D. Ergebnisse

1. Projekt 1 – IP-Zeitprotokoll

1.1. Hepatozellulärer IR Schaden (Serumkonzentrationen AST, ALT, GLDH)

↓40

Alle Gruppen zeigten im Vergleich zur sham operierten Gruppe (AST 29 ± 2 U/l, ALT 26 ± 4 U/l, GLDH 3,6 ± 0,5 U/l) jeweils erhöhte Serumwerte für AST, ALT und GLDH. Die höchsten Serumkonzentrationen wurden in der unbehandelten Ischämiegruppe gemessen. Die Konzentrationen betrugen hier für die AST 399 ± 63 U/l, für die ALT 249 ± 118 U/l und für die GLDH 192 ± 63 U/l.

↓41

Durch IP-Vorbehandlung mit 5/30, 5/45 und 15/30 min konnte jeweils eine statistisch signifikante Abnahme der Serumkonzentrationen erzielt werden (jeweils p=0,0001), wohingegen die IP-Zeitintervalle 5/5, 5/10 und 5/15 min keine statistisch signifikante Abnahme im Vergleich zur unbehandelten Ischämiegruppe aufwiesen. Nach IP-Vorbehandlung mit 10/10 min war die AST mit 259 ± 39 U/l (p<0,05) und die GLDH mit 108 ± 40 U/l (p<0,05) jeweils signifikant verringert, die Analyse der ALT Serumkonzentrationen zeigte jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied zur unbehandelten Ischämiegruppe (Abbildung 4 A-C).

Basierend auf diesen Daten wurde für die folgenden Versuchsreihen das Zeitintervall 5/30 min als optimales IP-Zeitprotokoll aus drei Gründen gewählt. Zum einen genügten 5 min Ischämie, um einen signifikanten Leberzellschaden zu induzieren. Zum zweiten beobachteten wir, daß mit zunehmender Reperfusionsphase die Schädigungsparameter umso geringer ausfielen. Drittens, die Verlängerung der Reperfusionsdauer von 5/30 auf 5/45 min erbrachte keine weitere signifikante Senkung der Schädigungsparameter, sondern bedeutete lediglich eine Verlängerung der totalen Operationszeit.

Abbildung 4: Serumkonzentrationen von AST (A), ALT (B) und GLDH (C) in U/l 24 h nach 45-minütiger warmer Leberischämie bei sham operierten Tieren, unbehandelten Ischämietieren und mit verschiedenen IP-Zeitintervallen vorbehandelten Tieren (Box-and-Whisker-Plots)

1.2.  Zusammenfassung Projekt 1

↓42

2. Projekt 2 – warme Leberischämie

2.1. Hepatozellulärer IR Schaden (Serumkonzentrationen AST, ALT, GLDH, HE-Färbung)

Die hepatozelluläre IR Schädigung war gemessen an den Serumkonzentrationen von AST, ALT und GLDH signifikant geringer nach MP- und IP-Behandlung als in den unbehandelten Kontrollen. Wie in den Graphiken ersichtlich wird, war insbesondere zu den Zeitpunkten 3 h, 6 h und 24 h nach Reperfusion die postischämische Ausschüttung von AST und ALT reduziert (Abbildung 5). Die mitochondriale Schädigung fiel nach 6 h und 24 h nach Reperfusion signifikant geringer in beiden Behandlungsgruppen aus verglichen mit der unbehandelten Kontrolle (Abbildung 5). Interessanterweise waren die Serumkonzentrationen bei IP-behandelten Tieren insgesamt niedriger als bei MP-behandelten Tieren, ohne jedoch Signifikanzniveau zu erreichen.

↓43

Abbildung 5: Serumkonzentrationen von AST, ALT und GLDH nach 45-minütiger warmer Leberischämie ( Ischämie; I/P-Behandlung; MP-Behandlung)

Analog zu den Enzymkonzentrationen von AST, ALT und GLDH fiel die histomorphologische Schädigung des Leberparenchyms bei IP- und MP-behandelten Tieren geringer aus als in den unbehandelten, ischämischen Kontrollen (Abbildung 6). Ein statistisch signifikanter Unterschied bestand bei 6 h nach Reperfusion für beide Behandlungsgruppen verglichen mit der Kontrollgruppe sowie unmittelbar (0 h) nach Reperfusion für die MP-Gruppe verglichen mit der Kontrollgruppe. Statistische Unterschiede zwischen der IP- und MP-Gruppe bestanden nicht (Tabelle 1).

