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5.  Molekulargenetische Einzelzell-Analyse der variablen Anteile der schweren und der leichten Kette von Immunglobulingenen in kutanen B-Lymphozyten

5.1.  Primär kutane B-Zell-Lymphome sind Keimzentrumszell-Lymphome (Gellrich et al., J Invest Dermatol 2001, Gellrich et al, J Invest Dermatol, 1997)

5.1.1. Hintergründe und Fragestellungen

Primär kutane B-Zell-Lymphome sind durch das Fehlen einer extrakutanen Manifestation über lange Zeit gekennzeichnet. (Burg G, Bull Cancer, 1977; Kerl H, Hautarzt, 1979). Obwohl die primär kutanen B-Zell-Lymphome histologisch große Ähnlichkeiten mit den nodalen follikulären Lymphomen aufweisen, unterscheiden sie sich jedoch im Verlauf, welcher bei den primär kutanen B-Zell-Lymphomen indolent bzw. intermediär aggressiv ist (Willemze R, Blood, 1997).

Innerhalb der primär kutanen B-Zell-Lymphome gibt es jedoch prognostisch heterogene Gruppen: 1. Primär kutane B-Zell-Lymphome am Stamm und Kopf, welche zu ca. 50% histologisch den Keimzentrumszell-Lymphomen und zu 50% den Marginalzonen-Lymphomen / Immunozytomen zuzuordnen sind und eine 5-Jahres-Überlebensrate von 97% haben. 2. GCBCLL an der unteren Extremität mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 57%. (Vermeer MH, Arch Dermatol, 1996; Geelen FA, J Clin Oncol, 1998; Bekkenk MW, J Clin Oncol, 1999).

Entsprechend der physiologischen B-Zell-Entwicklung unterliegt der B-Zell-Rezeptor Veränderungen. So finden sich in naiven B-Zellen nahezu unmutierte, keimbahnidentische Immunoglobulin-Gene (Hummel M, Blood, 1994). Im Keimzentrum können die B-Zellen mit Hilfe der antigenpräsentierenden Zellen und mit Hilfe der T-Zellen proliferieren. Dabei führt die Erkennung von Antigen durch den B-Zell-Rezeptor zu einer Wachstumsstimulation der B-Zelle. B-Lymphozyten mit einer hohen Affinität zum Antigen werden selektiert (Lindhout E, Immunol Today, 1997). Eine optimale Anpassung ist durch das Auftreten von somatischen Mutationen gewährleistet, wobei die R-Mutationen zum Aminosäureaustausch führen. (Berek C, Cell, 1991; Jacob J, Nature, 1991). Der Mutationsstatus des Immunglobulins einer B-Zelle bzw. ihrer klonalen Vertreter gibt demzufolge Auskunft über ihre Entwicklungsstufe. In Anlehnung an dieses Prinzip können nun auch B-Zell-Lymphomzellen beurteilt werden. (Abbildung 9)

Haben alle Tumor-B-Zellen keimbahnidentische VH- und VL- Gene, entsprechen sie Prä-Keimzentrumszell-B-Zell-Lymphomen; zeigen sie mutierte VH-, VL-Gene und intraklonal verschiedene Mutationen, entsprechen sie Keimzentrumszell-Lymphomen; sind die Tumor-B-Zellen mutiert, jedoch ohne das Vorliegen von intraklonalen Diversitäten, handelt es sich um Post-Keimzentrumszell-Lymphome (Abschnitte 3.1. und 4.2.3.) (Abbildung 9).

Für die primär kutanen B-Zell-Lymphome war nicht bekannt gewesen, in welche Kategorie der molekulargenetischen Klassifikation entsprechend den B-Zell-Rezeptor-Genen diese Entitäten einzuorden sind. Es ergaben sich folgende Fragen:

5.1.2. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse

Es wurden 8 Patienten mit primär kutanen B-Zell-Lymphom untersucht. Bei 4 Patienten waren die Hautveränderungen an Kopf und Stamm lokalisiert und entsprachen histologisch einem Keimzentrumszell-Lymphom (FCCL) (Gruppe I). 4 Patienten zeigten histologisch ein großzelliges B-Zell-Lymphom (GBCLL), welches sich in allen Fällen am Bein manifestierte (Gruppe II). Immunphänotypisch wurde in allen Präparaten das CD20 Molekül, bcl-2- nur bei den Patienten mit GBCLL exprimiert. Die leichte Kette des Immunglobulins (kappa oder lambda) war in 7/8 Fällen immunhistochemisch nachweisbar. Alle Patienten der Gruppe 1 wiesen zwar rezidivierende Hautveränderungen auf, waren jedoch 5 Jahre nach Diagnosestellung noch am Leben. In der Gruppe II verstarben 2/4 Patienten innerhalb von 1,5 Jahren.

Zur Mikromanipulation und Einzelzell-PCR wurden die histologischen Schnitte mit einem anti-CD20-Antikörper markiert. Lediglich in Patient GG wurde ein anti-kappa-Antikörper zur Markierung verwendet. Der Methodik von Abschnitt 4 folgend, wurden insgesamt 532 Einzelzellen detektiert und anschießend die DNA in der PCR mit Primern für VH und Vκ bzw. Vλ amplifiziert.

Bei den Patienten AZL und WS konnte kein Amplifikat für die schwere Kette des Immunglobulins amplifiziert werden. Für die leichte Kette dieser beiden Patienten erhielten wir ein PCR-Produkt.

Es ist davon auszugehen, daß die Primer aufgrund von Mutationen nicht an die schweren Ketten binden konnten. Dieses Phänomen konnte auch in anderen Experimenten nachgewiesen werden (Golembowski S, Immunobiology, 2000; Child FJ, Br J Dermatol, 2001). Daß nur eine Kette, entweder die schwere Kette oder die leichte Kette, erfolgreich rearrangiert wurde ist eher unwahrscheinlich, jedoch in diesen Experimenten nicht vollständig auszuschließen. Die Effizienz der Experimente war unterschiedlich: In 25-50% der isolierten B-Zellen wurde die schwere Kette und in 9 - 44% die leichte Kette des Immunglobulingens nachgewiesen. In keinem Fall wurde ein biallelisches Rearrangement gefunden.

Zusätzlich wurden bei 3 Patienten (UK, LB, IL) die Keimbahngene der in der Tumorzelle verwendeten VH-Gene mittels PCR detektiert, um einen allelen Polymorphismus auszuschließen (Gellrich et al., J Invest Dermatol, 2001).

Um eine Aussage zur Transkription der Immunglobulingene in der Tumorzelle treffen zu können, erfolgte die RNA-Isolation aus kryokonserviertem Gewebe der Patienten UK und LB. Für die PCR wurden die VH -spezifischen und kettenspezifische Primer für den Cµ-, Cγ- oder Cδ-Isotyp verwendet (Gellrich et al., J Invest Dermatol, 2001).

Nach Reinigung aller gewonnenen PCR-Produkte erfolgte die Sequenzierung mit den 5’ -spezifischen Primern. Ergaben die Elektropherogramme der Sequenzierung keine eindeutigen Ergebnisse, wurde die Sequenzierung mit dem 3’-Primer wiederholt und durch anschließendes Alignment (Vergleich) beurteilt (ABI Sequence navigator, Applied Biosystem, Weiterstadt).


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Schwerpunkt dieser Arbeit war es, das Repertoire der verwendeten Immunglobulingene und deren Mutationsmuster zu erfassen.

