Dörffel, Yvonne: Rolle peripherer Monozyten bei Patienten mit essentieller Hypertonie

Humboldt-Universität zu Berlin


Habilitationsschrift
Rolle peripherer Monozyten bei Patienten mit
essentieller Hypertonie

zur Erlangung der Lehrbefähigung für das Fach
Innere Medizin

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité

von Frau Dr. med Yvonne Dörffel,

geboren am 15.06.1962 in Hennigsdorf

Präsident: Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
Prof. Dr. med. Thomas Philipp
Prof. Dr. med. Günter Linß

Eingereicht am: 12.06.2001

Öffentlich-wissenschaftlicher Vortrag: 26.03.2002

Abstrakt

Erstes Ziel der Arbeit war es Methoden aufzubauen, die die funktionellen Eigenschaften von peripheren Monozyten ermitteln sollten, um die Rolle dieser Zellen bei der essentiellen Hypertonie zu erfassen. Es wurde versucht, die immunologischen Mechanismen der Entzündung oder Voraktivierung dieser Zellen zu charakterisieren.

Der Aktivierungsgrad der peripheren Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie im Vergleich zu Normalkontrollen wurde anhand ihrer Zytokinsekretion untersucht. Die durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass die peripheren Monozyten von essentiellen Hypertonikern im Vergleich zu normotensiven Probanden nach Stimulation vermehrt IL-1ß und TNF-alpha sezernieren, verursacht durch eine transkriptionelle Hochregulation. Neben spezifischen Mediatoren sezernieren aktivierte Monozyten eine Reihe unspezifischer toxischer Effektormoleküle wie z.B. Sauerstoffsuperoxid. Der Gipfel der Chemilumineszenzaktivität als Maß der Superoxidproduktion peripherer Monozyten von Hypertonikern war nach Stimulation signifikant höher im Vergleich zu den Kontrollen.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die Hypothese generiert, dass den voraktivierten Monozyten von Hypertoniepatienten eine entscheidende Rolle bei der Initiierung von Gefäßwandläsionen zu kommen könnte, welche die frühen arteriosklerotischen Veränderungen bei diesen Patienten im Vergleich zur gesunden Normalbevölkerung mitbegründen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde daher die Adhäsion peripherer Monozyten von Hypertonikern an humane Endothelzellen im Vergleich zu Monozyten von normotensiven Gesunden überprüft. Die Adhäsion der Monozyten von Hypertonikern war signifikant erhöht. Interessanterweise führte die Vorinkubation mit einem AT1-Rezeptorantagonisten bei den Patientenmonozyten zu einer Reduzierung der Sekretion proinflammatorischer Zytokine und der Endothelzelladhäsion.

Die vorgestellten Befunde sind für die Pathogenese der vorzeitigen sowie vermehrten atherosklerotischen Veränderungen essentieller Hypertoniker von Bedeutung und unterstützen die Hypothese einer inflammatorischen Genese der Atherosklerose.

Abstract

Immunopathogenic mechanisms may be involved in the pathogenesis of atherosclerosis and hypertensive disease. The possible role of monocytes in the pathology of atherosclerosis in hypertension has been a matter of great interest. It was demonstrated that monocytes from hypertensive patients secrete significantly higher levels of proinflammatory cytokines after stimulation with lipopolysaccharide or angiotensin II compared with normotensive individuals. The upregulation of IL-1ß and TNF-alpha expression was also seen at the RNA-level. The increased secretion of these cytokines is considered to be a marker for activated circulating monocytes. To investigate the direct impact of these preactivated monocytes, the adhesion of monocytes from normal controls and hypertensive patients to vascular endothelial cells was determined spontaneously and after in vitro stimulation. Oxygen species release as a further activation marker was analyzed for monocytes by chemiluminescence. Spontaneous adhesion of monocytes from patients and the adhesion after stimulation were significantly increased compared with normal controls. Preincubation with an AT1 receptor antagonist diminished the cytokine secretion and the adhesion in both groups to comparable levels. In monocytes, peak levels of chemiluminescence after stimulation were significantly higher in patients.

The data indicate that preactivated monocytes from hypertensives may be of pathogenic importance in atherosclerosis. Prevention of angiotensin II-mediated activation of monocytes from hypertensive patients by an AT1 receptor antagonist may be a novel therapeutic approach to prevent vascular alterations in hypertension.