Tabelle 1: Hepatozelluläre Schädigung nach einem histomorphologischen Score nach Bilbao [Bilbao 1999]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. * p<0,05 für Kontrolle versus MP; + p<0,01 für Kontrolle versus IP und MP

Hepatoz. Schädigung

Kontrolle

IP-Behandlung

MP-Behandlung

baseline

0

0

0

0 h

1.6 ± 0.4 *

1.1 ± 0.3

0.7 ± 0.1

3 h

1.4 ± 0.4

1.1 ± 0.2

1.15 ± 0.2

6 h

1.85 ± 0.2 +

1.3 ± 0.3

1 ± 0.4

24 h

2 ± 0.2

2.2 ± 0.3

2.8 ± 0.3

↓44

Abbildung 6: Hepatozelluläre IR Schädigung (HE-Färbung 400-fach)

2.2. Apoptose (Cyctochrom C mRNA, Caspase 3 Protein, TUNEL Färbung)

Die Analyse der Apoptose-Parameter zeigte eine signifikant geringere postischämische apoptotische Aktivität in den Lebern von MP-behandelten Tieren, wohingegen IP-behandelte und unbehandelte Tiere keinerlei Unterschiede aufwiesen.

Die Expression von Cytochrom C mRNA und von Caspase 3 war in der MP-Gruppe zu den Zeitpunkten 0 h und 3 h, sowie für Cytochrom C mRNA auch nach 6 h, deutlich vermindert gegenüber IP-behandelten und unbehandelten Kontrolltieren. Während in unbehandelten Ischämietieren die mRNA Expression unmittelbar (0 h) nach Reperfusion deutlich reduziert war und erst nach 6 h einen Anstieg der mRNA Expression aufwies, war in IP-behandelten Tieren zu allen Meßzeitpunkten eine ausgeprägte mRNA Expression nachweisbar. Bei MP-behandelten Tieren beobachteten wir erst 24 h nach Reperfusion einen Anstieg der mRNA Expression (Abbildung 7).

↓45

Analog hierzu gelang der Proteinnachweis von Caspase 3 in unbehandelten Ischämietieren und IP-behandelten Tieren gleichermaßen zu allen Zeitpunkten, wohingegen in der MP-Gruppe zum Zeitpunkt 0 h und 3 h nach Reperfusion deutlich weniger Protein nachweisbar war (Abbildung 8).

Die Anzahl der TUNEL positiven Zellen war signifikant reduziert in IP- und MP-behandelten Tieren 3 h, 6 h und 24 h nach Reperfusion. Ein Unterschied zwischen MP- und IP-behandelten Tieren war, im Gegensatz zu den mRNA und Proteinanalysen von Cytochrom C und Caspase 3, jedoch nicht vorhanden. In allen Behandlungsgruppen zeigte sich eine zunehmende Apoptoseaktivität im Verlauf des Beobachtungsintervalls nach Reperfusion (Tabelle 2).

Tabelle 2: TUNEL positive Zellen [%]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP; * p<0,05 für Kontrolle versus MP; + p<0,01 für Kontrolle versus IP und MP

TUNEL pos. Zellen

Kontrolle

IP-Behandlung

MP-Behandlung

baseline

0.5 ± 0.3

1.8 ± 0.6

0.3 ± 0.2

0 h

2.8 ± 0.6

6.5 ± 0.9

1.3 ± 0.9

3 h

36.3 ± 9.1 #

7.9 ± 1.4

6 ± 1.4

6 h

38.2 ± 10.5 *

17.2 ± 4.5

8.5 ± 0.8

24 h

65.3 ± 6.3 +

22.4 ± 6.8

10.2 ± 0.6

↓46

Abbildung 7: Darstellung der Proteinexpression von Cytochrom C im Zeitverlauf

Cytochrom C als cytosolischer Apoptosemarker zeigte in der Ischämiegruppe eine reduzierte Expression zu den Zeitpunkten 0 h und 6 h nach der Ischämie. Ein ähnliches Expressionsmuster zeigte sich bei MP-behandelten Tieren, die ebenfalls bei 0 h und 6 h kaum Cytochrom C mRNA in der Leber exprimierten. Allerdings war auch 6 h nach Reperfusion immer noch kaum mRNA nach MP-Behandlung nachweisbar. Im Gegensatz hierzu war nach IP-Behandlung bereits vor Ischämie sowie zu allen Beobachtungszeitpunkten nach Reperfusion Cytochrom C mRNA deutlich nachweisbar (Abbildung 7).

