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3.  Aktive Konformation des Rhodopsins

Die Belichtung von Rhodopsin führt zu einer 11-cistrans Isomerisierung des Chromophors im Femtosekundenbereich. Zwei Drittel der durch das Photon auf­ge­nommenen Energie werden zunächst im Photoprodukt Bathorhodopsin gespeichert und dann sukzessiv durch thermische Relaxation abgegeben. Dabei durchläuft der Rezeptor verschiedene weitere Photoprodukte, die nach Millisekunden in ein Gleich­gewicht von Metarhodopsin Konformationen führt (siehe z. B. eigene Übersichts­artikel [20,21,22]*). Metarhodopsin I (Meta-I, λmax = 478 nm) steht mit seinem Folge­produkt Metarhodopsin II (Meta-II, λmax = 380 nm) im Gleichgewicht und kann spektroskopisch durch UV/vis und FTIR Spektroskopie unterschieden werden [20,23]*. Die Verschiebung des Absorptionsspektrums beruht auf einer De­pro­tonierung der Schiffbasenbindung zwischen Retinal und Lys-296 in Trans­mem­branhelix 7, die beim Übergang von Meta-I nach Meta-II erfolgt. Dadurch wird eine stabilisierende Salzbrücke zwischen dem Schiffbasenproton und dem Gegenion Glu-113 in Trans­membranhelix III aufgebrochen, und es resultiert eine Protonierung des Gegenions [58] (siehe hierzu Abbildung 3 des Übersichtsartikels Hofmann & Ernst (2001), Ref. [8]*, in der Einleitung). Durch eine anschließende Protonenaufnahme aus dem wässrigen Milieu in der cytoplasmatischen Domäne des Rhodopsins kommt es zu einer weiteren Konformationssänderung. Diese ist mit keiner Änderung des Absorp­tions­spektrums verbunden und führt zu zwei im Gleichgewicht stehenden Sub­konformationen des Meta-II, Meta-IIa und Meta-IIb [59]. Die Protonen­auf­nahme in Meta-II ist an Glu-134 gekoppelt [60,61], einem Aminosäurerest des in GPCRs hochkonservierten D(E)RY Motivs am cyto­plasma­tischen Ende der Trans­mem­­bran­helix III (Glu-134/Arg-135/Tyr-136 in Rho­dopsin) [62].

Aus zeitaufgelösten Absorptionsmessungen wurde geschlossen, dass Rhodopsin zur Ausbildung des Meta-II Zustandes neben dem klassischen Reaktionsweg [27,63] zu geringen Anteilen einen etwas anderen Reaktionsweg einschlagen kann [64,65]. Hierbei deprotoniert die Schiffbase noch vor Bildung des Meta-I Zustandes, im Meta-I Vorläuferprodukt, Lumirhodopsin, und gelangt auf einem Parallelweg über ein so genanntes Meta-I380 Produkt zum Meta-II Zustand. Dieser Reaktionsweg wird in Detergenslösung verstärkt beschritten [66]*. Die Solubilisierung des Rhodopsins [Seite 11↓] mit Detergens er­laubte es auch, die beiden von Arnis und Hofmann (1993) beschrie­benen Meta-II Isoformen, Meta-IIa und Meta-IIb, kinetisch zu unterscheiden [59]. Um die bekannten lichtinduzierten Protonierungs­änderungen des Rhodopsins, d. h. Depro­tonierung der Schiffbase und Protonen­aufnahme aus der Lösung, im solubi­lisierten Zustand zeitaufgelöst zu untersuchen, haben wir in Kollaboration mit dem Labor von Dave Kliger (University of California, Santa Cruz, USA) Blitz­licht­photo­lyse­messungen an gereinigtem Rho­dopsin in Gegen­­wart des Farbstoffes Brom­kresolrot durchgeführt. Durch Analyse der Daten mittels Singulär­wert­zerlegung und globaler exponentieller An­passung konnten Infor­ma­tionen zu den Spektren der einzelnen Intermediate und zu deren zeitlicher Entstehung erhalten werden. Die Ergebnisse konnten die früheren Beobachtungen der beiden Labore bestätigen und führten zu einem Reaktionsschema für die Meta-II Bildung in Detergenslösung, das neben dem Meta-I380 Produkt die beiden Meta-II Subformen beeinhaltet [66]*.

