C. Material und Methoden

1. Versuchstiere, -haltung

↓11

Die Genehmigung aller hier aufgeführten Versuche erfolgte duch das Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin mit Zustimmung des örtlichen Tierarztes.

Für die Versuche wurden männlichen Wistar-Ratten (Gewicht ca. 200–300 g) der Fa. Harlan-Winkelmann, Borchen, Deutschland verwandt. Das Akklimatisierungsintervall zwischen Eintreffen der Tiere und Versuchsbeginn betrug mindestens eine Woche. Die Tiere wurden unter konstanten Temperaturbedingungen bei 20 bis 24°C zu fünf Tieren pro Käfig im Forschungshaus der Charité, Humboldt-Universität Berlin, Campus Virchow-Klinikum, untergebracht. Sie hatten freien Zugang zu Futter und Trinkwasser ad libitum und einen natürlichen Tag-/ Nachtrhythmus.

2. Versuchsprotokolle

2.1. Projekt 1 – IP-Zeitprotokoll

Verschiedene Zeitprotokolle sind bisher in der Literatur benutzt worden, um die Effizienz der IP-Behandlung zu untersuchen. Daher wurde zunächst systematisch der Einfluß der Dauer der Ischämie- bzw. der Reperfusionsphase im Rahmen der IP-Behandlung auf die Intensität des hepatischen IR Schadens analysiert. Letzterer wurde anhand der postischämischen Ausschüttung der Serumenzyme AST, ALT und GLDH quantifiziert. Diese Voruntersuchungen dienten der Festlegung eines optimalen IP-Zeitprotokolls für die nachfolgenden Versuche.

↓12

Die Leberischämie betrug bei allen Tieren 45 min, abgesehen von einer Kontrollgruppe (sham operation). Diese Zeitspanne ist ausreichend, um einen signifikanten hepatozellulären Schaden zu induzieren, wobei gleichzeitig gewährleistet ist, daß diese Schädigung mit dem Leben vereinbar ist, so daß alle Versuchstiere überleben. Die untersuchten IP-Zeitintervalle sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben (Tabelle 1). Die Enzymkonzentrationen wurden 24 h nach Leberischämie im Serum der Tiere gemessen.

Tabelle 1: Projekt 1 / verschiedene IP-Zeitintervalle

IP Intervall

(in min)

warme Leberischämie

(in min)

Zeitpunkt der Messung

(h nach Reperfusion)

n =

0

0

24

9

0

45

24

11

5/5

45

24

8

5/10

45

24

8

5/15

45

24

8

5/30

45

24

8

5/45

45

24

5

15/30

45

24

8

10/10

45

24

8

2.2. Projekt 2 – warme Leberischämie

Im zweiten Projektabschnitt wurde der Einfluß von IP und MP auf den IR Schaden der Leber nach warmer Organischämie untersucht. Drei Behandlungsgruppen wurden dabei unterschieden. In der ersten Gruppe wurde keine Vorbehandlung vor der Leberischämie durchgeführt, so daß diese Gruppe als unbehandelte, ischämische Kontrollgruppe fungierte. Die zweite Gruppe wurde mittels IP vorbehandelt, wobei das effizienteste IP-Zeitprotokoll aus Projekt 1 angewandt wurde. In der dritten Gruppe erfolgte eine pharmakologische Präkonditionierung mit Methylprednisolon (MP) in einer Dosierung von 30 mg/kgKG, welches 2-3 min vor Induktion der Leberischämie über die Penisvene appliziert wurde. Die Leberischämie betrug bei allen Tieren 45 min.

↓13

1.

unbehandelte, ischämische Kontrolle

+ 45 min Leberischämie

2.

IP-Vorbehandlung

+ 45 min Leberischämie

3.

MP-Vorbehandlung

+ 45 min Leberischämie

Die Analyse von Blut und Lebergewebe erfolgte vor der Behandlungsphase (baseline), unmittelbar nach der Reperfusion (0 h), sowie 3, 6 und 24 h nach Reperfusion (n=8 pro Zeitpunkt und Gruppe). In dieser Versuchsreihe wurde das Ausmaß der IR Schädigung anhand der Serumkonzentrationen von AST, ALT und GLDH sowie der morphologischen Schädigungsmuster in der histologischen Übersichtsfärbungen mit Hämatoxylin-Eosin (HE) bestimmt. Desweiteren wurde die postischämische apoptotische Aktivität mittels Western Blot-Nachweis von Caspase 3, rt-PCR-Nachweis von Cytochrom C und TUNEL-Färbung analysiert und quantifiziert. Ebenso wurde die postischämische inflammatorische Aktivität in der Leber anhand des rt-PCR-Nachweis von ICAM-1 und des Myeloperoxidasegehaltes (MPO) in der Leber bestimmt. Zusätzlich erfolgte die Auszählung der inflammatorischen Zellen (polymorphkernige Leukozyten, Monozyten, Lymphozyten) im Lebergewebe. Auf transkriptioneller Ebene wurde die Bindungsaffinität und damit die Aktivität des Transkriptionsfaktors NFkB mittels Electrophoric Mobility Shift Assay (EMSA) bestimmt. Die Intravitalmikroskopie erfolgte zur Analyse weiterführender pathophysiologischer Untersuchungen bei IP-behandelten und unbehandelten, ischämischen Kontrollen.