Abbildung 8: Darstellung der Proteinexpression von Caspase3/32 im Zeitverlauf

↓47

In der Kontrollgruppe konnte bereits zu frühen Zeitpunkten eine Expression von Caspase 3 nachgwiesen werden, wobei deren Aktivität nach 6 h und 24 h leicht abnahm. IP-behandelte Lebern zeigte bereits vor Ischämie eine starke Caspase 3 Expression, die unmittelbar nach Ischämie abnahm. Im weiteren Verlauf nahm diese an Aktivität jedoch wieder deutlich zu. Im Gegensatz dazu war in MP-behandelten Lebern zu den Zeitpunkten 0 h und 3 h nur eine sehr geringe Caspase 3 Expression zu verzeichnen. Hier kam es erst ab 6 h zu einem deutlichen Anstieg (Abbildung 8).

2.3. Inflammation (ICAM-1 mRNA, inflammatorisches Infiltrat, Myeloperoxidase)

ICAM-1 mRNA war bei unbehandelten Kontrolltieren unmittelbar nach der Reperfusion (0 h) deutlich geringer exprimiert und erreichte erst 6 h nach Reperfusion wieder normale Ausgangswerte. Demgegenüber war die ICAM-1 mRNA Expression bei IP-behandelten Tieren zu keinem Zeitpunkt verändert und jederzeit gut nachweisbar. Bei MP-behandelten Tieren hingegen war zum Zeitpunkt 0 h, 3 h und 6 h nach Reperfusion keine ICAM-1 mRNA nachweisbar. Erst 24 h nach Reperfusion war ICAM-1 mRNA wieder in normaler Intensität vorhanden (Abbildung 9).

Abbildung 9: Darstellung der mRNA- Expression von ICAM-1 im Zeitverlauf

↓48

Die Auszählung des inflammatorischen Infiltrates zeigte signifikant weniger inflammatorische Zellen in den Lebern von IP- und MP-behandelten Tieren verglichen mit unbehandelten Kontrollen. Dieser Unterschied bestand jedoch nur unmittelbar nach der Reperfusion (0 h) und war zu späteren Beobachtungszeitpunkten nicht mehr vorhanden. Ebenfalls bestand kein Unterschied zwischen IP- und MP-behandelten Tieren (Tabelle 3).

Tabelle 3: Leukozytäres Infiltrat [n/Gesichtsfeld]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP

Leukozytäres Infiltrat

Kontrolle

IP-Behandlung

MP-Behandlung

baseline

19.1 ± 5.4

22.5 ± 5.6

19.1 ± 5.4

0 h

48.4 ± 13.5 #

29.7 ± 8

24.6 ± 7

3 h

24.7 ± 7.1

16.2 ± 9

21 ± 5

6 h

29.9 ± 6.8

36.3 ± 5.7

24.3 ± 5.9

24 h

18.4 ± 4.7

33.7 ± 9.5

18.2 ± 7.3

Ein ähnliches Verteilungsmuster wie bei der leukozytären Infiltration sahen wir bei der Messung der Myeloperoxidasespiegel in der Leber. Diese waren ebenfalls 0 h nach Reperfusion in IP- und MP-behandelten Tieren signifikant reduziert gegenüber den Kontrolltieren (42,38 ± 24,2 mU/mg bzw. 33,78 ±16,1 mU/mg versus 64,37 ± 45,8 mU/mg), zu späteren Beobachtungszeitpunkten jedoch ebenfalls ohne Unterschied. Ein statistischer Unterschied zwischen IP und MP Behandlung bestand auch hier nicht (Tabelle 4).

↓49

Tabelle 4: Myeloperoxidase-Spiegel [mU/mg]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP

