1. EINLEITUNG

1.1. Ursachen der Schädigung des unreifen Gehirns

Wesentliche Gründe für neurologische Folgeerkrankungen im unreifen Gehirn sind perinataler Sauerstoffmangel, Hyperoxie, Hirnblutungen, Trauma, Infektionen, metabolische Störungen, Intoxikationen und Fehlbildungen. Im Folgenden werden fokussiert einige wichtige Ursachen einer frühkindlichen Hirnschädigung dargestellt. Diese sind auch Gegenstand der vorliegenden klinischen und experimentellen Arbeiten.

1.1.1. Hypoxie, Hyperoxie, Inflammation

Die perinatale Hirnschädigung trägt wesentlich zu frühkindlicher Morbidität und Mortalität bei [Volpe 2001]. Allein in Deutschland erleiden etwa 1000 Kinder im Jahr eine gravierende Schädigung des Nervensystems, die aus einem perinatal einwirkenden Insult resultiert [Berger 2002]. Bei Reifgeborenen sind perinatale Asphyxien, beim Frühgeborenen die Schädigung der weißen Substanz, durch eine Vielzahl von Ursachen, wesentliche Faktoren eines neurologischen Folgeschadens [Kirpalani 2001].

Die Empfindlichkeit gegenüber einer Hypoxie hängt sehr stark von der intrazerebralen Durchblutung und dem Energiemetabolismus ab. Nach einer perinatalen Asphyxie kommt es im unreifen Gehirn zu einer ganzen Kaskade von neurotoxischen Ereignissen: Zusammenbrechen des Energiehaushaltes, Freisetzung von Glutamat, Aktivierung des N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptors, Einstrom von Calcium-Ionen und Formierung freier Radikale wie NO. Dies resultiert in mitochondrialer Dysfunktion, Schädigung von Membranlipiden und Proteinen und führt schließlich zum Tod der Zelle.

Die neuropathologische Manifestation der Schädigung hängt ganz entscheidend vom Entwicklungsstatus des Gehirns, aber auch von der Art der Schädigung und der [Seite 11↓] stattgefundenen Interventionen ab [Vexler 2001]. Die wichtigsten neuropathologischen Korrelate einer hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie (HIE) sind selektive neuronale Nekrosen, der Status marmoratus, parasagittale Verletzungen, die periventrikuläre Leukomalazie (PVL) und multifokale ischämische Läsionen. Beim Reifgeborenen beobachtet man typischerweise die Schädigung der Basalganglien, den Status marmoratus, während bei Frühgeborenen die PVL, aber auch die diffuse multifokale Schädigung, deren Ursache nicht abschließend geklärt ist, dominiert. Das klinische Bild ist sehr variabel und reicht von motorischen und kognitiven Entwicklungsverzögerungen bis zum Vollbild einer Zerebralparese [Volpe 2001].

Frühgeborene repräsentieren 5% aller Geburten, aber 50% aller Kinder mit frühkindlichen Hirnschädigungen [Berkowitz 1993]. Die Überlebensraten dieser Kinder sind ständig gestiegen, nicht jedoch die Chance ohne Behinderung zu überleben. Die Gruppe der sehr kleinen Frühgeborenen unter 1000g Geburtsgewicht hat ein besonders hohes Risiko für die Entwicklung motorischer und insbesondere kognitiver Defizite [Grunau 2002, Tommiska 2003].

Neuere Studien zeigen, dass bei Frühgeborenen möglicherweise neben einer Hypoxie auch andere Mechanismen für die Entstehung dieser Schäden verantwortlich sind. Das Frühgeborene ist im Verlauf seiner frühen extrauterinen Entwicklung aufgrund der Unreife der Lunge und des Hirnstamms wechselnden Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt. Hypoxische Situationen, aber auch die relative postnatale Hyperoxie (verglichen mit dem intrauterinen Sauerstoffpartialdruck von 25 mmHg) spielen eine wesentliche Rolle in der Genese der Hirnschädigung [Taglialatela 2000, Felderhoff-Müser 2002, Höhn 2003]. Hypoxische Insulte haben bei Frühgeborenen oft eine Hirnblutung zur Folge, die die Prognose dieser Kinder entscheidend verschlechtert [Volpe 2001].

