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Kapitel 6. Material und Methoden

6.1 Chemikalien und Reagenzien

Alle Chemikalien und Reagenzien, die für die Isolierungen und Experimente verwendet wurden, waren Endotoxin-frei (Endotoxin < 0,01 ng/ml). Endotoxin-freies fetales Kälberserum (Endotoxin < 0,002 ng/ml) wurde von Biochrom KG/Seromed (Berlin) bezogen. Endothelzellmedium M-199 wurde von Bio Whittaker (Boehringer Ingelheim Bioproducts, Heidelberg) und Endothelzellwachstumsmedium (ECGM) von Promocell (Heidelberg) bezogen. PBS (Phosphate Buffered Saline) wurde von Dulbeco (Biochrom KG/Seromed, Berlin) geliefert. Ficoll-Histopaque wurde von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen. Die AT1-Rezeptorantagonisten Losartan und Eprosartan wurden von MSD (Haar) bzw. Hoechst Marion Roussel (Bad Soden/Taunus) zur Verfügung gestellt. Die IL-1ß und IL-6 ELISA wurden über R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen und der TNF- ELISA über Medgenix Diagnostics (Fleurus, Belgien) bezogen. Na⁵¹Cr wurde von Nycomed Amersham (Amersham, UK) geliefert. Der Faktor VIII Kit zur Identifizierung der Endothelzellen kam von der Worthington Biochemical Corporation (Lakewood, NJ, USA). Die Adhäsionsmolekül-Assays wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Fluoreszenzmarkierte und nicht markierte monoklonale Antikörper für die Flusszytometrie wurden von DAKO (Dänemark) bzw. Pharmingen / Becton-Dickinson (Mountainview, CA) bezogen. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde von Boehringer Ingelheim GmbH (Ingelheim) verwendet. Alle übrigen Produkte waren von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA), falls nicht anders angegeben.

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6.2 Periphere Monozyten

6.2.1 Isolierung der Monozyten aus dem peripheren Blut

Die mononukleären Zellen wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit essentieller Hypertonie sowie gesunden Normalpersonen gewonnen und präpariert (Boyum A., 1968; Dörffel-Rückert Y., 1996). Dieses Vorgehen war durch die zuständige Ethikkommission (Charité) gebilligt worden. Es wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes durch Dichtegradientenzentrifugation mittels Ficoll-Histopaque abgetrennt. Dazu wurden jeweils ca. 100 ml heparinisiertes (100 U Heparin/ml) venöses Blut mit PBS (1:1) verdünnt und dann über Ficoll-Histopaque (SG = 1,077) geschichtet und für 40 min bei 400 g zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurde die Zwischenschicht (Interface, Abb. 2) entnommen und mehrfach mit PBS (ohne Ca²⁺/Mg²⁺) gewaschen sowie anschließend je nach weiterem Isolierungsverfahren in RPMI 1640 (Roosevelt Park Memorial Institute - Medium) mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS) bzw. PBS mit 0,1 % HSA resuspendiert.

Abb. 2 Abtrennuung der mononukleären Zellen mit Ficoll-Histopaque. Bei der Dichtegradientenzentrifugation setzen sich die Erythrozyten und Granulozyten am Boden des Röhrchens ab, da ihre Dichte höher als die von Ficoll (weiß) ist. Die mononukleären Zellen reichern sich in einer schmalen Zwischenschicht zwischen Plasma (oben, rot) und Ficoll an.

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Zur Isolierung von Monozyten mittels Plastikadhärenz wurden mononukleäre Zellen in Kulturmedium auf positiv geladenen Gewebekulturschalen inkubiert (1h, 37°C, 5 % CO₂, 95 % O₂). Nicht adhärente Zellen wurden durch vorsichtiges Spülen mit Medium (RPMI 1640, 37°C) abgetrennt und verworfen. Die verbleibenden adhärenten Zellen wurden mechanisch mittels Zellschaber (Nunc, Rosklide, Dänemark) in kaltem HBSS (Hank`s Balanced Salt Solution, ohne Ca²⁺/Mg²⁺) gelöst. Anschließend wurden die adhärenten Zellen mehrfach in HBSS gewaschen und in RPMI 1640 (mit 10% FCS, 100 E/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin) für Zellkulturexperimente resuspendiert.

Zur Verifizierung des ersten Isolierungsverfahrens wurden die peripheren Monozyten auch mittels magnetischer Trennung durch Dynabeads® (Dynal, Oslo, Norwegen) isoliert. Dazu wurde zu den in PBS resuspendierten mononukleären Zellen Gammaglobulin als blockende Reagenz sowie ein monoklonales Maus Immunglobulin G gegeben und alles für 10 min bei 5°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschvorgang mit PBS (0,1 % HSA) und die Zentrifugation für 8 min bei 500 g. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen resuspendiert und zu den gewaschenen Dynabeads® (100 µl pro 1 Mio mononukleäre Zellen) gegeben. Die Inkubation erfolgte rotierend für 15 min bei 5°C.

