formamid verdünnt (mit 50 mM EDTA, 1:3) und mit einer denaturierenden 6% Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Der Nachweis des synthetisierten PCR Produkts erfolgte mit einem DNA Sequenzierautomaten (Applied Biosystems), der das an das 5`-Ende des Primers gekoppelte Fluoresceinmolekül über einen Argon Laser anregte. Die gescannten Rohdaten wurden mit dem Programm “gene


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scan“® (Applied Biosystems) analysiert. Die Abschätzung der enthaltenen authentischen RNA Konzentration erfolgte in der Probe, in der Konzentrationen der PCR Produkte von synthetischem Standard und authentischer RNA am ehesten äquimolar waren.

6.5 Chemilumineszenz-Assay und Stimulation der Zellen

Neben spezifischen pro-entzündlichen Mediatoren sezernieren aktivierte Monozyten eine Reihe unspezifischer Effektormoleküle wie z.B. Sauerstoffsuperoxid. Mittels Chemilumineszenz wurde die Superoxidproduktion von peripheren Monozyten und humanen Umbilikalvenenendothelzellen analysiert.

Die Monozyten wurden in RPMI 1640 resuspendiert (106 Zellen/ml) und bis zur anschließenden Verwendung auf Eis gelagert. Die Freisetzung von Sauerstoffsuperoxid wurde durch PMA induziert. PMA (8 x 10-5 mol/l) wurde in DMSO gelöst und bei - 70°C aufbewahrt. Jeweils 105 Monozyten wurden mit Angiotensin II (10-8 mol/l) oder LPS (10 ng/ml) und PMA stimuliert bzw. unstimuliert verwendet. Die Sauerstoffsuperoxid-produktion von Monozyten der Hochdruckpatienten wurde mit der der Kontrollen verglichen.

Konfluente HUVEC in Petrischalen von 20 cm2 wurden dreimal mit einem modifizierten Krebs-Puffer gewaschen (Pueyo M.E., 1998). Die Superoxidfreisetzung der HUVEC wurde nach Stimulation mit Angiotensin II (10-8 mol/l) ermittelt. Bei Verwendung des AT1-Antagonisten Eprosartan, erfolgte die Zugabe desselben 30 min vor Beginn der Experimente. Jeweils ca. 105 HUVEC wurden mittels Zellschaber abgekratzt und in eine Luminometer-Küvette gegeben.

Als Chemilumineszenz-Substrat wurden jeweils 10 µl Lucigenin (2,5 x 10-4 mol/l) zugegeben. Alle Prozeduren wurden im Dunkeln durchgeführt. Nach 5-minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Küvetten in einen CL analyzer Lumat LB 9501


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(Berthold, Bad Wildbad) gegeben. Die Messungen erfolgten alle 30 s für 2 Stunden (bis zu 24 Stunden). Die Werte ergaben sich aus der Differenz zwischen der stimulierten und unstimulierten Chemilumineszenz. Jede Messung wurde zweifach durchgeführt und das arithmetische Mittel wurde zu statistischen Zwecken verwendet.

6.6 Adhäsionsmoleküle

6.6.1 Bestimmung der Adhäsionsmoleküle mittels ELISA

Serumproben von Patienten und Kontrollen für die Bestimmung der Konzentrationen von zirkulierendem sICAM-1, sVCAM-1 und sE-Selektin wurden gesammelt. Die Seren wurden im Zweifachansatz mittels kommerziellem monoklonalen Antikörper ELISA (R&D Systems) analysiert (Prinzip s. 6.3.). Der Intra-Assay Variationskoeffizient betrug für sICAM-1 und sE-Selektin jeweils 4,8 % und für sVCAM-1 5,9 %.