In den letzten Jahren werden inflammatorische Prozesse fernab vom kindlichen Gehirn als Auslöser für eine zerebrale Schädigung diskutiert. Auslöser wie eine mütterliche Chorioamnionitis [Yoon 1997; Gomez 1997; Dammann 1999, 2002; Berger 2002] oder [Seite 12↓] auch kindliche inflammatorische Erkrankungen, wie z.B. eine nekrotisierende Enterokolitis sind mit einer schlechten neurologischen Prognose assoziiert [Sonntag 1999]. Ein weiterer möglicher Hinweis auf eine inflammatorische Genese dieser Schädigungen ist die Tatsache, dass pränatal erhöhte Serumspiegel von inflammatorischen Zytokinen mit einem hohen Risiko der Entwicklung einer Zerebralparese vergesellschaftet sind [Nelson 1998]. In postnatal abgenommenen Blutproben konnte dies jedoch nicht bestätigt werden, wie eine neuere Studie derselben Gruppe gezeigt hat [Nelson 2003].

Untersuchungen am Tiermodell haben gezeigt, dass Inflammationen nicht nur den, durch einen hypoxisch-ischämischen Insult ausgelösten Schaden potenzieren, sondern auch direkt schädigend auf das Gehirn einwirken können [Eklind 2001, Dommergues 2000]. Dies wird möglicherweise durch kardiovaskuläre Effekte von Endotoxinen vermittelt, was zur zerebralen Hypoperfusion mit daraus resultierender Gewebehypoxie führt [Berger 2002]. Als Folge werden neben fokalen insbesondere diffuse Hirnschädigungen vermutet, über deren zugrundeliegenden Mechanismen nur wenig bekannt ist. Leider ist es bisher nicht gelungen, ein Tiermodell der spezifischen Schädigung des Frühgeborenengehirns zu etablieren, da es sich wahrscheinlich um ein multifaktorielles Geschehen handelt [Hagberg 2002].

Im der klinischen Praxis wird angenommen, dass sich gerade diese subtilen, multifokalen Läsionen bei Frühgeborenen in den gängigen Ultraschalluntersuchungen nicht darstellen [Maalouf 2001, Hüppi 2002]. Neuere Untersuchungsmodalitäten wie die Magnetresonanz-tomographie (MRT) zeigen diffuse Veränderungen der Signalintensität der weißen Substanz und eine reduzierte Entwicklung des zerebralen Kortex [Battin 1997, Maalouf 1999, Ajayi-Obe 2000]. An ehemaligen Frühgeborenen durchgeführte Untersuchungen beschreiben eine Reduktion den Hirnvolumens und eine Korrelation mit schlechter psychomotorischer Entwicklung dieser Kinder [Inder 1999; Peterson 2000, 2003]. Die [Seite 13↓] pathophysiologischen Korrelate dieser Läsionen sind gerade Gegenstand intensiver Forschungen.

1.1.2. Intrazerebrale Blutungen

Intrazerebrale Blutungen können bei Gerinnungsstörungen, nach Trauma, Hypoxie, Malformationen und assoziiert mit Infektionen im unreifen Gehirn auftreten. Periventrikuläre und/oder intraventrikuläre Blutungen sind typische Läsionen des Frühgeborenengehirns. Meist haben sie ihren Ursprung im Gefäßbett des periventrikulären Keimlagers, einer Hirnregion, die beim Reifgeborenen nicht mehr vorhanden ist [Volpe 2001]. Die Gefäße dieser Region sind sehr fragil und können Fluktuationen im zerebralen Blutfluss oft nicht standhalten [Milligan 1980]. Auch werden Blutungen durch andere Faktoren, wie Koagulationsstörungen oder Thrombozytenaggregationsstörungen verstärkt [Amato 1988]. Kürzlich wurde ein Zusammenhang zwischen einer Chorioamnionitis, der Erhöhung pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1ß, IL-6, IL-8) im Nabelschnurblut und dem Auftreten von Hirnblutungen beschrieben [Tauscher 2003]. Mögliche Konsequenzen einer Hirnblutung sind die Zerstörung des Keimlagers, ein hämorrhagischer Parenchyminfarkt, die Entwicklung eines Hydrozephalus und eine periventrikuläre Leukomalazie.