2.3. Projekt 3 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (70%)

Im dritten Projekt wurde der Einfluß von IP und MP auf die hepatozelluläre Regeneration nach 70%-iger Leberresektion (LTR) bei gleichzeitiger warmer Organischämie untersucht. Die warme Leberischämie betrug bei allen Tieren 30 min, während derer die Resektion durchgeführt wurde. Eine 70%-ige Leberresektion (selbst in Kombination mit 30 min warmer Ischämie) garantiert ein 100%-iges Überleben der Tiere, so daß regenerative Vorgänge gut zu untersuchen sind.

↓14

Es wurden drei Behandlungsgruppen untersucht. In der Kontrollgruppe wurde die Resektion unter Ischämie durchgeführt. Eine Vorbehandlung erfolgte hier nicht, so daß diese Tiere als nicht-behandelte, ischämische Kontrolltiere fungierten. In der IP-Gruppe wurde die Organkonditionierung mit dem effizientesten IP-Zeitprotokoll aus Projekt 1 durchgeführt. Methylprednisolon wurde in einer Dosierung von 30 mg/kgKG 2-3 min vor Induktion der Leberischämie bzw. -resektion über die Penisvene appliziert.

1.

unbehandelte, ischämische Kontrolle

+ 30 min Leberischämie + 70% Resektion

2.

IP-Vorbehandlung

+ 30 min Leberischämie + 70% Resektion

3.

MP-Vorbehandlung

+ 30 min Leberischämie + 70% Resektion

Zur Quantifizierung des IR-Schadens wurde 6 h postoperativ aus der Schwanzvene Blut entnommen und die Serumenzyme AST, ALT und GLDH bestimmt. Die weitere Analyse von Blut und Lebergewebe zur Beurteilung der regenerativen Vorgänge erfolgte an Tag 1, 4 und 7 nach der Operation (n=8 pro Zeitpunkt und Gruppe). Hierzu wurden mittels Immunhistochemie Ki-67 positive Hepatozyten nachgewiesen. Anhand von HE-Färbungen wurde die Anzahl der mitotischen Zellen pro 2000 Hepatozyten ausgezählt. Zusätzlich erfolgte die Bestimmung der Serumkonzentrationen von AST, ALT, Bilirubin und Albumin. Ebenso wurde in allen Gruppen das Gewicht der regenerierenden Restleber bezogen auf das jeweilige Körpergewicht an den entsprechenden postoperativen Tagen gemessen und analog zum Gesamt-Körpergewicht zwischen den Gruppen verglichen.

2.4. Projekt 4 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (90%)

↓15

Im Gegensatz zur 70%-igen Resektion stellt die 90%-ige Leberresektion eine subletale Kondition dar. Daher wurde in dieser Versuchsreihe eine Überlebensanalyse durchgeführt, um Rückschlüsse auf die Regeneration nach IP- bzw. MP-Behandlung ziehen zu können (n=10 pro Gruppe). Desweiteren erfolgte die Analyse der frühen postischämischen Mikrozirkulation mittels IVM und Laserdopplerflowmetrie (n=8 pro Gruppe). Hierbei wurde der Einfluß der postischämischen Mikrozirkulation auf die Regeneration in ausgedehnt resezierten, sogenannten small-for-size Lebern analysiert. Die warme Leberischämie betrug bei allen Tieren 30 min, während derer die Resektion durchgeführt wurde.

Es wurden drei Behandlungsgruppen untersucht. In der Kontrollgruppe wurde die Resektion unter Ischämie durchgeführt. Eine Vorbehandlung erfolgte nicht, so daß diese Tiere als nicht-behandelte, ischämische Kontrolltiere fungierten. In der IP-Gruppe wurde die Organkonditionierung mit dem effizientesten IP-Zeitprotokoll aus Projekt 1 durchgeführt. In Gruppe 3 wurde Methylprednisolon in einer Dosierung von 30 mg/kgKG 2-3 min vor Induktion der Leberischämie bzw. -resektion über die Penisvene appliziert.

1.

unbehandelte, ischämische Kontrolle

+ 30 min Leberischämie + 90% Resektion

2.

IP-Vorbehandlung

+ 30 min Leberischämie + 90% Resektion

3.

MP-Behandlung

+ 30 min Leberischämie + 90% Resektion

3. Narkose, Operation

↓16

Materialien/Geräte

Operationsinstrumente

Mikrochirurgische Instrumente

Nahtmaterial:

↓17

Ethicon® Vicryl 3-0

Johnson & Johnson, Intl, SA8JQBB0

Prolene® 6-0

Ethicon®, Norderstedt, D, JL4HQPB

Resolon® 3-0

Resorba®, Nürnberg, D, REF 881519

Narkosegerät

Reagenzien

↓18

Isoflurane

Abbott GmbH, Wiesbaden, D

Methylprednisolon

Aventis Pharma, D

Pentobarbital

Abbott, USA

Ketanest

Parke-Davis GmbH, Berlin, D

Xylacin

Rompun®, Bayer, Leverkusen, D

Die Narkoseeinleitung der Tiere erfolgte durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (Dosierung: 25-45 mg/kg Körpergewicht). Dieses nur hypnotisch wirkende Barbiturat wurde in Versuch 1 durch eine i.m. Narkose mit Ketanest und Xylacin ergänzt. Hierzu wurde Ketanest/Xylacin 2% im Verhältnis 1:4 intramuskulär mit einer Konzentration von 0,1ml pro 100 mg Körpergewicht injiziert. In den Versuchen 2, 3 und 4 wurde eine Inhalationsnarkose mit einem Isofloran/Sauerstoffgemisch durchgeführt. Die Überwachung der Narkosetiefe erfolgte jeweils durch den Chirurgen mittels Kontrolle der Herz- und Atemfrequenz.

