Dörffel, Yvonne: Rolle peripherer Monozyten bei Patienten mit essentieller Hypertonie

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Kapitel 8. Diskussion

Die Monozyten sind die Präkursorzellen des mononukleären Phagozytensystems. Die zentrale Rolle der Monozyten/Makrophagen bei Abwehrmechanismen von Infektionen, malignen Prozessen und nicht zuletzt der Atherosklerose, macht die Monozyten zu einem faszinierenden Forschungsgebiet der Immunologie und Zellbiologie. Das sekretorische Potential der Monozyten ist immens. Studien zu Oberflächenrezeptoren der Monozyten und ihrer Rolle bei der Antigenpräsentation sind im Gange. In der letzten Zeit konnten bei der Charakterisierung der für die Monozytenadhäsion verantwortlichen Rezeptoren Fortschritte erzielt werden. Die Adhäsionsmoleküle sind von umfassender Bedeutung für die Interaktion Antigen-präsentierender Zellen mit anderen Zellen des Immunsystems. Die hier vorgelegte Arbeit soll einen Beitrag zur Rolle der Monozyten bei der essentiellen Hypertonie leisten.

8.1 Aktivierung peripherer Monozyten bei Patienten mit essentieller Hypertonie

Bereits 1995 wiesen Bataillard und Kollegen nach, dass Lyon hypertensive Ratten (LH) nach intraperitonealer Applikation von Silica, einem selektiven Monozytentoxin, einen signifikant niedrigeren Blutdruck aufwiesen als die unbehandelten Tiere (Bataillard A., 1995). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Monozyten-vermittelte Immunreaktionen in die Pathogenese der arteriellen Hypertonie von LH involviert sind.

Die meisten Studien konzentrieren sich auf Gewebsmakrophagen, welche zu Schaumzellen transformieren. Schaumzellen sind das Kennzeichen der Initialläsion der Atherosklerose (Faggiotto A., 1984) und seit den 80er Jahren gibt es genügend Beweise


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dafür, dass sich die meisten Schaumzellen atherosklerotischer Läsionen aus denzirkulierenden Monozyten rekrutieren (Schaffner T., 1980; Gerrity R.G., 1981).

Die vorliegenden Experimente zeigen erstmals, dass bereits zirkulierende Monozyten von Hypertonikern einen erhöhten Aktivitätszustand aufweisen. Der Aktivierungszustand der Monozyten wurde anhand der Sekretion pro-entzündlicher Zytokine wie IL-1ß, TNF-alpha und IL-6, der Superoxidproduktion und der aktivierungsabhängigen Oberflächenmarker bestimmt.

Ähnliche Ergebnisse wurden von Arbeitsgruppen berichtet, die mit hypertensiven Ratten experimentierten (Schmid-Schönbein G.W., 1991 Tsao P.S., 1998). Mittels NBT-Test (nitroblue tetrazolium reduction) wiesen Schmid-Schönbein et al. (1991) nach, dass bei erwachsenen SHR die Anzahl der aktivierten Monozyten signifikant erhöht ist.

8.1.1 Sekretion pro-entzündlicher Zytokine

Zunächst wurde die Fähigkeit isolierter peripherer Patientenmonozyten, spontan pro-entzündliche Zytokine (IL-1ß, TNF-alpha, IL-6) freizusetzen, untersucht. Diese pro-entzündlichen Zytokine, welche vor allem von aktivierten Monozyten und Makrophagen produziert werden (Fuhlbrigge R.C., 1987), sind Mediatoren von Entzündungsreaktionen.

Spontan wurde eine vermehrte Sekretion von IL-1ß nachgewiesen, welche jedoch im Gegensatz zu der Arbeit von Dalekos nicht statistisch signifikant war (Dalekos G.N., 1997). Ursächlich können möglicherweise die erhöhten Cholesterolwerte der von Dalekos eingeschlossenen Patienten (Gesamtcholesterol: 263 ± 45 mg/dl, LDL: 177 ± 43 mg/dl), zu Grunde liegen. So ist bekannt, dass eine verminderte Aufnahme von oxidierten LDL durch humane Monozyten, eine geringere IL-1ß Sekretion zur Folge haben kann (Janabi M., 2000).


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Eine vermehrte Freisetzung von IL-1ß und TNF-alpha durch Monozyten wurde kürzlich auch von Devaraj und Jialal bei Diabetikern nachgewiesen (Devaraj S., 2000). Auch der Urin hypertensiver Schwangerer enthält mehr IL-1ß und TNF-alpha nach Heyl et al., nicht dagegen der Urin normotensiver schwangerer Patientinnen. Da eine zirkadiane Ausscheidungsrhythmik fehlt, gehen die Autoren von einer, vom 24-Stunden Blutdruckverhalten unabhängigen, Zytokinexkretion aus (Heyl W., 1996).

Allgemein wird davon ausgegangen, dass die Hypertonie die Antwort des Endothels auf Faktoren, welche die Monozytenadhäsion fördern, verstärkt. Laut Ross sind die Endothelzellen an der Aktivierung der Monozyten ursächlich beteiligt (Ross R., 1993).

Die hier vorgestellten Experimente zeigen, dass die Monozyten von Hypertoniepatienten im Vergleich mit den Zellen des peripheren Blutes von Gesunden einen erhöhten Aktivierungszustand aufweisen. Dies zeigt sich u.a. durch eine signifikant vermehrte in vitro Sekretion von IL-1ß nach Angiotensin II oder LPS Stimulation sowie von TNF-alpha nach LPS Stimulation. Als Kontrollgruppe dienten freiwillige Blutspender.

