Thema: „Erforschung der Ätiopathogenese primär kutaner Lymphome mit Hilfe der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR“

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Lehrbefähigung

für das Fach

Dermatologie und Venerologie

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Frau Dr. med. Sylke Gellrich

geboren am 01.08.1967 in Berlin

Präsident:Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek

Dekan:Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

eingereicht am:Mai 2003

öffentlich-wissenschaftlicher Vortrag am: 04. Dezember 2003

Gutachter:
1. Prof. Dr. R. Dummer
2. Prof. Dr. H. Kerl

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
• 2.  Primär kutane Lymphome
  • 2.1. Klassifikation, Histologie und Klinik primär kutaner B-Zell-Lymphome (CBCL)
    • 2.1.1. B-Zell-Lymphome am Stamm und Kopf
      • 2.1.1.1. Keimzentrumszell-Lymphom (FCCL)
      • 2.1.1.2.  Immunozytom / Marginalzonenlymphom (IZ / MZL)
    • 2.1.2. Intermediär aggressives großzelliges B-Zell-Lymphom an der unteren Extremität (GBCLL)
    • 2.1.3. Diagnostik und Verlaufskontrolle kutaner B-Zell-Lymphome
    • 2.1.4. Therapie kutaner B-Zell-Lymphome
      • 2.1.4.1. Lokale Behandlung
      • 2.1.4.2.  Immuntherapie
      • 2.1.4.3. Systemische Therapie
  • 2.2. Klassifikation, Histologie und Klinik primär kutaner T-Zell-Lymphome (CTCL)
    • 2.2.1. Mykosis fungoides (MF)
    • 2.2.2. Pagetoide Retikulose (PR)
    • 2.2.3.  CD30+ großzelliges Lymphom (CD30+LTCL)
    • 2.2.4. Lymphomatoide Papulose (LyP)
    • 2.2.5. Sézary-Syndrom (SS)
    • 2.2.6. Diagnostik und Verlaufskontrolle primär kutaner T-Zell-Lymphome
    • 2.2.7. Therapie primär kutaner T-Zell-Lymphome
      • 2.2.7.1. Lokale Therapie
      • 2.2.7.2. UV-Exposition
      • 2.2.7.3. Kombination verschiedener Therapieverfahren
      • 2.2.7.4. Modulatoren des Immunsystems
      • 2.2.7.5. Fusionsproteine
      • 2.2.7.6.  Tumorspezifische Peptidvakzinierungen
      • 2.2.7.7. Chemotherapie
      • 2.2.7.8. Knochenmarktransplantation
• 3.  Ätiopathogenese primär kutaner Lymphome
  • 3.1. B-Zell-Entwicklung und B-Zell-Lymphome
    • 3.1.1. Hypothese der Immundysregulation
      • 3.1.1.1. Helicobacter pylori assoziierte MALTome
      • 3.1.1.2. Borrelien-assoziierte primär kutane B-Zell-Lymphome
  • 3.2. Das CD30-Molekül in der Lymphomgenese
    • 3.2.1. Die Bedeutung des CD30-Moleküls in nicht-kutanen Lymphomen
    • 3.2.2. CD30 und genetische Veränderungen
    • 3.2.3. CD30 und assoziierte Infektionen
    • 3.2.4. Die Bedeutung des CD30-Moleküls in primär kutanen Lymphomen
  • 3.3.  Ätiopathogenese der Mycosis fungoides
    • 3.3.1. Bedeutung der T-Zell-Klonalität bei Mykosis fungoides und Parapsoriasis en plaques
    • 3.3.2. Infektionserreger
    • 3.3.3. Genetische Prädisposition und genetische Veränderungen
    • 3.3.4. Verlauf und Transformation der Mykosis fungoides
    • 3.3.5. Tumorspezifische Abwehrmechanismen
• 4. Methoden
  • 4.1. Mikromanipulation
    • 4.1.1. Geschichte der Mikromanipulation
    • 4.1.2. Immunhistochemische Markierung
    • 4.1.3. Hydraulische Mikromanipulation
  • 4.2.  Molekularbiologische Analyse
    • 4.2.1. Einzelzell-PCR
    • 4.2.2. Darstellung der PCR-Produkte, Sequenzierung, Datenanalyse
    • 4.2.3.  Keimbahn- und Mutationsanalysen
    • 4.2.4. Klonierung
    • 4.2.5. Fluoreszenz-Fragment-Analyse (FFA)
  • 4.3. Etablierung der PCR für die schweren Ketten der Immunglobulingene am Beispiel des Sjögren-Syndroms (Gellrich S, Arthritis Rheum, 1999)
• 5.  Molekulargenetische Einzelzell-Analyse der variablen Anteile der schweren und der leichten Kette von Immunglobulingenen in kutanen B-Lymphozyten
  • 5.1.  Primär kutane B-Zell-Lymphome sind Keimzentrumszell-Lymphome (Gellrich et al., J Invest Dermatol 2001, Gellrich et al, J Invest Dermatol, 1997)
    • 5.1.1. Hintergründe und Fragestellungen
    • 5.1.2. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
    • 5.1.3. Diskussion
  • 5.2. Intraklonale Diversität bei primär kutanen B-Zell-Lymphomen
    • 5.2.1. Hintergründe und Fragestellungen
    • 5.2.2. Nachweis von intraklonaler Diversität in zeitlich unterschiedlichen, räumlich entfernten Biopsien (Golembowski, Immunobiol, 2000)
      • 5.2.2.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
    • 5.2.3.  Nachweis von intraklonaler Diversität in unterschiedlichen Abschnitten einer Läsion (diese Arbeit ist zusammen mit Frau Claudia Jacob entstanden)
      • 5.2.3.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
    • 5.2.4. Diskussion
  • 5.3.  Untersuchung reaktiver B-Lymphozyten in T-Zell-Lymphomen
    • 5.3.1. Hintergründe und Fragestellungen
    • 5.3.2. B-Zellen im Infiltrat von Mykosis fungoides Läsionen (Förste N, Clin Exp Immunol, 1997)
      • 5.3.2.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
    • 5.3.3. B-Zell-Repertoire in einem primär kutanen pleomorphen T-Zell-Lymphom (Golembowski S, J Cutan Pathol, 1999)
      • 5.3.3.1. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
    • 5.3.4. Diskussion
• 6. CD30+ Zellen in primär kutanen Lymphomen
  • 6.1. CD30+ großzellige T-Zell-Lymphome der Haut (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2003)
    • 6.1.1. Hintergründe und Fragestellungen
    • 6.1.2. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
    • 6.1.3. Diskussion
  • 6.2. CD30+ Zellen in der lymphomatoiden Papulose (Gellrich S, in Revision in I Invest Dermatol)
    • 6.2.1. Hintergründe und Fragestellungen
    • 6.2.2. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
    • 6.2.3.  Diskussion
  • 6.3. Zusammenfassung der Analyse von CD30+ Einzelzellen in primär kutanen T-Zell-Lymphomen
• 7. Verteilung klonaler und polyklonaler T-Zellen im Infiltrat verschiedener Stadien der Mykosis fungoides (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000)
  • 7.1. Hintergründe und Fragestellungen
  • 7.2. Patienten, spezielle methodische Aspekte, Ergebnisse
  • 7.3. Diskussion
• 8.  Zusammenfassende Betrachtung der Daten und Perspektiven
• Literatur
• Abkürzungen
• Dank
• Publikationsliste der Verfasserin über primär kutane Lymphome (chronologisch)
• Eidesstattliche Versicherung