1.1.3. Hydrozephalus

Hydrozephalus ist eine pathologische Erweiterung der zerebralen Ventrikel, die aus einer gestörten Liquorzirkulation resultiert. Bei Kindern ist die Ätiologie des Hydrozephalus vielfältig. Beim Frühgeborenen tritt ein shuntpflichtiger Hydrozephlus meist nach einer intrazerebralen Blutung auf und ist der wichtigste prognostische Faktor für eine schlechte psychomotorische Entwicklung. Als weitere Ursachen für den kindlichen Hydrozephalus kommen Infektionen, Fehlbildungen (Arnold Chiari Malformation, Dandy Walker Malformation, Aquäduktstenose etc.), Traumen oder Liquorzirkulationsstörungen [Seite 14↓] ungeklärter Genese in Frage [Volpe 2001]. Als Resultate dieser Störungen vermutet man die Entstehung einer Art chronischen Gewebehypoxie, die unter anderem zu einer axonalen Schädigung führen kann. Da es nur wenige experimentelle Modelle gibt, sind die dem Hydrozephalus zugrundeliegenden Pathomechanismen nur unzureichend geklärt [del Bigio 1998]. Zudem fehlen objektive klinische Parameter, um die oft diffuse klinische Symptomatik bei Shuntdysfunktion näher einzuordnen.

1.1.4. Trauma

Die traumatische Hirnschädigung trägt in Industrieländern entscheidend zur gesellschaftlichen Morbidität und Mortalität bei [Goldstein 1990, Sosin 1995, Thurman 1999] und ist ein wesentlicher Grund für Tod und neurologische Residualsyndrome in der Kindheit. Als Ursachen für mechanische Hirnverletzungen bei Neugeborenen und Säuglingen kommen perinatale Traumen im Rahmen von Geburtsverletzungen, oft in Verbindung mit einer Asphyxie, und Kindesmißhandlungen in Frage [Volpe 2001]. Bei Kleinkindern und jungen Schulkindern stehen Unfälle, insbesondere im Straßenverkehr, an erster Stelle.

Im Gegensatz zum Trauma des Erwachsenen sind die dem kindlichen Hirntrauma zugrundeliegenden Pathomechanismen noch weitgehend ungeklärt. Die Annahme, dass die Pathophysiologie von Hirntraumen bei Kindern identisch mit denen der Erwachsenen ist, ist nicht korrekt. Klinische Studien haben gezeigt, dass Kinder unter 4 Jahren die schlechteste neurologische Prognose aufweisen [Mahoney 1983, Koskiniemi 1995, Adelson 1998]. Unterschiede in den Umständen wie es zum Trauma kommt, sind sicher nur eine Begründung für die erhöhte Vulnerabilität des juvenilen Gehirns [Kraus 1987, James 1999]. Obwohl diese Kinder die größte Gruppe der Hirnverletzten repräsentieren, haben sich bisher nur wenige Forschergruppen diesem Thema zugewandt [Adelson 1998].


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1.2. Mechanismen der Schädigung des unreifen Gehirns

Kinder, deren Gehirn während seiner Entwicklung geschädigt wurde, leiden ihr ganzes Leben unter den oft dramatischen Konsequenzen. Obwohl die klinischen und sozioökonomischen Folgen gravierend sind, ist die Entwicklung effektiver neuroprotektiver Therapiestrategien bisher noch in weiter Ferne.

Die Ursachen einer frühkindlichen Hirnschädigung, aber auch die Mechanismen, unterscheiden sich deutlich vom adulten Gehirn [Towfighi 1997, Back 2002]. Auch sind die klinischen Möglichkeiten der diagnostischen Darstellung von Pathologien bedingt durch die begrenzte Belastbarkeit der kleinen Patienten limitiert.

Verschiedene experimentelle Modelle sind in den letzten Jahren zur Erforschung der kindlichen Hypoxie [Rice 1981, Taylor 1999, Hagberg 2002], der Meningitis [Leib 1998, Reiss 2002] und des Hirntraumas etabliert worden [Ikonomidou 1996, Pohl 1999]. Es konnte gezeigt werden, dass bei einer Verletzung des unreifen Gehirns zwischen der akuten Schädigung, die sofort auftritt, und einem sekundären oder verzögerten Zelltod unterschieden werden muss. Dieser tritt Stunden bis Tage nach dem Insult auf und bestimmt letztlich die Langzeitprognose der neurologischen Entwicklung [Mehmet 1994, Taylor 1999, Ishimaru 1999].

Die Freisetzung und Akkumulation von potentiell schädigenden Faktoren wie Calcium und exzitotoxische Aminosäuren, z.B. Glutamat und Aspartat, mit konsekutiver Aktivierung ihrer spezifischen Rezeptoren werden als Initiatoren des sekundären Zelluntergangs angesehen [Faden 1989]. Auch können Insulte die elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionenkanälen verändern, die mit den Rezeptoren von exzitotoxischen Aminosäuren verbunden sind.