Angiotensin II wurde als Stimulans verwendet, da es u.a. von Endothelzellen bzw. in der Gefäßwand physiologischerweise produziert und freigesetzt wird (Lüscher T.F., 1995) sowie ein Teil der Hypertoniker erhöhte Angiotensin II Plasmaspiegel aufweisen. Auch ist die Kälte-induzierte Freisetzung von Angiotensin II (transfemorale Messungen) bei hypertensiven Patienten im Vergleich zu Normotonikern signifikant erhöht und eine Hyperinsulinämie führt lediglich bei Hypertonikern zur Angiotensin II Freisetzung, nicht bei den normotensiven Kontrollen (Gasic S., 1999). Angiotensin II ist damit das Stimulans, welches den physiologischen bzw. pathophysiologischen Verhältnissen der essentiellen Hypertonie am nächsten kommt. Ein weiterer Vorteil ist die alleinige inflammatorische Aktivierung der Monozyten als Vertreter der mononukleären Zellen,


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nicht dagegen die der Lymphozyten bei eventuellen Verunreinigungen der Zellpräparationen (Kranzhofer R., 1999).

Interessanterweise verstärkte eine Stimulation der Monozyten mit Angiotensin II oder LPS bei den hier dargestellten Untersuchungen den Unterschied zwischen Patienten und Kontrollen, welcher im Hinblick auf das immunregulatorische Potential dieser Zytokine von Bedeutung sein könnte. Im Unterschied zu IL-1ß sezernierten die Patientenmonozyten mit den Kontrollen vergleichbare Mengen von TNF-alpha und IL-6. Lediglich nach LPS Stimulation ließ sich für die Patientenmonozyten eine gegenüber den Kontrollen signifikant erhöhte Sekretion von TNF-alpha nachweisen.

Während bei den hier vorgestellten Untersuchungen sich die Basalsekretion der pro-entzündlichen Zytokine bei Hypertonikern im Vergleich zu Normotonikern nicht signifikant unterscheidet, reagierten die Patientenmonozyten nach Stimulation hochsignifikant stärker mit der Sekretion dieser Zytokine. So kann man davon ausgehen, dass die Patientenmonozyten aufgrund einer stärkeren Stimulierbarkeit gegenüber physiologischen Stimulanzien, wie z.B. Angiotensin II oder im Rahmen von Infekten, über die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine primär zur Schädigung des Endothels und Entwicklung atherosklerotischer Prozesse beitragen können.

Das Endotoxin LPS wurde als Stimulans verwendet, da es eine seit Jahren etablierte Methode ist, LPS zur Untersuchung der maximalen Aktivierung dieser Zellen einzusetzen (Jelinek D.F., 1987 ). LPS aktiviert im Gegensatz zu anderen Stimulanzien die angeborene Immunantwort der Monozyten (Langstein J., 2000).

Möglicherweise geht eine vermehrte Sekretion pro-entzündlicher Zytokine makroskopisch sichtbaren Entzündungszeichen voraus und kann damit potenziell ein pathophysiologisch


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bedeutsames Ereignis darstellen. Diese Hypothese wird auch durch Befunde aus der Gastroenterologie gestützt, wo eine erhöhte Sekretion pro-entzündlicher Zytokine durch mononukleäre Phagozyten als Prediktor für das erneute Auftreten eines akuten Schubes bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und damit als prognostischer Faktor dient (Schreiber S., 1995).

Keiner der Patienten zeigte eine erhöhte Sekretion von IL-6 im Einklang mit den unauffälligen Laborparametern wie C-reaktives Protein und Leukozyten. Die gewonnen Ergebnisse bestätigen Untersuchungen von Kishikawa, nach denen Makrophagen aus fortgeschrittenen atherosklerotischen Läsionen neben IL-1 und TNF-alpha auch IL-6 sezernieren, frühe Läsionen aber nur IL-1 und TNF-alpha (Kishikawa H., 1993). Es wurden für die vorgestellten Experimente Patienten mit sonographisch sichtbaren atherosklerotischen Läsionen bzw. grenzwertiger oder verdickter Intima-Media-Dicke ausgeschlossen, so dass sich aufgrund der Ausschlusskriterien ein ähnliches Zytokinmuster, wie von Kishikawa für frühe Läsionen beschrieben, ergeben hat.

Um die vermehrte Sekretion pro-entzündlicher Zytokine bis auf mRNA Ebene zu verfolgen, wurde eine semiquantitative Polymerasekettenreaktion zur Quantifizierung von pro-entzündlicher Zytokin mRNA durchgeführt. Korrespondierend zu den entsprechenden Proteinen zeigten sich auch erhöhte mRNA Konzentrationen des Interleukin-1ß- und TNF-alpha-Gens nach LPS bzw. für IL-1ß auch nach Angiotensin II Stimulation. TNF-alpha, induziert durch LPS, triggert u.a. die Synthese von IL-1ß und IL-6 (Beutler B., 1988).

TNF-alpha und IL-1ß spielen bei der Atherogenese eine nicht unbedeutende Rolle. Sie verursachen Alterationen der Endothelzellen in vivo (Hicks C., 1989). IL-1 steigert laut Bevilacqua die Adhärenz von Monozyten (U-937-Zellinie) und Endothelzellen


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(Bevilacqua M.P., 1985) durch die verstärkte Expression von ICAM-1 (DeSouza C.A., 1997). TNF und IL-1 induzieren eine vermehrte koagulatorische Aktivität kultivierter Endothelzellen vermutlich über die Bildung von PDGF (platelet derived growth factor), das in den Prozess der Atherogenese involviert ist (Bevilacqua M.P., 1986). Dabei induziert IL-1 die PDGF Produktion glatter Muskelzellen (Ross R., 1987) und TNF-alpha die PDGF Produktion von Endothelzellen (Hajjar K.A., 1987).

