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2.  Methodische Entwicklungen

Aufgrund seiner besonderen biophysikalischen Eigenschaften bietet das Rhodopsin-system den Vorteil, dass die Rhodopsin/Transducin-Interaktion und die G-Protein Aktivierung mit intrinsic monitoring verfolgt werden können. Mit spektroskopischen Methoden kann insbesondere die zeitliche Änderung bio­phy­sikalischer Eigen­schaften der Reaktionspartner gemessen werden. Vorzüge und Weiterentwicklungen verschiedener Methoden sind aus­führlich in Ernst et al. (2000), Ref. [43]*, be­schrieben. Eine für Diskmembranen der Stäbchen­außensegmente etablierte Methode stellt der kinetische Lichtstreumonitor dar [44,45,46]. Die Größe dieser mit Rhodopsin gefüllten Membranpartikel erlaubt die Echtzeit-Messung der licht­induzierten Bindung von nicht-membran­gebundenem Trans­ducin an die Membran als Zunahme der Intensität des unter einem geeigneten Winkel gestreuten nahen Infrarotlicht­s (Bindungssignal; Abbildung 4, Ernst et al. (2000), Ref. [43]*). In Gegenwart von GTP hingegen führt die Lichtaktivierung des Rezeptors zur Akti­vierung des Transducins. Die damit verbundene Dissoziation der bereits im Dunkel­zustand membran­gebundenen Transducin Fraktion von der Disk­membran lässt sich durch eine entsprechender Abnahme der Lichtstreuintensität verfolgen (Disso­ziations­signal). Änderungen der Lichtstreuintensität korrelieren hier­bei mit der Änderung der Proteinmasse an der Oberfläche der Diskmembranen [46]. Um rekom­binantes Rhodopsin oder Rhodopsinmutanten mit diesen Methoden unter­suchen zu können, müssen die solubilisierten und gereinigten Proteine in Lipid­vesikel rekon­stituiert werden. Da in der Regel die Proteinmenge gering ist, mussten wir entspre­chende micro-scale Methoden für die Herstellung der Rho­dop­sin-Lipid­vesikel und die Charak­terisierung von Rhodopsinmutanten entwickeln [14,43]*.

Ähnlich wie beim Lichtstreumonitor können Massenänderungen an der Oberfläche von entsprechenden Biosensor-Chips mit Hilfe von Techniken, die auf evaneszenten Feldern an der Grenzfläche zweier optischer Medien beruhen, gemessen werden. Hierzu gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (surface plasmon resonance , SPR) Technik und die auf einem planaren Wellenleiter basierende Resonant Mirror Technik, die auf Änderungen des Brechungsindex (bzw. der Proteinmasse) im Bereich des evaneszenten Feldes reagieren. Dies ist z. B. der Fall, wenn ein Inter­[Seite 6↓] aktions­partner aus der umgebenden Lösung in den Bereich des evaneszenten Feldes diffundiert und an einen zweiten auf der Sensoroberfläche immobilisierten Inter­aktionspartner bindet [47,48] [43]*.

In Kollaboration mit Stephan Heyse, Christoph Bieri und Horst Vogel von der ETH Lausanne (Schweiz) hatten wir uns zum Ziel gesetzt, ein immobilisiertes, planares Rhodopsin-Lipid-Doppelmembransystem auf einer Gold­ober­fläche zu rekon­stitu­ieren und mittels SPR-Technik die Interaktion mit Transducin zu messen. Einen Überblick über verschiedene Modellmembransysteme auf Biosensoren geben Referenzen [48,49]. Wir haben uns für eine Festkörper-unterstützte Lipidmembran entschieden, die auf einem wenige Nanometer dicken Wasserfilm schwimmt und über hydrophile Verbindungsstücke geeigneter Länge an der Lipidkopfgruppe synthetischer Thio­lipide [50] auf der planaren Goldschicht des SPR-Sensors ver­ankert ist. Zudem sollte die Lipidmembran ein Streifenmuster im Mikrometer Maßstab aufweisen, bei dem Streifen mit fluiden Rhodopsin-Lipid­-Doppel­mem­branen durch einen zweiten Strei­fentyp mit verankerter Lipidmembran begrenzt werden. Beim zweiten Streifentyp wird eine kovalent gebundene Thiolipid-Monoschicht durch eine zweite Lipidschicht zu einer im Idealfall rhodopsinfreien Doppelmembran ergänzt (siehe Abbildung 1, Heyse et al. (1998), Ref. [51]*). Dies hat den Vorteil, dass diese rhodopsinfreien Lipidmembran-Streifen als Referenz­bereiche dienen können und 1‑dimensionale bildgebende SPR-Messungen möglich werden. Bei der Funktio­nalisierung der Goldoberfläche mit Thiolipiden wurde zur Ausbildung des Streifen­musters UV-Lithographie eingesetzt. Durch einen self-assembly Prozess der Phospho­lipide und des Rhodopsins aus einer Detergenslösung wurden dann die Festkörper-unterstützten Lipidmembranen auf der funktionalisierten Goldoberfläche erzeugt [51]*.