Analyse des IgH-Gen-Rearrangements

In den Tumorzellen wurden VH-Gene aus 5 verschiedenen VH-Familien, nicht jedoch aus den VH-Familien 2 und 7 nachgewiesen. 2x konnte ein Gen der VH3-Familie gefunden werden. 4/6 Rearrangements enthielten ein JH4-Gen, 1/6 JH5b, 1/6 JH3a. In 5 Fällen konnte ein D-Gen identifiziert werden. Bei Patient IL konnte kein Immunglobulingen DH zugeordnet werden. Die N-Regionen zwischen den Genen VHD und DJH waren an beiden Verbindungsstellen zu finden. (Abbildung 11) (Tabelle V)

Analyse des IgL-Gen- Rearrangements

Bei 5 Patienten enthielten die B-Lymphomzellen ein VκJκ-Rearrangement, wobei in 4/5 Fällen das Gen IGVK3-20*1 verwendet wurde (Lefranc, Immunol Today, 1997; Barbie, Immungenet, 1998). Bei 2 Patienten wurde ein VλJλ-Rearrangement des Leichtkettengens in der Tumorzelle nachgewiesen (Williams SC, J Mol Biol, 1996). In 5/8 Patienten konnte die Gene der schweren und der leichten Kette gleichzeitig amplifiziert werden (Abbildung 12) (Tabelle VI).

Mutationsanalyse

Alle detektierten Gene der Tumorzellen enthielten somatische Punktmutationen verglichen mit den äquivalenten Keimbahngenen. Von 3 Patienten wurden die individuellen Keimbahngene der genutzten VH-Gene über Klonierung dargestellt und mit den somatischen Mutationen in der Tumorzelle verglichen (Abbildungen 11,12).

Die Mutationsrate betrug 9.2 und 16,3% für die schwere Kette und 5.4 und 15,5% für die leichte Kette. Die Mutationsrate wird kalkuliert als die Ratio von Nukleinsäureaustauschen pro rearrangierten V-Gen. Es wurde kein Unterschied zwischen den Entitäten GBCLL Gruppe I) und FCCL (Gruppe II) gefunden. R-Mutationen, als deren Folge ein Aminosäureaustausch stattfindet, waren über die gesamte Länge der VH- bzw. VL-Gene verteilt, wobei eine leichte Dominanz in den CDR’s gegenüber den FR’s nachzuweisen war (Abbildungen 11,12).

Ein Aminosäureaustausch (S-N) zeigte sich bei mehreren Patienten in der CDR1 (UKVH5, ILVH3, VMVH3 Position 31), der CDR2 und im FR3 der schweren Kette bzw. in der CDR1, der CDR2 und im FR3 der leichten Ketten (Abbildungen 11,12).

Die kalkulierte Ratio der beobachteten R/S Mutationen verglichen mit dem erwarteten Wert der nicht selektierten zufällig mutierten V-Keimbahngene wurden nach Chang und Casali, 1994 anhand der dominierenden Gene der schweren und der leichten Ketten der Tumor-B-Zellen berechnet (Abschnitt 4.2.4.). Die kalkulierte Ratio war in 2/3 Genen der schweren Kette und in 3/3 Genen der leichten Kette für die CDR’s etwas mehr erhöht als erwartet. Die FR’s waren in 5/6 Fällen weniger von R–Mutationen betroffen als statistisch erwartet. Die FR’s der leichten Ketten zeigten eine sehr niedrige R/S-Ratio bei den Patienten mit FCCL von Kopf und Stamm (Gruppe I) und bei 2/3 Fällen eine erhöhte R/S-Ratio bei den GBCLL (Gruppe II). Zusammengefasst spricht die R/S-Ratio für einen antigengetriebenen Prozeß in den Tumor-B-Zellen aller Patienten mit geringeren R/S- Mutationen in den FR und erhöhten R/S-Mutationen in den CDR’s. Die Verteilung der Mutationen ist in beiden histologischen und klinischen Entitäten vergleichbar.


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Bei 2 Patienten (UK, LB) konnte aus der mRNA/cDNA ein VHDJHC-Transkript gewonnen werden: Bei beiden Patienten wurde ein klonspezifisches Cµ-Transkript für das Gen der schweren Kette nachgewiesen. Ferner wurde eine schwaches Produkt für das Cδ-Transkript bei Patient LB amplifiziert, welches allerdings aus technischen Gründen nicht sequenziert worden ist.

Bei 6/8 Patienten fanden wir innerhalb der Tumor-B-Zellen (Subklone) V-Gene der schweren oder der leichten Kette, die dem Tumorklon entsprachen, jedoch einzelne zusätzliche oder fehlende Punktmutationen gegenüber dem dominierenden Klon aufwiesen. Dieses Phänomen war bei beiden Patientengruppen vorhanden. Dabei konnte es sich um S-Mutationen, aber auch um R-Mutationen handeln, welche zum Aminosäureaustausch führten, z.B. Patient VM: VMVH3a R-Q ohne Aminosäureaustausch und VMVH3b von R-Q zu R-H Aminosäureaustausch an Position 50 (CDR 2) (Abbildungen 11, 12).

5.1.3. Diskussion

Die Mutationsanalyse von Immunoglobulingenen aus Tumormaterial kann schwierig sein, wenn das Gesamtmaterial einer Biopsie verwendet wird. Dabei können die Tumorzellen unterrepräsentiert sein und geringe Unterschiede in den Mutationsmustern nicht erfaßt werden. Um eine genaue Analyse dieser Gene durchführen zu können, wurden 4 Patienten mit einem Keimzentrumszell- Lymphom am Kopf und Stamm und 4 Patienten mit einem großzelligen B-Zell-Lymphom am Bein untersucht. Die Mikromanipulation und Einzelzell-PCR (Küppers R, Handbook of Experimental Immunology, 1997; Gellrich S, J Invest Dermatol,1997) stellen dabei die Methoden der Wahl dar, da individuelle Gene einer einzelnen Zelle untersucht werden können.

Die bei 6/8 Patienten detektierten Tumor-VH-Gene zeigten keine besonders bevorzugte Nutzung einer bestimmten VH-Gen-Familie durch die Tumorzelle, ähnlich den Ergebnissen in nodalen Lymphomen (Bahler DW, Blood, 1991; Rosenquist R, Eur J Haematol, 1999). Bemerkenswert ist jedoch das Vorkommen von 2 Genen, welche bei der B-CLL eine besondere Rolle spielen: VH1-69-1 und VH3-7 Möglicherweise sind diese Gene für das Auftreten in Tumorzellen prädisponiert (Bahler DW, Blood, 1998). Die leichten Ketten der Immunglobuline rearrangierten in 4/7 Fällen die Nutzung der Vκ3-20*1-Familie. Aufgrund der geringen Fallzahlen kann hier keine Statistik durchgeführt werden. Obwohl die Verwendung von Vκ3-Genen in physiologischen B-Zellen häufig vorkommt: 14% in IgM+ B-Zellen, (Foster SJ, J Clin Invest, 1997; Cox JP, Eur J Immunol, 1994; Feeney AJ, J Immunol, 1997), ist jedoch die überpräsentierte Nutzung dieses Gens in den B-Zell-Tumoren bemerkenswert. ( Lefranc MP, Nucleic Acids Res, 1999; Lefranc MP Immunol Today, 1997; Barbie V, Exp Clin Immunogenet,1998). Ob sich dieses Phänomen des häufigen Auftretens bestimmter Gene in den Tumorzellen eine pathogenetische Relevanz hat oder ob es sich um ein zufälliges Auftreten handelt ist derzeit ungeklärt. Möglicherweise sind die Gene für Mutationsprozesse besonders empfindlich.