Wick geht als initiierendem Ereignis der Atherogenese sogar von einer Autoimmunreaktion gegen HSP 60 (heat-shock protein), welches von dem Endothel nach Kontakt mit TNF-alpha exprimiert wird, aus. Parallel dazu werden laut Wick ICAM-1 und VCAM-1 von humanen Endothelzellen exprimiert (Wick G., 1995).

Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse zeigen, dass Angiotensin II in der Lage ist, Monozyten zu aktivieren. Interessanterweise triggert Angiotensin II die IL-1ß Produktion der Monozyten ohne die Produktion von TNF-alpha signifikant zu erhöhen. Diese Ergebnissse führen zu der Annahme, dass der Angiotensin II Signaltransduktionsmechanismus der Monozyten gegenüber der durch Endotoxin ausgelösten Signaltransduktion different ist. Während NF_B (Nuklearfaktor-kappa B) und AP-1 (Aktivator Protein-1) die Hauptrolle in der LPS-vermittelten TNF-alpha Produktion der Monozyten spielen (Libermann T.A., 1990; Kyriakis J.M., 1999; Medveddev A.E., 2000), scheint die IL-1ß Regulation durch Angiotensin II andere Wege zu gehen. So induziert LPS die Aktivierung der IL-1 Rezeptor-assoziierten Kinase (Swantek J.L., 2000). Angiotensin II führt dagegen über den AT1- Rezeptor zur Aktivierung der Tyrosinkinase Rezeptoren (Saito Y., 2001).

Nach Inkubation der Monozyten mit dem AT1-Rezeptorantagonisten Losartan vor der Angiotensin II Stimulation war kein signifikanter Unterschied der IL-1ß Sekretion von Patienten und Kontrollen mehr nachweisbar. Losartan reduziert den Aktivierungszustand


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der Monozyten in vitro. Es blockiert die Aktivierung des pro-inflammatorischen Transkriptionsfaktors NF_-B durch Angiotensin II in Monozyten (Kranzhofer R., 1999). Die hier dargestellten Ergebnisse weisen daraufhin, dass die IL-1ß Sekretion peripherer Monozyten über den AT1-Rezeptor reguliert wird.

8.1.2 Superoxidproduktion

Funktionelle Untersuchungen an peripheren Monozyten von Hypertoniepatienten konnten auch eine vermehrte Sensibilisierung dieser Zellen nachweisen. Als weiterer Parameter zur Beurteilung des Aktivitätszustandes wurde die Fähigkeit von Monozyten, nach Stimulation mit PMA oder Angiotensin II Superoxidanionen freizusetzen, gewählt. PMA ist die beste Substanz zur Testung der Proteinkinaseaktivität, welche eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der NADPH Oxidase spielt.

Die erhöhte Superoxidfreisetzung weist ein hohes pathogenetisches Potential auf, da die Superoxidradikale zur Bildung des atherogenen oxidierten LDL führen können, welches zytotoxisch gegenüber den Zellen der arteriellen Gefäßwand wirkt sowie entzündliche und thrombotische Prozesse stimuliert (Aviram M., 1998; Ross R., 1999). Sinkt die Aufnahme von oxidiertem LDL wie z.B. in den Monozyten/Makrophagen von CD36-Defizit Patienten, sezernieren diese Zellen auch signifikant weniger TNF-alpha und IL-1ß im Vergleich zu den Kontrollen (Janabi M., 2000). Nach einer Arbeit von Volk et al. steigt die TNF-alpha Synthese proportional mit der Superoxidproduktion. Dabei wurde immun-fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen, dass die Monozyten die Hauptproduzenten von TNF-alpha sind (Volk T., 1999).


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Die vorliegenden Experimente ergaben, dass periphere Monozyten von Hochdruck-patienten in unterschiedlichem Maß eine erhöhte Kapazität zur Freisetzung von Superoxid aufwiesen. Die maximale Chemilumineszenz als Aktivierungsmarker war nach PMA Stimulation bei den Patienten gegenüber den Kontrollen signifikant erhöht. Diese Ergebnisse ergänzen die Arbeit von Sagar et al., die eine vermehrte Superoxidproduktion durch polymorphkernige Granulozyten bei der essentiellen Hypertonie nachwiesen (Sagar S., 1992).

Eine vermehrte Superoxidproduktion von Monozyten wurde auch bei entzündlichen Erkrankungen wie dem M. Crohn (Kitahora T., 1988), dem Asthma bronchiale (Vachier I., 1992) und der Autoimmunvaskulitis (Bruce I., 1997) nachgewiesen.

Neben der signifikant erhöhten Sekretion pro-entzündlicher Zytokine, führte Angiotensin II auch zur vermehrten Superoxidproduktion. Nach Laursen ist die Angiotensin II induzierte Hypertonie der Ratte zumindest partiell durch eine vermehrte Superoxid-produktion begründet, da applizierte Superoxiddismutase zu einer signifikanten Blutdruckreduktion führt, bei Katecholamin induzierten Hypertonie dagegen keine Wirkung zeigt (Laursen J.B., 1997). Fukai wies allerdings nach, dass Angiotensin II selbst die Expression der vaskulären Superoxiddismutase unabhängig von dem Hypertonus steigert (Fukai T., 1999).