Nach Erreichen einer ausreichenden Narkosetiefe erfolgt in Rückenlage eine mediane Laparatomie und die Präparation des Ligamentum hepatoduodenale zur Darstellung der die Leber versorgenden Gefäße. Durch Setzten eines mikrovaskulären Clips auf das Ligamentum hepatoduodenale wurde eine warme Leberischämie eingeleitet. Entsprechend der Versuchsgruppen wurde zuvor eine ischämische oder eine pharmakologische Präkonditionierung durchgeführt.

↓19

Im Falle einer Leberresektion wurden zusätzlich bei bestehender Ischämie die Haltebänder der Leber durchtrennt und eine 70%-ige bzw. 90%-ige Leberteilresektion nach der Methode von Higgins und Anderson [Higgins 1931] durch eine Ligatur mit Vicryl 3/0-Nahtmaterial nahe dem den entsprechenden Leberlappen versorgenden Gefäßstamm durchgeführt (Abbildung 2). Nach Reperfusion und Bluttrockenheit erfolgt der Bauchdeckenverschluß mit einer fortlaufenden Naht sowie die i.m. Injektion eines Analgetikums gegen postoperativen Schmerz. Postoperativ wurden alle Tiere mit ungehindertem Zugang zu Wasser und Futter ad libitum in Einzelkäfigen gehalten und täglich visitiert. Zusätzlich erhielten alle resezierten Tiere bis zum vierten postoperativen Tag Glukose 20% ad libitum über das Trinkwasser.

Abhängig von der Versuchsgruppe wurden die Tiere am Ende des Beobachtungszeitraums zur Blut und Gewebeentnahme in Narkose durch Ausbluten getötet. Aus der Vena cava inferior wurde Blut in ein 5 ml Serumröhrchen aufgezogen und sofort auf Eis gelagert. Anschließend wurde die Leber entnommen, gewogen und für weitere Gewebeuntersuchungen in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder in Formalin konserviert.

Abbildung 3: Parenchymmasse vor bzw. nach 70%-iger und 90%-iger Leberresektion einer 200-300 g schweren Wistar-Ratte (Verlauf der V. cava inferior - Plastikschlauch)

4. Analysen (Parameter und Analysetechniken)

4.1. Serumparameter (Albumin, Bilirubin, AST, ALT, GLDH)

↓20

Im Serum der Versuchstiere wurden die Konzentrationen von Albumin und Bilirubin sowie der Enzyme AST, ALT und GLDH gemessen. Aufgrund des Verteilungsmusters innerhalb der Leberzelle (AST/ALT - Zytosol, GLDH - Mitochondrien) kann die Analyse dieser Parameter über die Schwere der zellulären IR Schädigung Auskunft geben. Desweiteren erlaubt die Analyse der Parameter Albumin und Bilirubin Rückschlüsse auf die Synthese- und Entgiftungsfunktion der Leber [Gressner 1989, Shaked 1997]. Hierzu wurden, bevor das Serum abpipettiert wurde, die in Serumröhrchen aufgenommenen Blutproben in einer vorgekühlten Zentrifuge mit 3000 x g für 10 min zentrifugiert. Die Untersuchungen wurden anschließend in der Abteilung Klinische Chemie der Charité, Humboldt-Universität Berlin, Campus Virchow-Klinikum mit handelsüblichen Reaktionskits durchgeführt.

4.2. Histologische Färbung (Hepatozelluläre Schädigung, Mitose Index, Inflammatorisches Infiltrat)

Zur histomorphologischen Beurteilung wurde Lebergewebe mittels Hämatoxylin-Eosin- (HE-) Färbung aufgearbeitet. Diese Übersichtsfärbung wurde gewählt, da hiermit einerseits das Ausmaß der hepatozellulären Schädigung quantifiziert werden kann und andererseits sowohl die Anzahl der mitotischen Hepatozyten als auch die Intensität des inflammatorischen Infiltrates ausgezählt werden kann.

Bei der HE-Färbung entsteht durch Oxidation des Hämatoxylins der Farbstoff Hämatein, der mit Aluminiumionen einen positiv geladenen Komplex bildet. Dieser reagiert mit den negativ geladenen Phosphatgruppen der Nukleinsäuren des Zellkerns, welcher dadurch im Präparat blau erscheint. Um das Zytoplasma anzufärben, wird das schwach saure Eosin verwendet, welches dieses rosa erscheinen läßt.

↓21

Materialien/Geräte:

Kryostat Microtom HM 500 OM

Microm-Laborgeräte, Walldorf, D

Objektträger SuperFrost

R.Langenbrinck, Emmendingen, D

Microtom

Leica Microsystem, Nussloch, D

Schüttler

Heidolph, Kelheim, D

Reagenzien:

↓22

Aceton

J.T.Baker, 8002, Deventer, NL

Hematoxylin

Sigma, HHS-32, Deisenhofen, D

Eosin, wässrig (0,3%)

Sigma, HT-110-2-80, Deisenhofen, D

Ethanol

Merck, Darmstadt, D

Essigsäure (99,8%)

Riedel de Haen, 33209, Seelze, D

Vitro-Clud

R.Langenbrinck, Emmendingen, D

Freezing Medium

Killik, 490110, Milano, Italien

Um das Ausmaß der hepatozellulären Schädigung histologisch zu quantifizieren, wurde bei der Auswertung der Schnitte ein histomorphologischer Score nach Bilbao angewandt [Bilbao 1999] (Tabelle 2). Es wurden jeweils 10 Gesichtsfelder pro Präparat analysiert. Die Analyse der in die Leber infiltrierten inflammatorischen Zellen erfolgte durch Zählung der polymorphkernigen Leukozyten, Monozyten und Lymphozyten in wenigstens 5 Gesichtsfeldern bei 400-facher Vergrößerung. Das leukozytäre Infiltrat wurde als absolute Anzahl der inflammatorischen Zellen pro Gesichtsfeld angegeben. Die Quantifizierung der mitotischen Zellen (Mitose Index) erfolgte durch Auszählung von insgesamt 2000 Hepatozyten und wurde als absolute Anzahl aller mitotischen Hepatozyten pro 2000 Zellen angegeben.

