1  Einordnung des eigenen Arbeitsgebietes in den Stand der Forschung

Vor wenigen Jahren wurden Resorption, Verteilung und Ausscheidung von Arzneistoffen hauptsächlich als passive Vorgänge beschrieben, bei denen Moleküle vor allem per Diffusion biologischer Membranen in verschiedene Kompartimente gelangen (Avdeef, 2001). Dabei bestimmen vor allem die physikochemischen Eigenschaften Größe, Ladung, Lipidlöslichkeit und Flexibilität des Arzneistoffmoleküls die Passage von Zellmembranen. Entsprechend ist die Diffusionsgeschwindigkeit kleiner, lipophiler und flexibler Pharmaka schneller, als die großer, hydrophiler und starrer Substanzen. Die passive Diffusion von Molekülen durch Zellmembranen entlang eines Konzentrationsgradienten wird durch das Ficksche Gesetz beschrieben. Die Resorptionsprofile zahlreicher Arzneistoffe weisen jedoch unerwartet hohe oder niedrige Bioverfügbarkeiten auf, die durch passive Diffusion oder first-pass Metabolismus allein nicht erklärt werden konnten (Ayrton et al., 2001 ;Kruijtzer et al., 2002). Kürzlich erlangten Transmembran-Transporter zunehmende Aufmerksamkeit für ihre wichtige Rolle in der Pharmakokinetik. So konnte die Disposition einiger Arzneistoffe mit bis dahin nicht erklärbarer, nichtlinearer Kinetik auf aktive, Transporter-vermittelte Prozesse zurückgeführt werden.

Transporter sind in der Zellmembran verankerte Proteine, die an der transmembranären Passage von Nahrungsbestandteilen, aber auch Fremd- und Arzneistoffen beteiligt sind. Im Gastrointestinaltrakt, in der Leber und in den Tubuli der Niere sind eine Reihe von pharmakokinetisch bedeutsamen Membrantransportern lokalisiert (Abb. 1). Darüberhinaus sind Transporter wichtige Bestandteile von Blut-Gewebe Schranken, wie der Blut Hirn-, Blut Plazenta- und Blut Testis-Schranke (Cordon-Cardo et al. 1990; Rao et al., 1999). In diesen sensiblen Organen sorgen Transporter für eine effiziente Abwehr toxischer Substanzen, verhindern aber auch die Passage von Arzneistoffen. In Analogie zu den Phase I und Phase II Reaktionen des Arzneistoffmetabolismus werden aktive transmembranäre Transportprozesse zunehmend als Phase III Reaktionen bezeichnet.

Ein weiterer wichtiger pharmakologischer Aspekt aktiver Transport-Prozesse sind Wechselwirkungen, die auftreten können, wenn Substanzen um ein und denselben Transporter konkurrieren. Beispielsweise kommt es zu Interaktionen zwischen dem Herzglykosid Digoxin mit einer Reihe von Arzneistoffen, wie Chinidin, Propafenon, Verapamil, Clarithromycin und Ciclosporin A. Digoxin wird kaum metabolisiert, ist jedoch wie die anderen genannten Pharmaka ein gutes Transportsubstrat für Pgp. In in vitro Studien und im Tierversuch konnten diese und andere Pgp-bedingte Arzneistoff-Interaktionen gut dokumentiert werden (Yu, 1999).

	Abb. 1: Beteiligung von Membrantransportern an der Arzneimittel Disposition

Transporter Proteine gehen mit ihrem Substrat eine spezifische Bindung ein, ändern ihre Konformation und transferieren das gebundene Substrat durch biologische Membranen. Einige Transporter vermitteln lediglich die passive Membranpassage von Stoffen abwärts ihres Konzentrationsgradienten. Dieser Vorgang wird auch als erleichterte Diffusion bezeichnet. Aktive Membrantransporter sind immer dann erforderlich, wenn Substrate entgegen ihres Konzentrations- oder elektrochemischen-Gradienten „aufwärts“ transportiert werden müssen. Diese Transporter verbrauchen Energie, die ihnen entweder indirekt durch Ionengradienten oder direkt aus der Hydrolyse von ATP zur Verfügung gestellt wird. Bei erstgenannten Carrier-Systemen ist der Aufwärts-Transport eines Substrats gekoppelt mit einem Abwärts-Transport von Ionen, wie z.B. Na⁺ , H⁺ oder -HCO₃ ^- . Je nach Richtung des Substrattransports in oder aus der Zelle heraus wird zwischen Aufnahme- (Uptake) und Ausscheidungstransportsystemen (Efflux) unterschieden. Aufnahme-Carrier vermitteln die Resorption zahlreicher Nährstoffe und endogener Substrate, wie Aminosäuren, Peptiden, Zuckern, Nukleosiden, Gal-[Seite 8↓] lensäuren und Vitaminen. Efflux-Carrier sind in exkretorischen Organen, wie Leber oder Niere lokalisiert, wo sie Ausscheidungsfunktionen übernehmen.