Laut Ross handelt es sich bei der Atherosklerose um eine entzündliche Erkrankung (Ross R., 1999). Allerdings sieht Ross die inflammatorische Aktivität u.a. in einer vermehrten Superoxidproduktion der Gefäßwand begründet, das zwar die NO Bildung der Endothelzellen nicht senkt, aber die Bioverfügbarkeit durch oxidative Inaktivierung reduziert (Kojda G., 1999) sowie die Leukozytenadhäsion steigert (Swei A., 1997). Endothelzellen der Aortensegmente spontan hypertensiver Ratten setzen 120 % mehr


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Superoxidanionen frei als die Kontrollen (Kojda G., 1999). Wurden humane Umbilikal-venenendothelzellen in einem in vitro System von Molenaar und Kollegen Hydroperoxid ausgesetzt, verdoppelte sich die Monozytenadhärenz (Molenaar R., 1989). Die Chemilumineszenzaktivität postkonfluenter HUVEC war in dem vorgestellten System im Vergleich zu der Chemilumineszenzaktivität der Monozyten vernachlässigbar gering, was die Hypothese von Ross nicht unterstützen würde. Allerdings sind humane Umbilikal-venenendothelzellen hinsichtlich der Superoxidproduktion sicherlich nicht mit arteriellen Patientenendothelzellen vergleichbar.

Wurden die Monozyten neben PMA mit LPS stimuliert, ließ sich lediglich bei den Kontrollen eine weitere Steigerung der Superoxidproduktion nachweisen, nicht dagegen bei den Patienten. LPS ist als direktes Stimulans der Superoxidproduktion humaner Monozyten bekannt (Landmann R., 1995), so dass die fehlende Stimulierbarkeit der Patientenmonozyten verwundert. Möglicherweise sind die sensibilisierten Monozyten von Hypertonikern im Gegensatz zu den Monozyten gesunder Kontrollen mit PMA bereits maximal stimuliert worden.

Diese Befunde sind als Hinweise auf eine Störung der Monozytenfunktion bei Hypertonikern zu werten, da neben der Transkription und Sekretion pro-entzündlicher Zytokine auch ein anders reguliertes System wie die Freisetzung reaktiver Sauerstoff-metaboliten betroffen ist.

8.1.3 Aktivierungsabhängige Oberflächenmarker

Phänotypische Hinweise auf einen vermehrten Aktivierungszustand ergaben die durchflusszytometrischen Untersuchungen isolierter mononukleärer Zellen von


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Hypertonikern. Es zeigte sich, dass die untersuchten aktivierungsassoziierten Antigene in einem erhöhten Prozentsatz von peripheren Monozyten der Patienten exprimiert wurden.

Eine signifikant erhöhte Expression fand sich für ICAM-1 (CD54), welches zur Immunglobulin Superfamilie der Adhäsionsmoleküle gehört sowie für LFA-1 (CD11a) und MAC-1 (CD11b), die Liganden oder Counterrezeptoren von ICAM-1. LFA-1 und MAC-1 gehören zur Gruppe der ß2-Integrine. Die transendotheliale Migration der Monozyten wird durch LFA-1 vermittelt (Shang X.Z., 1999). Die ß2-Integrinrezeptoren sind aber auch Bindungsmoleküle für Bakterien und LPS (Ammon C., 2000). Normalerweise befinden sich die Integrinrezeptoren zirkulierender Monozyten in einem inaktiven Zustand (Raines E.W., 1996). Die gesteigerte Expression unterstützt die Hypothese, dass eine vermehrte Aktivierung des Immunsystems bei der Hypertonie stattfindet.

Nach Kalra et al. wird der Ligand CD11b auf der Oberfläche peripherer Monozyten auch nach Kontakt mit Zigarettenrauchkondensat exprimiert, was zu einer verstärkten Adhärenz an Endothelzellen führt, die mittels monoklonalem CD11b-Antikörper blockierbar ist (Kalra V.K., 1994). Da die Probanden sich nur aus Nichtrauchern zusammensetzten, scheidet dieser Aktivierungsmechanismus der Monozyten für unsere Patientenpopulation aus.

Zeitgleich mit den hier gewonnenen Daten, berichtete Takemori über eine vermehrte MAC-1 (CD11b) Expression der Monozyten SHRSP (stroke-prone spontaneously hypertensive rats) im Vergleich mit Wistar Kyoto Ratten und eine Reduktion der MAC-1 Expression nach oraler Gabe eines AT1-Rezeptorantagonisten (Takemori K., 2000). Wurden die peripheren Monozyten in unseren Versuchsreihen vor FACS Analyse mit Losartan vorinkubiert, ließ sich keine Reduktion der MAC-1 Expression nachweisen (Ergebnisse nicht dargestellt.). Allerdings ist der Einsatz von AT1-Rezeptorantagonisten


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in vivo (0,5 mg/kg/d oral) über 4 Wochen im Tierexperiment, nicht mit einer 30 minütigen Vorinkubation humaner Monozyten in vitro vergleichbar, zudem die Patienten- (n = 12) wie Versuchstierzahlen (n = 7) gering ausfielen.

Die Oberflächenmarker CD29 (VLA-1, ein ß1-Integrin), CD31 (PECAM-1, aus der Ig Superfamilie), CD44 (H-CAM) und CD49 (VLA-4, ein ß1-Integrin) waren nicht bzw. nicht signifikant erhöht.

CD29 hat als Liganden Laminin und wurde als interne Kontrolle mitgeführt. Die Expression von CD29 erfolgt normalerweise während der Differenzierung der Monozyten zu Makrophagen (Ammon C., 2000). CD31 wird vor allem von Gefäßzellen und Thrombozyten exprimiert und ist für die Transmigration zuständig. CD44 weist als Liganden Hyaloronat und Kollagen auf, wird hauptsächlich von B- und T-Zellen exprimiert und ist in das Lymphozytenhoming involviert. Eine vermehrte Expression von CD29, CD31 und CD44 war aufgrund der minimalen Expression durch Monozyten kaum zu erwarten.