Erst mit der Meta-II Konformation ist die aktive Form des Rhodopsins erreicht, die mit dem Transducin interagiert und den Nukleotidaustausch katalysiert [67,68]. Es existiert experimentelle Evidenz, dass im nukleotidfreien Komplex mit Transducin die Meta-IIb Konformation vorliegt [61,69] und Glu-134 in diesem Komplex pro­to­niert ist [61]. Die konservierte ERY-Region und insbesondere die Protonierung von Glu-134 spielen eine Schlüsselrolle bei der Ausbildung des aktiven Rhodopsin­zu­standes. Zu einem analogen Schluss sind wir für den humanen Thrombin­rezeptor PAR1 (Protease-aktivierter Rezeptor 1) gekommen [70] [71]*. Diesen Rezeptor konnten wir in Zusammenarbeit mit dem Labor von Günter Schultz (Freie Universität Berlin) funktionell in Sf9 Insektenzellen exprimieren. Die Aktivierung des PAR1 kann einerseits durch proteolytische Spaltung des N-terminalen Bereichs von PAR1 mit der Serinprotease Thrombin oder andererseits durch Zugabe eines von diesem Bereich abgeleiteten Thrombin­rezeptor-aktivierenden Hexapeptids, dem Agonisten TRAP6 (SFLLRN-NH2 ), erfolgen. Der exprimierte und durch TRAP6 aktivierte Thrombin­rezeptor in den Insekten­zellmembranen war in der Lage den Nukleotid­austausch bzw. die GTPγ S-Aufnahme durch Transducin zu katalysieren. Eine Untersuchung der pH-Ab­hängigkeit der PAR1 katalysierten Trans­ducin­aktivierung zeigte, dass auch bei diesem Rezeptor, trotz des unter­schiedlichen Aktivierungs­mechanismus, die aktive Konformation wie beim Rho­dopsin durch die [Seite 12↓] Protonierung einer titrierbaren Gruppe (apparenter pKa von 6,4) bestimmt wird [71]*. Ein Kandidat für diese titrierbare Gruppe ist Asp-199, das Pendant zu Glu-134 in Rhodopsin. Analoge Protonierungsänderungen im D(E)RY Motiv bei der Rezep­toraktivierung wurden auch für den α1B -adrenergen Rezeptor vorgeschlagen [72]. Eine Regulation der Rezeptoraktivität durch Pro­tonierung, evtl. neben dem D(E)RY Motiv auch in anderen Regionen [73], scheint ein allgemeines Prinzip für die Rezeptor­aktivierung darzustellen [21]*. Die Metarhodopsin Zustände können hierbei als Analoge der GPCR Zustände niedriger und hoher Ligandaffinität aufgefasst werden, bei denen die aktive Rezeptorkonformation durch Protonierung bzw. G-Protein­bindung stabilisiert wird [21]*.

Die Protonierung von Glu-134 zur Stabilisierung der aktiven Rhodopsin-Kon­for­mation wird ebenfalls in Experimenten mit Rhodopsinpigmenten, die synthetische Retinalanaloga enthalten, deutlich [74]*. Rhodopsin unterscheidet sich von anderen GPCRs durch den bereits im Grundzustand gebunden Liganden. Dieser ist zudem durch eine kovalente Schiffbasenbindung in der Retinalbindungstasche fixiert. Dies hat für das Rhodopsin zwei entscheidende Vorteile: i) das 11-cis -Retinal inaktivert als inverser Agonist das Apoprotein Opsin und verhindert eine spontane Aktivierung des Rezeptors äußerst effektiv, d.h. es dauert daher (virtuell) tausende von Jahren, bis ein Rhodopsin­molekül in der Retina thermisch aktiviert wird. ii) Die Retinal-Protein Interaktionen bewirken eine Stabili­sierung des Grund­zustandes, die nur durch Energie-Zufuhr in Form von geeigneten Lichtquanten überwunden werden kann [32,33,34] [21]*. Dies geschieht mit einer sehr hohen Quantenausbeute von 67% [75] und erlaubt der Photorezeptorzelle auf einzelne Lichtquanten zu reagieren [76]. Durch die Lichtaktivierung ist es möglich, beim Rhodopsin die Aktivität gegenüber dem G-Protein um etwa 10 Größen­ordnungen zu steigern (siehe z. B. [8,21]*). Rhodopsin stellt also einen mole­kularen Schalter dar, im Gegensatz zu anderen GPCRs, die durch Liganden­bindung ihre Aktivität gegenüber dem G-Protein in wesentlich geringerem Umfang modu­lieren.