Myeloperoxidase

Kontrolle

IP-Behandlung

MP-Behandlung

baseline

23.93 ± 10.4

34.77 ± 8.3

22.8 ± 9.8

0 h

64.37 ± 45.8 #

42.38 ± 24.2

33.78 ± 16.1

3 h

12.21 ± 9

12.94 ± 6.9

27.81 ± 14.1

6 h

11.73 ± 7.9

12.65 ± 4.8

27.88 ± 12.8

24 h

26.29 ± 11.2

24.77 ± 12.8

19.31 ± 8

2.4. Nukleärer Transkriptionsfaktor NFkB

In der Ischämiegruppe konnte bereits vor Ischämie eine geringe Aktivität von NFkB nachgewiesen werden. Zum Zeitpunkt 0 h nach Reperfusion wurde ein Expressionsmaximum erreicht. Im weiteren Verlauf zeigte sich eine weitgehend konstante Expression von NFkB, die gegenüber der Basalexpression vor der 45-minütigen Ischämie erhöht war. IP-behandelte Tiere wiesen bereits vor der 45-minütigen Leberischämie eine signifikant höhere NFkB Bindungsaktivität aus. Hier beobachteten wir nach der Reperfusion eine stete Abnahme der Bindungsaktivität bis zum Beobachtungszeitpunkt 6 h nach Reperfusion. Interessanterweise war bei 24 h nach Reperfusion wieder eine starke NFkB Bindungsaktivität in den Lebern der IP-behandelten Tieren nachweisbar.

Im Vergleich zu den Kontrolltieren war auch bei MP-behandelten Tieren eine erhöhte NFkB Expression bereits vor der 45-minütigen Ischämie nachweisbar. Im weiteren Verlauf sahen wir dann eine deutliche Abnahme der NFkB Bindungsaktivität, insbesondere zu den Beobachtungszeitpunkten 0 h und 3 h (verglichen mit IP-behandelten und unbehandelten Lebern). Auch in dieser Gruppe war nach 24 h wieder eine starke Expression zu verzeichnen gewesen (Abbildung 10).

↓50

Abbildung 10: Darstellung der NFkB Kernproteinexpression

Supershift und Competition

Durch den Supershift konnten die NFkB Anteile der Rel-Proteinfamilie nachgewiesen werden. Zu den einzelnen Untereinheiten gehören Rel A (p65), Rel B, c-Rel, NFkB1 p50 und NFkB2 p52 [Schmid 1994]. In der Competition-Analyse wurde bei zunehmender Konzentration unmarkierter DNA die spezifische Bindung von NFkB aufgrund der abnehmenden Signalintensität der spezifischen Banden nachgewiesen (Abbildung 11).

↓51

Abbildung 11: Darstellung der NFkB Untereinheiten NFkB1 p50, NFkB2 p52, RelA p65, c-Rel, Rel-B mittels Supershift- und Competitionanalyse

2.5. Mikrozirkulation (sinusoidale Perfusion, Leukozyten/Endothelzell-Interaktion, NADH-Fluoreszenz, Gallefluß)

Die Analyse der Mikrozirkulation wurde bei IP-behandelten und unbehandelten Tieren durchgeführt. Zur Quantifizierung des postischämischen Perfusionsausfalls wurden die perfundierten Sinusoide prozentual im Verhältnis zu den nicht perfundierten Sinusoide angegeben. Es bestand eine signifikante Verbesserung der sinusoidalen Perfusion in der IP-behandelten Gruppe im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. 30 min nach der Reperfusion zeigte sich in der unbehandelten Kontrollgruppe ein Abfall der perfundierten Sinusoide auf 28,39 ± 10,51%. In der IP-behandelten Gruppe lag die Perfusionsrate hingegen bei 75,59 ± 7,54% (p<0,01). 90 min nach Reperfusion war die Perfusion in der unbehandelten Kontrollgruppe weiter bis auf 23,89 ± 8,96% abgefallen, während in der IP-behandelten Gruppe die sinusoidale Perfusion noch bei 66,68 ± 11,35% lag (p<0,05) lag (Abbildung 12).

Abbildung 12: Darstellung der sinusoidalen Perfusion in der Rattenleber nach einer 45 minütigen warmer Ischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05; ## p<0,01

↓52

Zur Darstellung der sinusoidal stagnierenden Leukozyten wurde die Anzahl der Leukozyten pro mm2 Endothelzelloberfläche ausgezählt [Vollmar 1994]. Es zeigte sich in beiden Gruppen eine leichte Zunahme der stagnierenden Leukozyten. Die Ausgangswerte betrugen in der unbehandelten Kontrollgruppe 33 ± 13 Leukozyten/mm² und in der IP-behandelten Gruppe 58 ± 11 Leukozyten/mm². 30 min nach Reperfusion (73 ± 12 vs 77 ± 18 Leukozyten/mm²) sowie 90 min nach Reperfusion (65 ± 22 vs 85 ± 16 Leukozyten/mm²) zeigten sich jeweils keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen (Abbildung 13 A).