Als Resultat treten mindestens zwei Formen von Zelltod auf, der schnelle exzitotoxische und der langsame apoptotische oder programmierte neuronale Zelltod [Faden 1989, Conti [Seite 16↓] 1998], die morphologisch unterschieden werden können [Olney 1971, Wyllie 1980, Ishimaru 1999]. Im unreifen Gehirn ist der langsame apoptotische Zelltod nach einem Insult morphologisch identisch mit physiologisch auftretender Apoptose. Insbesondere während der intrauterinen Entwicklung wird im Gehirn Apoptose als Regulationsmechanismus für überschüssig angelegte Neurone regelhaft beobachtet [Cheema 1999, Dikranian 2001]. Zudem ist die Menge der apoptotischen Zellschädigung regional unterschiedlich und direkt proportional zum physiologischen Zelltod in einer bestimmten Hirnregion. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass es sich bei schädigungsbedingter Apoptose im unreifen Gehirn um eine Art Überaktivierung von physiologischen Apoptosemechanismen handeln könnte [Bittigau 1998, 1999; Pohl 1999].

Was sind die Gründe dafür, dass ein bestimmter Insult mit minimal schädigendem Potential im erwachsenen Gehirn im unreifen Gehirn massiven, disseminierten apoptotischen Zelltod auslöst? Eine Erklärung dafür könnte sein, dass es altersspezifische Unterschiede im Grad der Myelinisierung und im Wassergehalt des Gehirns gibt. Zudem liegt das Maximum der entwicklungsabhängigen Vulnerabilität in etwa in der Phase des stärksten Hirnwachstums, dem sogenannten „brain growth spurt“, der sich beim Menschen vom letzten Trimester der Schwangerschaft bis ins zweite Lebensjahr ausdehnt [Dobbing 1979]. Apoptotischer Zelltod während dieser extrem vulnerablen Phase des Hirnwachstums könnte ein wesentlicher Faktor sein, um neurologische Folgeschäden nach Insulten auf das unreife Gehirn zu erklären [Mehmet 1994; Mazarakis 1997; Adelson 1998; Taylor 1999; Bittigau 1999, 2002].

Im Gegensatz zum adulten Gehirn werden Untersuchungen zu apoptosespezifischen Signaltransduktionsmechanismen und apoptoseregulierenden Faktoren bei der Schädigung des unreifen Gehirns derzeit nur von wenigen Forschergruppen durchgeführt.

Das Verständnis der Pathophysiologie von Zelluntergängen im sich entwickelnden Gehirn kann möglicherweise zur Konzeption sinnvoller präventiver und neuroprotektiver Therapieansätze beitragen. Dabei sind Therapieansätze, die das Ziel haben, die [Seite 17↓] apoptotische Kaskade zu unterbrechen, vielversprechend, müssen aber im unreifen Gehirn, wo Apoptose wesentlich zur physiologischen Hirnentwicklung beiträgt [Dikranian 2001], sorgfältig getestet werden.

1.2.1.  Apoptotische Signaltransduktion

In den letzten Jahren sind die unterschiedlichen Mechanismen des Zelltodes zum Gegenstand intensiver Forschungen geworden. Die akute exzitotoxische Zelldegeneration ist durch rapides Anschwellen von Dentriten, Zellkörpern und intrazytoplasmatischen Organellen, Kernfragmentation und Lyse der Zelle gekennzeichnet.

Neben der klassischen Form des akuten Zelltodes beschrieben Wyllie und Kerr 1972 erstmals an nicht-neuronalen Zellen einen physiologischen, programmierten Zelltod, den sie Apoptose nannten [Kerr 1972]. Der Begriff apoptosis stammt aus dem Griechischen und beschreibt das Herabfallen der Blätter im Herbst. Bei der Apoptose handelt es sich um eine verzögerte Form des Zelltodes, die physiologisch in der Entwicklung aber auch Stunden oder manchmal sogar Tage und Wochen nach einem Insult auftreten kann [Hamrick 2002]. Die Zelle schrumpft langsam bei zunächst noch intakter Zellintegrität. Die Zellkontakte lösen sich, das Chromatin kondensiert entlang der Kernmembran, der Kern schrumpft (Karyopyknose) und die DNA wird fragmentiert. Die Zellorganellen lösen sich auf, beim Zerfall der Zelle entstehen Fragmente, sogenannte Apoptosekörperchen (“apoptotic bodies“), die anschließend phagozytiert werden, ohne dass es dabei zu einer wesentlichen inflammatorischen Reaktion kommt (Abb. 1), [Kerr 1972].