Tabelle 2: Histologisches Grading [Bilbao 1999]

Grading zur Bestimmung des Zellschadens

Grad

Ausmaß des Zellschadens

histologische Kriterien

0

kein Zellschaden

klar abgrenzbare Zellgrenzen; runde, gleich-mäßige Kerne

1

leichter Zellschaden

leicht entrundete Kerne, Zellgrenzen erhalten

2

mäßiger Zellschaden

Verschwinden der Zell- und Kerngrenzen; Karyorrhexis, kondensiertes Chromatin; intra-zytoplasmatisch teils perinukleäre Vakuolen-bildung, Chromatinverklumpung

3

starker Zellschaden

massivster Zellschaden mit allen genannten Morphologien, keine Zellgrenzen mehr erkennbar

4.3. Immunhistochemie (TUNEL, Ki67)

↓23

Immunhistochemische Färbungen ermöglichten die Analyse von apoptotischen (TUNEL Färbung) [Clavien 2000] und regenerativen (Ki-67 Färbung) Vorgängen [Gerlach 1997]. Die Immunhistochemie dient dem Nachweis antigener Zielstrukturen mittels Antigen-Antikörper-Reaktion und anschließender Sichtbarmachung durch Farbstoffreaktionen. Nach Anlagerung eines primären und eines biotinierten sekundären Antikörpers erfolgt eine Farbreaktion, die auf der Bindung von Biotin an Streptavidin, einem Protein aus dem Strahlenpilz Streptomyces avidinii, beruht. Ein löslicher Streptavidin-Peroxidase-Konjugat oxidiert letztendlich ein Chromogen, das in der oxidierten Form durch einen Farbumschlag sichtbar wird. Vereinfacht gesagt fungiert der biotinierte Sekundärantikörper als Bindeglied für die Reaktion des Chromogens, da sich zwischen Biotin und dem Streptavidin-Peroxidase-Komplex (Markermolekül) eine nahezu irreversible Bindung ausbildet. Ungebundene Markermoleküle werden ausgewaschen, so daß nur gebundene eine positive (Farb-)Reaktion hervorrufen.

Materialien/Geräte:

Kryostat Microtom HM 500 OM

Microm-Laborgeräte, Walldorf, D

Objektträger

Langenbrinck, 041300, Emmendingen, D

Mikrotom

Leica Microsystem, Nussloch, D

↓24

Reagenzien:

Protein K Solution

30 µl

10x TdT Labeling Buffer

100 ml

10x TdT Stop Buffer

100 ml

TdT dNTP Mix

30 µl

TdT Enzyme

30 µl

Streptavadin-HRP

30 µl

DAB Solution

3,75 ml

Methyl Green Stain (0,1%)

50 ml

50x Co2+

30 µl

50x Mg2+

30 µl

50x Mn2+

30 µl

Cytonin

5 ml

TACS- Nuclease

15 µl

TACS- Nuclease Buffer

1,5 ml

Aceton

J.T.Baker,8002, Deventer, NL

DAKO Pen

DAKO, S2002, Glostrup, Denmark

Biotin Blocking System

DAKO, X0590, Carpintiera, CA, USA

Peroxidase Blocking Reagent

DAKO, S2001, Carpintiera, CA, USA

Protein Block Serum-Free

DAKO, X909, Carpintiera, CA, USA

Liquid Dab + Substrate-Chromogen Solution

DAKO, K3467, Carpintiera, CA, USA

Peroxidase-Conjugated Streptavidin

DAKO, P0397, Carpintiera, CA, USA

Monoclonal Mouse Anti-Rat Ki-67 Antigen

DAKO, M7248, Carpintiera, CA, USA

Biotinylated Rabbit Anti-Mouse Immunglobulin

DAKO, E0464, Carpintiera, CA, USA

Die Beurteilung der Apoptose erfolgte mittels TUNEL Färbung, welche geeignet ist, um einerseits apoptotische Vorgänge nachzuweisen sowie andererseits diese durch Auszählen der apoptotischen Zellen zu quantifizieren [Clavien 2000]. Diese Färbung basiert auf der Identifizierung von apoptotischen Zellen durch farbliche Darstellung von DNA Fragmenten. Die Quantifizierung der Apoptose erfolgte durch Auszählung der angefärbten Zellen in 20 Gesichtsfeldern bei 400-facher Vergrößerung und wurde als Prozent der TUNEL-positiven Zellen pro Gesamtzellzahl angegeben.

↓25

Die Quantifizierung der Ki-67 positiven Zellen erfolgte durch Auszählung der angefärbten Zellen pro 1000 gezählter Hepatozyten in der Ki-67 Färbung bei 200-facher Vergrößerung und wurde als Prozent der Ki-67 positiven Zellen angegeben. Das Protein Ki-67 kann in allen Zellen nachgewiesen werden, die sich aktiv im proliferativen Zellzyklus befinden [Gerlach 1997].