6.6.2 Identifikation aktivierungsabhängiger Oberflächenmoleküle der Monozyten mittels FACS

Die Messung der aktivierungsabhängigen Oberflächenmoleküle auf peripheren Monozyten erfolgte unter Nutzung der fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie (FACS-Calibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA). Die Monozyten wurden sofort nach der Isolierung und Stimulation mit verschiedenen FITC (CD11a, CD54, CD29) oder RPE (CD11b, CD31, CD44) -konjugierten Antikörpern markiert. Zur Erhöhung der Genauigkeit erfolgte jeweils eine Färbung mit CD14 (APC (Allophycocyanin)-markierter Antikörper) als Monozytenmarker. Nur die Fluoreszenz der CD14 positiven Zellen, die ein bestimmtes für lebende Monozyten typisches Muster im forward - und sideward scatter aufwies (zweifache Gates), wurde ausgewertet.


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Zum Vergleich wurden Färbungen mit Isotyp-Antikörpern gegen IgG mitgeführt. Entsprechend der Fluoreszenz der Isotyp-Antikörper erfolgte die Wahl der Kompensation und Verstärkung des FACS. Die relative Intensität und Häufigkeit der Fluoreszenz, der mit den Oberflächenmolekülen markierten Monozyten, wurde mit dem Cellquest-Programm ausgewertet (Histogramm, Mittelwert der Fluoreszenz, Anzahl der Fluoreszenz positiven Zellen). Es erfolgte für jeden Versuch eine Auswertung der Isolationsreinheit durch Analyse der Zellgruppen.

Folgende aktivierungsabhängige Integrine bzw. Adhäsionsmoleküle wurden auf den peripheren Monozyten von Patienten und Kontrollen im Vergleich ausgewertet: CD11a (LFA-1) und CD11b (membrane attack complex-1 = MAC-1), CD54 (ICAM-1), CD62L (L-Selektin), CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1 = PECAM-1), CD44 (Pgp-1 adhesion to matrix), CD49d (very late antigen-4 = VLA-4), CD 29 (VLA-1).

6.7 Humane Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC)

6.7.1 Isolierung der HUVEC

Die humane Umbilikalvenenendothelzellen wurden nach dem modifizierten Protokoll von Jaffe (Jaffe E.A., 1973) mittels Kollagenase isoliert. Unmittelbar nach der Entbindung wurden die Nabelschnüre in sterile Behälter gegeben, welche einen HEPES Puffer (0,14 mol/l NaCl, 0,004 mol/l KCl, 0,001 mol/l HEPES Puffer (pH 7,4), 0,011 mol/l Glukose) enthielten und bis zur Präparation bei 4°C aufbewahrt. Die Verarbeitung erfolgte innerhalb der nächsten 24 Stunden nach Entbindung.

Unter sterilen Bedingungen wurden die Umbilikalvenen mit Luerlock Konnektor (Sherwood Medical, Tullamore, Irland) kanüliert und mit 100 ml des HEPES Puffers gespült. An dem anderen Ende der Umbilikalvene erfolgte mittels Konnektor die Befestigung eines 4 cm langen Silikonröhrchens (0,8 cm Durchmesser). Zehn ml einer 0,2


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% Kollagenase (Collagenase P, Boehringer Mannheim GmbH) in HEPES Puffer wurden dann für 20 min bei Zimmertemperatur in die präparierte Vene appliziert. Die Reaktion wurde beendet, indem 30 ml HEPES Puffer in die Vene gegeben wurden und die Endothelzellen in M-199 mit 20 % fetalem Kälberserum aufgefangen wurden.

6.7.2 Kultivierung der HUVEC

Die Umbilikalvenenendothelzellen wurden nach Zentrifugation bei 400g für 5 min in Endothellzellwachstumsmedium resuspendiert und auf 24 Loch-Gewebekulturplatten zu jeweils ca. 30000 Zellen pro 0,5 ml ECGM ausgesät. Die Inkubation erfolgte bei 37°C und 5 % CO2 im Brutschrank. Alle 2-3 Tage wurden die Zellen durch Mediumwechsel gefüttert. Mittels Trypsin erfolgte ein- bis dreimalig die Subkultivierung, letztmalig 48 Stunden vor Verwendung der Zellen im Adhäsionsassay.