Schlagwörter:
Hypertonie, Monozyten, Zytokine, Adhäsion

Keywords:
hypertension, monocytes, cytokines, adhesion


Seiten: [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132] [133] [134] [135] [136] [137] [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteRolle peripherer Monozyten bei Patienten mit essentieller Hypertonie
1 Inhaltsverzeichnis
2 Zusammenfassung
3 Thesen
4 Einleitung
4.1Die essentielle Hypertonie
4.2Immunsystem und Hypertonie
4.2.1Die Immunpathologie der klinischen essentiellen Hypertonie
4.2.1.1Die Antikörperantwort beim essentiellen Hypertoniker
4.2.1.2Die zellvermittelte Immunantwort beim essentiellen Hypertoniker
4.2.1.3Das Komplementsystem beim essentiellen Hypertoniker
4.2.2Immunpathologie der experimentellen spontanen Hypertonie
4.3Die Rolle des Renin-Angiotensin Systems in der Immunpathologie
4.4Hypertonie und vermehrte Superoxidproduktion
4.5Periphere Monozyten
4.5.1Aktivierung peripherer Monozyten
4.5.1.1Pro-entzündliche Zytokine
4.5.1.2Oberflächenmarker
4.6Endothelzell-Monozyteninteraktionen
4.7Hypertonie und Arteriosklerose
5 Problemstellung
6 Material und Methoden
6.1Chemikalien und Reagenzien
6.2Periphere Monozyten
6.2.1Isolierung der Monozyten aus dem peripheren Blut
6.2.2Identifikation der Monozyten aus dem peripheren Blut mittels fluoreszenzaktiviertem Flusszytometer
6.2.3Stimulation peripherer Monozyten und Zellkultur
6.3Zytokinassays
6.4Zytokin mRNA Bestimmungen
6.4.1Extraktion der RNA
6.4.2Reverse Transkription (RT)
6.4.3Semiquantitative Polymerasekettenreaktion
6.5Chemilumineszenz-Assay und Stimulation der Zellen
6.6Adhäsionsmoleküle
6.6.1Bestimmung der Adhäsionsmoleküle mittels ELISA
6.6.2Identifikation aktivierungsabhängiger Oberflächenmoleküle der Monozyten mittels FACS
6.7Humane Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC)
6.7.1Isolierung der HUVEC
6.7.2Kultivierung der HUVEC
6.7.3Identifkation der HUVEC
6.8Monozyten-Adhäsionsassays
6.9Untersuchungen am Menschen
6.10Expression von Daten
7 Ergebnisse
7.1Immunologische Aktivierung von isolierten peripheren Monozyten bei Patienten mit essentieller Hypertonie
7.1.1Sekretion pro-entzündlicher Zytokine
7.1.1.1Interleukin-1ß
7.1.1.2Tumor Nekrose Faktor-alpha
7.1.1.3Interleukin-6
7.1.2Bestimmung der mRNA pro-entzündlicher Zytokine
7.1.2.1IL-1ß mRNA Konzentration
7.1.2.2TNF-alpha mRNA Konzentration
7.1.3Superoxidproduktion
7.1.4Adhäsionsmoleküle
7.1.4.1Serumkonzentration zirkulierender Adhäsionsmoleküle
7.1.4.2Aktivierungsabhängige Oberflächenmoleküle auf den Monozyten
7.2Adhäsionsassays
7.2.1Unstimulierte Adhäsion
7.2.2Adhäsion nach Stimulation
7.2.2.1LPS
7.2.2.2Angiotensin II
7.2.2.3Eprosartan
7.3Korrelationen
7.3.1Zytokinkonzentration und Blutdruck
7.3.2Zytokinkonzentration und Alter
7.3.3Adhäsion und Blutdruck
7.3.4Adhäsion und Alter
8 Diskussion
8.1Aktivierung peripherer Monozyten bei Patienten mit essentieller Hypertonie
8.1.1Sekretion pro-entzündlicher Zytokine
8.1.2Superoxidproduktion
8.1.3Aktivierungsabhängige Oberflächenmarker
8.2Adhäsion
8.2.1Adhäsionsmoleküle im Serum
8.2.2Adhäsion peripherer Monozyten an HUVEC
8.3Korrelationen der Monozytenadhäsion und Zytokinsekretion mit Alter und Blutdruck der Probanden
8.4Methodenkritik
8.5Fazit
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Klassifikation des Blutdrucks für Erwachsene nach JNC-VI (Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure (JNC-VI), 1997)
Tabelle 2: Paraklinik der Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme
siehe