4.4. Myeloperoxidase (MPO)-Gewebskonzentration der Leber

Der MPO-Gehalt in der Rattenleber wurde zur Beurteilung der Intensität der postischämischen hepatischen Inflammation gemessen. MPO wird aus neutrophilen Granulozyten freigesetzt und kann somit als Parameter der neutrophilen Infiltration und Aktivierung im postischämischen Lebergewebe fungieren [Colletti 1996].

Reagenzien:

↓26

K2HPO4

Merck, 1.05104.1000, Darmstadt, D

K2EDTA

Fluka, 03662, Neu-Ulm, D

KH2PO4

Merck, 4873.1000, Darmstadt, D

Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB)

Sigma, H-9151, Deisenhofen, D

Tetramethylbenzidin (TMB)

Sigma, T-2885, Deisenhofen, D

DMSO

Fluka, 41640, Neu-Ulm, D

H2O2 (30% stabilisiert)

Merck, 822287, Hohenbrunn, D

H2SO4 2N

Merck, 731.100150, Darmstadt, D

MPO (für Standards)

Sigma, M-6908, Deisenhofen, D

Zur Bestimmung des MPO-Gehaltes in der Leber wurden ca. 100 mg kryokonserviertes Gewebe in 0,05 M Kaliumdihydrogenphosphat (KDHP) Puffer und 0,5%-igem (w/v) Hexasecyltrimethylammoniumbromid (HTAB) mit Hilfe eines Ultraturrax dismembriert. Die Proben wurden anschließend auf Eis gelagert. Das Detergenz HTAB setzt aus den primären Granula der Neutrophilen Granulozyten MPO frei. Nach Zentrifugation der Proben mit 2000 x g bei 4°C wurden jeweils 1 ml der Überstände für 2 Stunden bei 60°C inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation mit 15000 x g für 2 Minuten wurden 25 µl der abgekühlten Probe in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Zu den Proben wurden 25 µl eines Tetramethylbenzidin-Dimethyl-Sulfoximin-(DMSO) Gemisches (0,1% w/v) und 200 µl eines H2O2/KDHP Gemisches (1:18000) in die Mikrotiterplatte gegeben. Nach 5 Minuten Inkubationszeit bei 37°C wurden 50 µl einer 2 M H2SO4-Lösung dazu gegeben, um die kinetische Reaktion zu unterbrechen. Die Messung der Extinktion erfolgte bei 450 nm im Fluostar. Die Berechnung der MPO-Konzentrationen erfolgte über eine Standardkurve, die anhand von MPO-Standards der Konzentrationen von 15,7 mU/ml bis 1000 mU/ml erstellt wurde.

4.5. Hepatische Mikrozirkulation (Intravitalmikroskopie, Laserdopplerflowmetrie)

Mittels der Intravitalmikroskopie wurden die Mikroperfusion in der Rattenleber gemessen. Hierbei wurde das Ausmaß der postischämischen Mikrozirkulationsstörung und die Intensität der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion analysiert [Menger 1999]. Die Durchführung der IVM-Untersuchungen erfolgte im Institut für Experimentelle Chirurgie (Leiter: Prof. Dr. med. M. Menger) an der Universität Homburg/Saar sowie der Abteilung für Experimentelle Chirurgie (Leiterin: Prof. Dr. med. B. Vollmar) an der Universität Rostock.

↓27

Materialien/Geräte:

Zeiss Axio-Tech Mikroskopie

Zeiss, Oberkochen, D

FK 6990 Videokamera

Prospective Measurements Inc., USA

Video System VO-5800 PS

Sony, München, D

Cliniflow II Model FM 701D

Carolina Medical Electronics, USA

Flußmeßköpfe SF105 und SF 107,5

Carolina Medical Electronics, USA

Reagenzien:

↓28

Natrium Fluoreszein

Merck, Darmstadt, D

Rhodamin-6G

Merck, 1.07599.0100, Darmstadt, D

Die IVM wurde in einer „epi-illiuminations“ Technik durchgeführt, nachdem das Versuchstier in Linksseitenlage gelagert wurde. Die Aufnahmen wurden auf Video aufgenommen und nach Digitalisierung mit dem Capimage-Programm ausgewertet. Zum Erhalt eines Hintergrundbildes wurde dem Versuchstier 2 µmol/kgKG Natrium-Fluoreszein intravenös injiziert. Die sinusoidale Perfusion wurde quantifiziert durch die Bestimmung der Anzahl der perfundierten Sinusoide in 10 repräsentativen Acini und als durchschnittliche prozentuale sinusoidale Perfusion angegeben.