Es wurden humane Umbilikalvenenendothelzellen gesunder Mütter zur Vermeidung jeglicher Beeinflussung des Adhäsionsassays durch voraktivierte Endothelzellen verwandt. Es wurden nur Nabelschnüre verwendet, die ansonsten verworfen worden wären.

6.7.3 Identifkation der HUVEC

Die humanen Umbilikalvenenendothelzellen wurden immunhistochemisch mittels direkter Immunfluoreszenzfärbung für den von Willebrand Faktor unter Verwendung von Anti-humanem vWF-FITC Konjugat (Factor VIII-related Antigen Staining Kit, Worthington Biochemical Corporation) identifiziert. Dabei wurden Methanol-fixierte mikrovaskuläre Endothelzellen als Positivkontrolle und Fibroblasten als Negativkontrolle verwendet. Eine Anfärbung der Zellmatrix der mikrovaskulären und umbilikalen Endothelzellen im


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Gegensatz zu den Fibroblasten wurde mittels Epifluoreszenzmikroskop (Diaphot, Nikon, Japan) nachgewiesen (Abb. 4).

Abb. 4 Humane Umbilikalvenenendothelzellen nach direkter Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-humanen vWF-FITC Konjugat.

6.8 Monozyten-Adhäsionsassays

Die Monozytenadhäsion an HUVEC wurde mit 2 verschiedenen Adhäsionsassays zur

Qualitätskontrolle gemessen.

Zunächst wurde die Monozytenadhäsion, wie von Hahn und Kollegen 1994 beschrieben, modifiziert durchgeführt (Hahn A.W.A., 1994):

Bei den konfluierende HUVEC Monolayer wurde 2 Stunden vor Adhäsion das ECGM durch das Medium RPMI 1640 mit 1 % HSA ersetzt. Nach Inkubation der Monozyten für 24 Stunden wurden sie in RPMI 1640 (mit 1 % HSA) gewaschen und auf den


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Endothelzellmonolayer ausgesät (1Mio Zellen/well). Die nicht-adhärenten Monozyten wurden nach 2 Stunden aufgenommen und gezählt. Die Monozytenadhäsion ergab sich als Prozentsatz der initial ausgesäten Zellen.

Ein zweiter Adhäsionsassay nach McCarron wurde modifiziert zur Verifizierung des ersten Assays angewandt (McCarron R.M., 1994):

Dazu wurden die Monozyten mit 100µCi Na51Cr/ml versetzt und in ein schüttelndes Wasserbad von 37°C für 1 Stunde gegeben. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert, mehrfach gewaschen und in M-199 Medium resuspendiert. Die Adhäsion der Monozyten (105 Zellen/ml/well) an die Endothelzellmonolayer erfolgte bei 37°C und 5 % CO2 für 1 Stunde. Nach der Inkubation wurden die nicht-adhärenten Zellen abpipettiert. Die Endothelzellmonolayer wurden wiederholt mit warmem M-199 gewaschen. Die adhärenten Zellen wurden mit 2 % Triton-X (0,2 ml/well) über Nacht lysiert. Die Radioaktivität aller Fraktionen wurde mittels Gamma Counter (Packard gamma 5650 counter) gemessen. Der Prozentsatz der adhärenten Zellen wurde anhand der Ausgangs- oder Totalaktivität pro Minute im Verhältnis zur Radioaktivität der adhärenten Zellen pro Minute ermittelt.

6.9 Untersuchungen am Menschen

Insgesamt nahmen 81 Patienten mit essentieller Hypertonie (Alter: 19 bis 64 Jahre) und 74 gesunde Kontrollen (Alter: 19 bis 59 Jahre) an den Versuchen teil. Alle Patienten wurden in den Hypertoniesprechstunden der Medizinischen Poliklinik der Charité, Berlin, betreut. Jegliche Entnahme von venösem Blut während Routineblutentnahmen erfolgte freiwillig. Es wurde die revidierte Deklaration von Helsinki (41. Generalversammlung des Weltärztebundes in der revidierten Fassung vom September 1989, Hongkong) zur


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Anwendung gebracht. Es wurden jedoch keine Heilversuche bzw. in vivo Experimente vorgenommen. Personenbezogene Daten wurden nicht gespeichert.