Tabellen

• Tabelle I: EORTC-Klassifikation für primär kutane B-Zell-Lymphome (Willemze R, Blood, 1997)
• Tabelle II: EORTC-Klassifikation für primär kutane T-Zell-Lymphome(CTCL) (Willemze R, Blood, 1997)
• Tabelle III: TNM-Staging der Mykosis fungoides
• Tabelle V: Bezeichnung und Gen-Sequenz der Primer und ihrer Annealing-Temperaturen für verschiedene Gene
• TabelleVI: Anzahl und Keimbahnzuordnung der Tumor-Klone und -Subklone der untersuchten Patienten
• Tabelle VI: Ergebnisse der Einzelzell-Analyse
• Tabelle VII: Mutationsanalyse der Tumorgene des Patienten UK
• Tabelle VIII: Ergebnisse Patient LB
• Tabelle IX: Ergebnisse Patient WS
• Tabelle X: Ergebnisse der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR für das TCR-γ Gen-Rearrangements und CGH –Ergebnisse in CD30+ Zellen von Patienten mit CD30+ großzelligem Lymphom der Haut
• Tabelle XI: FFA-Analysen von 3 Patienten mit lymphomatoider Papulose
• Tabelle XII: Charakterisierung der Proben, Histologie, rearrangierte Gene
• Tabelle XIII: Klonale TCR-γ Sequenzen in der Haut der Patienten I, II, III
• Tabelle IV: Patienten, Stadien, Färbung und Ergebnisse der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR-Analyse (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000)