54

siehe

55

siehe

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Tabelle 3: Patientendaten einschließlich der Intima-Media-Dicke der A. carotis
communis nach der “leading edge“ - Methode
siehe

58

siehe

59

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Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Peripherer Monozyt mit charakteristischem hufeisenförmigen Kern und azidophiler Granula, Giemsa-Färbung.
Abb. 2 Abtrennuung der mononukleären Zellen mit Ficoll-Histopaque. Bei der Dichtegradientenzentrifugation setzen sich die Erythrozyten und Granulozyten am Boden des Röhrchens ab, da ihre Dichte höher als die von Ficoll (weiß) ist. Die mononukleären Zellen reichern sich in einer schmalen Zwischenschicht zwischen Plasma (oben, rot) und Ficoll an.
Abb. 3 Amplifikationskinetik TNF-alpha-Primer. Über der relevanten Zykluszahl finden sich parallele Amplifikationskinetiken für authenitisches TNF-alpha und synthetischen Standard
Abb. 4 Humane Umbilikalvenenendothelzellen nach direkter Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-humanen vWF-FITC Konjugat.
Abb. 5: Sonographie der A. carotis communis. Bestimmung der Intima-Media-Dicke nach der “leading edge“ - Methode mit einem 7-10 MHz Schallkopf (HDI, ATL Gerät).
Abb. 6: Konzentrationskinetik für Angiotensin II. Sekretion von IL-1ß durch periphere Monozyten in Abhängigkeit von der Angiotensin II Konzentration. (n = 7, SD < 10 %)
Abb. 7: Konzentrationskinetik für LPS. Sekretion von IL-1ß durch periphere Monozyten in Abhängigkeit von der LPS Konzentration (n = 5, SD < 10 %).
Abb. 8: Zeitkinetik für LPS. Sekretion von IL-1ß peripherer Monozyten in Abhängigkeit von der Dauer der Stimulation mit 10 ng/ml LPS. (n = 3, SD < 10 %)
Abb. 9: Spontansekretion von IL-1ß der Monozyten von Patienten (n = 22) und Kontrollen (n = 24) nach 20 Stunden Zellkultur im Überstand.
Abb. 10: 10 IL-1ß Sekretion peripherer Monozyten von Patienten (n = 31) und Kontrollen (n = 35) im Vergleich nach Stimulation mit Angiotensin II (?) oder LPS (¯).
(T = P < 0,05)
Abb. 11: IL-1ß Sekretion der Monozyten von Patienten (n = 31) und Kontrollen (n = 35) im Vergleich nach Stimulation mit Angiotensin II (?) und 30 minütiger Vorinkubation mit Losartan (¯). (T = P < 0,05; n.s. = nicht signifikant)
Abb. 12: TNF-alpha Sekretion der Monozyten von Patienten (n = 31) und Kontrollen (n = 32) im Vergleich nach Stimulation mit Angiotensin II (?) oder LPS (¯). (T = P < 0,02; n.s. = nicht signifikant)
Abb. 13: Sekretion von IL-6 der Monozyten von Patienten (n = 31) und Kontrollen
(n = 35) im Vergleich nach Stimulation mit Angiotensin II (?) oder LPS (¯).
(n.s. = nicht signifikant)
Abb. 14: PCR Produkte für eine Amplifikation mit spezifischen IL-1ß Primern. MWM = Marker verschiedenen Molekulargewichts, 1 = Positivkontrolle, 2 = Negativkontrolle, Kontrollen = PCR Produkte nach Verwendung von Monozyten zweier Normalkontrollen nach Stimulation mit Angiotensin II, Patienten = PCR Produkte nach Verwendung von Monozyten zweier Patienten nach Stimulation mit Angiotensin II, die Banden zeigen die PCR Produkte der in den Proben enthaltenen Wild-Typ mRNA
Abb. 15: IL-1ß mRNA peripherer Monozyten von Kontrollen (n = 14) und Patienten (n = 12) im Vergleich nach Stimulation mit Angiotensin II (?) oder LPS (¯). (TT = P < 0,02; T = P < 0,05)