CD49 wird neben den Lymphozyten in erheblichem Maße von Monozyten exprimiert, Liganden sind VCAM-1 und Fibronectin. Es ist u.a. für das Leukozyten Rolling, die Adhäsion und Migration zuständig, so dass eine vermehrte Expression durch Patienten-monozyten erwartet wurde, zudem VCAM-1 im Serum der Patienten erhöht war. Bei genauer Betrachtung der gemessenen Werte (Patienten: 164,0 ± 171,5; Kontrollen: 108 ± 113,9 counts, P = 0,14) kommt allerdings der Verdacht auf, dass lediglich aufgrund der hohen Standardabweichung kein signifikanter Unterschied nachweisbar war.


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8.2 Adhäsion

Die Hypertonie ist mit einer vorzeitigen Atherosklerose vergesellschaftet (Keidar S., 1998; Kannel W.B., 2000). So wurde von Clozel und Mitarbeitern gezeigt, dass bei der Hypertonie eine endotheliale Dysfunktion sowie eine subendotheliale Akkumulation von Monozyten vorliegen. Die Untersuchungen wurde an SHR durchgeführt. Die subendotheliale Infiltration mit Monozyten wurde morphometrisch ermittelt und die endotheliale Dysfunktion wurde mittels Serotonin Quotienten (maximale Kontraktion isolierter arterieller Ringe mit Endothel unter Serotonin zu der maximalen Kontraktion ohne Endothel) bestimmt (Clozel M., 1991). Möglicherweise sind diese Veränderungen teilweise in der vermehrten Sekretion von IL-1ß und TNF-alpha durch Monozyten von SHR begründet.

In Tiermodellen wurde bereits mehrfach nachgewiesen, dass Monozyten eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen spielen (Gerrity R.G., 1981; Ross R., 1986). Leider gibt es so gut wie keine Arbeiten zur Rolle der Monozyten bei essentiellen Hypertonikern.

Bei den vorliegenden Untersuchungen wurden Patienten mit Hypercholesterinämie ausgeschlossen, da seit den 90er Jahren eine gesteigerte Monozytenadhärenz an das Endothel durch Hypercholesterinämien aus Tiermodellen sowie humanen Versuchen bekannt ist (Gimbrone M.A., 1990; Cybulsky M.I., 1991), darüber hinaus kürzlich über eine höhere IL-1ß und TNF-alpha Expression durch Monozyten von Patienten mit Hyper-cholesterinämie berichtet wurde (Ferro D., 2000) und die Validität der Messergebnisse durch zusätzliche Risikofaktoren der Arteriosklerose nicht eingeschränkt werden sollte.


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Es erfolgte weiterhin ein Ausschluss sämtlicher Patienten mit einer Intima-Media-Dicke der A.carotis ge 0,7 mm für die Adhäsionsversuche und Chemilumineszenzmessungen und > 0,75 mm für sämtliche Experimente. Diese Entscheidung basierte vor allem auf den Ergebnissen der Übersichtsarbeit von Aminbakhsh und Mancini sowie der Arbeit von Ferrieres (Aminbakhsh A., 1999; Ferrieres J., 1999). Die erwähnte Übersichtsarbeit wies ein erhöhtes Risiko einen Apoplex zu erleiden, bei einer Intima-Media-Dicke ge 0,75 mm nach. Ferrieres konnte nachweisen, dass bei Ausschluss aller Risikofaktoren einer koronaren Herzkrankheit die durchschnittliche Intima-Media-Dicke bei 0,6 mm lag und schlussfolgerte daraus, dass die in der Literatur angegebenen Intima-Media-Dicken von Hochrisiko-Patienten mit einer lokalen Atherosklerose vergesellschaftet sind (Ferrieres J., 1999).

8.2.1 Adhäsionsmoleküle im Serum

Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstützen die Arbeit von DeSouza, die erhöhte ICAM-1 und VCAM-1 Serumspiegel bei Hypertonikern nachwies (DeSouza C.A., 1997).

Unklar bleibt die Genese der erhöhten Adhäsionsmoleküle im Serum von Hypertonikern. Einerseits führt Scherstress zu einer vermehrten Expression von ICAM-1 (Nagel T., 1994), andererseits könnten aktivierte Monozyten dafür verantwortlich sein, da TNF-alpha und IL-1 zu einer Hochregulation der ICAM-1 und VCAM-1 Expression von Endothel-zellen führen (Davies M.J., 1993).

ICAM-1 und VCAM-1 werden hauptsächlich von Endothelzellen aber auch von Monozyten produziert; E-Selektin wird dagegen ausschließlich von Endothelzellen produziert (Bevilacqua M.P., 1989).


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Da hier lediglich erhöhte ICAM-1 und VCAM-1 Serumkonzentrationen der Patienten nachgewiesen wurden, könnte dies unsere Hypothese, dass die aktivierten Monozyten für die hohen Serumspiegel in einem frühen Stadium der Hypertonie vor jeglichen Endothelzelläsionen verantwortlich sind, stützen. Das würde auch die diskrepanten Befunde von Blann und Kollegen erklären, welche bei Hypertonikern signifikant erhöhte E-Selektin Konzentrationen im Serum nachwiesen, aber nicht Patienten mit sonographisch nachweisbaren atherosklerotischen Läsionen bzw. grenzwertiger Intima-Media-Dicke ausschlossen (Blann A.D., 1994). Möglicherweise wird E-Selektin erst von einem alterierten Endothel sezerniert.