Während der IVM wurden die Leukozyten in vivo mit Rhodamin-6G (0,1 µmol/kg i.v.) gefärbt und entsprechend ihrer Interaktion mit der sinusoidalen oder postsinusoidalen Gefäßwand analysiert. Die stagnierenden sinusoidalen Leukozyten sind definiert, als jene an der Gefäßwand anhaftende Leukozyten im midzonalen Segment für länger als 20 Sekunden. Analysiert wurden 10-15 randomisiert ausgewählte Acini pro Tier, angegeben als n Zellen pro mm². Die Einteilung der Leukozyten in den postsinusoidalen Venolen erfolgte nach dem folgenden Prinzip. Jene Leukozyten, welche länger als 20 Sekunden Kontakt mit der Gefäßwand hatten, wurden als stagnierende Leukozyten definiert. Es wurde eine Gefäßlänge von 100 µm für die Untersuchung beobachtet. Die stagnierenden Leukozyten, die sogenannten „Stickers“, wurden als n Zellen pro mm² angegeben. Jene Leukozyten, die weniger als 20 Sekunden Kontakt mit der Gefäßwand hatten, wurden als temporäre stagnierende Leukozyten, sogenannte „Rollers“, definiert. Angegeben wurden die „Rollers“ in % zur Gesamtzahl der die Venolen durchfließenden Leukozyten, wobei als Grundlage die Auszählung der passagierten Leukozyten innerhalb von 20 Sekunden über ein Gefäßabschnitt von 100 µm war. Es wurden jeweils 5-10 Venolen pro Tier analysiert [Vollmar 1994]. Darüber hinaus erfolgte bei der Intravitalmikroskopie die Messung der NADH Fluoreszenz der Leberoberfläche, die einen Indikator für die mitochondriale Funktion darstellt [Vollmar 1997]. Die Messung der erythrozytären Flußrate (velocity) bzw. der erythrozytären Flußrate (velocity) bezogen auf auf den Gefäßdurchmesser (volumetric blood flow) erfolgte in 5 postsinusoidalen Venuolen und in 8-10 individuellen Sinusoiden der midzonalen Region [Richter 2001].

↓29

Die Laserdopplerflowmetrie zur Messung der Blutflußgeschwindigkeit in der V. portae erfolgte nach dem elektromagnetischen Prinzip mit dem Cliniflow® II Model FM 701D und den Flußmeßköpfen SF105 (5 mm) und SF 107,5 (7,5 mm). Die Flußköpfe wurden intraoperativ direkt um die V. portae plaziert, und es wurde vor Induktion der Ischämie, sowie 1, 3, 5 und 10 min nach Reperfusion die portalvenöse Flußgeschwindigkeit gemessen.

4.6. Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration in der Leber erfolgte mittels eines photometrischen Nachweises nach Lowry [Lowry 1951]. Dazu wurden die Gewebeproben zunächst homogenisiert, mit Wasser und Aceton gewaschen und danach mit Natronlauge, Bicinochinic-Acid-Lösung und 4%-iger Kupfersulfatlösung versetzt. Danach erfolgte die photometrische Bestimmung der Lichtabsorption bei 562 nm, die proportional zum Proteingehalt der Probe ist. Mit Hilfe einer Standardkurve konnte dann die Proteinkonzentration der Probe bestimmt werden.

4.7. Western Blot (Caspase 3)

Die Analyse von Proteinen aus dem Lebergewebe erfolgte mit der Methode des Western Blot. Zur Beurteilung der Apoptose wurden mit der Caspase 3 ein wichtiges Protein der apoptotischen Kaskade untersucht [Slee 1999, Jaeschke 2003].

↓30

Materialien/Geräte:

Blockthermostat BT100

Kleinfeld-Labortechnik, Gehrden, D

Mini Protean 3 Electrophoresis-Cell-Set

Bio-Rad, 165-3301, München, D

Mini Trans-Blot Cell-Set

Bio-Rad, 170-3930, München, D

Nitrocellulose-Membran

Bio-Rad, 162-0112, München, D

Gel-Blotting-Papier

Schleicher&Schuell,10426694, Dassel, D

Kodak Film

Kodak, 636 03 5, Rochester, NY, USA

Reagenzien:

↓31

NaH2PO42H2O

Merck, 1.06345.1000, Darmstadt, D

Na 2 HPO 4 2H 2 O

Merck, 1.06580.1000, Darmstadt, D

Glycin

Serva, 23390, Heidelberg, D

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)

Merck, 8.17034.1000, Hohenbrunn, D

Tris Base

Sigma, T-1503, Steinheim, D

Tris HCl

Sigma, T-3253, Steinheim, D

Acrylamid 30%

Roth, 3029.1, Karlsruhe, D

6-Aminohexansäure

Merck, 8.00145.0250, Hohenbrunn, D

Ammonium Persulfat

Sigma, A-9164, Steinheim, D

Methanol

J.T.Baker, 8045, Deventer, NL

Tetramethylethylenediamine

Sigma, T-9281, Steinheim, D

Tween20

Aldrich, 27.434-8, Steinheim, D

-Mercaptoethanol

Calbiochem, 444203, Darmstadt, D

Bromphenol Blue

Sigma, B-6896, St.Louis, MO, USA

Glycerol

Sigma, G-7757, Steinheim, D

DTT

Sigma, D-0623, Deisenhofen, D

TES

Sigma, T-0772, St.Louis, MO, USA

Blot-Quick-Blocker (Milchpulver)

Chemicon, 2078E, Temecula, CA, USA

ECL Western blotting detection reagents

Amersham, RPN2106, Freiburg, D

Rainbow protein molecular weight marker

Amersham, RPN756, Freiburg, D

Primäre Antikörper:Caspase 3

BD, 611048, Heidelberg, D

Sekundäre Antikörper: Anti mouse IgG

Amersham, 164015, Freiburg, D

Das Prinzip der Western Blot Analyse beruht auf der gelelektrophoretischen Auftrennung von Proteinen aus dem verdünnten Leberhomogenisat mittels SDS/ Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE). Hierbei wandern die Proteineentsprechend ihrer Größedurch eine Gelmatrix und werden anschließend auf eine Nitrocellulose-Membran mittels Wet-Transfer-Methode geblottet. Durch Inkubation der Membran mit einem Primärantikörper und der Behandlung mit dem entsprechenden sekundären Antikörper kann mittels Chemiluminescense-Reaktion die spezifische Proteinbande sichtbar gemacht werden.