Retinalanaloga werden in der Rhodopsinforschung seit Jahrzehnten eingesetzt, um Informationen zu gewinnen über die Wechselwirkungen des Retinals mit Amino­säure­seitenketten in der Retinal­bindungs­tasche, den Einfluss der Modifikation auf [Seite 13↓] den Grund­zu­stand, und die Photoreaktion des Rhodopsins [77,78,79]. In einem Konzept zur Aktivierung des Rhodopsins werden sterische Interaktionen des Retinals mit der Proteinumgebung ange­nommen, die die photochemische Reaktion zum aktiven Zustand steuern [80,81], in Analogie zu einem Aktivierungskonzept für das senso­rische Rhodopsin I in Halobacterium halobium [80]. Eine hierfür wichtige Rolle scheint die Methylgruppe am Kohlenstoffatom in Position 9 der Retinal­polyenkette zu spielen, da Rhodopsinpigmente, denen diese 9-Methylgruppe fehlt, sogenanntes 9-demethyl-Rhodopsin (mit 9-demethyl-Retinal rekonstituiertes Rho­dopsin), nur eine geringe G-Proteinaktivierung aufweisen [82].

Wir konnten in Zusammenarbeit mit Wolfgang Gärtner und Andreas Ockenfels (Max-Planck-Institut Mülheim) zeigen, dass auch beim 9-demethyl-Rhodopsin nach Lichtaktivierung Zustände einge­nommen werden, die Meta-I und Meta-II ver­gleich­bar sind. Das Gleichgewicht zwischen den Meta-Zuständen ist jedoch auf­grund der Retinalmodifikation stark auf die inaktive Meta-I Seite verschoben, was die geringe Aktivität gegenüber dem G-Protein erklärt [74]*. Damit wurde auch für das Rho­dopsin gezeigt, dass wie bei anderen GPCRs, die agonistischen Eigen­schaften des Liganden durch Modifikation der chemischen Struktur beeinflusst werden können. Das Belichten des rhodopsingebundenen 9-demethyl-Retinals führt somit zur Bildung eines partiellen Agonisten in situ [74]*. Dieser Befund wurde von anderen durch Infra­rotspektroskopie bestätigt [83]. Neben der Auswirkung der Retinal­modifikation in den Meta-Zuständen ist ein Einfluss auf die frühen Photo­intermediate und deren Bildung wahrscheinlich [84,85,86]. Von besonderer Bedeutung war unsere Beo­bachtung, dass durch Erniedrigung des pH-Wertes das Meta-I / Meta-II Gleich­gewicht des 9-demethyl-Rhodopsins auf die Seite des aktiven Meta-II verschoben werden konnte. Zudem zeigte eine mit 9-demethyl-Retinal regenerierte Rhodop­sinmutante mit Glu→ Gln Substitution an Position 134 eine volle Meta-II Bildung [74]*. Diese Mutation, die quasi die Protonenaufnahme vorweg­nimmt, konnte auch die volle katalytische Aktivität bezüglich der G-Protein Aktivierung restaurieren.

Wir haben deshalb dem Retinal in den Meta Zuständen eine Gerüstfunktion bei der Adjustierung von Protonen-Akzeptor und -Donorgruppen zugeschrieben, die die [Seite 14↓] Protontransfer-Reaktionen bei den Meta-I → Meta-IIa und Meta-IIa → Meta-IIb Über­­gängen fördert und dadurch die Bildung der aktiven Konformation unterstützt [74]*.

In der Familie der Rhodopsin-ähnlichen GPCRs gibt es ein zweites konserviertes Motiv, das NPxxY(x)5,6 F Motiv. Es besteht aus Asn-302/Pro-303/xxx/xxx/Tyr-306 am cytosolischen Ende der Transmembranhelix VII und Phe-313 in der darauf­folgenden, parallel zur Membran verlaufenden, cytosolischen Helix 8 (siehe Ab­bildung 1, Fritze et al. (2003), Ref. [87]*). In der Kristallstruktur des Rhodopsins erkennt man eine hydrophobe Interaktion zwischen Tyr-306 und Phe-313 [32]. Verschiedene Untersuchungen inklusive eigener Mutationsstudien in Helix 8 [88]* legen nahe, dass bei Belichtung des Rhodopsins Konformationsänderungen in dieser Helix stattfinden [29,31,89,90,91,92,93].

In Zusammenarbeit mit dem Labor von Kris Palczewski (University of Washington, Seattle, USA) führten wir Experimente durch, um die Rolle dieses konservierten Motives bei der Rezeptoraktivierung zu verstehen. Dazu exprimierten wir Rhodop­sin­­mutanten, bei denen je ein konservierter Aminosäurerest dieses Motivs durch Alanin ersetzt war. Durch Regeneration mit 11-cis -Retinal und 9-demethyl-Retinal konnten wir den Einfluss verschieden starker Agonisten auf die Bildung der aktiven Rhodopsinkonformation untersuchen. UV-vis Spektroskopie erlaubte es, durch Mes­sung des Protonierungszustandes der Retinal-Schiffbase den Aktivierungs­zustand des Rezeptors im Bereich der Chromophorbindungstasche zu bestimmen. Durch Mes­sung der G-Proteinaktivierung wurden Informationen über den Aktivierungszustand der Interaktionsdomäne zum G-Protein erhalten.