Die Gruppe der Patienten setzte sich aus essentiellen Hypertonikern vor medikamentöser Therapie bzw. ge 10 Tage nach Absetzen der antihypertensiven Therapie zusammen. Das mittlere Körpergewicht betrug 73 ± 9,6 kg und der “body mass index“ (BMI) 24,4 ± 1,5 kg/m2. Die Hypertonie wurde mittels 24 Stunden ABDM gesichert. Nur Patienten mit einem diastolischen Blutdruck zwischen 95 und 120 mmHg wurden eingeschlossen (mittlerer Blutdruck: 172/101 mmHg). Ausschlusskriterien waren alle anderen Erkrankungen sowie die sekundäre Hypertonie.

Als Kontrollgruppe wurden freiwillige, gesunde Blutspender verwendet. Das mittlere Körpergewicht betrug 70 ± 7,1 kg und der BMI 22,9 ± 2,3 kg/m2. Patienten- und Kontrollgruppe wurden hinsichtlich Alter (mittleres Alter: Patienten 47, Probanden 45 Jahre) und Geschlecht (Patienten: 37 weiblich, 44 männlich; Probanden: 35 weiblich, 39 männlich) gematcht.

Patienten- und Probandenblut wurde nicht verwendet, wenn pathologische Laborwerte (K, Kreatinin, ASAT, ALAT, BSG, CRP, Gluc, Hb, Leukozyten, Thrombozyten, LDL (< 160 mg/dl); Tabelle 2) oder sonographische Veränderungen der Carotiden bzw. Aorta abdominalis (Plaques oder pathologische Intima-Media-Dicke (> 0,80 mm; Pit`ha J., 1999; Ferrieres J., 1999)) vorlagen. Patienten mit grenzwertiger Intima-Media-Dicke der Arteria carotis communis (0,70 - 0,79 mm; Aminbakhsh A., 1999; Simons PC, 1999) im hochauflösenden Sonogramm wurden nicht in die Adhäsionsversuche sowie Chemilumineszenzmessungen eingeschlossen (Abb. 5, Tabelle 3). Raucher wurden generell ausgeschlossen, um die Ergebnisse der Versuche nicht zu verfälschen.


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Tabelle 2: Paraklinik der Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme

Patient

K

Krea

ASAT

ALAT

BSG

CRP

Gluc

Hb

Leuko

Thrombo

LDL

1, w.

4,3

0,68

8

11

5/13

<0,1

109

12,9

4,3

243

149

2, w.

3,6

0,74

8

8

13/28

<0,1

95

12,5

7,3

205

136

3, w.

3,9

0,71

6

9

8/14

<0,1

95

13,4

10,1

340

137

4, m.

3,7

0,75

7

12

8/17

<0,1

89

14,0

4,8

299

91

5, m.

4,2

0,76

10

16

7/25

0,2

108

15,2

4,8

262

120

6, m.

3,6

0,64

5

9

10/20

0,8

113

14,8

5,9

133

141

7, m.

4,3

0,68

10

21

8/13

0,3

89

14,8

9,9

189

87

8, w.

3,6

0,67

9

8

6/13

<0,1

95

12,8

4,9

289

114

9, w.

3,9

0,77

9

11

6/16

<0,1

101

14,7

6,0

234

108

10, m.

4,8

1,10

11

21

12/28

<0,1

115

14,0

5,7

174

153

11, w.

4,5

0,67

7

18

5/11

0,2

97

14,2

6,1

332

136

12, w.