ICAM-1, ein Protein der Ig Superfamilie, ist einer der Liganden für LFA-1 (CD11a). Eine vermehrte ICAM-1 Expression der Endothelzellen ist mit einer gesteigerten Adhäsion von Monozyten an die Intima assoziiert. 85 % der Makrophagen in Initialläsionen exprimieren LFA-1, was laut Watanabe auf die Einbindung des LFA-1/ICAM-1 Rezeptorliganden-Systems in die Rekrutierung der Monozyten hinweist (Watanabe T., 1998). Ein von Watanabe et al. injizierter monoklonaler Anti-ICAM-1/LFA-1 Antikörper reduzierte signifikant die Adhärenz der Monozyten an die aortale Intima der Ratten.

Die vorgestellten Ergebnisse wiesen sowohl erhöhte ICAM-1 Spiegel im Serum von hypertensiven Patienten wie auch eine vermehrte Expression von CD11a (LFA-1) auf der Monozytenoberfläche nach.

Komatsu et al. zeigten, dass die differente ICAM-1 Expression von SHR und Wistar Kyoto Ratten nicht durch Veränderungen der Endotheloberfläche begründet ist, da sich die endotheliale ICAM-1 Expression nicht unterschied. Sie vermuten dagegen eine mit der Hypertonie assoziierte abnorme Entzündungsreaktion (Komatsu S., 1997), was durch unsere Untersuchungen am Menschen gestützt würde.


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Aufgrund der erhöhten Adhäsionsmoleküle im Serum verwendeten wir ausschließlich HUVEC für die Adhäsionsversuche, um eine Aktivierung der Endothelzellen auszuschließen. Da bekanntermaßen auch der von Willebrand Faktor als Hinweis auf eine endotheliale Dysfunktion im Plasma von hypertensiven Patienten erhöht ist (Blann A.D., 1996, Goonasekera C.D., 2000), schloß sich die Verwendung von Patientenendothelzellen aus. Die Superoxidfreisetzung der HUVEC war im Vergleich mit der Superoxid-produktion der Monozyten vernachlässigbar gering.

8.2.2 Adhäsion peripherer Monozyten an HUVEC

Zahlreiche Studien gehen davon aus, dass die Adhärenz von Monozyten an das Endothel der entscheidende Schritt in der Ausbildung atherosklerotischer Veränderungen ist (Watanabe T., 1998; Gerszten R.E., 1999). Daher untersuchten wir die Adhäsion isolierter Monozyten an humane Umbilikalvenenendothelzellen und stellten dabei fest, dass bereits unstimulierte Monozyten von Hypertoniepatienten eine stärkere Adhäsion an HUVEC aufweisen als die Monozyten gesunder Kontrollen. So könnte die vermehrte Expression von CD11b auf den Patientenmonozyten ein ursächlicher Faktor für die erhöhte Adhäsion an Endothelzellen in vitro sein.

Eine erhöhte Adhäsion von humanen Monozyten an Endothelzellen wurde kürzlich von Devaraj auch bei Diabetikern nachgewiesen (Devaraj S., 2000). Interessanterweise hatten von 50 rekrutierten Diabetiker 25 eine diabetische Makroangiopathie und von diesen, 16 Patienten einen Hypertonus. Von den restlichen 25 Diabetikern litten weitere 9 Patienten zusätzlich an einer Hypertonie.

Artigues berichtete über eine gesteigerte Adhäsion von Monozyten an arterielle Endothelzellen bei Dahl Ratten, die nach kochsalzreicher Diät (8 %) einen Hypertonus


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ausgebildet hatten. Als Ursache wurde u.a. eine verminderte NO Produktion vermutet (Artigues C., 2000).

In den letzten Jahren wird die entzündliche Genese der Atherosklerose und die potenzielle Bedeutung der pro-entzündlichen Zytokine heftig diskutiert (Boring L., 1998; Ross R., 2000).

Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, dass Angiotensin II aktivierte Monozyten zur Adhäsion an Endothelzellen führen können und damit das Risiko für atherosklerotische Läsionen erhöhen. Ultraschallstudien der Carotiden zeigen eine postitve Korrelation zwischen Hypertonus und dem Nachweis von Plaques an der Arterienwand, insbesondere bei Patienten mit hohen Reninspiegeln (Lusiani L., 1990).

In einer prospektiven Studie mit 1717 Hochdruckpatienten, die anhand ihres Reninspiegels klassifiziert und über 8,3 Jahren beobachtet wurden, wies Aldermann nach, dass die Inzidenz eines Myokardinfarktes bei den Patienten mit hohem Reninspiegel zwei- bis fünffach höher war als bei Patienten mit niedrigen oder normalen Reninwerten. Die Plasma-Reninaktivität war ein stärkerer Prädiktor für den Myokardinfarkt als Cholesterol-spiegel, Alter, Geschlecht, BMI oder diastolischer Blutdruck (Aldermann M.H., 1991).

Zur Vermeidung einer Angiotensin II induzierten Monozytenaktivierung haben sich AT1-Rezeptorantagonisten in vitro als brauchbar erwiesen. So führt eine Vorinkubation der Patientenmonozyten mit Eprosartan zur Reduktion der Adhäsion an HUVEC nach Angiotensin II Stimulation. Möglicherweise stellen sie ein neues Therapeutikum zur Prävention der Arteriosklerose dar. Angiotensin II führt nach der Arbeit von Hayek auch zu einer vermehrten Aufnahme oxidierten LDL`s durch Makrophagen, welche durch Losartan in vivo um 78 % reuduziert wurde (Hayek T., 2000).