Die Auswertung der leukozytären Adhärenz in den postsinusoidalen Venolen ergab ebenfalls keine statistisch signifikanten Unterschiede. Sowohl die Anzahl der temporär anhaftenden Leukozyten (=Roller, Abbildung 13 B) als auch die Anzahl der permanent adhäsiven Leukozyten (=Sticker) (Abbildung 13 C) zeigte jeweils eine Zunahme der leukozytären Adherenz, jedoch ohne Unterschied zwischen beiden Behandlungsgruppen.

Abbildung 13: Darstellung der sinusoidalen und postsinusoidalen Leukozytenadhärenz nach 45-minütiger warmer Leberischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM

↓53

Die Messung der NADH Fluoreszenz der Leberparenchymoberfläche bei unbehandelten Kontolltieren zeigte eine Zunahme von nahezu 30% gegenüber der präischämischen Basalmessung zu den Beobachtungszeitpunkten 30 min und 90 min nach Reperfusion (Tabelle 5). IP-Behandlung dahingegen führte zu einer geringeren Zunahme der NADH Fluoreszenz, was auf einen verbesserten Sauerstofftransport in das Gewebe und damit auf eine verbesserte hepatozelluläre mitochondriale Funktion schließen ließ. Diese Beobachtung wurde durch die Messung der GLDH Serumkonzentration unterstützt. Bereits 6 h nach Reperfusion fand sich eine statistisch signifikant niedrigere GLDH Konzentration im Serum IP-behandelter Tiere (34 ± 13 vs. 133 ± 67 U/l).

Tabelle 5: NADH Fluoreszenz [aU]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP; * p<0,05 für Kontrolle versus Basalwert.

NADH Fluoreszenz [aU]

Kontrolle

IP-Behandlung

Basalwert

120 ± 3

125 ± 4

30 min

156 ± 17 *

134 ± 8 #

90 min

156 ± 22 *

139 ± 9

Entsprechend der verbesserten sinusoidalen Perfusion und der verbesserten mitochondrialen Sauerstoffversorgung erschien auch die Messung der Leberfunktionsparameter bei IP-behandelten Tieren verbessert. Dabei erwies sich die postischämische Galleproduktion als statistisch signifikant besser gegenüber den unbehandelten Kontrolltieren (Abbildung 14). Hierbei korrelierte der gemessene Gallefluß signifikant mit der sinusoidalen Perfusion (p<0,01, r = 0,84).

↓54

Abbildung 14: Gallefluß nach 45-minütiger Leberischämie in IP-behandelten und unbehandelten Kontrolltieren. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP

2.6.  Zusammenfassung Projekt 2

3. Projekt 3 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (70%)

3.1. Resektion und hepatozellulärer IR Schaden (Serumkonzentrationen AST, ALT, GLDH)

Bei dieser Versuchsreihe überlebten alle Tiere die 70%-ige Leberresektion, die während einer 30-minütigen Leberischämie durchgeführt wurde. Es wurden 5,9 bis 6,7 g Lebergewebe reseziert, was ca. 2,5 vol.% des Körpergewichts entsprach. Die postischämische Ausschüttung der Serumtransaminasen AST, ALT und GLDH war 6 h nach Reperfusion in beiden Behandlungsgruppen signifikant niedriger als in der unbehandelten Kontrollgruppe (p<0,05). Wenngleich tendentiell niedrigere Werte in der IP-Gruppe verglichen mit der MP-Gruppe gemessen wurden, war dieser Unterschied nicht signifikant (Tabelle 6).

↓55

Tabelle 6: Körpergewicht, Gewicht der resezierten Leber und Verhältnis von Resektat zu Körpergewicht sowie die Serumkonzentrationen von AST, ALT und GLDH 6 h nach Reperfusion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP

Parameter

Kontrolle

IP-Behandlung

MP-Behandlung

Körpergewicht (gramm)

253,7 ± 14

254,8 ± 17

242,5 ± 8

Gewicht Resektat (gramm)

6,7 ± 0,8

6,1 ± 0,8

5,9 ± 0,7

Resektat / Körpergewicht (vol.%)

2,6 ± 0,4

2,4 ± 0,5

2,4 ± 0,6

AST nach 6 h (U/l)

467 ± 46 #

128 ± 68

287 ± 116

ALT nach 6 h (U/l)

552 ± 177 #

142 ± 74

288 ± 129

GLDH nach 6 h (U/L)

128 ± 48 #

24 ± 7

46 ± 29

3.2. Regeneration (Körpergewicht, Lebergewicht, prozentuales Lebervolumen)

Während des postoperativen Verlaufs kam es zu einer konstanten Zunahme des Körpergewichts bei IP-behandelten und unbehandeletn Kontrolltieren. Im Gegensatz dazu war bei MP-behandelten Tiere die Körpergewichtszunahme geringer und zeigte an Tag 4 und Tag 7 nach der Operation signifikant niedrigere Werte an (Abbildung 15 A).