4,1

0,67

8

10

14/24

0,4

104

13,0

4,9

191

106

13, m.

3,6

1,01

12

18

6/20

0,2

115

14,0

4,8

229

97

14, m.

3,9

0,80

7

9

8/14

<0,1

100

16,6

9,2

185

102

15, m.

3,9

0,67

12

23

6/9

<0,1

104

14,5

7,1

238

90

16, m.

3,6

1,03

7

9

6/12

0,1

83

14,2

5,5

281

146

17, w.

3,7

0,60

6

7

10/17

0,3

98

14,8

9,4

238

138

18, m.

3,6

0,85

9

15

14/26

0,3

115

14,6

4,8

167

145

19, m.

4,1

0,57

12

18

6/13

<0,1

112

15,2

4,8

191

156

20, w.

3,9

0,61

17

19

8/18

<0,1

83

14,5

7,6

340

116

21, m.

3,8

1,02

10

18

12/23

0,4

101

14,3

6,8

187

112

22, w.

4,3

0,63

9

13

14/29

0,1

112

13,7

7,6

201

138

23, m.

4,5

1,07

11

13

14/30

<0,1

77

14,5

4,8

163

141


54

24, m.

4,0

0,76

10

12

8/17

0,3

102

14,0

5,1

215

115

25, m.

4,2

0,76

11

13

3/10

0,1

101

14,0

6,5

227

86

26, m.

3,9

1,14

9

11

12/25

0,5

111

14,3

6,1

223

122

27, w.

4,3

0,80

7

13

6/10

0,8

67

13,2

9,2

328

146

28, m.

3,9

0,88

10

10

15/28

0,7

86

14,7

9,4

332

148

29, w.

4,0

0,70

8

9

7/12

<0,1

77

12,9

5,6

222

151

30, m.

4,1

0,92

8

18

13/29

0,7

96

14,6

7,2

256

159

31, m.

4,5

1,07

11

13

14/30

<0,1

77

14,5

4,8

163

105

32, w.

4,3

0,69

17

19

4/9

0,3

117

13,9

4,9

259

155

33, m.

4,2

0,84

5

7

15/30

0,3

89

14,5

5,8

196

90

34, m.

4,0

0,84

9

22

12/25

0,4

120

14,4

8,5

208

114

35, m.

4,5

0,85

10

17

6/14

<0,1

113

14,4

5,9

234

119

36, w.

4,6

0,61

13

16

14/30

<0,1

90

13,0

6,8

315

160

37, m.

4,5

0,85

10

17

6/14

<0,1

89

14,6

4,8

247

106

38, m.

4,4

0,74

11

17

8/18

<0,1

113

14,4

6,0

199

83

39, w.

3,9

0,78

6

8

12/23

0,3

76

12,9

4,8

310

90

40, w.

4,1

0,66

7

8

6/19

<0,1

67

13,1

6,2

244

77

41, w.

4,1

0,60

13

15

14/25

<0,1

90

13,5

5,3

167

98

42, m.

4,0

0,90

12

18

12/30

0,7

80

14,7

7,1

208

129

43, w.

3,8

0,66

15

20

14/27

0,6

112

13,7

5,3

312

154

44, m.

3,9

0,80

8

12

8/12

<0,1

77

14,0

4,9

174

100

45, w.

4,2

0,61

6

9

10/17

<0,1

89

13,5

8,1

155

88

46, m.

3,9

0,56

7

8

6/9

<0,1

96

14,5

5,3

176

67

47, w.

4,0

0,66

9

9

10/21

0,3

61

13,4

6,0

151

99

48, w.

4,0

0,78

12

14

8/10

0,2

78

13,9

4,9

201

115


55

49, m.

4,6

0,77

17

21

6/13

<0,1

90

14,6

7,6

340

143

50, w.

4,0

0,69

10

16

12/17

<0,1

78

12,5

5,6

227

151

51, m.

4,5

0,99

8

8

13/27

0,3

92

14,3

5,6

221

158

52, m.