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Abbildung 11: Aminosäuren der schweren Ketten der tumorindividuellen Gene, obere Reihe Patienteninitialen, zweite Reihe Keimbahngene, folgende Reihen einzelzellindividuelle Sequenzen des dominierenden Klons und der Subklone, obere Box Patientengruppe I (FCCL), untere Box Patientengruppe II (GBCLL), R-Mutationen grau unterlegt, D-Gene unterstrichen


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Abbildung 12: Aminosäuren der leichten Ketten der tumorindividuellen Gene, obere Reihe Patienteninitialen, zweite Reihe Keimbahngene, folgende Reihen einzelzellindividuelle Sequenzen des dominierenden Klons und der Subklone, obere Box Patientengruppe I (FCCL), untere Box Patientengruppe II (GBCLL), R-Mutationen grau unterlegt


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TabelleVI: Anzahl und Keimbahnzuordnung der Tumor-Klone und -Subklone der untersuchten Patienten

Patient

Anzahl der analysierten Zellen

Klonales IgH-Gen-Rearrangment

(VHDJH)

Anzahl der klonalen IgH-Gen-Rearrangments

Klonale IgL-Gen- Rearrangments

(VLJL)

Anzahl der klonalen IgL-Gen-Rearrangements1

Anzahl der Zellen mit IgH- und IgL-Genen

 

 

UK

129

IGHV5-51UK—D6-13—JH5b

19 (UKVH5A)

13 (UKVH5B)

IGKV3-20*1—JK2

6 (UKVK3A)

5 (UKVK3B)

4

WS

100

-

-

IGKV3-20*1—JK2

(WSVK3A)

5 (WSVK3B)

(WSVK3C)

4 (WSVK3D)

-

LB

126

IGHV4-59*3—D7-27—JH4

44 (LBVH4A)

1 (LBVH4B)

1 (LBVH4C)

IGLV3-21*2—JL2/JL3

(LBVL3A)

(LBVL3B)

(LBVL3C)

3 (LBVL3D)

1 (LBVL3E)

24

GG

18

IGHV1-69*1—D3-22—JH4

8

IGKV3-20*1—JK2

8

6

IL

45

IGHV3-7*1—D?—JH3a

14

-

-

-

VM

42

IGHV3-74*1—D1-26—JH4

21 (VMVH3A)

1 (VMVH3B)

IGKV3-20*1—JK2

13

11

DG

36

IGHV6-1*1—D6-25—JH4

9 (DGVH6A)

1 (DGVH6B)

1 (DGVH6C)

1 (DGVH6D)

1 (DGVH6E)

1 (DGVH6F)

IGLV2-8*1—JL1

8 (DGVL2A)

1 (DGVL2B)

6

AZL

36

-

-

IGKV1-5*3—JK3

13 (AZLVK1A)

1 (AZLVK1B)

1 (AZLVK1C)

-


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In den Tumor-B-Zellen der hier untersuchten Patienten wurde bei keinem der 8 Patienten ein biallelisches Rearrangement der Immunglobulingene gefunden. Alle detektierten Gene enthielten kein Stop-Codon und sind somit potentiell produktive Gene. In anderen Experimenten konnten biallelische Rearrangements für physiologische und maligne B- und T-Zellen nachgewiesen werden, so daß ein technischer Fehler ausgeschlossen werden kann (Golembowski S, J Cutan Pathol, 1999.; Brezinschek HP, J Immunol, 1995; Dorner T, J Immunol, 1997; Brauninger, Blood, 1999). Möglicherweise deutet das Auftreten von monoallelischem Rearrangement auf eine relativ geringe molekulargenetische Instabilität in den primär kutanen B-Zell-Lymphomen gegenüber aggressiveren nodalen B-Zell-Lymphomen hin, welche die Prozesse von Hypermutation, Genrearrangement und Klassenwechsel der Immunglobuline umfasst (Kuppers R, N Engl J Med, 1999). Der prognostische Unterschied zwischen den beiden pCBCL-Entitäten kann mit dieser Hypothese der genetischen Instabilität derzeit nicht erklärt werden. Zusätzliche Faktoren, wie z.B. die bcl-2-Expression dürften eine Rolle spielen (Geelen FA, J Clin Oncol, 1998).

Die Mutationsanalysen der Tumorgene zeigten in allen Fällen für beide Immunglobulinkettengene hohe Mutationsraten (5,4-16,3%), welche über den Werten der physiologischen Keimzentrumszellen liegen (Pascual V, J Immunol, 1994; Tomlinson IM, J Mol Biol, 1996, Williams SC, J Mol Biol, 1996). Die Verteilung von Replacement versus silent-Mutationen (R/S-Ratio) über die Regionen der CDR und FR entsprach dem erwarteten Wert (Chang B, Immunol Today, 1994). Diese Daten zeigen, daß die Tumorzelle einer antigenen Selektion unterlag, jedoch der Prozeß der Mutationen offensichtlich über das normale Maß hinaus stattgefunden hat. Besonders in den FR können R-Mutationen gefunden werden. Die FR sind für die Stabilisierung der Antikörper verantwortlich. Der genaue Einfluß einer einzelnen Mutation auf die Affinität eines Antikörpers zum Antigen ist in den hier gewonnenen Ergebnissen nicht genau festzustellen, da schon eine einzelne Mutation zur wesentlichen Strukturänderung im Antikörper führen kann. Ebenfalls ist unklar, ob die somatischen Mutationen vor oder während der Tumorentwicklung stattgefunden haben. Der Nachweis eines genübergreifenden Mutationsmechanismus (Pasqualucci L, Nature, 2001) spricht für beide Möglichkeiten. Einige Mutationen sind schon im Rahmen der physiologischen Keimzentrumszell-Reaktion erworben worden, andere jedoch während der Tumorgenese. Das erklärt auch das Auftreten von intraklonalen Diversitäten innerhalb eines Tumorklones. Dieses Phänomen der intraklonalen Diversität wurde bei allen 8 Patienten nachgewiesen. Im Vergleich zu einer Arbeit von Aarts, welcher überwiegend Immunozytome der PCBCL untersuchte, ist die Frequenz der intraklonalen Diversitäten in Keimzentrumszell-Lymphomen und großzelligen B-Zell-Lymphomen am Bein geringer (Aarts WM, Blood, 1998). Es wird vermutet, daß die geringere intraklonale Diversität mit der Aggressivität eines B-Zell-Lymphoms korreliert und somit einen prognostischen Anhaltspunkt bietet (Matolcsy A, Eur J Immunol, 1999). Bei 2 Lymphompatienten zeigte das Immunglobulin der Tumorzelle einen IgM-Isotyp, wovon auch Aarts in seiner Arbeit berichtet (Aarts WM, Blood, 1998).

Potentiell produktive Gene und intraklonale Diversität sprechen für einen Einfluß der Tumor-Immunglobuline auf die Lymphomgenese ähnlich den MALTomen im Magen bei chronischer Infektion mit Helicobacter pylori. Eine antibiotische Behandlung, welche zur Unterbrechung des chronischen Stimulus führt, kann in beiden Fällen die Rückbildung initialer Lymphome bewirken. (Kutting B, J Am [Seite 50↓]Acad Dermatol, 1997; Roggero E, Hum Pathol, 2000; Wotherspoon AC, Lancet, 1991; Hussell T, Lancet, 1993).

Zusammenfassend kann anhand der Daten festgestellt werden, daß die Immunglobulingene der FCCL und der GBCLL ein Mutationsmuster entsprechend dem Keimzentrum aufweisen und damit den sogenannten Keimzentrumszell-Lymphomen angehören wie z.B. auch ein Teil der Hodgkin-Lymphome und der B-CLL (Kuppers R, Adv Cancer Res, 2002; Sakai A, Blood, 2000). Es konnte kein Unterschied zwischen beiden Entitäten der PCBCL hinsichtlich der Mutationsmuster und des Immunglobulingen-usage der Tumorzellen gefunden werden.

Nach Darstellung von Alizadeh sind unterschiedlich stark exprimierte Gene für den Verlauf von B-Zell-Entitäten in den nodalen diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen verantwortlich (Alizadeh AA, Nature, 2000).