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Abb. 1 : Schematische Darstellung der Morphologie des, von Wyllie und Kerr erstmals beschriebenen, apoptotischen Zelluntergangs aus: Brit J Cancer (1972) 26, S. 242.


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Ein elementares Problem bei der histologischen Detektion apoptotischer Zellen im Vergleich zu anderen Zelltodmechanismen ist der Mangel an zuverlässigen Labormethoden. Die Darstellung der DNA Fragmentation mittels TUNEL-Technik (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling) wird angewendet, gilt jedoch nicht in jedem Fall als zuverlässig [Dikranian 2001]. Außerdem bestehen auch Übergangsformen zwischen Nekrose und Apoptose, die die Detektion erschweren [Friedlander 2003]. Als sicherer Marker wird die Elektronenmikroskopie eingesetzt. Auch in neuronalem Gewebe lassen sich so elektronenmikroskopisch frühe von späten Stadien der Apoptose unterscheiden [Dikranian 2001], (Abb.2).

Abb. 2 : Elektronenmikroskopische Darstellung des Nukleus von apoptotischen Neuronen:
Bild A zeigt die charakteristische Morphologie eines frühen apoptotischen Stadiums mit intakter nukleärer Membran und kondensierten “Chromatinbällen“. Ein spätes Stadium der Apoptose ist in Bild B dargestellt: Mit fortschreitender Neurodegeneration entrundet sich die nukleäre Membran und kondensiertes Chromatin stülpt sich ins Zytoplasma vor (unterer Bildrand).


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Apoptose ist die häufigste Form von Zelltod im Organismus. So können bestimmte Zellen des Immunsystems ihre Anzahl über Apoptose selbst regulieren, wie z.B.
T-Lymphozyten, die mit speziellen “Todessystemen“ Selbstmord begehen oder auch andere T-Lymphozyten töten. Dies ist von entscheidender Bedeutung für das Gleichgewicht des Immunsystems [Krammer 1994].

Aber auch in anderen Organsystemen, wie im Gehirn, ist Apoptose ein wichtiger Mechanismus, um die Gewebshomöostase unter pathologischen, aber auch physiologischen Bedingungen aufrecht zu erhalten. Große Fortschritte sind in der Aufklärung der molekularen Mechanismen der Apoptosesignalgebung gemacht worden. Diese sind von Bedeutung für die Erklärung der Pathogenese von Erkrankungen und für die Entwicklung rationaler Therapieansätze [Friedlander 2003].

Allen oben genannten Schädigungsmechanismen gemeinsam ist die Tatsache, dass Apoptose der vorwiegende Modus des Zelltodes im sich entwickelnden Gehirn ist [Mazarakis 1997, Taylor 1999, Hamrick 2002]. Ob im unreifen Gehirn dieselben Mechanismen während des programmierten Zelltodes ablaufen wie im adulten System ist momentan Gegenstand intensiver Forschungen.

An multiplen experimentellen Modellen hat sich gezeigt, dass im wesentlichen zwei zentrale Stoffwechselwege zur Apoptose führen: Ein Rezeptor-vermittelter, extrinsischer und ein mitochondrialer, intrinsischer Weg, wie in Abbildung 3 schematisch dargestellt (Abb.3). Beiden ist gemeinsam, dass sie in der Aktivierung von Caspasen, wichtigen Schlüsselenzymen auf dem Weg der Exekution der Zelle, resultieren. Caspasen sind Cysteinproteasen und Homologe des menschlichen Interleukin-1ß-Converting-Enzyme (ICE/Caspase 1), [Thornberry 1998].


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Abb. 3 : Schematische Darstellung der Aktivierung der apoptotischen Stoffwechselkaskade:
Beim extrinsischen Weg kommt es durch einen schädigenden Insult zur Bindung der Todesrezeptoren an ihren spezifischen Liganden. Nach Rezeptortrimerisation erfolgt die Formierung einer Todesdomäne mit konsekutiver Aktivierung von Caspasen. Der intrinsische Weg ist durch eine direkte Schädigung der Mitochondrien durch ein definiertes Agens charakterisiert. Es kommt zur Änderung des mitochondrialen Membranpotentials und zur konsekutiven Ausschüttung von Cytochrom C ins Zytoplasma. Dies führt wiederum zur Caspasenaktivierung. Wichtige Regulatoren des Prozesses sind die Mitglieder der Bcl-2 Familie, denen die Stabilisation der mitochondrialen Membran zugeschrieben wird. Wachstumsfaktoren, sowie deren Regulatoren kommen Apoptose-hemmende Funktionen zu.