3,7

0,86

8

13

10/20

0,2

97

15,8

7,8

188

123

53, w.

3,9

0,72

9

10

10/17

<0,1

70

13,7

5,9

178

80

54, w.

4,3

0,60

10

12

9/15

0,2

78

13,4

9,0

210

103

55, w.

4,2

0,76

12

17

12/29

<0,1

110

15,0

7,9

274

112

56, m.

3,6

0,90

13

20

15/30

0,5

92

16,4

9,0

256

139

57, m.

3,9

0,71

8

11

8/15

<0,1

70

17,5

6,7

211

142

58, w.

4,7

0,66

7

9

5/17

0,3

86

13,1

7,0

233

160

59, w.

4,2

0,98

13

14

13/26

<0,1

98

14,2

8,7

312

78

60, m.

4,4

0,82

7

10

10/20

<0,1

96

15,2

6,5

219

142

61, w.

3,9

0,62

12

10

7/12

0,2

103

14,1

6,6

254

128

62, m.

3,7

1,00

11

15

14/29

<0,1

83

16,2

5,6

281

80

63, w.

4,3

0,83

9

7

6/12

0,5

65

14,3

6,9

156

54

64, m.

3,6

0,79

14

18

14/30

<0,1

104

15,4

8,1

278

102

65, m.

3,9

0,99

17

15

10/15

0,2

78

16,0

7,2

276

125

66, w.

4,3

1,00

11

12

14/29

<0,1

70

14,3

5,1

188

141

67, m.

3,9

0,66

7

9

5/12

<0,1

98

15,2

7,4

303

110

68, w.

3,6

0,87

10

17

8/17

0,5

72

14,8

5,5

298

154

69, w.

4,2

0,71

18

22

9/14

<0,1

66

14,9

7,9

277

144

70, m.

4,7

0,69

15

16

12/19

0,2

75

15,9

6,5

249

90

71, m.

4,5

0,73

5

10

14/30

<0,1

65

14,9

5,0

196

101

72, m.

4,4

0,69

13

17

5/18

<0,1

81

15,2

8,6

177

68

73, w.

3,9

0,90

8

12

11/15

<0,1

99

14,6

6,0

271

133


56

74, m.

4,0

0,90

9

7

8/18

0,3

60

16,0

4,9

339

109

75, m.

4,3

0,79

18

22

12/17

<0,1

69

15,3

6,3

301

149

76, m.

4,0

0,92

15

17

10/21

0,4

109

14,8

5,4

231

155

77, w.

3,7

0,78

12

12

15/26

<0,1

100

14,0

6,1

255

104

78, w.

4,2

0,60

8

19

14/25

<0,1

70

14,9

4,8

239

133

79, w.

4,2

0,65

10

13

13/23

0,2

88

14,2

7,7

198

155

80, w.

4,1

0,78

12

15

6/13

<0,1

62

14,5

4,8

201

132

81, m.

3,9

0,60

7

10

5/11

<0,1

75

15,0

8,0

317

113

w. - weiblich, m. - männlich, K - Kalium (mmol/l), Krea - Kreatinin (mg/dl), ASAT/ALAT (U/l), BSG - Blutsenkungsgeschwindigkeit, CRP - C-reaktives Protein (mg/dl), Gluc- Glukose im Plasma (mg/dl), Hb - Hämoglobin (g/dl), Leuko - Leukozyten (/nl), Thrombo - Thrombozyten (/nl), LDL - low density lipoprotein (mg/dl).

Die arterielle Gefäßwand stellt sich im Ultraschallbild dreischichtig dar. Direkt an das Lumen angrenzend findet sich eine echoreiche Zone, die Intima. Die folgende echoarme Schicht entspricht der Media, welche an eine breite echoreiche Zone, die Adventitia, grenzt (Abb. 5).