Nach Resuspendierung der Rosetten wurde ein Magnetpartikelkonzentrator zur Abtrennung der Lymphozyten verwendet. Die Monozyten befanden sich dann im Überstand.

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6.2.2 Identifikation der Monozyten aus dem peripheren Blut mittels fluoreszenzaktiviertem Flusszytometer

Die Monozyten wurden mittels Immunfluoreszenzfärbung von Zelloberflächenantigenen identifiziert. Es wurden monoklonale Mausantikörper von DAKO A/S (Dänemark) verwendet, welche spezifisch waren für humane T-Zellen (CD3; Klon UCHT1, Code F0818, RPE (R-Phycoerythrin)-konjugiert), humane B-Zellen (CD19; Klon HD37, Code F0768, RPE-konjugiert) bzw. humane Monozyten (CD14; Klon TÜK4, Code R0864, FITC (Fluoreszinisothiocyanat)-konjugiert).

Die Monozyten wurden mit den spezifischen (s.o.) fluoreszierenden Antikörpern versetzt und in eine vibrierende Fliesskammer gegeben. Der Zellstrom wurde an einem Laserstrahl vorbeigeleitet, wobei im Durchlicht die Größe jeder einzelnen Zelle, die Granularität in einer 90°-Ablenkung des Lichtstrahls, ferner rote und grüne Fluoreszenz und damit verschiedene Oberflächenmarker gemessen wurden. Durch die Vibration wurde der Zellstrom in feine Tröpfchen verteilt, die aufgeladen und unter Computerkontrolle durch Ablenkungsplatten nach den zu messenden Parametern sortiert wurden. Eine geeignete Antikörperkontrolle lief stets mit, um unspezifische Färbungen anzuzeigen.

Die Analyse erfolgte mittels fluoreszenzaktiviertem Flusszytometer (FACSalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA). Der Computer errechnete nach Subtraktion der Kontrollen von den Fluoreszenzprofilen die relative Frequenz von Zellen, welche die verschiedenen Oberflächenantigene exprimierten.

Die Zellsuspension enthielt in der Regel 2 % CD3 positive Zellen, 3 % CD19 positive Zellen und 93 % CD14 positive Zellen.

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6.2.3 Stimulation peripherer Monozyten und Zellkultur

Periphere Monozyten wurden in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 (supplementiert mit 10 % FCS, 1 % Pyruvat, 100 E/ml Penicillin, 100 µl/ml Streptomycin und 50µl/ml Gentamycin) bei 37°C und 5 % CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden in 24 Loch-Gewebekulturplatten (Nunc) entweder mit oder ohne Stimulation kultiviert.

Die optimalen Bedingungen und Konzentrationen für die Stimulation der Monozyten in Kultur mit LPS und Angiotensin II wurden mittels Zeit- und Konzentrationskinetiken ermittelt. In diesen Voruntersuchungen fanden wir, dass die Konzentration der pro-entzündlichen Zytokine im Zellkulturüberstand nach 24 Stunden ein Plateau erreichte, nach 4-6 Stunden war im ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) eine vermehrte Zytokinproduktion nachweisbar.

LPS wurde als Monozytenstimulans gewählt, da es in Vorversuchen erheblich stärker stimulierte als Pokeweed-Mitogen (Gibco) oder Concanavalin A. Die Konzentrations-kinetiken zeigten bereits eine massive Stimulierung der pro-entzündlichen Zytokine ab 10 ng LPS/ml, welche bis zu 1000 ng LPS/ml noch steigerbar war. Aufgrund der toxischen Eigenschaften von LPS verwendeten wir die niedrigere Konzentration.

Angiotensin II stimulierte die Monozyten ab einer Konzentration von 10^-10 mol/l minimal und bei Konzentration von 10^{-6 bis -8} optimal.

In zusätzlichen Experimenten wurden die Monozyten in Gegenwart der AT1-Rezeptorantagonisten Losartan (10^-8 mol/l) bzw. Eprosartan (10^-6 mol/l) für 30 min vorinkubiert.

Nach 20 Stunden wurden die Kulturüberstände von den Zellen durch Zentrifugation separiert, schockgefroren (Flüssigstickstoff) und bei - 70°C bis zur Bestimmung der Zytokinkonzentrationen aufbewahrt.

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6.3 Zytokinassays

Die Konzentrationen von Interleukin-1ß und Interleukin-6 wurden in Kulturüberständen mittels spezifischer Sandwich ELISA (R&D Systems) bestimmt, der Gesamtgehalt an TNF- wurde mit einem ELISA von Medgenix Diagnostics bestimmt (Dörffel Y., 1999).