Ein wesentliches Merkmal der extrinsischen Stoffwechselkaskade ist das Binden von Liganden an spezifische Zelloberflächenrezeptoren, von denen Fas (CD95/Apo-1) eine prominente Rolle einnimmt. Mit Fas wurde 1989 erstmals ein Zelloberflächenrezeptor [Seite 22↓] beschrieben, der nach Bindung an einen spezifischen Antikörper in der Lage ist, Apoptose auszulösen [Trauth 1989, Nagata 1995, Krammer 1999].

Fas gehört neben dem Apo-2/TRAIL-Komplex zur Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Rezeptorfamilie und ist ein 40-kDa Typ-II-Transmembranprotein. Nach Bindung an seinen spezifischen Liganden erfolgt die Trimerisation des Rezeptors mit Bildung einer Todesdomäne, der sogenannten “death domain“ und eines “death inducing signalling complex“ (DISC), der wiederum durch Adaptermoleküle und Enzyme die Durchführung des apoptotischen Programmes vermittelt (Abb. 3, Abb. 4). Eine wesentliche Rolle spielen dabei die Caspasen, die als intrazelluläre Schaltstellen fungieren. Im Fall der Fas-induzierten Apoptose gilt Caspase 8 als Schlüsselenzym, das wiederum sogenannte Effektorcaspasen, die für die Exekution der Zelle verantwortlich sind, rekrutiert [Krammer 2000, Peter 2003].

Das Fas System ist insbesondere bei inflammatorischen Effektorzellen gut untersucht. Dort fungiert Fas neben dem TNF-alpha Rezeptor als ein wesentlicher Zelloberflächenrezeptor, der die lokale Elimination von Entzündungszellen ohne erneute Freisetzung von Entzündungsmediatoren erlaubt und so die Lebensdauer dieser Zellen reguliert [Nagata 1995, Krammer 1999]. Außerdem wird Fas von vielen anderen Geweben exprimiert und spielt bei immunologisch vermittelten pathologischen Prozessen des Gehirns wie Multiple Sklerose und Morbus Alzheimer eine Rolle [Dowling 1996, Nishimura 1997, Zipp 1999]. Bei hypoxisch-ischämischen Insulten ließ sich im Tierexperiment Fas mRNA nachweisen [Matsuyama 1995].

Die im Rahmen der normalen Hirnentwicklung ablaufende apoptotische Neuro-degeneration ist ebenfalls Fas-getriggert [Cheema 1999].

Der intrinsische Stoffwechselweg führt unter anderem zur Änderung des mitochondrialen Membranpotentials (68 ), welches zusammen mit Proteinen der Bcl-2 Familie die mitochondriale Wand kontrolliert [Kroemer 1997a, 1997b; Peter 1998; Kayahara 1998]. [Seite 23↓] Cytochrom C wird ins Zytoplasma ausgeschüttet und reguliert dann die Produktion pro-apoptotischer Peptide, die die für Apoptose charakteristische DNA-Fragmentierung vermitteln [Peter 1998, Susin 1999]. Cytochrom C ist in der Lage einen Komplex mit Apoptotic-Protease-Activating-Factor (Apaf-1) und Caspase 9 zu bilden [Susin 1999, Yuan 2000]. Dies wiederum führt zur proteolytischen Aktivierung von Caspase 3. Caspase 3 ist eine Schlüsselprotease, die in der Lage ist, vitale Proteine zu schneiden und Endonukleasen zu aktivieren. Sie nimmt eine ganz entscheidende Rolle bei der Exekution des apoptotischen Programmes ein [Thornberry 1998, Porter 1999].

Auch Apoptose ohne Einbeziehung der Mitochondrien [Jouvet 2001] und Caspasen-unabhängige Formen sind kürzlich beschrieben worden [Braun 2001, Murahashi 2003]. Welche Faktoren der apoptotischen Kaskade aktiviert werden, hängt ganz entscheidend von der Art des Schädigungsmodells ab.

Neuere Arbeiten beschreiben protektive Maßnahmen, die sich auf die Unterbrechung der apoptotischen Kaskade geschädigter ZNS-Zellen fokussieren. Interessante Ansätze ergeben sich durch den Einsatz von Caspaseninhibitoren, die auch auf neuronale Apoptose hemmend einwirken können. Untersuchungen an einem Tiermodell der Meningitis des adulten Kaninchens konnten ihren neuroprotektiven Effekt klar demonstrieren [Braun 1999]. Im unreifen Gehirn sind diese Substanzen bisher noch nicht hinreichend getestet.