Die Intima-Media-Dicke der A. carotis communis wurde nach der “leading edge“ -Methode gemessen (Gamble G., 1993; Frost D., 1998). Dabei erfolgte die Messung an der schallkopffernen Wand von der echoreichen Grenzfläche Lumen/Intima bis zur Grenzfläche Media/Adventitia.


57

Abb. 5: Sonographie der A. carotis communis. Bestimmung der Intima-Media-Dicke nach der “leading edge“ - Methode mit einem 7-10 MHz Schallkopf (HDI, ATL Gerät).

Tabelle 3: Patientendaten einschließlich der Intima-Media-Dicke der A. carotis
communis nach der “leading edge“ - Methode

Patient

Alter

Gewicht kg

Intima-Media-Dicke (mm)

1

21

76,5

0,5

2

50

55,5

0,6

3

57

66,0

0,7

4

23

78,4

0,4

5

56

71,6

0,6

6

58

83,2

0,7

7

58

69,9

0,6

8

60

74,3

0,6


58

9

54

68,7

0,6

10

55

80,2

0,5

11

52

89,2

0,6

12

28

78,7

0,6

13

36

87,8

0,6

14

64

63,5

0,7

15

53

56,9

0,6

16

61

74,2

0,7

17

43

80,1

0,6

18

57

66,7

0,6

19

49

88,1

0,7

20

47

54,0

0,5

21

56

87,8

0,5

22

35

96,0

0,5

23

63

66,7

0,6

24

32

63,3

0,4

25

51

76,0

0,7

26

68

91,9

0,7

27

38

87,5

0,5

28

62

78,9

0,6

29

42

80,7

0,7

30

27

76,6

0,6

31

63

78,5

0,7

32

39

81,2

0,6

33

41

55,8

0,7


59

34

47

62,8

0,6

35

60

69,0

0,6

36

60

89,3

0,7

37

32

77,8

0,6

38

23

65,8

0,5

39

37

54,9

0,6

40

49

65,4

0,6

41

52

70,7

0,6

42

31

87,9

0,7

43

43

90,2

0,7

44

56

74,4

0,6

45

50

76,9

0,6

46

19

63,2

0,4

47

28

89,9

0,5

48

45

78,5

0,7

49

63

79,5

0,7

50

48

70,9

0,6

51

48

89,6

0,7

52

53

81,2

0,6

53

39

69,0

0,5

54

59

75,0

0,5

55

43

75,1

0,6

56

51

78,8

0,6

57

53

86,9

0,6

58

32

95,6

0,7


60

59

43

76,5

0,6

60

55

81,0

0,6

61

45

69,8

0,6

62

46

77,7

0,6

63

28

75,5

0,5

64

47

83,9

0,6

65

45

78,0

0,6

66

52

71,5

0,6

67

57

82,2

0,5

68

58

89,0

0,7

69

63

79,9

0,6

70

41

76,4

0,6

71

40

66,5

0,6

72

44

69,0

0,6

73

54

87,0

0,7

74

57

80,7

0,6

75

38

85,8

0,6

76

54

89,0

0,7

77

54

79,6

0,6

78

45

77,2

0,6

79

63

81,5

0,6

80

56

85,6

0,6

81

49

80,0

0,7


61

6.10 Expression von Daten

Alle Resultate werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Das Symbol n bezeichnet die Zahl der Experimente. Alle Bestimmungen im ELISA wurden in Duplikaten oder Triplikaten ausgeführt. Falls nicht anders gekennzeichnet, wurden alle Experimente mindestens dreifach durchgeführt. Die statistische Signifikanz von unterschiedlichen Ergebnissen wurde mittels des Student-T-Test untersucht, falls die Werte einer Normalverteilung nach dem Kolmogorov-Smirnov goodness-of-fit-Test folgten. Bei nicht normal verteilten Messwerten wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. P-Werte von < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Die Korrelationen wurden berechnet nach Spearman oder Pearson R. Die gesamte Statistik wurde mittels Statistical Package (SPSS) 9, 1999 (Chicago, USA), erstellt.


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