Das Gewicht der regenerierenden Leber betrug an Tag 1 ca 5 g und nahm bis zum vierten postoperativen Tag sprunghaft in allen Gruppen bis ca 8,5 g zu. Die weitere Gewichtszunahme bis zum Tag 7 war nicht mehr so ausgeprägt. Unterschiede zwischen den Gruppen bestanden an Tag 1, wo die Lebern von IP-behandelten Tieren signifikant leichter waren als bei unbehandelten Kontrolltieren (Kontrolle: 5,2 ± 0,4 g, IP-Behandlung: 4,16 ± 0,4 g, MP-Behandlung: 4,9 ± 0,5 g) (Abbildung 15 B). Dieser Unterschied bestand auch noch bei der Ratio von verbleibender Leberparenchymmasse zu Körpergewicht (Kontrolle: 2,2 ± 0,3 vol%, IP-Behandlung: 1,7 ± 0,2 vol%, MP-Behandlung: 2,2 ± 0,3 vol%).

↓56

Demgegenüber war bei MP-behandelten Tieren das Gewicht der verbleibenden Leber, sowie das Lebervolumen bezogen auf das Körpergewicht gleichermaßen von Tag 1 bis Tag 4 angestiegen, so daß wie auch an allen anderen postoperativen Tagen keine statistisch signifikanten Unterschiede zu unbehandelten Kontrollen bestanden (Abbildung 15 C).

Abbildung 15: Körpergewicht (A), Restparenchym (B) und Restleber pro Körpergewicht (C) nach Leberresektion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus MP. * p<0,05 für Kontrolle versus IP

Bei der laborchemischen Analyse der hepatpzellulären Schädigungsparameter fiel bei IP-behandelten Tieren eine signifikant höhere AST und ALT Serumkonzentration gegenüber MP-behandelten und unbehandelten Kontrolltieren an Tag 1 nach Resektion auf. Vergleichbar waren die Ergebnisse hingegen für Albumin und Bilirubin im Serum der Tiere. Während bei MP-behandelten sowie bei unbehandelten Kontrolltieren die Leberenzyme an Tag 1 bereits gegenüber der 6 h Messung abgesunken waren, sahen wir nach IP-Behandlung einen deutlichen Anstieg von AST und ALT (128 ± 68 auf 435 ± 167 sowie 142 ± 74 auf 325 ± 105). Dieser Anstieg war jeweils statistisch signifikant (p<0,05). Bei MP-behandelten Tieren bestanden keine Unterschiede zu unbehandelten Kontrolltieren für AST, ALT und Bilirubinwerte. Lediglich die Serumalbuminkonzentration war bei MP-behandelten Tieren signifikant niedriger an Tag 4 (Tabelle 7).

↓57

Tabelle 7: Laborchemische Analysen von AST, ALT, Albumin und Bilirubin. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP versus Kontrolle und MP. * p<0,05 für MP versus IP und Kontrolle

Parameter

Kontrolle

IP-Behandlung

MP-Behandlung

AST (U/l)

Tag 1

Tag 4

Tag 7

340 ± 106

32 ± 2

27 ± 8

435 ± 167 #

37 ± 6

31 ± 3

279 ± 93

47 ± 17

37 ± 4

ALT /U/l)

Tag 1

Tag 4

Tag 7

143 ± 43

25 ± 3

24 ± 4

325 ± 105 #

23 ± 3

22 ± 4

187 ± 79

20 ± 7

24 ± 4

Albumin (mg/dl)

Tag 1

Tag 4

Tag 7

3 ± 0,1

2,98 ± 0,1

3,05 ± 0,2

3 ± 0,29

2,95 ± 0,2

3,02 ± 0,2

2,98 ± 0,3

2,6 ± 0,2 *

3 ± 0,2

Bilirubin (mg/dl)