Das Prinzip des Sandwich ELISA besteht darin, dass die Testplatten bereits mit einem spezifischen, immobilisierten Zytokinantikörper beschickt wurden. Die Standards oder Proben werden nun in die Plattenlöcher pipettiert, dabei bindet das darin vorhandene Zytokin an den immobilisierten Antikörper. Nach Auswaschen von allem ungebundenen Protein, wird ein polyklonaler Antikörper, welcher an ein Enzym gebunden ist und spezifisch für das entsprechende Zytokin ist, zugegeben. Damit wäre das sogenannte Sandwich komplett. Das Enzym führt nach Zusetzen einer Reagenz zur Farbreaktion je nach Zytokinkonzentration, welche photometrisch ermittelt wird.

Alle Proben wurden zumindest in Duplikaten analysiert. Kreuzreaktivitäten wurden durch Probenverdünnungsstudien abgeschätzt. Die Spezifität der ELISA-Systeme wurde durch Zusatz von bis zu 100 pg/ml Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-8, Interleukin-10 und TNF- untersucht (Bienvenu J., 1993). Die Intra- und Inter-Assaypräzision lag über 97 %. Die Sensitivität lag zwischen 0,3 pg/ml für IL-1ß und 3,0 pg/ml für TNF-.

6.4 Zytokin mRNA Bestimmungen

6.4.1 Extraktion der RNA

Die RNA wurde nach 4-6 Stunden mittels eines kommerziellen Kits (RNAeasy, Quiagen GmbH, Hilden), welcher modifiziert der Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktion nach Chromczynski entspricht, gewonnen (Chromczynski P., 1987).

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Nach Zentrifugation (20 min, 12000g) wurde das Pellet in 70 % Ethanol gewaschen und die RNA in sterilem H₂O (mit 0,1 % Diethyl-Pyrocarbonat vorbehandelt) resuspendiert. Die RNA-Menge und Reinheit wurden mittels Spektrophotometrie und Agarose-Gel-Elektrophorese (1 %) bestimmt.

6.4.2 Reverse Transkription (RT)

Für die semiquantitative RT-PCR wurde ein cRNA Standard (Perkin Elmer Cetus, NJ, USA) verwendet, der eine Vielzahl von Primer-Bindungsstellen (u.a. TNF- und IL-1ß) enthält. Das Gewicht des co-amplifizierten internen Standards (ca. 300 bps) erlaubte über die Größe des Amplifikationsproduktes eine einfache Unterscheidung des Standards vom PCR-Produkt der Wild-Typ (authentischen) Zytokin mRNA der Probe. Zelluläre RNA, die wie oben beschrieben isoliert worden war und die authentische (Wild-Typ) RNA für TNF- und IL-1ß enthielt, wurde mit verschiedenen Konzentrationen des synthetischen cRNA Standards gemischt. Aliquots dieser Mischung wurden revers transkribiert.

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In Vorexperimenten war bestätigt worden, dass äquimolare cDNA Konzentrationen aus authentischen Zytokin RNA und synthetischen Standard über die relevante Zahl von Zyklen mit gleicher Effizienz amplifiziert werden (Abb. 3). Die Voruntersuchungen zur Amplifikationskinetik wurden bei verschiedenen Konzentrationen und für jedes der untersuchten Zytokine durchgeführt.

Abb. 3 Amplifikationskinetik TNF--Primer. Über der relevanten Zykluszahl finden sich parallele Amplifikationskinetiken für authenitisches TNF- und synthetischen Standard

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6.4.3 Semiquantitative Polymerasekettenreaktion

Die Amplifikation erfolgte in Anlehnung an die von Wang beschriebene Methode (Wang A.M., 1989). Es wurde eine Amplifikation mit 25 Zyklen für beide Zytokine ausgewählt, da über den relevanten Bereich eine lineare und parallele Verstärkung vorlag (24-27 Zyklen für TNF- (Abb. 3) und 23-27 Zyklen für IL-1ß). Die folgenden Primer-Paare (Perkin Elmer Cetus) wurden verwendet:

TNF-:	5`-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3` und
	5`-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3`
IL-1ß:	5`-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3` und
	5`-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3`

Es wurden 2 µl der komplementären DNA (entsprechend ca. 300 ng RNA) zu einer Lösung aus: 10 µl PCR-Puffer (200 mmol/l Tris-HCl (pH 8,4), 500 mmol/l KCl), 3 µl MgCl₂ (50 mmol/l), 2 µl dNTP (10 mmol/l), je 1 µl der 5`und 3` Primer (25 µM), 5 E Taq DNA Polymerase und 80 µl destilliertes Wasser gegeben.

Die PCR-Bedingungen waren die Folgenden: Die Doppelstrang-DNA wurde bei 94°C aufgetrennt, die Annealingtemperatur (komplementäre Anlagerung der Primer an Zielregion) lag bei 62°C für je 1 min, die Verlängerung der Primer entlang der DNA-Matritze erfolgte bei 72°C.