5.2. Intraklonale Diversität bei primär kutanen B-Zell-Lymphomen

5.2.1. Hintergründe und Fragestellungen

Somatische Hypermutationen und intraklonale Diversität sind ein Merkmal von Keimzentrumszell-Lymphomen, was in verschiedenen vorangegangenen Abschnitten (3.1.1., 4.1.3., 5.1) dargelegt wurde (Abbildung 9). Beim Nachweis von intraklonalen Diversitäten bzw. „ongoing mutation“ wird ein Lymphom als Keimzentrumszell-Lymphom eingeordnet. Fehlen diese bei bestehenden Hypermutationen, entspricht das Lymphom einem Post-Keimzentrumszell-Lymphom. Um diese Unterscheidung genau zu verifizieren, ergab sich folgende Fragestellung:

5.2.2. Nachweis von intraklonaler Diversität in zeitlich unterschiedlichen, räumlich entfernten Biopsien (Golembowski, Immunobiol, 2000)

5.2.2.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse

Von einem 52 jährigen Patienten UK mit einem histologisch gesichertem FCCL wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Verlauf der Erkrankung und von verschiedener Lokalisation Hautbiopsien entnommen. Die Biopsie A erfolgte von einer am Kopf manifesten Läsion 1994, die Biopsien B und C von Rezidiven in loco 12/1995 und 07/1996 sowie von einem späteren Rezidiv mit retrobulbärer Manifestation (D) (Tabelle VI). Mittels Staginguntersuchung konnte eine extrakutane Beteiligung stets ausgeschlossen werden.

Histologisch zeigten alle Proben den Befund eines diffusen FCCL mit Zentrozyten und Zentroblasten im Infiltrat. Der Phänotyp war CD20+, CD5-, CD10-, bcl-2-. Aus den Proben A, C, D wurden CD20+Einzelzellen isoliert. Genomische DNA wurde aus den Proben B und D aus dem gesamten Biopsiematerial (bulk-DNA) hergestellt. Aus Probe D wurde zusätzlich cDNA präpariert.


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Entsprechend der beschriebenen Methodik wurden CD20+ B-Zellen mittels hydraulischer Mikromanipulation isoliert und anschließend mittels Einzelzell-PCR für die schwere und die leichten Ketten (κ, λ) des Immunglobulingens analysiert. Alle Produkte wurden sequenziert. Für die Probe D wurde ein sequenzspezifischer VH-Primer zur Identifizierung der Tumorgene eingesetzt (Golembowski, Immunobiol, 2000).

Tabelle VI: Ergebnisse der Einzelzell-Analyse

Biopsie

Lokalisation

Anzahl isolierter Einzelzellen

Ergebnisse

Sequenzbezeichnung

A 11/94

Kopf

66

19 identische VHDJH

6 identische Vκ

AHCR

BHCR, Bκ CR

B 12/95

Kopf

Gesamt-DNA

Die gleiche Sequenz wurde in unabhängigen PCR-Analysen nachgewiesen

BHSC

C 07/96

Kopf

63

13 identische VHDJH

5 identische VκJκ

CHSC

CHCR, Cκ CR

D 03/97

retrobulbär

97

Gesamt-DNA

cDNA

ausschließlich polyklonale Zellen

Nachweis des Klons in verschiedenen PCR-Analysen

DHCR

DHcDNA

In den Proben A und C konnten die individuellen Immunglobulingen- Sequenzen der schweren Kette auf Einzelzell-Ebene nachgewiesen werden. In Probe D zeigte die Einzelzell-PCR ausschließlich nichtklonale Gene des Immunglobulin-Rezeptors in allen isolierten Zellen. In den Proben B und D wurden diese individuellen Gene auf Ebene der genomischen Gesamt – DNA (bulk) ebenfalls nachgewiesen.

Innerhalb einer Biopsie A oder C konnten sowohl in den Genen der leichten Kette als auch in den Genen der schweren Kette des Immunglobulins ausschließlich identische Gene beobachtet werden. Beim Vergleich der Biopsien untereinander zeigten sich jedoch Unterschiede in den somatischen Mutationen. (Abbildungen 13, 14)

Die chronologische Reihenfolge der Biopsien entsprach nicht der Reihenfolge der auftretenden Mutationen. Bei Analyse der somatischen Mutationen kann ein „Mutations-Bäumchen“ konstruiert werden. (Abbildung 15)

Es konnten Mutationen in der späten Probe B gefunden werden, welche in der frühen Probe A noch nicht existierten. So kann postuliert werden, daß für diese beiden Subklone A und B eine gemeinsame Vorläuferzelle X existiert hat. Die Subklone B und C sind ebenfalls intraklonal divers und könnten demzufolge auch aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle X* hervorgegangen sein, welche jedoch später als die Vorläuferzelle X aufgetreten sein muß. Die Probe D repräsentiert eine Subpopulation von A. In diesem Fall entspricht das zusätzliche Auftreten von somatischen Mutationen der zeitlichen Abfolge der Biopsien. (Abbildung 15)

Die Daten für die Mutationsanalyse in FR und CDR sind in Tabelle VII dargestellt:

Tabelle VII: Mutationsanalyse der Tumorgene des Patienten UK

Gen-Region

Relative Größe

Gefundene Mutationen

Kalkulierte

Pb)

  

R

S

R/S

R/S Ratioa)

 

CDR

66/234=9,282

5

1

5

3.6

0,13

FR

168/234=0,718

6

3

2

3.4

 

a) Chang and Casali, Ann.N.Y.Sci, 1995, b) Shlomchik, Proc.Natl.Acad.Sci., 1987


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Abbildung 13: Nukleinsäure-Sequenz der VHDJH-Gen-Rearrangements eines Patienten mit primär kutanem Keimzentrumszell-Lymphom in chronologischer Reihenfolge; die keimbahnidentische Sequenz ist in der ersten Reihe dargestellt; SC= Einzelzelldaten; CR= Gesamt-DNA; H= schwere Kette;
Die folgenden Reihen bezeichnen die Subklone des Patienten; R-Mutationen werden als große Buchstaben und S-Mutationen als kleine Buchstaben dargestellt.


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Abbildung 14: Nukleinsäure-Sequenz der VκJκ-Gen-Rearrangements eines Patienten mit primär kutanem Keimzentrumszell-Lymphom in chronologischer Reihenfolge; die keimbahnidentische Sequenz ist in der erstenReihe dargestellt; SC= Einzelzelldaten; CR= Gesamt-DNA; H= Schwere Kette;
Die folgenden Reihen bezeichnen die Subklone des Patienten; R-Mutationen werden als große Buchstaben und S-Mutationen als kleine Buchstaben dargestellt.


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5.2.3.  Nachweis von intraklonaler Diversität in unterschiedlichen Abschnitten einer Läsion (diese Arbeit ist zusammen mit Frau Claudia Jacob entstanden)

5.2.3.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse

Die Biopsie eines 54 Jahre alten Patienten (LB) wurde untersucht, bei welchem sich 1995 juckende Knoten am Rücken manifestierten. Zwischen 1995 und 1998 entwickelte er Rezidive am Rücken. Therapeutisch wurden Exzisionen, Röntgenweichstrahlen und Immunochemotherapien (CHOP, Mabthera) angewendet. Infolge eines aggressiven Rezidivs verstarb der Patienten im Januar 2000.

Beim 2. Patienten (WS) handelte es sich um einen 84 Jahre alten Mann, welcher sich 03/1997 erstmals wegen eines ca. 8 cm durchmessenden Knoten am Kopf vorstellte, der exzidiert wurde. Bei Wiedervorstellung ein Jahr nach Exzision, befand er sich im Stadium der kompletten Remission.

