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4.  Rezeptor / G-Protein Interface

Zu den lichtinduzierten Konformationsänderungen der cytoplasmatischen Rhodop­sin­oberfläche, dem Interface zum G-Protein, gehören die im vorigen Abschnitt be­schriebenen Änderungen in den D(E)RY und NPxxY(x)5,6 F Regionen. Aus umfang­reichen ESR-Studien der Arbeitsgruppen Hubbell und Khorana, in denen ESR-Sonden durch ortsgerichtete Cys Mutagenese (site-directed spin labeling ) [30] an allen Stellen der cytoplasmatischen Oberfläche eingebracht wurden, weiß man, dass sich der cytoplasmatische Teil der sechsten Transmembranhelix im solubilisierten Rhodopsin nach Lichtaktivierung aus dem Sieben-Helix-Bündel heraus­bewegt [40,94]. Neben dieser großen Helixbewegung über 6-8Å gibt es noch kleinere Be­wegungen der cytoplasmatischen Enden der Transmembran­helices II und VII [29]. Wann die dominante Bewegung der Transmembranhelix VI erfolgt, beim Übergang von Meta-I → Meta-IIa oder Meta-IIa → Meta-IIb, ist nicht bekannt und Gegen­stand gemeinsamer Untersuchungen mit dem Labor von Wayne Hubbell (University of California, Los Angeles, USA). Diese Konformations­änderungen ermöglichen dann die Interaktion des Transducins mit den bekannten Bindungs­stellen am Rhodopsin, der zweiten und dritten cytoplasmatischen Schleife und der cyto­plasma­tischen Helix 8 (siehe Abbildung 2, Hofmann & Ernst (2001), Ref. [8]*, in der Einleitung und Refs. [95,96,97] [88]*).

Als Bindungsstellen am G-Protein wurden die C- und N-terminalen Bereiche der Gtα Unter­einheit [98,99,100,101,102] und der farnesylierte C-terminale Bereich der Gγ Unter­einheit identifiziert [103]. Untersuchungen am α2 -adrenergen Rezeptor lassen ver­muten, dass auch der C-terminale Bereich der Gβ Untereinheit mit dem Rho­dopsin interagiert [104]. Eine gegenseitige Zuordnung der Bindungsstellen an Rhodopsin und Trans­ducin wurde erst in den letzten Jahren begonnen und liefert noch kein genaues Bild der Interaktion im Komplex aus aktiviertem Rhodopsin und Transducin [99,100,105,106] [88]*.

Die Beteiligung der cytoplasmatischen Helix 8 des Rhodopsins (früher als vierte cytoplasmatische Schleife bezeichnet) bei der Interaktion mit Transducin wurde in der Literatur kontrovers diskutiert (siehe Ref. [105]). Um die Rolle dieser cyto­[Seite 18↓] plasmatischen Helix zu klären, haben wir in Zusammenarbeit mit dem Labor von Tom Sakmar (Rockefeller University, New York, USA) und Peter Henklein (Institut für Biochemie, Charité, Humboldt Universität Berlin) Rhodopsin­mutanten unter­sucht, bei denen Teile dieser Helix gegen Sequenzen aus dem β2 -adrenergen Rezeptor ausgetauscht wurden [88]*. Wir haben hierzu eine neue Methode ent­wickelt, um die Bindung von Transducin und synthetischen Peptiden, die von den C-Termini der Gtα und der farnesylierten Gγ Untereinheiten abgeleitet waren, zu erforschen. Diese Methode beruht auf der Photolyse von Rhodopsin im Meta-II Zustand [69]. Wird Meta-II mit blauem Licht belichtet, bilden sich mit unter­schiedlicher Kinetik zwei Photoprodukte aus, P470 und P500, deren Absorptions­maxima gegenüber Meta-II rotverschoben sind. Das langsamer gebildete Produkt P500 (Entstehung im Millisekundenbereich) hat ein Absorptionsspektrum, das dem Rhodopsingrundzustand ähnelt, stellt jedoch ein eigenes Photoprodukt mit proto­nierter Schiffbase und Retinal in der all-trans Konformation dar [107].