Innerhalb und außerhalb der eigentlichen apoptotischen Signaltransduktionskaskade gibt es eine ganze Reihe von Apoptose-regulierenden Elementen. Dazu gehören zum Beispiel die Mitglieder der Bcl-2 Familie, lösliche Formen von Zelloberflächenrezeptoren und endogene neurotrophe Wachstumsfaktoren [Cheng 1994, Kroemer 1997, Yuan 2000].

Lösliches Fas (Soluble Fas - sFas) entsteht durch differentielles Spleißen mit Deletion eines Exons, welches die transmembranöse Domaine von Fas codiert. sFas blockiert Zelltod durch Inhibition der Interaktion zwischen Fas und Fas Ligand auf der [Seite 24↓] Zelloberfläche und dient so als Apoptose-regulierendes Protein (Abb.4), [Cheng 1994, Hughes 1995].

Im Gegensatz dazu entsteht löslicher Fas Ligand (soluble Fas Ligand - sFasL) durch proteolytisches Schneiden der Membran-gebundenen Form und wirkt verstärkend auf pro-apoptotische Prozesse (Abb.4), [Tanaka 1995, 1998]. Die Regulation der sFas and sFasL Synthese ist derzeit Gegenstand intensiver Forschungen in Zellkulturen und tierexperimentellen Modellen. Im klinischen Umfeld kommt sFas und sFasL eine Rolle als biochemischer Marker zu.

Abb. 4 : Schematische Darstellung Fas-induzierter Apoptose: Durch einen Insult kommt es zur Bindung des Zelloberflächenrezeptors Fas an Fas Ligand. Es erfolgt die Trimerisation des Rezeptors mit Bildung der “death domain“ und eines “death inducing signaling complex“ (DISC), der wiederum die Durchführung des apoptotischen Programmes vermittelt. sFas inhibiert die Interaktion zwischen Fas und Fas Ligand auf der Zelloberfläche. Im Gegensatz dazu wirkt sFasL verstärkend auf pro-apoptotische Prozesse.

Auch Neurotrophine können regulatorisch auf die apoptotische Signalgebung einwirken. Sie gehören zu einer Familie von Wachstumsfaktoren, die notwendig für die Hirnentwicklung aber auch für die Funktion des zentralen Nervensystems sind (Abb.3). [Seite 25↓] Obwohl sie ursprünglich als neuronale Überlebenssignale identifiziert worden sind, werden ihnen inzwischen multiple biologische Funktionen wie Proliferation, synaptische Modulation und axonaler Transport zugeschrieben. Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass Neurotrophinvorstufen je nach Aktivierungsgrad pro- und anti-apoptotische Prozesse über Trk oder p75 Rezeptoren triggern können [Chao 2002]. Auch daraus ergeben sich möglicherweise in Zukunft neuroprotektive Ansätze.

1.3. Modellsysteme zur Untersuchung der Schädigung des unreifen Gehirns

Es gibt eine Vielzahl von experimentellen und klinischen Ansätzen zur Untersuchung der Schädigung des sich entwickelnden Gehirns. Aus ethischen Gründen sind die Möglichkeiten der Beantwortung klinischer Fragestellungen bei Kindern sehr limitiert. Deshalb werden im wesentlichen experimentelle Modelle zur Untersuchung eingesetzt. Im Folgenden soll auf gängige Tier- und Zellkulturmodelle und die für diese Arbeit relevanten klinischen Untersuchungsansätze näher eingegangen werden.

1.3.1. Tiermodelle

Viele tierexperimentell arbeitende Gruppen, die sich mit der Schädigung des sich entwickelnden Gehirns beschäftigen, setzen 7 bis 14 Tage alte Ratten (P7 – P14) für ihre Untersuchungen ein [Hagberg 2002]. Dobbing und Sands haben sich in ihren Studien ausführlich mit dem Hirnwachstum verschiedener Species (Ratte, Schwein, Affe, Mensch) beschäftigt. Das Rattengehirn befindet sich in diesem Entwicklungsstadium in der Phase des rapiden Wachstums und ist sehr vulnerabel gegenüber äußeren Schädigungen [Dobbing 1979]. Ratten haben den Vorteil, dass sie unkompliziert zu züchten und billig sind. Damit ist gewährleistet, dass Daten an einer größeren Menge von Versuchstieren validiert werden können. Dies ist insbesondere zur Testung neuroprotektiver Substanzen [Seite 26↓] von großer Bedeutung. Es lassen sich außerdem primäre kortikale, zerebelläre und hippocampale Zellkulturen der einzelnen, im ZNS residenten, Zellen anzüchten und mittels gängiger Techniken analysieren. Zudem gibt es eine ganze Reihe von in der Ratte angezüchteten, kommerziell erhältlichen Zellinien. Beispielsweise bietet die Phäochromozytom-Zellinie PC12 nach Differenzierung mit dem Wachstumsfaktor Nerve Growth Factor (NGF) interessante Möglichkeiten, um das Verhalten von Neuronen unterschiedlichen Reifegrades in Hypoxie zu untersuchen [Charlier 2002].