Viele ABC-Transporter Gene wurden ursprünglich durch positionelle Klonierung bei der Suche nach Ursachen hereditärer Erkrankungen entdeckt. Zur Zeit können 14 ABC-Transporter Gene mit vererbbaren Erkrankungen in Verbindung gebracht werden (Tabelle 1). Entsprechend den breitgestreuten Funktionen von ABC-Transportern variieren auch genetische Erkrankungen, die durch diese Carrier ausgelöst werden. Da ABC-Transporter Gene typischerweise für Strukturproteine kodieren, sind entsprechende genetische Defekte rezessiv oder X-chromosomal vererbbar und durch eine verminderte Funktion oder den völligen Verlust der Transport-Aktivität gekennzeichnet.

Tabelle 1 : Krankheiten und Phänotypen, die durch genetische Veränderungen in ABC-Transporter Genen ausgelöst werden.

FHDLD, familiäre Hypoapoproteinämie; FFM, Fundus flavimaculatis; RP, Retinitis Pigmentosa 19; CRD, Zäpfchen/Stäbchen Dystrophie; AMD, altersabhängige makuläre Degeneration; PFIC, progressive familiäre intrahepatische Cholestase; ICP, intrahepatische Cholestase der Schwangerschaft; XLSA/A, X-chromosomale Sideroblastose und Anämie; CBAVD, kongenitale bilaterale Aplasie der Vasa deferentes; FPHHI, familiäre persistierende hyperinsulinämische Hypoglykämie in der Kindheit; ALD, Adrenoleukodystrophie.

Einige Mutationen in ABC-Transporter Genen sind letal. Die unbehandelte Zystische Fibrose (ABCC7/CFTR) veräuft in der Regel tödlich im ersten Lebensjahrzehnt. Der einzige embryonale Entwicklungsdefekt, der durch Mutationen in ABC Genen ausgelöst wird, ist die kongenitale Aplasie der Vasa deferentes. Die meisten ABC gene spielen daher keine Rolle bei der fetalen Entwicklung.

Gene der „ATP-binding cassette“ (ABC) Transporter bilden die größte Familie innerhalb der transmembranären Proteine. ABC-Transporter binden und hydrolysieren ATP und nutzen die dabei freiwerdende Energie, um diverse Substrate durch biologische Membranen zu transferieren. Voraussetzung für die Zuordnung eines Proteins zur ABC-Familie ist die Nukleotidsequenz und der Aufbau der ATP-bindenden Domäne, auch „nucleotide binding folds“ (NBF) genannt. Die NBFs müssen charakteristische Motive, Walker A und B genannt, enthalten, die durch ungefähr 90-120 Aminosäuren voneinander getrennt sind. Darüberhinaus kommt in ABC-Proteinen noch ein zusätzliches Element vor, das sogenannte Signatur- oder C-Motiv, das sich unmittelbar stromaufwärts der Walker B Stelle befindet. Ein typischer, funktionell aktiver ABC-Transporter enthält zwei NBFs und zwei transmembranäre Domänen (TMs). Eine TM wird aus 6-11 transmembranären α -Helices gebildet, die für die Substratspezifität verantwortlich sind. Die NBFs sind im Zytoplasma lokalisiert und stellen die bei der Hydrolyse von ATP freiwerdende Energie für die Transportfunktion zur Verfügung. ABC-Carrier sind überwiegend unidirektional und befördern Substrate beim Eukaryoten hauptsächlich aus dem Zytoplasma nach extrazellulär.