Abb. 16: TNF-alpha mRNA peripherer Monozyten von Kontrollen (n = 14) und Patienten
(n = 12) im Vergleich nach Stimulation mit Angiotensin II (?) oder LPS (¯). (n.s. = nicht signifikant; T = P < 0,05)
Abb. 17: Maximale Chemilumineszenzaktivität der Monozyten von Hochdruckpatienten und Kontrollen im Vergleich. Unstimuliert (?) fand sich kein signifikanter Unterschied n.s.). Nach Stimulation mit Angiotensin II (¯) fand sich ein signifikanter Unterschied
(T = P < 0,002, n = 20).
Abb. 18: Maximale Chemilumineszenzaktivität der Monozyten von Hochdruckpatienten und Kontrollen im Vergleich nach Stimulation mit PMA (8 x 10-5 M, ?) oder PMA und LPS (10 ng/ml, ¯). (n.s. = nicht signifikant; T = P < 0,005, n = 20)
Abb. 19: FACS peripherer Monozyten (R1) nach typischem Fluoreszenzmuster im forward- (FSC, Maßstab für die Zellgröße) und sideward-height-scatter (SSC, Maßstab für die Granularität). Die Abbildung zeigt die FACS-Ergebnisse von Monozyten eines repräsentativen Hypertoniepatienten. Es wurden jeweils 100 000 Zellen ausgewertet.
Abb. 20: FACS Analyse peripherer Monozyten des repräsentativen Hypertoniepatienten (Abb. 18). Jeweils 10 000 Ereignisse wurden gemessen (Counts = Ereignisse). 20a: Färbung mit einem APC-markierten CD14 Antikörper. Nur CD14 positive Ereignisse wurden als Monozyten gewertet (R2). 20b: Färbungen mit einem FITC-markierten Isotyp-Antikörper gegen IgG. Im Fluoreszenzhistogramm wurden nur die Monozyten als positiv gewertet, die eine Fluoreszenzintensität oberhalb des Isotyp-Kontrollantikörpers hatten (M1). 20c: Nachweis von CD11a mittels FITC konjugiertem Antikörper, einem bei aktivierten Monzyten typischerweise exprimiertem Antigen.
Abb. 21: Expression aktivierungsabhängiger Oberflächenmarker CD54 (?), CD11a (?) und CD11b (¯) auf Patienten- und Kontrollmonozyten im Vergleich. (T = P = 0,025; TT = P = 0,004; n = 40)
Abb. 22: Adhäsion von Patientenmonozyten (n = 37) und Kontrollen (n = 41) an humane Umbilikalvenenendothelzellen im Vergleich in Prozent der eingesetzten Monozyten: spontan (?) sowie nach Stimulation mit LPS (10 ng/ml, ¯). (T = P = 0,017; n.s. = nicht signifikant).
Abb. 23: Adhäsion von Patientenmonozyten (n = 37) und Kontrollen (n = 41) an humane Umbilikalvenenendothelzellen im Vergleich in Prozent der eingesetzten Monozyten: nach Angiotensin II Stimulation (?) sowie nach zusätzlicher Vorinkubation mit Eprosartan
(¯). (TT = P = 0,01; T = P < 0,05).
Abb. 24: Korrelation nach Spearman von IL-1ß nach Angiotensin II Stimulation der Patientenmonozyten mit dem systolischen Blutdruck (n = 31).
Abb. 25: Korrelation nach Spearman des Alters der Hochdruckpatienten (O, n = 31) und der Normalkontrollen (O, n = 35) mit IL-1ß nach Angiotensin II Stimulation der peripheren Monozyten in vitro.
Abb. 26: Korrelation nach Spearman des systolischen Blutdruckes der Patienten (n = 37) mit der Spontanadhäsion der Monozyten an humane Umbilikalvenenendothelzellen.
Abb. 27: Korrelation nach Pearson R des Alters der Probanden [Hypertoniker (O), Normalkontrollen (O)] mit der Spontanadhäsion der Monozyten an humane Umbilikalvenenendothelzellen.

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Tue Dec 30 10:20:32 2003