Der Upstream Primer wurde am 5`Ende an ein Fluoresceinmolekül gekoppelt. Das PCR Produkt wurde in Formamid verdünnt (mit 50 mM EDTA, 1:3) und mit einer denaturierenden 6% Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Der Nachweis des synthetisierten PCR Produkts erfolgte mit einem DNA Sequenzierautomaten (Applied Biosystems), der das an das 5`-Ende des Primers gekoppelte Fluoresceinmolekül über einen Argon Laser anregte. Die gescannten Rohdaten wurden mit dem Programm “gene

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6.5 Chemilumineszenz-Assay und Stimulation der Zellen

Neben spezifischen pro-entzündlichen Mediatoren sezernieren aktivierte Monozyten eine Reihe unspezifischer Effektormoleküle wie z.B. Sauerstoffsuperoxid. Mittels Chemilumineszenz wurde die Superoxidproduktion von peripheren Monozyten und humanen Umbilikalvenenendothelzellen analysiert.

Die Monozyten wurden in RPMI 1640 resuspendiert (10⁶ Zellen/ml) und bis zur anschließenden Verwendung auf Eis gelagert. Die Freisetzung von Sauerstoffsuperoxid wurde durch PMA induziert. PMA (8 x 10^-5 mol/l) wurde in DMSO gelöst und bei - 70°C aufbewahrt. Jeweils 10⁵ Monozyten wurden mit Angiotensin II (10^-8 mol/l) oder LPS (10 ng/ml) und PMA stimuliert bzw. unstimuliert verwendet. Die Sauerstoffsuperoxid-produktion von Monozyten der Hochdruckpatienten wurde mit der der Kontrollen verglichen.

Konfluente HUVEC in Petrischalen von 20 cm² wurden dreimal mit einem modifizierten Krebs-Puffer gewaschen (Pueyo M.E., 1998). Die Superoxidfreisetzung der HUVEC wurde nach Stimulation mit Angiotensin II (10^-8 mol/l) ermittelt. Bei Verwendung des AT1-Antagonisten Eprosartan, erfolgte die Zugabe desselben 30 min vor Beginn der Experimente. Jeweils ca. 10⁵ HUVEC wurden mittels Zellschaber abgekratzt und in eine Luminometer-Küvette gegeben.

Als Chemilumineszenz-Substrat wurden jeweils 10 µl Lucigenin (2,5 x 10^-4 mol/l) zugegeben. Alle Prozeduren wurden im Dunkeln durchgeführt. Nach 5-minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Küvetten in einen CL analyzer Lumat LB 9501

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6.6 Adhäsionsmoleküle

6.6.1 Bestimmung der Adhäsionsmoleküle mittels ELISA

Serumproben von Patienten und Kontrollen für die Bestimmung der Konzentrationen von zirkulierendem sICAM-1, sVCAM-1 und sE-Selektin wurden gesammelt. Die Seren wurden im Zweifachansatz mittels kommerziellem monoklonalen Antikörper ELISA (R&D Systems) analysiert (Prinzip s. 6.3.). Der Intra-Assay Variationskoeffizient betrug für sICAM-1 und sE-Selektin jeweils 4,8 % und für sVCAM-1 5,9 %.

6.6.2 Identifikation aktivierungsabhängiger Oberflächenmoleküle der Monozyten mittels FACS

Die Messung der aktivierungsabhängigen Oberflächenmoleküle auf peripheren Monozyten erfolgte unter Nutzung der fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie (FACS-Calibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA). Die Monozyten wurden sofort nach der Isolierung und Stimulation mit verschiedenen FITC (CD11a, CD54, CD29) oder RPE (CD11b, CD31, CD44) -konjugierten Antikörpern markiert. Zur Erhöhung der Genauigkeit erfolgte jeweils eine Färbung mit CD14 (APC (Allophycocyanin)-markierter Antikörper) als Monozytenmarker. Nur die Fluoreszenz der CD14 positiven Zellen, die ein bestimmtes für lebende Monozyten typisches Muster im forward - und sideward scatter aufwies (zweifache Gates), wurde ausgewertet.

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Folgende aktivierungsabhängige Integrine bzw. Adhäsionsmoleküle wurden auf den peripheren Monozyten von Patienten und Kontrollen im Vergleich ausgewertet: CD11a (LFA-1) und CD11b (membrane attack complex-1 = MAC-1), CD54 (ICAM-1), CD62L (L-Selektin), CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1 = PECAM-1), CD44 (Pgp-1 adhesion to matrix), CD49d (very late antigen-4 = VLA-4), CD 29 (VLA-1).

6.7 Humane Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC)

6.7.1 Isolierung der HUVEC

Die humane Umbilikalvenenendothelzellen wurden nach dem modifizierten Protokoll von Jaffe (Jaffe E.A., 1973) mittels Kollagenase isoliert. Unmittelbar nach der Entbindung wurden die Nabelschnüre in sterile Behälter gegeben, welche einen HEPES Puffer (0,14 mol/l NaCl, 0,004 mol/l KCl, 0,001 mol/l HEPES Puffer (pH 7,4), 0,011 mol/l Glukose) enthielten und bis zur Präparation bei 4°C aufbewahrt. Die Verarbeitung erfolgte innerhalb der nächsten 24 Stunden nach Entbindung.