Beide Patienten zeigten über 6 Monate nach Diagnosestellung keine extrakutane Beteiligung und entsprechen somit dem Kriterium eines primär kutanen B-Zell-Lymphoms.

Histologisch handelte es sich in beiden Fällen um FCCL vom diffusen Typ mit CD20+ Zentrozyten und Zentroblasten im Infiltrat. Bcl-2 war bei Patient LB negativ und bei Patient WS positiv.

Mittels Mikromanipulation und Einzelzell-PCR wurden bei Patient LB eine 6 cm durchmessende Läsion vom Rücken und bei Patient WS die 8 cm durchmessende Läsion vom Kopf ausgewählt. Aus diesen Läsionen wurden Areale abgeteilt, welche mindestens 1 cm voneinander entfernt lagen. Die Isolierung der CD20+ Einzelzellen erfolgte aus 8 Arealen von Patient LB und 3 Arealen von Patient WS mittels hydraulischer Mikromanipulation. Es schlossen sich die PCR-Analysen für die VH- und Vκ bzw. Vλ-Genfamilien wie im Abschnitt 4 beschrieben an.

Bei Patient LB wurde in allen 8 Arealen (53 Amplifikate) das gleiche hypermutierte Gen der schweren Kette des Immunglobulins ohne intraklonale Diversität gefunden (LBVH4A). Die leichte Kette des Immunglobulins war ein λ-Gen. Hier konnten 4 verschiedene Varianten in 43 Amplifikaten gefunden werden ( LBVλ3b a,b,d,e).

Insgesamt wurden in 24 Genen die leichte und die schwere Kette parallel amplifiziert. Davon zeigte sich 20x die Kombination LBVH4A/LBVλ3ba (Proben I, II, V, VI, VIII), 2x LBVH4A/LBVλ3bd (V, VI), 2x LBVH4A/LBVλ3be (Probe VIII).

LBVλ3bb, LBVλ3be konnten nur einmalig unter allen Sequenzen gefunden werden (Tabelle VIII).

Tabelle VIII: Ergebnisse Patient LB

Biopsie

Anzahl isolierter Zellen

Anzahl PCR-Amplifikate schwere Kette

VHDJH-Rearrangement

Anzahl PCR-Amplifikate leichte Kette

VλJλ-Rearrangement

I

18

5 VH4

4 LBVH4A

5 Vλ3b

4 LB Vλ3ba

1 LB Vλ3be

II

18

7 VH4

7 LBVH4A

7 Vλ3b

7 LB Vλ3ba

III

18

4 VH4

1 LBVH4A

4 Vλ3b

-

IV

18

6 VH4

6 LBVH4A

2 Vλ3b

-

V

18

16 VH4

16 LBVH4A

12 Vλ3b

9 LB Vλ3ba

1 LB Vλ3bd

VI

9

7 VH4

6 LBVH4A

8 Vλ3b

6 LB Vλ3ba

1 LB Vλ3bd

VII

9

2 VH4

2 LBVH4A

-

-

VIII

18

6 VH4

2 LBVH4A

5 Vλ3b

1 LB Vλ3ba

2 LB Vλ3bb

Summe

126

53

44

43

33

Bei Patient WS wurden 34 Amplifikate für das Vκ-Gen der leichten Kette aus 3 Arealen gewonnen. Die schwere Kette ließ sich nicht amplifizieren. Es konnten 4 verschiedene Varianten (WSVκ3 A,B,C,D) [Seite 55↓]detektiert werden. Keine der Varianten konnte in mehreren Biopsien gefunden werden, in einem Areal jedoch 2 Subklone (II: WSVκ3A und WSVκ3B ) (Tabelle IX).

Tabelle IX: Ergebnisse Patient WS

Biopsie

Anzahl isolierter Zellen

Anzahl PCR-Amplifikate leichte Kette

VλJλ-Rearrangement

I

37

16

12 WS Vκ3 C

II

27

9

3 WS Vκ3 A

5 WS Vκ3 B

III

36

9

4 WS Vκ3 D

Summe

100

34

24

Die Daten der Mutationsanalysen für beide Patienten sind in Tabelle X für alle CDR’s bzw. FR’s zusammengefaßt, wobei nur die häufig gefundenen Gene berücksichtigt werden. Am Beispiel des Patienten WS wurde ebenfalls ein „Mutationsbäumchen“ entworfen (Abbildung 16).

Tabelle X: R/S-Ratio Patient WS

Detektierte Gene

R/S-Ratio FR 1,2,3

R/S-Ratio CDR 1,2,3

WS Vκ3 A

0

6/4 = 1,50

WS Vκ3 B

0

7/4 = 1,75

WS Vκ3 C

0

8/3 = 2,60

WS Vκ3 D

0

5/5 = 1,00

intrinsische R/S-Ratio

 

 

Keimbahngen IGKV3-20*1

391/127 = 3,08

172/51 = 4,61

5.2.4. Diskussion

Die Mikromanipulation und Einzelzell-PCR sind sensible Methoden zur Analyse zellindividueller Gensequenzen. Nachteilig ist jedoch, daß mit diesen Methoden nur relativ kleine Areale des Gewebes untersucht werden können.

In allen 3 untersuchten Fällen erbrachten die Untersuchungen einzelner Biopsien keinen Hinweis auf eine intraklonale Diversität. Nur die Möglichkeit der Analyse von weiteren Hautbiopsien bzw. mehreren Gewebeabschnitten ergab den korrekten Befund von intraklonaler Diversität. Damit konnten diese Lymphome als Keimzentrumszell-Lymphom klassifiziert werden.

Durch Konstruktion eines „Mutationsbäumchens“ gelang der Nachweis, daß die Tumorzellen des Patienten UK im Infiltrat des retrobulbären Raumes eine Subpopulation (D) einer früheren Subpopulation (A) sind (Abbildung 15). Der Nachweis von zunehmend mutierten Genen (Subklon A zu D) ist ein Hinweis dafür, daß die Mutationen in den Tumorzellen stattfinden.

Bei beiden Patienten LB und WS existieren intraklonale Mutationen auf dem Gen der leichten Kette, welche jeweils 4 Subpopulationen bilden. Wird ein „Mutationsbäumchen“ konstruiert, hier am Beispiel des Patienten WS, läßt sich die wahrscheinliche Folge der Mutationen darstellen. Die intraklonal diversen Gene bestehen nebeneinander in einer Läsion, jedoch teilweise in räumlich abgetrennten Bereichen. Dieser Befund läßt auch hier das Vorhandensein einer gemeinsamen Vorläuferzelle X vermuten, was schematisch in Abbildung 16 dargestellt ist. Ob es sich hierbei um präformierte Subklone oder über ongoing mutations entstandene Subpopulationen handelt, kann in diesen Untersuchungen nicht geklärt werden.


[Seite 56↓]

Ähnliche Phänomene konnten auch in nodalen follikulären Lymphomen und in MALTomen gezeigt werden. (Bahler DW, Proc Natl Acad Sci U S A, 1992; Zhu D, Br J Haematol, 1994; Du M, Leukemia, 1996).

Mittlerweile ist bekannt, daß in Lymphomen eine generelle Möglichkeit für somatische Mutationen verschiedener Gene bestehen bleibt. In diffusen großzelligen nodalen B-Zell-Lymphomen wurden in der Mehrzahl der untersuchten Fälle Mutationen auf den Genen PIM1, PAX5, cMyc, bcl-6 und ARHH gefunden (Pasqualucci L, Nature, 2001). Die Mutationsfrequenz ist dabei mit 9% in den Tumorzellen wesentlich höher als bei physiologischen B-Zellen mit 4% (Klein U, Blood, 1997).