Bilder

• Abbildung 1a: B-Zell-Lymphom
• Abbildung 1b: Zentrozyten, Zentroblasten Giemsa 20x
• Abbildung 1c: Anti-CD20-Färbung40x
• Abbildung 2a: Marginalzonen-Lymphom
• Abbildung 2b: Marginalzonen-Lymphom, Anti- κ-Färbung 40x
• Abbildung 3a: B-Zell-Lymphom mit Manifestation am Bein
• Abbildung 3b: großzelliges B-Zell-Lymphom Giemsa 40x
• Abbildung 3c: Immunoblasten, Zentroblasten, Mitosen, 80x
• Abbildung 4a: vor Therapie
• Abbildung 4b: nach Therapie mit 8 Zyklen Rituximab
• Abbildung 5a: Mykosis fungoides, Ekzemstadium
• Abbildung 5b: Mykosis fungoides Plaquestadium
• Abbildung 5c: Mykosis fungoides, Tumorstadium
• Abbildung 5d: Mykosis fungoides, HE 20x
• Abbildung 6a: CD30+ großzelliges T-Zell-Lymphom
• Abbildung 6b: CD30+ großzelliges T-Zell-Lymphom, Anti-CD30-Färbung, 40x
• Abbildung 7a: Lymphomatoide Papulose
• Abbildung 7b: Lymphomatoide Papulose, Typ A Anti-CD30-Färbung, 40x
• Abbildung 8a, 8b: Sézary-Syndrom, Erythrodermie, Hyperkeratose der Hände
• Abbildung 8c: klonales TCR-γ- Rearrangement, FFA-Analyse
• Abbildung 9: Darstellung der Zuordnung von physiologischen B-Zellen und deren lymphoproliferativen Äquivalente zur Keimzentrumszell-Reaktion
• Abbildung 10
• Abbildung 11: Aminosäuren der schweren Ketten der tumorindividuellen Gene, obere Reihe Patienteninitialen, zweite Reihe Keimbahngene, folgende Reihen einzelzellindividuelle Sequenzen des dominierenden Klons und der Subklone, obere Box Patientengruppe I (FCCL), untere Box Patientengruppe II (GBCLL), R-Mutationen grau unterlegt, D-Gene unterstrichen
• Abbildung 12: Aminosäuren der leichten Ketten der tumorindividuellen Gene, obere Reihe Patienteninitialen, zweite Reihe Keimbahngene, folgende Reihen einzelzellindividuelle Sequenzen des dominierenden Klons und der Subklone, obere Box Patientengruppe I (FCCL), untere Box Patientengruppe II (GBCLL), R-Mutationen grau unterlegt
• Abbildung 13: Nukleinsäure-Sequenz der V_HDJ_H-Gen-Rearrangements eines Patienten mit primär kutanem Keimzentrumszell-Lymphom in chronologischer Reihenfolge; die keimbahnidentische Sequenz ist in der ersten Reihe dargestellt; SC= Einzelzelldaten; CR= Gesamt-DNA; H= schwere Kette; Die folgenden Reihen bezeichnen die Subklone des Patienten; R-Mutationen werden als große Buchstaben und S-Mutationen als kleine Buchstaben dargestellt.
• Abbildung 14: Nukleinsäure-Sequenz der VκJκ-Gen-Rearrangements eines Patienten mit primär kutanem Keimzentrumszell-Lymphom in chronologischer Reihenfolge; die keimbahnidentische Sequenz ist in der erstenReihe dargestellt; SC= Einzelzelldaten; CR= Gesamt-DNA; H= Schwere Kette; Die folgenden Reihen bezeichnen die Subklone des Patienten; R-Mutationen werden als große Buchstaben und S-Mutationen als kleine Buchstaben dargestellt.
• Abbildung 15: Klonale Expansion von B-Lymphozyten in 3 verschiedenen Biopsien (Patient UK)
• Abbildung 16: Klonale Evolution von Tumor-B-Zellen aus 3 Arealen einer Biopsie
• Abbildung 17: Klinische Manifestation, Histologie HE und Anti-CD30-Färbung
• Abbildung 18: Flureszenz Fragment-Analyse für den TCR-γ Patient III
• Abbildung 19: Immunglobulin-Gen-Rearrangment der schweren Kette von Patient III im Vergleich zur Keimbahnkonfiguration, welche in den CD30+ Zellen der Läsion der lymphomatoiden Papulose und des Lymphknotens von Patient III zu finden waren, kleine Buchstaben: S-Mutationen, große Buchstaben: Aminosäureaustausch