Prinzipiell reagiert hierbei der spezifische Primärantikörper mit dem zu untersuchenden Protein, welches an der Nitrocellulose-Membran gebunden ist, während der sekundäre Antikörper wiederum mit dem Fc-Fragment des primären Antikörpers reagiert. Da der Sekundärantikörper mit einer Peroxidase modifiziert ist (peroxidase-labeled), oxidiert dieser das in der ECL-Detection-Reagenz enthaltene Luminol. Dies führt sodann zu einer Lichtemission mit einer maximalen Wellenlänge von 428 nm, welche in einer Dunkelkammer mit Hilfe von Entwicklergerät und Film die spezifischen Banden sichtbar werden läßt [Luss 1994].

4.8. Reverse Transkriptase-Polymerase Ketten Reaktion (ICAM-1, Cytochrom C)

↓32

Mittels Reverse Transkriptase-Polymerase Ketten Reaktion (reverse transkriptase-polymerase chain reaktion; rt-PCR) wurde das Adhäsionsmolekül ICAM-1 nachgewiesen. Dies ist maßgeblich an der Leukozyten/Endothel-Interaktion im Rahmen der hepatischen IR Schädigung beteiligt [Yadav 1998, Menger 1999, Martinez-Mier 2000]. ICAM-1 wird auf der Oberfläche der Endothelzellen der Leber exprimiert. Es unterstützt die Anheftung von Leukozyten am Endothel und unterstützt folglich die konsekutive Transmigration von Leukozyten in das Interstitium [Jaeschke 1997, Kubes 1999].

Desweiteren wurde Cytochrom C als Parameter der apoptotischen Aktivität analysiert [Jaeschke 2003]. Cytochrom C ist essentieller Bestandteil der mitochondrialen Atmungskette und ist an der Induktion der Apoptose sowie an der Aktivierung der Caspasenkaskade beteiligt. Der Austritt von Cytochrom C aus den Mitochondrien in das Zytosol markiert durch Aktivierung der Caspase 9 den Beginn apoptotischer Vorgänge in der Zelle [Slee 1999].

Materialien/Geräte:

↓33

Ultraturrax

IKA, 2953000, Staufen, D

Zentrifuge

Haraeus, Hanau, D

Photometer

Amersham, GeneQuant 2, Freiburg, D

Küvette

Hellma, 105.202.008-QS, Mühlheim, D

Thermocycler

MJ Research, PTC-200, Waltham, USA

Power Pac 200

Biorad, 165-5053, München, D

UV Messgerät

Biometra TI3/Biodoc2, Göttingen, D

Reagenzien:

DEPC (Diethylpyrocarbonat)

Sigma, D-5758, Deisenhofen, D

Guanidiniumthiocyanat

Sigma, G-7028, Deisenhofen, D

Ethanol

Merck, 1.00986, Darmstadt, D

Natriumcitrat

Merck, 6586, Darmstadt, D

N-Lauryl-Sarcosin

Sigma, L-9150, Deisenhofen, D

ß-Mercaptoethanol

Sigma, M-6250, Deisenhofen, D

Natriumacetat

Sigma, S-2889, Deisenhofen, D

Isopropanol

Sigma, 405-7, Deisenhofen, D

Phenol

Sigma, P-4682, Deisenhofen, D

Oligo(dt) 12-18

Gibco, 18418-012, Karlsruhe, D

Rnasin

Promega, N2111, Mannheim, D

10x PCR-Puffer

Gibco, Y02028, Karlsruhe, D

MgCl2

Gibco, Y02016, Karlsruhe, D

DNTP

Gibco, 10297018, Karlsruhe, D

DEPC

Sigma, D-5758, Deisenhofen, D

DTT

Gibco, Y0014, Karlsruhe, D

Super Script 2

Gibco, 10297018, Karlsruhe, D

Taq Polymerase

Gibco, 10342-020, Karlsruhe, D

Primer

Fa. Interactiva, Ulm, D

Basenpaarleiter

Amersham 50, 27-4005, Freiburg, D

Agarose

Roth, 2267.4, Karlsruhe, D

Ethidiumbromid

Sigma, E-8751, Deisenhofen, D

Xylencyano

Sigma, X-4126, Deisenhofen, D

Bromphenolblau

Sigma, B-6896, Deisenhofen, D

Glycerol

Sigma, G-5516, Deisenhofen, D

Tris HCL

Sigma, T-3253, Deisenhofen, D

Borsäure

Sigma, E-5134, Deisenhofen, D

↓34

Für die Analyse der mRNA wurde das Gewebe zunächst nach der Methode von Chomczynski isoliert und mittels Reverse Transkriptase-Reaktion in cDNA umgeschrieben [Chomczynski 1987]. Die Proben wurden dann mittels spezifischem Primer durch Polymerase-Ketten-Reaktion amplifiziert und auf Agarosegel aufgetragen. Für die Amplifizierung der cDNA wurden spezifische Primer und Versuchsbedingungen angewendet. Zur Beurteilung der PCR wurde als interner Standard ß-Actin mitgeführt, um den Einsatz gleichmäßiger DNA Mengen in den untersuchten Proben zu kontrollieren.