Ob es sich bei diesen Mutationen um einen antigenselektierten Prozeß handelt, wurde mit den Methoden von Chang and Casali, 1997 und Shlomchik, 1987 berechnet (Chang B, Immunol Today, 1994; Shlomchik MJ, Proc Natl Acad Sci U S A, 1987). Die R/S-Ratio und der intrinsic R/S-Ratio, welche für die FR’s und für die CDR’s getrennt vorgenommen wird, ergab Unterschiede. Dabei ist die R/S-Ratio des Patienten UK für die CDR’s mit 5 höher als die intrinsic Ratio von 3.6. und für die R/S-Ratio für die FR’s mit 2 niedriger als die intrinsic Ratio von 3.4. Für die Patienten LB und WS ist die R/S-Ratio für FR und CDR’s niedriger als in der kalkulierten R/S-Ratio. Den Modellen von Chang und Shlomchik zufolge, würde bei Patient UK die antigene Selektion möglich sein, bei den Patienten LB und WS jedoch nicht.

Die Methode der Mutationsbeurteilung sollte mit Vorsicht verwendet werden, da es sich 1. um eine statistische Berechnung handelt, da 2. nicht alle Abschnitte der CDR’s, welche durch Kabat, 1971 definiert werden, an der Antigenbindung beteiligt sind (Kabat EA, Ann N Y Acad Sci, 1971) und da 3. unbekannt ist, welche Mutation entscheidend für die Affinität an ein Antigen ist (Rudikoff S, Proc Natl Acad Sci U S A, 1982; Bruggemann M, EMBO J, 1986; Kersten B, Exp Clin Immunogenet, 2001) und es 4. Anhaltspunkte dafür gibt, daß die FR’s ebenfalls einen Einfluß auf die Affinität des Antikörpers haben können (Hillson JL, J Exp Med. 1993; Foote J, J Mol Biol, 1992).

Auch die stets negativen Staginguntersuchungen weisen darauf hin, daß die extrakutane Manifestation des Patienten UK erst viele Jahre nach den kutanen Läsionen auftrat. Bemerkenswert ist, daß die Tumorzellen im retrobulbären Infiltrat nur mit Hilfe von spezifischen Primern nachgewiesen werden konnten. Die Einzelzellanalyse ergab ausschließlich polyklonale Infiltrate. Möglicherweise wird die Zusammensetzung des Infiltrats, bei welchem polyklonale Zellen überwiegen, durch ein verändertes Mikromilieu, z.B. den Einfluß von Zytokinen, verursacht (Asadullah K, Exp Dermatol, 2000).

Bezugnehmend auf die Fragestellungen unter 5.2.1. muß festgestellt werden, daß der sichere Ausschluß von intraklonaler Diversität weder mit Untersuchung einer einzelnen Biopsie noch durch Amplifikation von nur einer Kette des Immunglobulingens erreicht werden kann.

Dabei konnten Beispiele demonstriert werden, bei welchen eine einzige Tumor-B-Zell-Subpopulation in einem untersuchten Areal vorhanden war. Weitere Subpopulationen wurden erst bei Analyse anderer Areale der gleichen Läsion bzw. in räumlich oder zeitlich verschiedenen Läsionen gefunden.

Durch den Nachweis von intraklonaler Diversität können die primär kutanen Lymphome (FCCL und GCBCLL) auch bei molekularbiologischer Betrachtungsweise als Keimzentrumszell-Lymphome eingeordnet werden.


[Seite 57↓]

Abbildung 15: Klonale Expansion von B-Lymphozyten in 3 verschiedenen Biopsien
(Patient UK)

Abbildung 16: Klonale Evolution von Tumor-B-Zellen aus 3 Arealen einer Biopsie


[Seite 58↓]

5.3.  Untersuchung reaktiver B-Lymphozyten in T-Zell-Lymphomen

5.3.1. Hintergründe und Fragestellungen

Die Mehrzahl der primär kutanen Lymphome gehört zu den T-Zell-Lymphomen, wobei am häufigsten die Mykosis fungoides auftritt. Obwohl bei den primär kutanen T-Zell-Lymphomen die Veränderungen der malignen T-Zelle im Vordergrund der Diagnostik stehen, kann häufig ein unterschiedlich umfangreiches Infiltrat an B-Zellen in der Haut nachgewiesen werden. In einigen Läsionen formieren sie sich zu Keimzentrumsstrukturen und sitzen dann unterhalb des eigentlich typischen Infiltrates des kutanen T-Zell-Lymphoms, in anderen Fällen sind die B-Zellen dem subepidermalen bandförmigen Infiltrat locker untermischt. Morphologisch kann es sich um Plasmazellen, aber auch Zentrozyten und Zentroblasten handeln.

Bezüglich der Charakterisierung der infiltrierenden B-Zellen in Läsionen von Mykosis fungoides und pleomorphem T-Zell-Lymphom ergaben sich folgende Fragestellungen:

5.3.2. B-Zellen im Infiltrat von Mykosis fungoides Läsionen (Förste N, Clin Exp Immunol, 1997)

5.3.2.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse

Für die Untersuchungen wurden 2 Bioptate der Haut von Patienten mit Mykosis fungoides im Plaquestadium (TNM Stadium IB) verwendet. Histologisch zeigte sich ein subepidermal gelegenes bandförmiges Infiltrat, in welchem sich die kleinen Lymphozyten mit cerebriformem Kern dominierten. Einige dieser Lymphozyten verhielten sich epidermotrop und bildeten die charakteristischen Pautrier’schen Mikroabszesse. In einer Patientin (I) waren dem Infiltrat CD30+ T-Zellen untermischt. Die Mykosis fungoides Erkrankung dieser Patientin transformierte in ein pleomorphes T-Zell-Lymphom mit hoher Proliferationsrate der Lymphozyten. Dem Infiltrat beider Proben waren einzelne B-Zellen untermischt, welche an der Basis nestförmige Ansammlungen bildeten.

Mit Hilfe der beschriebenen Technik der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR wurden insgesamt 91 CD20+ B-Zellen isoliert und mittels Einzelzell-PCR hinsichtlich ihres Immunglobulin-Schwerketten-Rearrangements analysiert.

In 13/58 B-Zellen (Patient 1: 24%) und in 8/33 B-Zellen (Patient 2: 22%) konnten PCR-Produkte für das VHDJH-Gen-Rearrangement generiert werden. Es wurden 9 VH3-Gene (3x VH3-30, 2x VH3-8, 2x VH3-21, 1x VH3-21, 1x VH3-YAC-4), sieben VH4-Gene (2x VH4-34, 1x VH4.16, 1x VIV-4, 1x DP71-Rb, 1x DP71-RBm, 1x H10), 3 VH5 Gene (2x DP73, 1x VHVMW/VHVRG) und 2 VH1-Gene (1x DP-88, 1x DP75). Alle gefundenen Gene waren potentiell produktiv, d.h. sie enthielten weder ein Stop-Codon, noch waren sie „out-of-frame“. (Förste, Clin Exp Immunol. 1997, Table I, Figure I)

Bei der Analyse der CDR3 konnte in keinem Fall ein identisches Gen gefunden werden. Demzufolge wurden keine klonalen Zellen in den Läsionen der Mykosis fungoides nachgewiesen. Alle CDR-3-Regionen enthielten D-Gene. Ein Genrearrangement enthielt 2 D-Gene. Das D-21-9 Gen wurde von 3 Zellen verwendet. In sieben Zellen wurde ein JH-6 Gen, in sechs Zellen ein JH4-Gen, in vier Zellen ein JH5-Gen, in zwei Zellen ein JH3-Gen und in jeweils einer B-Zelle ein JH1- bzw. JH2-Gen verwendet.