Unter sterilen Bedingungen wurden die Umbilikalvenen mit Luerlock Konnektor (Sherwood Medical, Tullamore, Irland) kanüliert und mit 100 ml des HEPES Puffers gespült. An dem anderen Ende der Umbilikalvene erfolgte mittels Konnektor die Befestigung eines 4 cm langen Silikonröhrchens (0,8 cm Durchmesser). Zehn ml einer 0,2

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6.7.2 Kultivierung der HUVEC

Die Umbilikalvenenendothelzellen wurden nach Zentrifugation bei 400g für 5 min in Endothellzellwachstumsmedium resuspendiert und auf 24 Loch-Gewebekulturplatten zu jeweils ca. 30000 Zellen pro 0,5 ml ECGM ausgesät. Die Inkubation erfolgte bei 37°C und 5 % CO₂ im Brutschrank. Alle 2-3 Tage wurden die Zellen durch Mediumwechsel gefüttert. Mittels Trypsin erfolgte ein- bis dreimalig die Subkultivierung, letztmalig 48 Stunden vor Verwendung der Zellen im Adhäsionsassay.

Es wurden humane Umbilikalvenenendothelzellen gesunder Mütter zur Vermeidung jeglicher Beeinflussung des Adhäsionsassays durch voraktivierte Endothelzellen verwandt. Es wurden nur Nabelschnüre verwendet, die ansonsten verworfen worden wären.

6.7.3 Identifkation der HUVEC

Die humanen Umbilikalvenenendothelzellen wurden immunhistochemisch mittels direkter Immunfluoreszenzfärbung für den von Willebrand Faktor unter Verwendung von Anti-humanem vWF-FITC Konjugat (Factor VIII-related Antigen Staining Kit, Worthington Biochemical Corporation) identifiziert. Dabei wurden Methanol-fixierte mikrovaskuläre Endothelzellen als Positivkontrolle und Fibroblasten als Negativkontrolle verwendet. Eine Anfärbung der Zellmatrix der mikrovaskulären und umbilikalen Endothelzellen im

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Abb. 4 Humane Umbilikalvenenendothelzellen nach direkter Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-humanen vWF-FITC Konjugat.

6.8 Monozyten-Adhäsionsassays

Die Monozytenadhäsion an HUVEC wurde mit 2 verschiedenen Adhäsionsassays zur

Qualitätskontrolle gemessen.

Zunächst wurde die Monozytenadhäsion, wie von Hahn und Kollegen 1994 beschrieben, modifiziert durchgeführt (Hahn A.W.A., 1994):

Bei den konfluierende HUVEC Monolayer wurde 2 Stunden vor Adhäsion das ECGM durch das Medium RPMI 1640 mit 1 % HSA ersetzt. Nach Inkubation der Monozyten für 24 Stunden wurden sie in RPMI 1640 (mit 1 % HSA) gewaschen und auf den

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Ein zweiter Adhäsionsassay nach McCarron wurde modifiziert zur Verifizierung des ersten Assays angewandt (McCarron R.M., 1994):

Dazu wurden die Monozyten mit 100µCi Na⁵¹Cr/ml versetzt und in ein schüttelndes Wasserbad von 37°C für 1 Stunde gegeben. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert, mehrfach gewaschen und in M-199 Medium resuspendiert. Die Adhäsion der Monozyten (10⁵ Zellen/ml/well) an die Endothelzellmonolayer erfolgte bei 37°C und 5 % CO₂ für 1 Stunde. Nach der Inkubation wurden die nicht-adhärenten Zellen abpipettiert. Die Endothelzellmonolayer wurden wiederholt mit warmem M-199 gewaschen. Die adhärenten Zellen wurden mit 2 % Triton-X (0,2 ml/well) über Nacht lysiert. Die Radioaktivität aller Fraktionen wurde mittels Gamma Counter (Packard gamma 5650 counter) gemessen. Der Prozentsatz der adhärenten Zellen wurde anhand der Ausgangs- oder Totalaktivität pro Minute im Verhältnis zur Radioaktivität der adhärenten Zellen pro Minute ermittelt.

6.9 Untersuchungen am Menschen

Insgesamt nahmen 81 Patienten mit essentieller Hypertonie (Alter: 19 bis 64 Jahre) und 74 gesunde Kontrollen (Alter: 19 bis 59 Jahre) an den Versuchen teil. Alle Patienten wurden in den Hypertoniesprechstunden der Medizinischen Poliklinik der Charité, Berlin, betreut. Jegliche Entnahme von venösem Blut während Routineblutentnahmen erfolgte freiwillig. Es wurde die revidierte Deklaration von Helsinki (41. Generalversammlung des Weltärztebundes in der revidierten Fassung vom September 1989, Hongkong) zur

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Die Gruppe der Patienten setzte sich aus essentiellen Hypertonikern vor medikamentöser Therapie bzw. 10 Tage nach Absetzen der antihypertensiven Therapie zusammen. Das mittlere Körpergewicht betrug 73 ± 9,6 kg und der “body mass index“ (BMI) 24,4 ± 1,5 kg/m². Die Hypertonie wurde mittels 24 Stunden ABDM gesichert. Nur Patienten mit einem diastolischen Blutdruck zwischen 95 und 120 mmHg wurden eingeschlossen (mittlerer Blutdruck: 172/101 mmHg). Ausschlusskriterien waren alle anderen Erkrankungen sowie die sekundäre Hypertonie.