Tag 1

Tag 4

Tag 7

0,36 ± 0,02

0,05 ± 0,01

0,1 ± 0,03

0,37 ± 0,1

0,12 ± 0,03

0,05 ± 0,03

0,32 ± 0,1

0,07 ± 0,03

0,05 ± 0,03

3.3.  Regeneration (Ki-67 Färbung, Mitose Index)

An Tag 1 nach 70%-iger Leberresektion waren die Regenerationsparameter Ki-67 und Mitose Index bei den unbehandelten Kontrolltieren in maximaler Konzentration nachweisbar (14,5 ± 6 % Ki-67 positive und 10,1 ± 2,6 mitotische Hepatozyten). Bereits an Tag 4 war keine erhöhte mitotische Aktivität mehr nachweisbar, auch die Anzahl Ki-67 positiver Zellen nahm bereits an Tag 4 deutlich ab (Abbildung 16).

Nach IP-Behandlung war am ersten Tag keine Aktivitätszunahme zu beobachten. Analog zur verminderten Leberparenchymmasse war zu diesem Zeitpunkt sowohl die Anzahl mitotischer Zellen (1,4 ± 2,6) als auch die der Ki-67 positiven Hepatozyten (0,8 ± 0,5 %) signifikant vermindert.

↓58

Nach MP-Behandlung war eine ähnliche Kinetik der Regenerationsparameter zu beobachten wie bei unbehandelten Kontrollen. Dem starken Aktivitätsanstieg an Tag 1 folgte eine Normalisierung bis hin zu Tag 7. Dabei sahen wir einen höheren Mitose Index aber eine geringere Anzahl Ki-67 positiver Hepatozyten, jedoch ohne statistisches Signifikanzniveau zu erreichen (Abbildung 16).

Abbildung 16: Ki-67 positive Hepatozyten (A) und Mitose Index (B) als Regenerationsparameter nachg 70%-iger Leberresektion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP versus Kontrolle und MP

Abbildung 17: Repräsentative Immunhistochemische Färbungen mit Darstellung von Ki-67 positiven Hepatozyten an Tag 1 nach Resektion (600-fach)

↓59

Abbildung 18: Repräsentative HE-Färbungen mit Darstellung von mitotischen Hepatozyten an Tag 1 nach Resektion (600-fach)

3.4.  Zusammenfassung Projekt 3

4. Projekt 4 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (90%)

4.1.  Überleben

Das Ausmaß der Resektion war in allen Gruppen vergleichbar und betrug mit jeweils 7,57 ± 0,5 g, 8,01 ± 0,4 g und 8,05 ± 0,3 in den jeweiligen Behandlungsgruppen ca. 3 vol% des Geamtgewichts (Tabelle 8).

↓60

Wie bei diesem Modell zu erwarten, überlebte die Mehrzahl der Tiere nicht den Beobachtungszeitraum von insgesamt 21 Tagen. Dabei beobachteten wir signifikante Unterschiede beim Überleben zwischen den Behandlungsgruppen. Nach 90%-iger Leberresektion mit 30 minütiger warmer Leberischämie überlebten 10% aller Kontrolltiere und 20% aller MP-behandelten Tiere. Nach IP-Behandlung überlebte jedoch kein Tier länger als drei Tage (Abbildung 19). Das Überleben in der IP-Gruppe war somit signifikant reduziert verglichen zur MP-Gruppe (p<0,01).

Tabelle 8: Körpergewicht, Gewicht der resezierten Leber und Verhältnis von Resektat zu Körpergewicht. Angegeben sind Mittelwert ± SEM.

Parameter

Kontrolle

IP-Behandlung

MP-Behandlung

Körpergewicht (gramm)

248 ± 11

252,4 ± 11

252,1 ± 10

Gewicht Resektat (gramm)

7,57 ± 0,5

8,01 ± 0,4

8,05 ± 0,3

Resektat / Körpergewicht (vol.%)

3,05 ± 0,3

3,17 ± 0,3

3,19 ± 0,4

Abbildung 19: Überleben nach 90%-iger Leberresektion. # p<0,05 für IP-Behandlung versus MP-Behandlung.