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Als Antwort auf eine LPS Stimulation wird bekannterweise die Expression von Adhäsionsmolekülen durch das vaskuläre Endothel angeregt (Luhm J., 1997). Die vorgelegten Experimente konnten allerdings nach LPS Stimulation keinen signifikanten Unterschied zwischen der Adhäsion von Patienten- bzw. Kontrollmonozyten an HUVEC nachweisen, vermutlich aufgrund einer primär maximalen bzw. Überstimulierung der Zellen.

8.3 Korrelationen der Monozytenadhäsion und Zytokinsekretion mit Alter und Blutdruck der Probanden

Aufgrund des Designs der vorliegenden Untersuchungen kann nicht geschlussfolgert werden, ob die aktivierten Monozyten nur als ein Epiphänomen des hohen Blutdruckes oder als ein ursächlicher Faktor bezüglich der Hypertonie und arteriosklerotischer Folgeerkrankungen anzusehen sind.

Singhal et al. berichteten 1997, dass die Migration humaner Monozyten (U 937) durch einen Filter in direkter Beziehung zu der Höhe des applizierten Druckes stand (Singhal P.C., 1997). Allgemein bekannt ist auch, dass der Blutdruck zur Ausbildung atherosklerotischer Läsionen eine bestimmte Höhe haben muss, z.B. entstehen keine atherosklerotischen Plaques in Venen bzw. Pulmonalarterien.

Die Arbeitsgruppe um Strawn geht davon aus, dass Endothelläsionen hypertensiver transgener Ratten (TGR(mRen2)27) primär durch den erhöhten Blutdruck verursacht werden, da sie nach Hydralazin regredient sind, wogegen die Monozytenaktivität an eine Aktivierung des Renin-Angiotensin Systems gekoppelt sei (Strawn W.B., 1999).


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Allerdings beobachteten wir keine positive Korrelation der Monozytenadhäsion an HUVEC mit dem Blutdruck der Probanden und nur eine geringgradige positive Korrelation mit dem Alter. Die nur geringe Korrelation mit dem Alter der Probanden könnte durch den Ausschluss von Rauchern, Patienten mit erhöhtem LDL, mit grenzwertiger Intima-Media-Dicke oder atherosklerotischen Läsionen aus der Studie begründet sein. Im Gegensatz dazu wiesen die gesunden Probanden bei gleichen Ausschlusskriterien eine hohe Korrelation der Monozytenadhäsion mit dem Alter, bei insgesamt signifikant geringerer Adhärenz, auf. Offensichtlich weisen die Monozyten der Hypertoniker eine verstärkte Adhäsivität auf, die durch ein höheres Patientenalter nicht nennenswert gesteigert wird.

Nach Angiotensin II Stimulation ließ sich für TNF-alpha und IL-1ß eine positive Korrelation mit dem systolischen Blutdruck der Patienten nachweisen, jedoch keine Korrelation mit dem Alter. Offenbar ist für die Hypertoniepatienten die Höhe des systolischen Blutdruckes auch in Bezug auf die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine entscheidender als das Patientenalter.

In der Literatur wurde dagegen wiederholt über höhere IL-1 und TNF Spiegel in hohem Alter berichtet (Mooradian A.D., 1990; Liao Z., 1993). Dabei wurden Patientenpopulationen von 80-95 Jahren mit denen von 25-35 Jahren verglichen. Die in der vorgelegten Arbeit involvierten Patienten wiesen jedoch ein mittleres Alter von 47 Jahren auf, kein Patient war älter als 64 Jahre. Arbeitsgruppen, die nur Probanden ohne jegliche Erkrankung oder Infektion einschlossen, konnten ebenfalls keine erhöhte IL-1 oder TNF-alpha Produktion humaner Monozyten im Alter nachweisen (Rudd A.G., 1989; Mysliwska J., 1999).


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8.4 Methodenkritik

Primär stellte sich die Frage, ob die Aktivierung der Monozyten in der Isolierungsmethode (Dichtegradientenzentrifugation und Plastikadhärenz) begründet ist. Um Spekulationen dieser Art zu vermeiden, wurden die Monozyten nach Verfügbarkeit der Dynabeads® Methodik für Monozyten 1999 nur noch mit dieser isoliert, womit die Plastikadhärenz wegfiel (Romani N., 1996). Im Vergleich unterschieden sich die Ergebnisse der Experimente nicht signifikant.

Leider gibt es bisher keine Methodik, welche eine Isolierung der Monozyten ermöglicht, ohne zumindest eine geringe Aktivierung der Zellen zu verursachen, insbesondere bei Verarbeitung von kleinen Blutvolumina (Gmeling-Meyling F., 1980). Stent und Crowe verglichen 1997 verschiedene Isolierungsmethoden hinsichtlich der Expression von aktivierungsabhängigen Oberflächenmolekülen auf den Monozyten (Stent G., 1997). Nach Plastikadhärenz bis zu zwei Stunden fand sich im Vergleich mit der Elutriation keine vermehrte Expression von CD54 und Integrinen. Bei der hier dargestellten Isolierung erfolgte eine Plastikadhärenz von nur einer Stunde.

Eine mögliche Aktivierung der Monozyten durch die Isolierungsmethode schien zudem von geringer Bedeutung, da nicht die Absolutwerte, sondern der Vergleich der Patientenmonozyten mit denen der Normalkontrollen von Relevanz war.

Bis heute kann man allerdings nicht ausschließen, dass nur Subgruppen von Monozyten zirkulieren und nur diese somit zugänglich waren.