Eukaryotische ABC-Gene kodieren entweder für einen vollständigen Transporter, der aus zwei TMs und zwei NBFs besteht, oder nur für einen Halbtransporter. Beim letztgenannten muß entweder ein Homodimer oder ein Heterodimer gebildet werden, um einen funktionell aktiven Transporter zu bilden. ABC-Gene sind breitgestreut in eukaryotischen Genomen und treten als hochkonservierte Gene in verschiedenen Spezies auf. Dies deutet darauf hin, dass ABC-Transporter schon zu Beginn der Entwicklung von Eukaryoten aufgetreten sind. Die Gene werden in Unterfamilien nach der Ähnlichkeit ihrer Genstruktur (Halbtransporter vs. vollständiger Transporter), Anordnung ihrer Domänen und Nukleotidsequenz Homologie eingeteilt. Bei Säugern sind sieben ABC-Subfamilien bekannt. Für menschliche und Maus ABC-Gene ist eine Standard Nomenklatur von der „Human Genome Organization“ (HUGO) entwic-[Seite 10↓] kelt worden. Einzelheiten zum Schema dieser Nomenklatur sind unter: http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/abc.html zu finden.

Tabelle 2 : Klassifikation wichtiger Mitglieder des ABC-Transporter-Systems

Zellen können gegen toxische Substanzen resistent werden. Zu den Mechanismen, die eine Resistenz auslösen, gehören die verminderte Aufnahme, die verstärkte Entgiftung und die erhöhte Ausscheidung von Toxinen. Darüberhinaus kann es zu einer Modifizierung von Zielproteinen kommen. Meistens führt die Kombination dieser Mechanismen zur sogenannten Multiresistenz (multidrug resistance „MDR“), in der die Zelle nicht nur gegenüber der ur-[Seite 11↓] sprünglichen Substanz, sondern zusätzlich gegenüber einer Vielzahl von Zytostatika resistent ist. Dieses Phänomen limitiert den Erfolg einer Tumor-Chemotherapie empfindlich und führt außerdem zur Instabilität des Genoms und Verlust der Zellzyklus-Kontrolle der betroffenen Zellen, was die weitere Therapie zusätzlich erschwert. Mindestens 6 ABC-Transporter sind mit dem zellulären Export von Arzneistoffen assoziiert und spielen deshalb eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der MDR. Drei ABC-Gene werden fast regelmäßig in multiresistenten Tumorzellen exprimiert: ABCB1/MDR1/Pgp, ABCC1/MRP1 und ABCG2/MXR/BCRP.

Tabelle 3 : ABC-Transporter assoziiert mit Arzneimittelresistenz.

Umfangreiche Untersuchungen sind durchgeführt worden, mit dem Ziel die Entwicklung der MDR in der Tumortherapie zu verhindern. Dabei wurden zahlreiche Inhibitoren der wichtigsten ABC-Transporter entwickelt. Die parallele Gabe von Inhibitoren führte jedoch meistens zu einer erhöhten allgemeinen Toxizität der Zytostatika, da ABC-Transporter wichtige physiologische Bestandteile von Blut- Gewebeschranken sind. So konnten erhöhte ZNS-Nebenwirkungen von Tumortherapeutika mit der Inhibition von an der Blut- Hirnschranke exprimiertem Pgp in Verbindung gebracht werden (Tanigawara, 2000). Dadurch sind Dosislimitierungen der Zytostatika notwendig geworden, die für die Tumorsuppression nicht vorteilhaft waren. Neuere Untersuchungen ergaben jedoch hochspezifische Inhibitoren mit hoher Affinität zu ABCB1, die kaum zu unerwünschten Reaktionen führten oder das Zytostatika-Schema beeinflussten.