[Seite 59↓]

8/21 Genen waren weitgehend keimbahnidentisch (Homologie > 98,5%). 13 Gene zeigten Mutationen in mehr als drei Positionen. Die R/S-Ratio wurde für die Keimbahngene (kalkulierte R/S-Ratio) und die gefundenen Gene separat in CDR’s und FR’s berechnet und verglichen. Die Werte der R/S-Ratio der FR’s (1.6 versus kalkuliert 3.1) und der CDR’s (3.2. versus kalkuliert 5.7) waren niedriger als erwartet.

5.3.3. B-Zell-Repertoire in einem primär kutanen pleomorphen T-Zell-Lymphom (Golembowski S, J Cutan Pathol, 1999)

5.3.3.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse

Ein 61 jähriger Patient stellte sich mit indolenten subkutanen Knoten am Rücken vor, welche sich im Laufe von drei Jahren entwickelt hatte. Diese Hautveränderungen waren zunächst spontan regredient, zeigten jedoch später ein rasch fortschreitendes Rezidiv. Eine extrakutane Beteiligung der Erkrankung konnte ausgeschlossen werden.

Histologisch stellte sich ein dermales, teils periadnexal orientiertes lymphohistiozytäres Infiltrat dar, welches aus mittelgroßzelligen oder großen lymphoiden Zellen und aus großen blastenähnlichen Zellen bestand. Die immunhistochemische Markierung ergab eine Gleichverteilung von B- zu T-Lymphozyten im Verhältnis 1:1. Die B-Lymphozyten formierten sich unterhalb des T-Zell-Infiltrates in Form von keimzentrumsähnlichen Strukturen. Das CD30-Molekül wurde von ca. 20% der T-Zellen und von einzelnen großen atypischen Zellen exprimiert, welche sich innerhalb der T-Zell-Zone des Infiltrates befanden. Die Markierung dieser Zellen mit dem Marker Anti-CD-79a, welcher für Plasmazellen charakteristisch ist, ließ den Schluß zu, daß es sich hierbei um B-Lymphozyten handelte. In der Untersuchung der bulk-DNA aus dem Biopsiematerial konnte ein klonales Rearrangement für das TCR-γ –Gen und ein polyklonales Amplifikat für die IgH-Gene nachgewiesen werden.

Mit Hilfe der beschriebenen Technik der Mikromanipulation wurden CD79a+ Zellen aus zwei unabhängigen keimzentrumsähnlichen Strukturen (GC1, GC2) in der tiefen Dermis und einzelne in der T-Zell-Zone liegende große atypische CD30+ Zellen isoliert und anschließend mit der Einzelzell-PCR hinsichtlich ihres Schwerketten-Immunglobulingens untersucht.

Es wurden 42 B-Zellen aus den keimzentrumsähnlichen Strukturen (GC) isoliert. Davon konnten 7 VH-Gene in 5 B-Zellen aus GC1 und 9 VH-Gene in 8 B-Lymphozyten aus GC2 amplifiziert werden. In 3 Zellen wurden 2 VH-Gene rearrangiert, wobei jeweils ein Gen ein Stop-Codon enthielt und damit nicht produktiv sein konnte. In einer Zelle entstand das Stop-Codon infolge eines Frameshift, in zwei Zellen infolge eines Nukleotidaustausches. Aus der T-Zell-Zone wurden 12 B-Zellen isoliert, wobei 5 PCR-Produkte in 5 Zellen amplifiziert wurden. Alle 5 Gene der CD30+ Zellen waren potentiell produktiv (Golembowski, J Cutan Pathol, 1999).

Die CDR3-Region war in keinem Gen idententisch. Es handelte sich demzufolge um polyklonale B-Zellen.

Insgesamt wurden 7 verschiedene VH3-Keimbahngene (3x DP46, 2x DP47, je 1x COS3/D, VM3-8, DP58, DP48, DP54 und VH3-64); 4 verschiedene VH4-Keimbahngene (je 1x DP71, VH4-34, DP78 und VH4.30), 2 VH1-Keimbahngene (2x DP 14, 1x DP25) und 2 VH5-Keimbahngene (2xDP73, 1xVH32S) verwendet.

Bezugnehmend auf die Abbildungen Fig.3 und 4 der Arbeit von Golembowski et al., J Cutan Pathol, 1999, kann hinsichtlich der Mutationsanalyse folgende Zusammenfassung getroffen werden: Die [Seite 60↓]Mehrzahl der B-Lymphozyten in den Keinzentrumsähnlichen Strukturen (17/21) und die großen atypischen CD30+ Zellen aus der T-Zell-Zone (5/5) zeigten eine Sequenzhomologie mit den entsprechenden Keimbahn-VH-Genen von >98%. Ein unmutiertes VH-Gen war nicht produktiv.

In den 4 Zellen mit den mutierten Genen wurden 2x VH4-, 1x VH1- und 1x VH3-Keimbahngene für das VHDJH-Rearrangement verwendet. Zwei der mutierten Gene waren nicht produktiv, die anderen beiden Gene potentiell produktiv. Die Mutationsanalyse ergab folgende R-Mutationen: MW19H3 5/9 in den CDR’s, in Zelle MW52H1 3/4 in den CDR’s und 1/4 in den FR’s, MW19H4 3/4 in CDR2, MW30H4 6/11 in den CDR’s.

5.3.4. Diskussion

Im Infiltrat primär kutaner T-Zell-Lymphome können regelmäßig B-Lymphozyten nachgewiesen werden, wobei quantitativ individuell große Unterschiede bestehen. Teilweise liegen die B-Lymphozyten als einzelne Zellen dem T-Zell-Infiltrat untermischt, teilweise formieren sie sich zu keimzentrumsähnlichen Strukturen, meist unterhalb des eigentlichen Tumorzell-Infiltrates (Boehncke WH, Acta Derm Venereol, 1989; van der Putte SC, Am J Dermatopathol, 1989). Ihre funktionelle Bedeutung ist weitgehend unbekannt. Eine Korrelation zum klinischen Verlauf des T-Zell-Lymphoms wurde nicht gefunden. In gesunder Haut befinden sich keine B-Lymphozyten in der Dermis und Epidermis.

Die Analyse des verwendeten Keimbahngen-Repertoires und die Mutationsanalyse von B-Lymphozytengenen kann Auskunft über ihr Entwicklungsstadium geben. In der Regel entsprechen keimbahnidentische Gene naiven B-Zellen, welche bisher keinen Kontakt zu Antigenen hatten, mutierte Gene können sich dagegen gerade in der Phase der Keimzentrumszellreaktion in Kontakt mit Antigenen befinden oder Plasmazellen darstellen, deren Mutationsphase abgeschlossen ist (siehe auch Abschnitt 3). Die Zusammensetzung des B-Zell-Repertoires kann über diese Analysen möglicherweise Auskunft über die Situation im Tumorinfiltrat geben, welche beispielsweise durch die Zytokinproduktion von Tumor-Lymphozyten und reaktiven Zellen beeinflusst wird.