4.2. Laserdopplerflowmetrie

↓61

Die Flußmessung über der Pfortader erbrachte signifikant höhere postischämische portalvenöse Flußraten nach IP-Behandlung verglichen mit der Kontrollgruppe in der frühen Phase nach Reperfusion. IP-behandelte Tiere zeigten einen schnelleren Anstieg der portalvenösen Flußrate nach Reperfusion, der jedoch auch nach 10 min noch deutlich unter den Basalflußraten lag. Im Gegensatz hierzu war bei unbehandelten Kontrollen eine Zunahme der portalvenösen Flußrate erst ab der dritten Minute nach Reperfusion zu beobachten. Insgesamt jedoch war die portalvenöse Durchblutung jedoch signifikant reduziert in unbehandelten Kontrollen verglichen mit IP-behandelten Tieren. Nach MP-Behandlung sahen wir auch eine frühe Zunahme der Pfortaderperfusion (Minute 1), dennoch war im weiteren Verlauf keine weitere Zunahme der Flußrate zu sehen, so daß 10 min nach Reperfusion auch ein signifikant niedrigerer Wert verglichen zur IP-Behandlung resultierte (Abbildung 20).

Abbildung 20: Portale Leberperfusion nach 90%-iger Leberresektion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP-Behandlung versus Kontrolle. * p<0,05 für IP-Behandlung versus Kontrolle und MP-Behandlung

4.3. Mikrozirkulation (sinusoidale Perfusion, velocity, volumetric blood flow, Leukozyten/Endothelzell-Interaktion)

Da bei ausgedehnt resezierten, sogenannten small-for-size Lebern keine Unterschiede zwischen unbehandelten und MP-behandelten Tieren bestanden, wurde die intravital-mikroskopische Analyse fokusiert auf den Einfluß der IP-Behandlung auf die hepatische Mikrozirkulation und daher IP-behandelte mit unbehandelten Kontrolltieren verglichen.

↓62

Die Intravitalmikroskopie zeigte 30 min nach Resektion bzw. Reperfusion einen geringeren postischämischen Perfusionsausfall in den IP-behandelten Tieren als bei unbehandelten Kontrolltieren. Hierbei waren nach 90%-iger Resektion und vorheriger IP-Behandlung noch 95,1 ± 1,6 % aller Sinusoide perfundiert. Bei unbehandelten Kontrolltieren waren es immerhin noch 91,3 ± 2,4 % (Abbildung 21).

Interessanterweise sahen wir, unabhängig von der Behandlungsgruppe (IP- oder unbehandelt), bei resezierten Lebern in der frühen Phase nach Reperfusion deutlich mehr offene und frei perfundierte Sinusoide als bei nicht resezierten Lebern. Bei letzteren betrug die Perfusionsrate 30 min nach Reperfusion nur noch 28,39 ± 10,5 % in der Kontrollgruppe bzw. 75,59 ± 7,5 % in der IP-Gruppe. Da die resezierten Lebern 30 min warme Ischämie durchliefen (im Gegensatz zu 45 min bei nicht resezierten Lebern), wurde auf einen statistischen Vergleich verzichtet.

Abbildung 21: Perfundierte Sinusoide nach 30-minütiger Ischämie ohne bzw. mit Resektion

↓63

Die in vivo gemessene postischämische erythrozytäre Flußrate (velocity) war sowohl in den analysierten Venolen wie auch in den Sinusoiden 30 min nach Reperfusion signifikant erhöht nach IP-Behandlung verglichen mit unbehandelten Kontrollen (Abbildung 22 A). Gleichsinnig hierzu war die Analyse der erythrozytären Flußrate bezogen auf den Gefäßdurchmesser (volumetric blood flow). Signifikant höhere Flußraten, insbesondere wiederum in den Venolen, waren nach Resektion in den Lebern von IP-behandelten Tieren zu messen, während die volumetric blood flow in den Sinusoiden tendentiell (jedoch nicht statistisch signifikant) erhöht war (Abbildung 22 B). Die leukozytäre Antwort wie auch die NADH Fluoreszenzmessung waren in beiden Gruppen gleich (Tabelle 9).

Abbildung 22: Velocity (A) und Volumetric blood flow (B) nach 90%-iger Leberresektion mit 30 min warmer Ischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP versus Kontrolle

Tabelle 9: Leukozytenadhärenz und NADH Fluoreszenz nach 90%-iger Leberresektion mit 30 min warmer Ischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM.

Parameter

Kontrolle

IP-Behandlung

Leukozytenadhärenz [n/mm2]

Venole

Sinusoid

99,6 ± 27

26,3 ± 8

110,7 ± 36

22,9 ± 7

NADH Fluoreszenz [aU]

111,1 ± 19,3

103,4 ± 25,3

4.4. Zusammenfassung Projekt 4

↓64


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
19.10.2005