Wir fanden, dass Alanin-Substitutionen des Tyr-306 oder Phe-313 die lichtinduzierte Deprotonierung der Retinalschiffbase, d. h. die Ausbildung einer aktiven Rezeptor­konformation im Bereich der Retinalbindungstasche fördert. Dies spiegelt sich je­doch nicht im Aktivierungszustand der cytoplasmatischen Rezeptoroberfläche wider, da diese Rhodopsinmutanten nur eine geringe G-Proteinaktivierung zeigten. Um zu überprüfen, ob die hydrophobe Interaktion zwischen den Seitenketten der Amino­säurereste 306 und 313 für die G-Protein Interaktion benötigt wird, wurden diese Reste durch Cystein ausgetauscht und die Möglichkeit geschaffen, durch Ausbilden [Seite 15↓] einer Disulfidbrücke diese Seitenketten kovalent zu verbinden. Zusammen mit den Unter­­suchungen der Doppel­cystein­mutante schlossen wir, dass die hydrophobe Inter­aktion zwischen Tyr-306 und Phe-313 in der Meta-II Konformation aufgehoben ist und beide Aminosäurereste zur Ausbildung einer Bindungsstelle für das Transducin beitragen. Durch Analyse der Ala-Substitutionen in Kombination mit der Glu-134 → Gln Substitution und Regeneration mit 9-demethyl-Retinal konnten wir Infor­ma­tionen über die Kopplung zwischen Retinal-Bindungsstelle und der cyto­plasma­ti­schen Oberfläche erhalten. Nur im Falle der Ala-Substitutionen von Asn-302 oder Pro-303 konnte die durch 9-demethyl-Retinal verminderte Aktivität durch die Glu-134 → Gln Substitution in gewohntem Maße restauriert werden.

Entsprechend unserem Modell [87]* dient das NPxxY(x)5,6 F Motiv der Sta­bili­sierung des Grund­zustands. Asn-302 und Pro-303 kommt eine Rolle bei der Über­tragung der lichtinduzierten Änderung der Re­tinal­kon­formation, dem Aktivierungs­signal, von der Reti­nal­­bindungstasche zur cytoplasmatischen Helix 8 zu. Das Auf­brechen der hydrophoben Interaktion zwischen Tyr-306 und Phe-313 stellt dabei einen Teil der für die Interaktion mit dem Transducin nötigen strukturellen Änderungen dar. Mit unserer Arbeit wurden zwei weitere Module, die NP und die Y(x)5,6 F Sub­motive, identifiziert, die zusammen mit dem D(E)RY Motiv und der Retinal­bindungsstelle das Retinal in die Lage versetzen, die Sieben-Trans­membran­helix-Struktur zu funktionalisieren [87]*. Aufgrund der hohen Konserviertheit des NPxxY(x)5,6 F Motivs [62], ist anzunehmen, dass sich die am Rhodopsin gewonnenen Erkenntnisse auf den größten Teil der Rhodopsin-ähnlichen GPCRs übertragen lassen.

[Seite 16↓] Arbeiten zu Abschnitt 3 Aktive Konformation des Rezeptors:

Szundi, I., Mah, T.L., Lewis, J.W., Jäger, S., Ernst, O.P. , Hofmann, K.P., & Kliger, D.S. (1998) Proton transfer reactions linked to rhodopsin activation. Biochemistry 37, 14237-14244.

Seibert, C., Harteneck, C., Ernst, O.P., Schultz, G., & Hofmann, K.P. (1999) Activation of the rod G-protein Gt by the thrombin receptor (PAR 1) expressed in Sf9 cells. Eur. J. Biochem. 266, 911-916.

Meyer, C.K., Böhme, M., Ockenfels, A., Gärtner, W., Hofmann, K.P., & Ernst, O.P. (2000) Signaling states of rhodopsin: Retinal provides a scaffold for activating proton transfer switches. J. Biol. Chem. 275, 19713-19718.

Fritze, O., Filipek, S., Kuksa, V., Palczewski, K., Hofmann, K.P., & Ernst, O.P. Role of the Conserved NPXXY(X) 5,6 F Motif in the Rhodopsin Ground State and During Activation. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 100 , 2290-2295.


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28.06.2004