ß-ACTIN [Nudel 1983]

Primer:

Antisense

5`ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA`3

 

Sense

5`CGG AAC CGC TCA TTG CC `3

↓35

Cyctochrom C[Scarpulla 1981]

Primer:

Antisense

5`GTT CTT GTT GGC ATC TGT G`3

 

Sense

5`GGA CGT CTC CCT AAG AGT C `3

ICAM-1 [Kita 1992]

↓36

Primer:

Antisense

5`ACC ACT GCC TGG CGG CTC`3

 

Sense

5`ATG GCT TCA ACC CGT GCC`3

4.9. Electrophoric Mobility Shift Assay (NFkB)

Mittels Electrophoric Mobility Shift Assay (EMSA) wurde die Aktivität des Transkriptionsfaktors NFkB untersucht. Durch NFkB wird die Expression von Proteinen reguliert, die wesentlich an Vorgängen wie Inflammation, Apoptose, Zellreplikation und Zell/Endothelzell-Interaktion beteiligt sind [Barnes 1998, Serracino-Inglott 2001]. Die Analyse erfolgte in Zusammenarbeit mit der Universität Ulm, Abteilung Innere Medizin 1.

Materialien/ Reagenzien:

↓37

Plastikfolie

Amersham, 80-1129-37, Freiburg, D

Säule

Amersham, 17-0855-02, Freiburg, D

Radiofilm

Biomax Film, Kodak, Rochester, USA

Acrylamid

Roth, 3030.1, Karlruhe, D

APS

Sigma, A9164, Deisenhofen, D

Temed

Sigma, T9281, Deisenhofen, D

dNTP Set (dGTP, dCTP,dTTP)

Gibco, BRL 10297-018, Karlsruhe, D

Alpha-dATP

Amersham PB 10204-9,25, Freiburg, D

Klenowenzym

Biolaps 210s 200 units, USA

Tris USB

Amersham, 13735, Freiburg, D

EDTA (Titriplex2)

Roth, 8043.1, Karlsruhe, D

DTT

Sigma, D0632, Deisenhofen, D

Glycerol

Sigma, G9012, Deisenhofen, D

Natriumflourid 5 µl/ml

Sigma, S7920, Deisenhofen, D

PMSF 5 µl/ml

Sigma, P7626, Deisenhofen, D

Leupeptin 1 µl/ml

Sigma, L2884, Deisenhofen, D

Pepstatin 2,5 µl/ml

Sigma, P4265, Deisenhofen, D

DTT 0,5 µl/ml

Sigma, D0632, Deisenhofen, D

Aprotinin 10 mg/ml

Sigma, A4529, Deisenhofen, D

Kernextraktion

Zur Aufbereitung der Kernproteine wurden 500 mg Leber in Sucrose- Homogenisationspuffer bei 4°C homogenisiert. Es folgte eine Auftrennung des Homogenisats durch Zentifugieren bei 100.000 g für 3,5 h. Die extrahierten Kernproteine wurden zweifach mit Waschpuffer gewaschen. Anschließend inkubierten die Kerne in Hochsalzpuffer für 50 min bei 4°C, um die Kernmembran osmotisch zu zerstören. Danach wurde das Homogenisat erneut zentrifugiert, die Kernproteine aus dem Überstand genommen und aliquotiert [Steinle 1999].

↓38

Shift

Für das Auftragen der Proben in die Geltaschen wurde zunächst ein Mix aus Bindungspuffer und Didc hergestellt. Danach erfolgte eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Anschließend wurden die verdünnten Proben in die Geltaschen pipettiert, die Gelkammer mit TGE-Puffer versetzt und mit einer Spannung von 150 V laufen gelassen. Um den Lauf der Proben verfolgen zu können, wurde eine freie Geltasche mit 20 µl Ladepuffer (Farbstoff) gefüllt. Aufgrund des veränderten Laufverhaltens der DNA- gebundenen Proteinfraktion von NFkB konnte diese von der ungebundenen Proteinfraktion abgegrenzt werden [Schmid 1994].

Supershift

↓39

Durch den Superschift wurden mit Hilfe von Antikörpern die Untereinheiten von NFkB dargestellt. Zu diesen zählen Proteine der NFkB / Rel- Proteinfamilie wie Rel A (p65), Rel B, c-Rel, NFkB (p105/p50) und NFkB (p100/p52). Die einzelnen Komplexe unterscheiden sich durch ihr Molekulargewicht und wurden anhand des Laufverhaltens in der Elektrophorese dargestellt [Schmid 1994].

Competition

Bei der Competition handelt es sich um den Nachweis für die spezifische Bindung von NFkB. Diese Spezifität wird nachgewiesen, indem man einen Teil radioaktiv markierter DNA sowie einen Teil unmarkierter DNA in den Versuchsansatz gibt. Bei zunehmender Konzentration von unmarkierter DNA und abnehmender Signalintensität wird der Beweis der spezifischen Bindung erbracht.

4.10. Statistik

↓40

Zur Auswertung der Daten wurde aus allen Datensätzen der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) berechnet. Diese Berechnung erfolgte mit dem Datenverarbeitungsprogramm Microsoft Excel 97. Die graphische Darstellung der Ergebnisse erfolgte mittels Box-and-Whisker-Plots bzw. mittels Säulen- oder Liniendiagramm.

Alle statistischen Tests wurden mit dem statistischen Auswertungsprogramm SPSS, Version 10.0 gerechnet. Nach vorheriger Prüfung der Datensätze auf Normalverteilung wurden der student’s t-test oder die einfache Varianzanalyse mit Meßwiederholung für normalverteilte Datensätze angewandt, um zwischen zwei oder mehreren Gruppen zu vergleichen. Korrelationen wurden mit dem bivariaten Korrelationstest (Spearman`s correlation coefficient) analysiert. Die Berechnung der Überlebenskurven erfolgte mit dem log rank test. Ein Ergebnis galt als statistisch signifikant, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit p <0,05 war.


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19.10.2005