7. Verteilung klonaler und polyklonaler T-Zellen im Infiltrat verschiedener Stadien der Mykosis fungoides (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000)

7.1. Hintergründe und Fragestellungen

Es ist bekannt, daß sowohl Tumorzellen als auch reaktive Zellen sich im Infiltrat befinden. Bisher wurden verschiedene Untersuchungen vorgenommen, um die Lokalisation der Tumorzellen festzustellen und ihre Interaktion mit anderen Zellen, z.B. Keratinozyten zu messen (Smoller, Am J Surg Pathol, 1995; Hansen ER, Arch Dermatol, 1996). Dabei wurden verschiedene Techniken, wie z.B. die Licht- und Elektronenmikroskopie und die Immunhistochemie angewendet (Nickoloff BJ, Am J Dermatopathol, 1988; Ralfkiaer E, Br J Dermatol, 1991; Smoller, Am J Surg Pathol, 1995). Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern gegen die α- bzw. β-Kette der T-Zell-Rezeptoren zeigte, daß in einigen Hautproben von MF-Patienten eine bevorzugte Expression einer V-Familie gefunden werden kann. Diese Färbung markiert die expremierte V-Familie, jedoch nicht den T-Zell-Klon selbst (Bagot M, J Am Acad Dermatol, 1992; Potoczna N, J Cutan Pathol, 1996). Mit Hilfe der im Abschnitt 4 erläuterten Methoden der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR wurden verschiedene Stadien der Mykosis fungoides analysiert, um folgende Fragestellungen zu beantworten:

7.2. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse

Insgesamt wurden 5 Patienten mit Mykosis fungoides untersucht (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000).

Patient I war zum Untersuchungszeitpunkt 56 Jahre alt und wies ein Rezidiv der Mykosis fungoides im Ekzemstadium mit ausschließlicher Hautmanifestation des T-Zell-Lymphoms auf.


[Seite 76↓]

Bei Patient II handelte es sich um eine 68-jährige Patientin mit einem Rezidiv der Mykosis fungoides, welche klinisch als Ekzem dominierte ohne interne Beteiligung.

Die untersuchten Hautproben der Patienten I und II wurden vom Unterschenkel entnommen. Histologisch waren im dermalen bandförmigen Infiltrat wenige mittelgroßzellige pleomorphe T-Zellen mit cerebriformen Kernen und überwiegend reaktive Lymphozyten zu sehen. Nur vereinzelt stiegen T-Lymphozyten in die Epidermis auf. Mittels Mikromanipulation wurden einzelne CD4+ Lymphozyten aus der Dermis isoliert.

Patient III war 66 Jahre alt. Er stellte sich mit einem Rezidiv der Mykosis fungoides im Plaquestadium vor. Histologisch zeigte sich in einer Probe der Übergang vom Ekzem- zum Plaquestadium (IIIa) und in einer zweiten Probe ein typisches Plaquestadium (IIIb). Es imponierte eine Hyperkeratose und Akanthose der Epidermis, dermal ein ausgeprägtes lymphohistiozytäres Infiltrat mit mitelgroßzelligen pleomorphen Lymphozyten, Eosinophilen und Plasmazellen. (IIIa, IIIb) Zusätzlich waren in der Probe IIIb noch tiefliegende kleine Gruppen atypischer T-Lymphozyten (Tumorzellnester) zu sehen. Eine bevorzugte Expression der Vβ3-Familie konnte immunhistochemisch nachgewiesen werden. Von beiden Proben wurden CD4+ und Vβ3+ Lymphozyten aus dem bandförmigen dermalen Infiltrat, den tiefliegenden dermalen Tumorzell-Nestern sowie aus der Epidermis isoliert zur Analyse mittels Einzelzell-PCR für das TCR-γ Gen.

Patient IV war ein 55 jähriger Mann mit einem Rezidiv der Mykosis fungoides im Plaquestadium ohne Nachweis einer internen Beteiligung durch das Lymphom. Histologisch war der gleiche Befund wie in Probe IIIa zu erheben. Bei diesem Patienten war die Vβ5.1-Familie bevorzugt exprimiert. Es erfolgte die Isolation von Vβ5.1+ Lymphozyten für die Einzelzell-PCR.