Als Kontrollgruppe wurden freiwillige, gesunde Blutspender verwendet. Das mittlere Körpergewicht betrug 70 ± 7,1 kg und der BMI 22,9 ± 2,3 kg/m². Patienten- und Kontrollgruppe wurden hinsichtlich Alter (mittleres Alter: Patienten 47, Probanden 45 Jahre) und Geschlecht (Patienten: 37 weiblich, 44 männlich; Probanden: 35 weiblich, 39 männlich) gematcht.

Patienten- und Probandenblut wurde nicht verwendet, wenn pathologische Laborwerte (K, Kreatinin, ASAT, ALAT, BSG, CRP, Gluc, Hb, Leukozyten, Thrombozyten, LDL (< 160 mg/dl); Tabelle 2) oder sonographische Veränderungen der Carotiden bzw. Aorta abdominalis (Plaques oder pathologische Intima-Media-Dicke (> 0,80 mm; Pit`ha J., 1999; Ferrieres J., 1999)) vorlagen. Patienten mit grenzwertiger Intima-Media-Dicke der Arteria carotis communis (0,70 - 0,79 mm; Aminbakhsh A., 1999; Simons PC, 1999) im hochauflösenden Sonogramm wurden nicht in die Adhäsionsversuche sowie Chemilumineszenzmessungen eingeschlossen (Abb. 5, Tabelle 3). Raucher wurden generell ausgeschlossen, um die Ergebnisse der Versuche nicht zu verfälschen.

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Tabelle 2: Paraklinik der Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme

Patient	K	Krea	ASAT	ALAT	BSG	CRP	Gluc	Hb	Leuko	Thrombo	LDL
1, w.	4,3	0,68	8	11	5/13	<0,1	109	12,9	4,3	243	149
2, w.	3,6	0,74	8	8	13/28	<0,1	95	12,5	7,3	205	136
3, w.	3,9	0,71	6	9	8/14	<0,1	95	13,4	10,1	340	137
4, m.	3,7	0,75	7	12	8/17	<0,1	89	14,0	4,8	299	91
5, m.	4,2	0,76	10	16	7/25	0,2	108	15,2	4,8	262	120
6, m.	3,6	0,64	5	9	10/20	0,8	113	14,8	5,9	133	141
7, m.	4,3	0,68	10	21	8/13	0,3	89	14,8	9,9	189	87
8, w.	3,6	0,67	9	8	6/13	<0,1	95	12,8	4,9	289	114
9, w.	3,9	0,77	9	11	6/16	<0,1	101	14,7	6,0	234	108
10, m.	4,8	1,10	11	21	12/28	<0,1	115	14,0	5,7	174	153
11, w.	4,5	0,67	7	18	5/11	0,2	97	14,2	6,1	332	136
12, w.	4,1	0,67	8	10	14/24	0,4	104	13,0	4,9	191	106
13, m.	3,6	1,01	12	18	6/20	0,2	115	14,0	4,8	229	97
14, m.	3,9	0,80	7	9	8/14	<0,1	100	16,6	9,2	185	102
15, m.	3,9	0,67	12	23	6/9	<0,1	104	14,5	7,1	238	90
16, m.	3,6	1,03	7	9	6/12	0,1	83	14,2	5,5	281	146
17, w.	3,7	0,60	6	7	10/17	0,3	98	14,8	9,4	238	138
18, m.	3,6	0,85	9	15	14/26	0,3	115	14,6	4,8	167	145
19, m.	4,1	0,57	12	18	6/13	<0,1	112	15,2	4,8	191	156
20, w.	3,9	0,61	17	19	8/18	<0,1	83	14,5	7,6	340	116
21, m.	3,8	1,02	10	18	12/23	0,4	101	14,3	6,8	187	112
22, w.	4,3	0,63	9	13	14/29	0,1	112	13,7	7,6	201	138
23, m.	4,5	1,07	11	13	14/30	<0,1	77	14,5	4,8	163	141