Wir konnten zeigen, dass es möglich ist, die Entstehung dieses Photoproduktes durch die Bindung von Transducin oder den C-terminalen Gtα und Gγ Peptiden konzen­trations­abhängig zu unterdrücken [88,108]*. Damit war eine Methode entwickelt, die spezifisch die Rezeptor-G-Protein-Interaktion im Komplex aus aktiviertem Rhodop­sin und Transducin bzw. Transducinfragmenten prüft. Unsere Unter­su­chungen iden­tifizierten eine Tripeptidsequenz (Asn-310/Lys-311/Gln-312) im N-terminalen Be­reich der cyto­plasma­tischen Helix 8 als entscheidend für die Inter­aktion mit Trans­ducin, während der C-terminale Bereich der Helix nicht für die Interaktion wichtig ist. Die Aminosäurereste 310-312 liegen im NPxxY(x)5,6 F Motiv zwischen Tyr-306 und Phe-313, die über ihre hydrophoben Seitenketten inter­agieren. Circular­di­chro­ismus Studien aus dem Labor Sakmar an synthetischen Peptiden, deren Sequenzen von der cytoplasmatischen Helix 8 abgeleitet waren, zeigten, dass die identifizierte Tripeptidsequenz (AS 310-312) wichtig ist für die Induktion der α -helicalen Kon­formation der cyto­plasma­tischen Helix 8 [92]. Dies steht in Einklang mit unseren Untersuchungen zum NPxxY(x)5,6 F Motiv (siehe vorher­gehender Abschnitt), die einen Mechanismus zur Konformationsänderung bzw. Aktivierung dieser Region aufzeigen.


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Darüberhinaus haben unsere Studien gezeigt, dass diese Region sowohl an der Interaktion der C-terminalen Bereiche von Gtα als auch Gγ beteiligt ist, entweder durch direkte Bindung oder über allosterische Regulation. Dies ist besonders interessant vor dem Hintergrund, dass die letzten in der Transducin-Kristallstruktur noch aufgelösten Amino­säurereste der Gtα und Gγ C-Termini, Asn-343 bei Gtα (350 Aminosäuren) und Glu-66 bei Gγ (71 Aminosäuren) über 42Å voneinander entfernt sind. Um diese Diskrepanz zu erklären, gibt es verschiedene Möglichkeiten, die sich nicht gegen­seitig ausschließen müssen: i) sowohl Transducin als auch Rezeptor durchlaufen relativ große Konformationsänderungen bei der Ausbildung des R*-Transducin Komplexes, ii) das Rhodopsin bindet als Rezeptordimer, iii) die C-Termini des Transducins binden nicht gleichzeitig an R*. In der Literatur gibt es Evidenz für Homo- und Heterodimerisierung von GPCRs [109,110]. Für den inaktiven Dunkel-Grundzustand des Rhodopsins wurden vor kurzem sogar oligomere Struk­turen aus Reihen von Rhodopsindimeren beschrieben [111].