Es gelang uns ein Modellsystem zu schaffen, das demonstrierte, dass GPCRs tatsächlich auf einer festen Sensoroberfläche immobilisiert und Echtzeitmessungen der GPCR/Transducin Interaktion mittels SPR untersucht werden können [51]*. Rhodopsin wurde bevorzugt in Bereiche mit Phospholipid­-Doppelmembranen einge­baut und nur in sehr geringem Maß in Bereiche mit Thiolipidanker. Transducin zeigte eine Dunkelbindung an die Lipidmembran und war gleichmäßig über alle Bereiche der Festkörper-unterstützten Lipidmembran verteilt. Die ermittelte Affinität [Seite 7↓] war ähnlich der Affinität zu nativen Diskmembranen. Bei Lichtaktivierung des Rhodopsins konnte aufgrund der R*-Transducin Komplexbildung weiteres Trans­ducin an die Membran gebunden werden. Die Rhodopsinaktivierung in Gegen­wart von GTP führte wegen der G-Proteinaktivierung wie erwartet zu einer Disso­ziation des Transducins von der Membran. Da bei diesen Experimenten, vergleichbar den oben beschriebenen Lichtstreuexperimenten, Änderungen der Proteinmasse an der Lipid­membran stattfinden, wurden den Lichtstreumessungen analoge Bindungs- und Disso­ziations­signale erhalten.

Parallel zu den Arbeiten in Lausanne mit dem von Stephan Heyse als Eigenbau realisiertem SPR-Meßgerät ist es uns gelungen, vergleichbare Bindungssignale mit einem kommerziell erhältlichen Resonant Mirror Gerät, dem IAsys-System (Thermo Labsystems, Affinity Sensors Division, Cambridge, England), in Berlin zu messen. Hierzu wurden Biotin-modifizierte Lipide durch kurze Ultraschallbehandlung in Diskmembranen inkorporiert und benutzt, um die Diskmembranen über einen immo­bilisierten anti-Biotin Antikörper auf der Oberfläche des Biosensors zu ver­ankern. Es konnten zeitaufgelöste Bindungs- und Dissoziationssignale des Trans­ducins ge­messen werden und eine Rückbindung des Transducins an die Disk­membran nach vollständiger GTP-Hydrolyse verfolgt werden (Abbildung 7, Ernst et al. (2000), Ref. [43]*).