Bei dem Patienten V handelte es sich um einen 60 Jahre alten Mann mit einer Mykosis fungoides im Tumorstadium, ohne daß eine extrakutane Beteiligung durch das T-Zell-Lymphom festgestellt werden konnte. Die untersuchte Hautprobe zeigte ein ausgeprägtes dermales Infiltrat mit mehrheitlich mittel- bis großzelligen atypischen Lymphozyten mit cerebriformen Kernen und nur wenigen reaktiven Lymphozyten. Eine dominierende Vβ22-Expression konnte immunhistochemisch nachgewiesen werden. Die Vβ22+ Zellen wurden zur Durchführung einer Einzelzell-PCR isoliert.

Bei allen 5 Patienten konnte in der Routine-PCR-Untersuchung ein monoklonales Amplifikat für das TCR -γ- Gen aus der Gesamt-DNA von Blut und Haut nachgewiesen werden.

Die Isolierung der Zellen mittels Mikromanipulation und anschließende Amplifikation für die TCR-γ- und das TCR-β-Gene (3, 5.1, 22) analog zu den immunhistochemischen Charakteristika erfolgte wie im Abschnitt 4 beschrieben.

Insgesamt wurden 387 Einzelzellen isoliert, davon 180 aus der Epidermis und 207 aus der Dermis. TCR-γ Sequenzen wurden von 181 Zellen gewonnen (79 epidermotrope, 102 dermale Zellen)

Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.


[Seite 77↓]

Tabelle IV: Patienten, Stadien, Färbung und Ergebnisse der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR-Analyse (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000)

Patienten

Kompartment

Färbung

Stadium

isolierte Zellen

negative

Kontrollen

polyklonale/gesamt -Sequenzen

klonale/gesamt-Sequenzen

I

Dermis*

CD4

Initiales Ekzem

63

7

22/22

0/22

II

Dermis*

CD4

Initiales Ekzem

36

4

12/12

0/12

IIIa

Dermis

CD4

Ekzem bis Plaque

18

2

9/9

0/9

IIIa

Epidermis

CD4

Ekzem bis Plaque

36

4

1/10

9/10

IIIb

Epidermis

Vβ3

Plaque

36

4

1/25

24/25

IIIb

Epidermis

CD4

Plaque

36

4

3/13

10/13

IIIb

Dermis

Vβ3

Plaque

27

3

4/13

9/13

IIIb

Tiefe Dermis, Gruppen atypischer Zellen

CD4

Plaque

27

3

5/20

15/20

IV

Epidermis

Vβ5.1

Plaque

72

8

11/31

21/31

V

Dermis*

Vβ22

Tumor

36

4

6/26

20/26

*Es konnten keine T-Zellen aus der Epidermis isoliert werden, wegen des zu geringen Infiltrates.

Die epidermotropen Zellen (Proben IIIa: 21/32 , IIIb: 9/10 und IV: 33/38 klonal) gehören überwiegend zu den Tumorzellen.

In den Proben I und II (initiales Ekzemstadium) konnten mikroskopisch keine epidermotropen Tumorzellen nachgewiesen werden. Das traf auch für Probe V (MF Tumorstadium) zu, wobei hier jedoch atypische Zellen in der Dermis dominierten.

Bei den dermalen Zellen steigt der Anteil der Tumorzellen im Infiltrat in Korrelation zum Fortschreiten der Erkrankung. So konnten bei dem initialen Ekzemstadium im Rezidiv (Proben I und II) keine Tumorzellen mittels der angewendeten Methodik nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu handelt es sich im Plaquestadium zu ca. 1/3 um Tumorzellen, wobei einige der malignen Zellen in Gruppen angeordnet sind (Tumorzellnester). Diese Nester befinden sich in der tiefen Dermis fern vom bandartigen Infiltrat. Im Tumorstadium gehört die überwiegende Menge der T-Lymphozyten im Infiltrat zu den Tumorzellen (Probe V: 20/26 klonal).

Nebenbefundlich ist bei den Patienten I und III ein bialleles Rearrangement für das TCR-γ-Gen des Tumorklons gefunden worden.

7.3. Diskussion

Die Methode der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR kann exakte Angaben zu individuellen Genkonstellationen einer einzelnen Zelle geben. Diese Methode wurde für die Anwendung am histologischen Schnitt etabliert (Kuppers R, Mol Med Today, 1995 ). Seitdem wurden vor allem lymphoproliferative Erkankungen mit dieser Methodik untersucht, z.B. der Morbus Hodgkin (Kuppers R, Mol Med Today, 1995, Stein H, Cancer Surv, 1997), das großzellige anaplastische T-Zell-Lymphom (Lorenzen et al, 1996) und primär kutane B-Zell Lymphome (Gellrich S, J Invest Dermatol, 1997; Gellrich S, J Invest Dermatol, 2001).