Um den Prozess der Nukleotidaustauschkatalyse zu verstehen und Fragen der Stoichiometrie zwischen Rhodopsin und Transducin im R*-Transducin Komplex zu klären, wäre eine Kristallstruktur sehr wünschenswert. Eine solche Moment­auf­nahme eines bestimmten Zustandes innerhalb des Nukleotidaustausch-Prozesses kann jedoch nur wenig zum Ablauf dieser katalytischen Interaktion aussagen. Wir haben begonnen diesen dynamischen Prozess auf molekularer Ebene zu untersuchen und konnten dazu in Zusammenarbeit mit Oleg Kisselev (Saint Louis University, St. Louis, Missouri, USA) ein mechanistisches Modell angeben [108]*. Hierzu haben wir synthetische C-terminale Peptide der Gtα und Gγ Untereinheiten des Trans­ducins mit verschiedenen spektros­ko­pischen Methoden untersucht, sowohl in Form direkter Interaktion mit R* mittels Blitzlicht­photolyse als auch in Form von Kompetitions­experimenten zur katalytischen Aktivierung des Transducins durch R*. Nach unseren Ergebnissen stabilisieren beide Peptide den Meta-II Zustand und kompetieren gegen Transducin um die Bindung an R*. Das farnesylierte, von der Gγ Untereinheit abgeleitete Peptid kann jedoch nicht das Gβγ Dimere in seiner Funktion beim Nukleotidaustausch in der Gtα Untereinheit ersetzen. Dies ist in Einklang mit neuen Unter­suchungen, denen zufolge für das Gβγ Dimere eine Hebelfunktion beim [Seite 20↓] Öffnen der Nukleotidbindungs­tasche in Gtα vorgeschlagen wird [112]. Die beiden Peptide zeigen deutliche Unterschiede in ihrem Kompetitionsverhalten und ihrer pH-Abhängigkeit bei der Transducinaktivierung. Wir haben aus unseren Resultaten einen sequentiellen Mechanismus für die Bindung der C-terminalen Bereiche von Gtα und Gγ an R* geschlossen und dafür ein „sequential fit“ Modell vorgeschlagen [108]*. Hiernach führt die Bindung zwischen zwei zusammengehörenden Inter­aktionsdomänen an Transducin und Rhodopsin zu einer Konformationsänderung an Rezeptor und/oder G-Protein, die dann die Interaktion des zweiten Domänen­paares erlaubt.

Wir arbeiten zur Zeit daran, dieses Modell zu verfeinern, um die Reihenfolge der Interaktion der C-terminalen Bereiche von Gtα und Gγ mit R* zu klären und mit der GDP-Freisetzung bzw. GTP-Aufnahme zu korrelieren (Rolf Herrmann, Petra Henklein, Peter Henk­lein, Klaus Peter Hofmann, Oliver Ernst, Manuskript in Vorbereitung).

[Seite 21↓] Arbeiten zu Abschnitt 4 Rezeptor / G-Protein Interface:

Ernst, O.P., Meyer, C.K., Marin, E.P., Henklein, P., Fu, W.-Y., Sakmar, T.P., & Hofmann, K.P. (2000) Mutation of the fourth cytoplasmic loop of rhodopsin affects binding of transducin and peptides derived from the carboxyl-terminal sequences of transducin α and γ subunits. J. Biol. Chem. 275, 1937-1943.

Kisselev, O.G., Meyer, C.K., Heck, M., Ernst, O.P., & Hofmann, K.P. (1999) Signal transfer from rhodopsin to the G-protein: evidence for a sequential fit mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 96, 4898-4903.

Weitere Publikationen:

Ernst, O.P., Hofmann K.P., & Sakmar, T.P. (1995) Characterization of rhodopsin mutants that bind transducin but fail to induce GTP nucleotide uptake - classification of mutant pigments by fluorescence, nucleotide release, and flash-induced light scattering assays. J. Biol. Chem. 270, 10580-10586.

Fitter, J., Ernst, O.P., Hauß, T., Lechner, R.E., Hofmann, K.P., & Dencher, N.A. (1998) Molecular motions and hydration of purple membranes and disk membranes studied by neutron scattering. Eur. Biophys. J. 27, 638-645.

Fitter, J., Verclas, S.A.W., Lechner, R.E., Büldt, G., Ernst, O.P., Hofmann, K.P., & Dencher, N.A. (1999) Bacteriorhodopsin and rhodopsin studied by incoherent neutron scattering: dynamical properties of ground states and light activated intermediates. Physica B 266, 35-40.

Pulvermüller, A., Gießl, A., Heck, M., Wottrich, R., Schmitt, A., Ernst, O.P., Choe, H.-W., Hofmann, K.P., & Wolfrum, U. (2001) Calcium dependent assembly of centrin/G-protein complex in photoreceptor cells. Mol. Cell. Biol. 22, 2194-2203.


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28.06.2004