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24, m.	4,0	0,76	10	12	8/17	0,3	102	14,0	5,1	215	115
25, m.	4,2	0,76	11	13	3/10	0,1	101	14,0	6,5	227	86
26, m.	3,9	1,14	9	11	12/25	0,5	111	14,3	6,1	223	122
27, w.	4,3	0,80	7	13	6/10	0,8	67	13,2	9,2	328	146
28, m.	3,9	0,88	10	10	15/28	0,7	86	14,7	9,4	332	148
29, w.	4,0	0,70	8	9	7/12	<0,1	77	12,9	5,6	222	151
30, m.	4,1	0,92	8	18	13/29	0,7	96	14,6	7,2	256	159
31, m.	4,5	1,07	11	13	14/30	<0,1	77	14,5	4,8	163	105
32, w.	4,3	0,69	17	19	4/9	0,3	117	13,9	4,9	259	155
33, m.	4,2	0,84	5	7	15/30	0,3	89	14,5	5,8	196	90
34, m.	4,0	0,84	9	22	12/25	0,4	120	14,4	8,5	208	114
35, m.	4,5	0,85	10	17	6/14	<0,1	113	14,4	5,9	234	119
36, w.	4,6	0,61	13	16	14/30	<0,1	90	13,0	6,8	315	160
37, m.	4,5	0,85	10	17	6/14	<0,1	89	14,6	4,8	247	106
38, m.	4,4	0,74	11	17	8/18	<0,1	113	14,4	6,0	199	83
39, w.	3,9	0,78	6	8	12/23	0,3	76	12,9	4,8	310	90
40, w.	4,1	0,66	7	8	6/19	<0,1	67	13,1	6,2	244	77
41, w.	4,1	0,60	13	15	14/25	<0,1	90	13,5	5,3	167	98
42, m.	4,0	0,90	12	18	12/30	0,7	80	14,7	7,1	208	129
43, w.	3,8	0,66	15	20	14/27	0,6	112	13,7	5,3	312	154
44, m.	3,9	0,80	8	12	8/12	<0,1	77	14,0	4,9	174	100
45, w.	4,2	0,61	6	9	10/17	<0,1	89	13,5	8,1	155	88
46, m.	3,9	0,56	7	8	6/9	<0,1	96	14,5	5,3	176	67
47, w.	4,0	0,66	9	9	10/21	0,3	61	13,4	6,0	151	99
48, w.	4,0	0,78	12	14	8/10	0,2	78	13,9	4,9	201	115

55

49, m.	4,6	0,77	17	21	6/13	<0,1	90	14,6	7,6	340	143
50, w.	4,0	0,69	10	16	12/17	<0,1	78	12,5	5,6	227	151
51, m.	4,5	0,99	8	8	13/27	0,3	92	14,3	5,6	221	158
52, m.	3,7	0,86	8	13	10/20	0,2	97	15,8	7,8	188	123
53, w.	3,9	0,72	9	10	10/17	<0,1	70	13,7	5,9	178	80
54, w.	4,3	0,60	10	12	9/15	0,2	78	13,4	9,0	210	103
55, w.	4,2	0,76	12	17	12/29	<0,1	110	15,0	7,9	274	112
56, m.	3,6	0,90	13	20	15/30	0,5	92	16,4	9,0	256	139
57, m.	3,9	0,71	8	11	8/15	<0,1	70	17,5	6,7	211	142
58, w.	4,7	0,66	7	9	5/17	0,3	86	13,1	7,0	233	160
59, w.	4,2	0,98	13	14	13/26	<0,1	98	14,2	8,7	312	78
60, m.	4,4	0,82	7	10	10/20	<0,1	96	15,2	6,5	219	142
61, w.	3,9	0,62	12	10	7/12	0,2	103	14,1	6,6	254	128
62, m.	3,7	1,00	11	15	14/29	<0,1	83	16,2	5,6	281	80
63, w.	4,3	0,83	9	7	6/12	0,5	65	14,3	6,9	156	54
64, m.	3,6	0,79	14	18	14/30	<0,1	104	15,4	8,1	278	102
65, m.	3,9	0,99	17	15	10/15	0,2	78	16,0	7,2	276	125
66, w.	4,3	1,00	11	12	14/29	<0,1	70	14,3	5,1	188	141
67, m.	3,9	0,66	7	9	5/12	<0,1	98	15,2	7,4	303	110
68, w.	3,6	0,87	10	17	8/17	0,5	72	14,8	5,5	298	154
69, w.	4,2	0,71	18	22	9/14	<0,1	66	14,9	7,9	277	144
70, m.	4,7	0,69	15	16	12/19	0,2	75	15,9	6,5	249	90
71, m.	4,5	0,73	5	10	14/30	<0,1	65	14,9	5,0	196	101
72, m.	4,4	0,69	13	17	5/18	<0,1	81	15,2	8,6	177	68
73, w.	3,9	0,90	8	12	11/15	<0,1	99	14,6	6,0	271	133

56

74, m.	4,0	0,90	9	7	8/18	0,3	60	16,0	4,9	339	109
75, m.	4,3	0,79	18	22	12/17	<0,1	69	15,3	6,3	301	149
76, m.	4,0	0,92	15	17	10/21	0,4	109	14,8	5,4	231	155
77, w.	3,7	0,78	12	12	15/26	<0,1	100	14,0	6,1	255	104
78, w.	4,2	0,60	8	19	14/25	<0,1	70	14,9	4,8	239	133
79, w.	4,2	0,65	10	13	13/23	0,2	88	14,2	7,7	198	155
80, w.	4,1	0,78	12	15	6/13	<0,1	62	14,5	4,8	201	132
81, m.	3,9	0,60	7	10	5/11	<0,1	75	15,0	8,0	317	113

w. - weiblich, m. - männlich, K - Kalium (mmol/l), Krea - Kreatinin (mg/dl), ASAT/ALAT (U/l), BSG - Blutsenkungsgeschwindigkeit, CRP - C-reaktives Protein (mg/dl), Gluc- Glukose im Plasma (mg/dl), Hb - Hämoglobin (g/dl), Leuko - Leukozyten (/nl), Thrombo - Thrombozyten (/nl), LDL - low density lipoprotein (mg/dl).