P-Glykoprotein wurde vor knapp 30 Jahren von Juliano und Ling entdeckt und ist der zur Zeit am besten untersuchte ABC-Transporter überhaupt. Seine herausragendste Eigenschaft ist ein extrem breites Substratspektrum, das sich durch eine Vielfalt molekularer Strukturen auszeichnet. Unter den Transportsubstraten finden sich zahlreiche Arzneistoffe, die in unterschiedlichen Indikationen Anwendung finden (Tabelle 4). Eine Reihe von Zytostatika werden durch Pgp transportiert, weswegen dieser Carrier auch ursprünglich als wichtiger Auslöser der MDR identifiziert wurde. Es gibt nur wenige gemeinsame Strukturmerkmale, die Transportsubstrate des Pgp aufweisen. Pgp-Substrate sind in der Regel organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von unter 200 Da bis fast 1900 Da. Die molekulare Struktur enthält häufig aromatische Gruppen, aber nicht-aromatische lineare oder zirkuläre Substrate werden ebenfalls transportiert. Die meisten Moleküle, die gut transportiert werden, sind nicht geladen oder schwache Basen. Es gibt jedoch auch saure Substanzen, wie Methotrexat oder Phenytoin, die ebenfalls Transportsubstrate von Pgp sind, wenn auch nur schwache. Allen Pgp-Substraten gemeinsam ist jedoch ihr amphipathischer Charakter. Dies könnte mit dem Transport-Mechanismus zusammenhängen, der für Pgp postuliert wurde. Danach inserieren die Substrate zuerst in der inneren Hälfte der Zytoplasmamembran und werden anschließend entweder durch Pgp in die äußere Hemimembran „geflippt“ oder direkt in den Extrazellulärraum transferriert (Borst P und Elferink RO, 2002). Nur amphipathische Moleküle haben die geeigneten physikochemischen Eigenschaften, um in biologischen Membranen zu inserieren.

Tabelle 4 : Arzneistoffe, die durch P-glycoprotein transportiert werden.

Pgp ist hauptsächlich am apikalen Pol epithelialer Zellen lokalisiert. Deshalb ist der Transport von Pgp-Substraten von basolateral nach apikal gerichtet. Dies kann für Arzneimittel, die von Pgp transportiert werden, weitreichende Konsequenzen bezüglich der Aufnahme, Verteilung und Elimination haben. Viele dieser pharmakologischen Aspekte wurden zuerst an so-[Seite 14↓] genannten Knockout-Mäusen, die defizient für die Maus Homologe Mdr1a und/oder Mdr1b des menschlichen Pgp waren, ermittelt (Kwei et al., 1999; Polli et al., 1999).

Viele Arzneimittel oder Fremdstoffe können Blut- Gewebeschranken nicht oder nur schwer überwinden. Dadurch werden sensible Organe und Strukturen, wie z.B. das ZNS, Testes, Fetus und periphere Neurone vor Toxinen geschützt.

Endotheliale Zellen in den Kapillaren des ZNS sind durch sogenannte Tight-Junctions eng miteinander verbunden. Deshalb können Substanzen, die nicht klein genug sind, um durch den Interzellularraum zu diffundieren, nur durch Passage der Endothelzellen in das umgebende Hirngewebe gelangen. Da die meisten Pgp-Substrate ziemlich hydrophob sind, können sie prinzipiell durch passive Diffusion die endothelialen Zellmembranen überwinden und so im ZNS akkumulieren. In der luminalen (apikalen), d.h. dem Blut zugewandten Seite, befinden sich jedoch zahlreiche Pgp Transporter (Tanigawara, 2000). Somit können Substrate, die in die Endothelzellen von der Blutseite aus gelangen, sofort wieder in das kapilläre Lumen zurückgepumpt werden. Durch diesen Mechanismus wird der Nettofluß von Substraten in das ZNS sehr gering gehalten. Fehlt das Pgp an der Blut- Hirnschranke, wie z.B. bei Mdr1a Knockout-Mäusen, so kann die Konzentration von Pgp-Substraten im ZNS das 10- bis 100-fache gegenüber Kontrolltieren betragen. In Analogie zur Blut- Hirnschranke ist die Expression und Funktion des Pgp an den anderen Blut- Gewebeschranken zu sehen. Erwähnt werden sollte noch, das Pgp nicht der einzige ABC-Transporter ist, der am Aufbau dieser Diffusionsbarrieren beteiligt ist. Auch MRP1, BCRP und möglicherweise MRP2 sind wichtige Bestandteile der Blut- Gewebeschranken.

Sowohl die kanalikuläre Membran von Hepatozyten, als auch die apikale (villöse) Membran intestinaler Epithelzellen des Dünn- und Dickdarms enthalten große Mengen von Pgp. Dort können Arzneistoffe, die Substrate von Pgp sind, effizient von der Leber in die Galle bzw. vom Darm über die Faeces ausgeschieden werden. Letzgenannter Vorgang wird von einigen Autoren auch im Gegensatz zur Absorbtion als sogenannte Exsorbtion bezeichnet. In Untersuchungen an Pgp Knockout-Mäusen wurden sowohl die biliäre als auch die intestinale Exkretionsfunktion des Pgp verifiziert. Die Clearance intravenös applizierter Arzneistoffe war in Kontrolltieren schneller und vollständiger, als in Pgp-defizienten Tieren.