Bei der Verwendung der humanen Umbilikalvenenendothelzellen galt es vor allem, Zeitlimits zu beachten. HUVEC wurden ausschließlich nach ein- bis dreimaliger Passage -48 h vor Verwendung im Adhäsionassay eingesetzt, da in vitro gealterte HUVEC eine erhöhte Monozytenadhärenz aufweisen (Molenaar R., 1989).


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Zur Überprüfung der Validität des Adhäsionsassays isolierter Monozyten an HUVEC nach Hahn wurde ein zweiter Adhäsionsassay nach McCarron durchgeführt, bei welchem die Adhäsion nicht mittels Auszählens per Hand, sondern anhand der Radioaktivität der adhärenten Zellen im Gamma Counter ermittelt wurde (Hahn A.W.A., 1994). Der bei 50 % der Adhäsionsversuche parallel durchgeführte Assay nach McCarron ergab nahezu identische Ergebnisse (McCarron R.M., 1994).

Aufwendig und langwierig gestaltete sich auch der Einschluss der Probanden. Das hier vorgestellte Patientengut wurde aus einem großen Pool ausgewählt. Da nur ein geringer Prozentsatz der Hypertoniepatienten die Einschlusskriterien erfüllte, zogen sich die Experimente über 4-5 Jahre hin. So haben z.B. über 40 % der hypertensiven Patienten nach Literaturangabe Plasma Cholesterolwerte über 240 mg/dl (Working group on management of patients with hypertension and high blood cholesterol, 1991).

Nach neuester Literatur weisen adipöse Menschen ebenfalls erhöhte VCAM-1 Konzentrationen im Serum auf (Ferri C., 1999), obwohl der BMI der eingesetzten Patienten im Durchschnitt normwertig war, lagen 23 Patienten darüber und könnten somit die VCAM-1 Werte negativ beeinflußt haben. Allerdings waren auch 17 gesunde Probanden leicht übergewichtig.

Die hohen Standardabweichungen bei den Zytokinmessungen, Chemilumineszenzen und Adhäsionwerten insbesondere der Patientengruppe, unterstützen die Hypothese von Palù, dass nicht nur die Genese der essentiellen Hypertonie multifaktoriell und polygen ist, sondern dass es auch Subgruppen von Hypertonikern mit unterschiedlichem Arterioskleroserisiko gibt (Palù C.D., 1996). Darauf weisen auch neuere Arbeiten zu Genpolymorphismen essentieller Hypertoniker hin (Giner V., 2000). So wurde über ein heterogenes Ansprechen essentieller Hypertoniker auf Angiotensin II berichtet. Spiering


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et al. konnten nachweisen, dass der A(1166)C Polymorphismus des Angiotensin II AT1-Rezeptorgens zu der Variabilität der Reaktionen auf Angiotensin II beiträgt. Sie untersuchten Patienten mit 3 Genotypen (AA, AC, CC). Patienten mit dem C Allel des AT1-Rezeptors zeigten eine erhöhte Sensitivität gegenüber Angiotensin II (Spiering W, 2000). Insbesondere nach Angiotensin II Stimulation der Monozyten schwankten die ermittelten IL-1ß-, TNF-alpha-, Chemilumineszenz- und Adhäsionswerte der Patientengruppe stark, was einerseits in der Statistik zu hohen Standardabweichungen führte, andererseits die Untersuchungen von Spiering bestätigt.

8.5 Fazit

Die vorgestellte Arbeit befasste sich mit bestimmten Zellen der Hypertoniker - den Monozyten, um die Frage zu beantworten, ob außer Elektrolytverschiebungen, hormonellen Veränderungen, dem Wirken einiger Metaboliten und nervalen Komponenten, bereits periphere Zellen verändert sind, die immunologische bzw. pro-inflammatorische Mechanismen beeinflussen und einen entscheidenden Beitrag zu Folgeerscheinungen wie der Arteriosklerose leisten.

Die hier erstmals nachgewiesene Aktivierung der Monozyten von hypertensiven Patienten unterstützt die in letzter Zeit diskutierten Hypothesen zu genetischen Ursachen der essentiellen Hypertonie. So sollen Genpolymorphismen z.B. die Sensitivität für Kochsalz oder Metaboliten wie Angiotensin II verändern (Luft F.C., 1998; Kurokawa K., 1998; Spiering W., 2000).

Andererseits wird die Diskussion um die immunologischen Veränderungen bei der essentiellen Hypertonie um die Komponente der Monozytenaktivierung erweitert.


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Noch interessanter erscheinen die vorliegenden Ergebnisse in Bezug auf die Entwicklung atherosklerotischer Veränderungen beim Hypertoniker. Die keineswegs angefochtene Hypothese einer ursächlichen Endothelzelläsion müsste lediglich um die ebenfalls - zumindest beim Hochdruckpatienten - primär aktivierten und vermehrt adhärenten Monozyten als partiellem Verursacher atherosklerotischer Läsionen erweitert werden. Schließlich wurden nur humane Umbilikalvenenendothelzellen mit im Vergleich minimaler Superoxidproduktion verwendet, so dass eine Aktivierung der Monozyten im Adhäsionsassay durch Endothelzellen ausgeschlossen werden kann. Wurden die Monozyten möglicherweise durch die Isolierungsmethoden aktiviert, ist damit noch nicht die signifikant erhöhte Adhärenz der Patientenzellen, gegenüber denen der gesunden Probanden zu erklären.

Die vorgestellten Befunde sind für die Pathogenese der vorzeitigen sowie vermehrten atherosklerotischen Veränderungen essentieller Hypertoniker von Bedeutung und unterstützen die Hypothese einer inflammatorischen Genese der Atherosklerose.


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Tue Dec 30 10:20:32 2003