Mit Hilfe der Verankerungstechnik via Biotin ist es uns in einem nächsten Schritt gelungen, Rhodopsin mit einheitlicher Orientierung auf der SPR-Sensoroberfläche zu immobi­lisieren [52]*. Geminale Hydroxylgruppen in den Kohlenhydrat-Modi­fi­ka­tionen in der N-terminalen Region des Rhodopsins wurden mit Natrium­periodat oxidiert und an Biotin-Hydrazid gekoppelt. Der N-Terminus des Rhodopsins wurde so mit einem Biotin-Affinitätsanhängsel versehen und konnte über ein Streptavidin-Ver­bin­dungsstück an einer mit Biotin funktionalisierten Sensoroberfläche immo­bilisiert werden [53]. Gleichzeitig wurde zur Strukturierung der Sensor­oberfläche anstatt der UV-Lithographie eine Mikrokontakt-Stempeltechnik, sogenanntes micro­contact printing [54], eingesetzt (siehe Abbildung 6, (Ernst et al. (2000), Ref. [43]*). Das immobilisierte Rhodopsin zeigte nun das gewünschte Verhalten: i) ver­nachlässigbare Immobilisation von Rhodopsin in den als Referenzbereich dienenden Streifen, ii) einen starken Kontrast der lichtinduzierten Transducin-Disso­ziations­[Seite 8↓] signale in Proben- bzw. Referenzstreifen, und iii) die Rhodopsin­aktivität im Proben­bereich konnte durch den Lichtumsatz bzw. die Retinalmenge gesteuert werden. Die so erhaltene Dosis-Wirkungskurve lässt vermuten, dass diese Technik in Zukunft auch auf andere GPCRs angewendet werden kann und das Potenzial besitzt, als Chip-basierte Methode in der Wirkstoffsuche der pharma­zeutischen Industrie ein­gesetzt zu werden [53].

Vor kurzem konnte die Firma Biacore (Uppsala, Schweden), unterstützt durch Probenmaterial und Kenntnisse aus unserem Institut, erste Rhodopsin/Transducin Interaktionen in rekon­stituierten Lipid­mem­branen mit dem von Biacore hergestellten SPR-Gerät (Biacore-System) messen [55]. Ebenfalls wurden Messungen zur Inter­aktion zwischen Transducin und solubili­siertem Rhodopsin in Detergenslösung mit einem Biacore-System durch­geführt [56].

In einem weiteren Schritt konnten wir die Technik der Rhodopsin-Verankerung über den N-Terminus vereinfachen. Dazu exprimierten wir in COS-1 Zellen Rhodopsin­fusions­­proteine, die über eine N-terminale Biotinylierungssequenz verfügen. Durch Koexpression des Enzyms Biotin Protein Ligase konnte ein Großteil der Fusions­proteine posttranslational mit Biotin modifiziert werden. Diese Biotin­modifikation erlaubt die Reinigung des Rezeptors über monomeres Avidin und die Rezeptor-Immobilisierung auf der Sensoroberfläche von SPR oder Resonant Mirror Geräten und an­schließende funktionelle Rekonstitution des Rhodopsins in Lipid­membranen (Qun Liu, Klaus Peter Hofmann, Oliver Ernst, Manuskript in Vorbereitung). Die Expression als ortsspezifisch biotinylierter Rezeptor unterstützt die Charakterisierung von Rhodopsinmutanten, kann aber sehr wahrscheinlich auch auf andere GPCRs übertragen werden. Die Fusion der nativen N-terminalen Rhodopsinsequenz an olfaktorische GPCRs erlaubte die Generierung einer Expressionsbibliothek und die Untersuchung der Wechselwirkung olfaktorischer GPCRs mit verschiedenen Duft­stoffen [57]. Es ist deshalb anzunehmen, dass auch der mit der Biotiny­lierungs­sequenz modifizierte N-Terminus von Rhodopsin die Expression anderer GPCRs und deren Analyse mit Evaneszentfeld-Techniken ermöglicht.

[Seite 9↓] Arbeiten zu Abschnitt 2 Methodische Entwicklungen:

Ernst, O.P., Bieri, C., Vogel, H., & Hofmann, K.P. (1999) Intrinsic biophysical monitors of transducin activation: Fluorescence, UV/Vis spectroscopy, light scattering and evanescent field techniques. Meth. Enzymol. 315, 471-489.

Heyse, S., Ernst, O.P., Dienes, Z., Hofmann, K.P., & Vogel, H. (1998) Incorporation of rhodopsin in laterally structured supported membranes: Observation of transducin activation with spatially and time-resolved surface plasmon resonance. Biochemistry 37, 507-522.

Bieri, C., Ernst, O.P., Heyse, S., Hofmann, K.P., & Vogel, H. (1999) Micropatterned immobilization of a G protein-coupled receptor and direct detection of G protein activation. Nature Biotechnol. 17 , 1105-1108.


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28.06.2004