Die hohe intestinale Expression von Pgp führt zu einer verminderten oralen Bioverfügbarkeit von Arznei- und Fremdstoffen, die Transportsubstrate von Pgp sind. Dies konnte in Pgp Knockout-Mäusen erstmals an der erhöhten Passage des Anti-Tumormittels Paclitaxel im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eindrücklich demonstriert werden (Stephens, 2002). Weitere Untersuchungen mit zahlreichen anderen Arzneistoffen konnten die Barriere- Funktion des Pgp für die intestinal Resorption verifizieren. Für einige Arzneistoffe, die nur einen engen therapeutischen Bereich aufweisen, wie z.B. Ciclosporin A, könnte die intestinale Pgp-Funktion ein ernsthaftes Problem darstellen. Aus diesem Grunde ist es für die pharmazeutische Industrie von großem Interesse, zu prüfen, ob ein Arzneistoff in der Entwicklung ein Transportsubstrat von Pgp ist.

Obwohl Pgp in großer Menge in den apikalen (luminalen) Membranen der proximalen Tubuli der Niere exprimiert wird ist seine Rolle bei der renalen Clearance von Arznei- und Fremdstoffen nicht eindeutig klar. Eigentlich sollte Pgp zur Exkretion von Substraten vom Blutplasma in den Urin beitragen. Die meisten pharmakologischen Untersuchungen an Pgp Knockout-Mäusen ergaben jedoch keine eindeutigen Belege für diese Funktion. In einigen Studien führte die Abwesenheit von Pgp sogar zu einer verstärkten renalen Exkretion und Clearance von Arzneistoffen, über dessen Ursachen bisher nur spekuliert wird. Angesichts der belegbaren Exkretionsfunktion von Pgp in anderen Organen und Geweben wird jedoch vermutet, dass Pgp in der Niere eine ähnliche Funktion übernehmen sollte. Weitere Untersuchungen werden diese Frage klären müssen.

Die Leberzelle ist eine polarisierte epitheliale Zelle, deren basolaterale (sinusoidale) und apikale (kanalikuläre) Plasmamembrandomäne durch „tight junctions“ voneinander getrennt sind. Zur Erhaltung des enterohepatischen Kreislaufs sind aktive Carrier-Systeme nötig, die durch ihre polare Anordnung an der Zytoplasmamembran einen vektoriellen Transport von Gallensäuren und anderen gallepflichtigen Substanzen vom portalen Blut in das Gallengangsystem aufrechterhalten. Die Aufnahme biliärer Substrate in die Leberzelle wird durch basolateral lokalisierte Transport-Systeme vermittelt, die mit dem portalen Blut über Fenestrae sinusoidaler Endothelien und den Disseschen Raum in Kontakt stehen. Zu den basolateralen Carriern gehören das hochaffine Na⁺ -abhängige Gallensäure Aufnahme System NTCP/Ntcp und [Seite 16↓] eine Familie von multispezifischen oranischen Anionen Transportern OATP/Oatp, die neben der Na⁺ -unabhängigen Aufnahme von Gallensäuren noch eine Reihe weiterer Substrate in den Hepatozyten befördern. Nach Aufnahme in die Hepatozyten gelangen Gallensäuren und andere cholephile Substrate via Diffusion durch das Zytoplasma, oder über intrazelluläre Membranvesikel an den kanalikulären Pol. Die kanalikuläre Membrandomäne ist der exkretorische Abschnitt der Hepatozytenmembran und bildet die Begrenzung der Gallenkanalikuli. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Gallesekretion wird durch kanalikuläre Carrier-Systeme vermittelt, die Substrate gegen einen großen Konzentrationsgradienten transportieren. Die Energie für diesen steilen Aufwärtstransport beziehen diese Transporter durch die Hydrolyse von ATP. Aus diesem Grunde gehören die kanalikulären Transmembrantransporter fast ausschließlich zur ABC Familie.