Die arterielle Gefäßwand stellt sich im Ultraschallbild dreischichtig dar. Direkt an das Lumen angrenzend findet sich eine echoreiche Zone, die Intima. Die folgende echoarme Schicht entspricht der Media, welche an eine breite echoreiche Zone, die Adventitia, grenzt (Abb. 5).

Die Intima-Media-Dicke der A. carotis communis wurde nach der “leading edge“ -Methode gemessen (Gamble G., 1993; Frost D., 1998). Dabei erfolgte die Messung an der schallkopffernen Wand von der echoreichen Grenzfläche Lumen/Intima bis zur Grenzfläche Media/Adventitia.

57

Abb. 5: Sonographie der A. carotis communis. Bestimmung der Intima-Media-Dicke nach der “leading edge“ - Methode mit einem 7-10 MHz Schallkopf (HDI, ATL Gerät).

Tabelle 3: Patientendaten einschließlich der Intima-Media-Dicke der A. carotis
communis nach der “leading edge“ - Methode

Patient	Alter	Gewicht kg	Intima-Media-Dicke (mm)
1	21	76,5	0,5
2	50	55,5	0,6
3	57	66,0	0,7
4	23	78,4	0,4
5	56	71,6	0,6
6	58	83,2	0,7
7	58	69,9	0,6
8	60	74,3	0,6

58

9	54	68,7	0,6
10	55	80,2	0,5
11	52	89,2	0,6
12	28	78,7	0,6
13	36	87,8	0,6
14	64	63,5	0,7
15	53	56,9	0,6
16	61	74,2	0,7
17	43	80,1	0,6
18	57	66,7	0,6
19	49	88,1	0,7
20	47	54,0	0,5
21	56	87,8	0,5
22	35	96,0	0,5
23	63	66,7	0,6
24	32	63,3	0,4
25	51	76,0	0,7
26	68	91,9	0,7
27	38	87,5	0,5
28	62	78,9	0,6
29	42	80,7	0,7
30	27	76,6	0,6
31	63	78,5	0,7
32	39	81,2	0,6
33	41	55,8	0,7

59

34	47	62,8	0,6
35	60	69,0	0,6
36	60	89,3	0,7
37	32	77,8	0,6
38	23	65,8	0,5
39	37	54,9	0,6
40	49	65,4	0,6
41	52	70,7	0,6
42	31	87,9	0,7
43	43	90,2	0,7
44	56	74,4	0,6
45	50	76,9	0,6
46	19	63,2	0,4
47	28	89,9	0,5
48	45	78,5	0,7
49	63	79,5	0,7
50	48	70,9	0,6
51	48	89,6	0,7
52	53	81,2	0,6
53	39	69,0	0,5
54	59	75,0	0,5
55	43	75,1	0,6
56	51	78,8	0,6
57	53	86,9	0,6
58	32	95,6	0,7

60

59	43	76,5	0,6
60	55	81,0	0,6
61	45	69,8	0,6
62	46	77,7	0,6
63	28	75,5	0,5
64	47	83,9	0,6
65	45	78,0	0,6
66	52	71,5	0,6
67	57	82,2	0,5
68	58	89,0	0,7
69	63	79,9	0,6
70	41	76,4	0,6
71	40	66,5	0,6
72	44	69,0	0,6
73	54	87,0	0,7
74	57	80,7	0,6
75	38	85,8	0,6
76	54	89,0	0,7
77	54	79,6	0,6
78	45	77,2	0,6
79	63	81,5	0,6
80	56	85,6	0,6
81	49	80,0	0,7

61

6.10 Expression von Daten

Alle Resultate werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Das Symbol n bezeichnet die Zahl der Experimente. Alle Bestimmungen im ELISA wurden in Duplikaten oder Triplikaten ausgeführt. Falls nicht anders gekennzeichnet, wurden alle Experimente mindestens dreifach durchgeführt. Die statistische Signifikanz von unterschiedlichen Ergebnissen wurde mittels des Student-T-Test untersucht, falls die Werte einer Normalverteilung nach dem Kolmogorov-Smirnov goodness-of-fit-Test folgten. Bei nicht normal verteilten Messwerten wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. P-Werte von < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Die Korrelationen wurden berechnet nach Spearman oder Pearson R. Die gesamte Statistik wurde mittels Statistical Package (SPSS) 9, 1999 (Chicago, USA), erstellt.

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