[Seite 78↓]

Ziel dieser Arbeit war es, die Lokalisation von Tumorzellen in der Haut in verschiedenen Stadien der Mykosis fungoides zu untersuchen. Der Vorteil der Mikromanipulation besteht darin, daß die genaue Lokalisation der Tumorzelle anhand ihrer T-Zell-Rezeptor-Klonalität nachgewiesen werden kann. Alle anderen Verfahren können entweder die Klonalität vieler Zellen feststellen oder phänotypische Merkmale im histologischen Schnitt darstellen. (Kuppers R, Mol Med Today. 1995)

Technisch gesehen konnte erstmalig mit dieser Arbeit gezeigt werden, daß es sich beim Vorhandensein von 2 dominierenden PCR-Produkten in der DNA aus läsionaler Haut nicht um 2 Tumorzell-Linien handelt, sondern um ein bialleles Rearrangement innerhalb einer Tumorzelle.

Es ist bekannt, daß die Tumorzellen der MF in verschiedenen Geweben des Körpers vorkommen und zwischen Haut, Lymphknoten und Blut rezirkulieren (Muche JM, Blood, 1997). Bisher wurde die Verteilung von Tumorzellen der MF in der Haut durch phänotypische Merkmale beurteilt. Dazu wurden die Gewebeschnitte histologisch mit den Vβ-Familien angefärbt. In einem Teil der MF-Fälle wird eine Vβ-Familie bevorzugt exprimiert, was mit dem Auftreten von Tumorzellen im Infiltrat korreliert (Bagot M, J Am Acad Dermatol, 1992; Potoczna N, J Cutan Pathol, 1996; Preesman AH, J Invest Dermatol, 1992; Fivenson DP, J Am Acad Dermatol, 1994). Diese Daten können zwar eine Orientierung für die Lokalisation der Tumorzellen geben, jedoch hinsichtlich der einzelnen Zelle sind sie nicht repräsentativ. Werden die Anteile der Vβx+ klonalen Zellen mit den Anteilen der CD4+ Zellen verglichen (Probe IIIb) zeigt sich, daß weder die CD4+ noch die Vβx+ Zellen eine homologe Zell-Population darstellen.

Über die Ursachen für die Verteilung der MF-Tumorzellen und der reaktiven Zellen kann diskutiert werden, daß 1. Zytokinmuster oder Adhäsionsmoleküle im Infiltrat eine Rolle spielen (Asadullah K, Exp Dermatol, 1998), 2. daß die Tumorzellen gemeinsam mit den reaktiven Zellen auf ein unbekanntes Antigen reagieren und deshalb in die Haut gelangen, oder 3. daß es sich im Falle der epidermotropen Zellen um einen Tumorescape-Mechanismus handelt. Dabei entziehen sich die Tumorzellen durch Lokalisation in der Epidermis oder innerhalb der Tumorzellnester in der tiefen Dermis den Einflüssen der reaktiven Zellen im bandartigen Infiltrat. Daß reaktive CD8+ Zellen autologe Tumorzellen zerstören können, zeigte Bagot et al. Die Arbeitsgruppe wies außerdem nach, daß Patienten mit vielen CD8+ Zellen im Infiltrat eine gute Prognose dieser Erkrankung haben (Bagot M, Ann N Y Acad Sci, 2001; Hoppe RT, J Am Acad Dermatol, 1995).

Möglicherweise hat das bandförmige Infiltrat im initialen Stadium der Mykosis fungoides eine Barrierefunktion, wobei die Tumorzellen bereits vor Eindringen in die Epidermis durch das Immunsystem beseitigt werden. Mit dem Fortschreiten der Erkankung können dann einige Tumorzellen doch in die Epidermis eindringen. Dabei kommt ihnen die Expression des CLA zugute, welches den reaktiven Lymphozyten fehlt (Borowitz MJ, Leukemia, 1993).

Mit diesen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, in welchen quantitativen Verhältnissen Tumorzellen der MF in Epidermis und Dermis in verschiedenen Stadien vorhanden sind (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000).


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
02.06.2005