In beiden Arbeiten, Analyse von Immunglobulingenen in Läsionen der Mykosis fungoides und in einem pleomorphen T-Zell-Lymphom (Förste N, Clin Exp Immunol, 1997; Golembowski S, J Cut Pathol, 1999), wurden erwartungsgemäß polyklonale B-Zellen nachgewiesen, was sich in nichtidentischen CDR3-Regionen der einzelnen Gene zeigt. Dieser Befund läßt sich in der immunhistochemischen Markierung nachvollziehen, wobei die κ- und die λ-Kette in den B-Lymphozyten zu gleichen Teilen exprimiert wurde. Die Keimbahngene der größten VH3-Gen-Familie wurden am häufigsten (9/21:43%) nachgewiesen, gefolgt von VH4 (7/21), VH5 (3/21) und VH1 (2/21). Keimbahngene der VH2- und VH6-Familie wurden in den hier analysierten Zellen nicht verwendet. JH6 (7/21: 33%) und JH4 (6/21: 28%) wurden am häufigsten gefunden. Sowohl das „usage“ der VH-, als auch das der JH-Keimbahngene in den B-Lymphozyten im Infiltrat der Mykosis fungoides spiegeln die Situation im peripheren Blut wider (Brezinschek HP, J Immunol, 1995; Matsuda F, Nat Genet, 1993; Cook GP, Nat Genet, 1994). Allerdings konnten in diesen Untersuchungen keine biallel rearrangierten VHDJH Gene nachgewiesen werden. Die analysierten Gene waren alle potentiell produktiv. Im peripheren Blut werden häufiger beide Allele rearrangiert, wobei dann ein Gen nicht produktiv ist (Brezinschek HP, J Immunol, 1995; Guigou V, Mol Immunol, 1990). Kritischer ist zu bemerken, daß die Anzahl der untersuchten Gene für eine statistische Analyse unzureichend ist. Die Gene V3-30/DP-49, welche in 3/21 VHDJH-[Seite 61↓]Rearrangements gefunden worden sind, werden häufiger in B-Zellen verwendet, welche Autoantikörper exprimieren (Winkler TH, Eur J Immunol, 1992; Pascual V, J Clin Invest, 1990; Stewart AK, Immunol Rev, 1992).

35% (8/21) der VH-Gene waren zu > 98% keimbahnidentisch, darunter 5 VH4- und 2 VH5-Gene. Auch dieser Befund entspricht der Situation im peripheren Blut (Brezinschek HP, J Immunol, 1995). Die VH4-Gen-Familie enthält 15 funktionelle Gene, wovon 4 Gene häufiger mit Autoantikörper produzierenden B-Zellen assoziiert sind (Pascual V, Arthritis Rheum, 1992). Auch das Fehlen von somatischen Mutationen in VH-Genen von autoantikörperproduzierenden B-Lymphozyten ist häufig (Pascual V, J Immunol, 1991). Obwohl die hier aufgeführten Untersuchungen keinen Schluß über eine Autoantikörperfunktion der B-Zellen in Mykosis fungoides-Läsionen zulassen, könnte die Beobachtung fehlender Mutationen in den VH-Genen eine Verbindung zu nachgewiesenen erhöhten Autoantikörper-Titern bei MF-Patienten vermuten lassen. Die R/S-Ratio in den FR’s der mutierten Gene (13/21) liegt niedriger als die kalkulierte R/S-Ratio, was nach Chang und Casali als Indikator der funktionellen Selektion von B-Zellen zu werten ist (Kocks C, Annu Rev Immunol. 1989). Eine höhere R/S-Ratio als kalkuliert würde zu funktionell ungünstigen Konformationsänderungen im Protein des Immunglobulins führen und damit die Antikörperaffinität zum Antigen senken (Kocks C, Annu Rev Immunol, 1989). Die R/S-Ratio in den CDR’s ist höher als in der kalkulierten R/S-Ratio erwartet. Das spricht für eine durch das Antigen getriggerte Selektion der B-Zellen (Chang B, Ann N Y Acad Sci, 1995). Allerdings sollten diese Berechnungen mit Vorsicht betrachtet werden, da auch hochaffine Antikörper mit einer niedrigen R/S-Ratio ihrer CDR’s gefunden werden konnten und sehr hohe R/S-Ratio’s in nichtproduktiven Genen nachgewiesen wurden (Pascual V, Arthritis Rheum, 1992; Pascual V, J Immunol, 1991; Allen D, EMBO J, 1988). Sowohl das Vorkommen von naiven B-Lymphozyten (unmutierte Gene) als auch von Antigen selektionierten B-Zellen (mutierte Gene) spiegelt die Situation im peripheren Blut wider. Es kann vermutet werden, daß die B-Lymphozyten aus dem peripheren Blut in die Läsionen der Mykosis fungoides einwandern. Möglicherweise werden sie durch die Zytokinmuster, welche durch die Tumorzellen der Läsion verursacht werden, beeinflußt.

In lymphoproliferativer Erkrankungen z.B. den MALTomen und primär kutanen pleomorphen T-Zell-Lymphomen, aber auch in nichtmalignen Erkrankungen wie z.B. dem Lupus erythematodes, werden keimzentrumsähnliche Strukturen in Hautläsionen gefunden (Berek C, Immunol Rev, 1988). Zur Analyse der VHDJH-Rearrangments wurden B-Lymphozyten aus 2 GC-Strukturen und große CD30+ B-Zellen, welche im T-Zell-Infiltrat vereinzelt vorkamen, isoliert. In 13/16 Genen handelte es sich um nichtmutierte VHDJH-Rearrangements. Alle analysierten VHDJH -Gene zeigten eine individuelle CDR3, weshalb die Zellen als polyklonale B-Lymphozyten eingeordnet werden. Der Nachweis eines polyklonalen, überwiegend unmutierten B-Zell-Repertoires entspricht der Situation im Lymphknoten (Bryant E, Cancer, 1982). Dabei prolifierieren polyklonale aktivierte B-Zellen mit nichtmutierten VH-Genen in der dunklen Zone eines initialen Lymphknotens. Während der Affinitätsreifung der B-Lymphozyten sammeln sich somatische Mutationen in den VHDJH-Gen-Rearrangements an. Die B-Zellen wandern in die helle Zone des Lymphknotens ein. Dort expandieren sie mit Hilfe der T-Lymphozyten und in räumlicher Nähe zu den dentritischen Zellen (Pascual V, J Immunol, 1993; Brezinschek HP, J Immunol, 1995; Pascual V, J Exp Med, 1994). In unserer Untersuchung entsprechen die B-Lymphozyten hinsichtlich ihres Mutationsmusters den B-Lymphozyten in der dunklen Zone des Lymphknotens. Entweder befinden sich diese B-Zellen in einer sehr frühen Phase [Seite 62↓]der Immunantwort oder sie werden durch das Mikromilieu des T-Zell-Infiltrates stimuliert, GC-ähnliche Strukturen zu bilden. Sollten antigenvermittelte Signale eine Rolle bei der Formation der GC-ähnlichen Strukturen bilden, bleibt völlig unklar, um welche Antigene es sich handeln könnte.

Die CD30+/ CD79a+ Lymphozyten stellen eine Besonderheit des untersuchten Falles eines pleomorphen T-Zell-Lymphoms dar (Golembowski S, J Cut Pathol, 1999). Das VHDJH-Gen Rearrangement von 5 Zellen zeigte produktive nichtmutierte Gene. Demzufolge gehören sie zur gleichen Population wie die Zellen in den keimzentrumsähnlichen Strukturen, wobei diese B-Lymphozyten aktiviert sind, was die starke CD30-Expression zeigt. Offensichtlich werden die aufsteigenden B-Zellen ebenso wie einige der pleomorphen malignen T-Lymphozyten durch das Mikromilieu beeinflußt, beispielsweise von Zytokinen oder vom EBV-Virus ähnlich wie in Hodgkin-Lymphomen und dem CD30+ anaplastischen großzelligen Lymphom des Lymphknotens (Winkler TH, Eur J Immunol, 1992; Cook GP, Nat Genet, 1994).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass B-Lymphozyten, welche in Läsionen von primär kutanen T-Zell-Lymphomen einwandern, in Abhängigkeit von der Entität verschiedene physiologische Situationen widerspiegeln: in der Mykosis fungoides das Repertoire des peripheren Blutes und in einem pleomorphen partiell CD30+ T-Zell-Lymphom die Situation im Lymphknoten.

Im Hinblick auf die CD30+ Zellen in T-Zell-Lymphomen, welche im Abschnitt 6. detailierter dargestellt werden, scheint es sich auch hier um eine weitreichende Stimulierung von reaktiven Zellen und Tumorzellen zu handeln.


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02.06.2005