Insbesondere zu in vivo Untersuchungen der HIE liegen für das, von Rice und Vannucci beschriebene Modell, eine Reihe von Studien vor [Rice 1981]. Auch unsere Versuche zu dem Thema wurden an diesem Modell durchgeführt. Zur Untersuchung der Mechanismen der traumatischen Schädigung eignet sich ebenfalls das Rattenmodell. Die histologischen Veränderungen nach Trauma wurden im adulten [Feeney 1981] wie auch im infantilen Gehirn ausführlich [Ikonomidou 1996; Bittigau 1998, 1999; Felderhoff-Müser 2000] charakterisiert. Über die Beteiligung der apoptotischen Signaltransduktion im Traumamodell des unreifen Rattenhirns war bisher wenig bekannt.

1.3.2. Klinische Modelle

Um histologische Untersuchungen an humanem Gewebe durchführen zu können, muss in der Regel auf Archivmaterial von verstorbenen Kindern zurückgegriffen werden. Das hat den Nachteil, dass nicht jeder Fall die gleiche Fixationsdauer aufweist, wie es bei der histologischen Aufarbeitung von Tierexperimenten der Fall ist. Dies kann sich unter Umständen negativ auf die Bandbereite der Möglichkeiten der immunhistochemischen Techniken auswirken [van Landeghem 2002]. Zudem gibt es selten tiefgefrorenes, frisches Hirnmaterial von in der Routine sektionierten Patienten, was den Einsatz spezieller Techniken wie RT-PCR, in-situ Hybridisierung und Western Blotting limitiert.

Als Modellsystem der hypoxisch-ischämischen Hirnschädigung eignet sich Archivmaterial [Seite 27↓] von Fällen mit pontosubikulärer Neuronennekrose (PSN), [Brück 1996]. Die PSN ist eine neuropathologische Diagnose und definiert eine Hirnschädigung, die zwischen der 30. Schwangerschaftswoche und dem 2. Lebensmonat auftritt [Friede 1972]. Während die makroskopische Inspektion unauffällig ist, zeigt sich mikroskopisch akuter neuronaler Zelltod, charakteristischerweise in den ventralen Anteilen der pontinen Kerngebiete und im Subiculum des Hippocampus. Die Pathogenese ist noch weitgehend unbekannt: Asphyktische Ereignisse, angeborene Herzfehler, schwere pulmonale Erkrankungen, Hypoxie, Hyperoxie, periventrikuläre Leukomalazien sowie intraventrikuläre Blutungen sind mit der PSN assoziiert [Skullerud 1988, Mito 1993]. Die morphologischen Veränderungen wurden zunächst als akute neuronale Nekrose verbunden mit dem Auftreten von Karyorrhexis und Zellschrumpfung beschrieben. Die von Friede beschriebene Morphologie der akuten Neuronennekrose ist der später beschriebenen Apoptose sehr ähnlich. Brück und Mitarbeiter wiesen 1996 bei der PSN die, für Apoptose typische Kernfragmentation nach [Brück 1996]. Diese neuropathologische Entität wurde für die folgenden Untersuchungen der apoptotischen Signalgebung bei der hypoxisch-ischämischen Schädigung des unreifen menschlichen Gehirns herangezogen.

Liquor- oder auch Blutproben zu sammeln und aufzuarbeiten hat sich in der Vergangenheit als minimal invasive Methode etabliert um bei pathologischen Prozessen Marker von prädiktivem oder diagnostischem Wert zu erhalten. Im zentralen Nervensystem hat man bisher multiple Faktoren der neuronalen Degeneration, Astrogliose, Aktivierung des Immunsystems und neurotrophe Faktoren untersucht, um den Pathomechanismus neurodegenerativer Erkrankungen aber auch akuter Verletzungen näher charakterisieren zu können [Zipp 1999, Galasko 2001, Zandbergen 2001]. Bei Kindern liegen dazu nur wenige Untersuchungen vor [Heyes 1995].


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