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2.  Eigene Arbeiten zur Expression und Funktion von PPARs in der Gefäßwand

2.1. Expression von PPARs in vaskulären und inflammatorischen Zellen, sowie in der pathologisch veränderten Gefäßwand

2.1.1. Vorkommen von PPARs in der Vaskulatur

Peroxisome Proliferator Activated-Receptors (PPARs) sind eine Gruppe nukleärer Rezeptoren die durch Liganden aktiviert werden und zur Familie der Steroid Hormon-Rezeptoren gehören [9,10,11,12]. Die Namensgebung der PPARs ist abgeleitet von der ursprünglichen Beobachtung einer Prolifera­tion hepatozellulärer Peroxisomen nach Behandlung mit PPAR-Liganden wie z.B. Fibraten, die jedoch nur bei Nagetieren auftreten. Aus der Gruppe der PPARs sind die Subtypen PPARα, PPARγ und PPARδ (syn. PPARβ) bekannt, jedoch konnten bislang nur für die α- und die γ-Form funktionelle Be­deutungen nachgewiesen werden [9,10,11,12]. PPARα wird insbesondere in der Leber exprimiert, während PPARγ überwiegend im Fettgewebe vorliegt. Beide, PPARα und –γ, sind jedoch auch in vielen anderen Zelltypen und Geweben nachweisbar [9,10,11,12].

Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, daß PPARγ sowohl in glatten Gefäßmuskelzellen als auch in Endothelzellen vorkommt [15]. Hierzu führten wir RNase Protection Assays und Western-Blot Ana­lysen durch, mit deren Hilfe wir in menschlichen Koronargefäßmuskelzellen, aortalen Rattengefäß­muskelzellen und humanen Endothelzellen die Expression von mRNA und auch von nukleären Rezeptoren für PPARγ1 nachwiesen. Vergleichbare Beobachtungen zur Expression von PPARγ in Gefäßmuskelzellen, Endothelzellen und auch in Monozyten/Makrophagen wurden auch von verschie­denen anderen Arbeitsgruppen gemacht [18,19,20,21]. Durch immunhistochemische Untersuchun­gen an menschlichen und Rattenarterien konnten wir zudem das in vivo Vorkommen von PPARγ demonstrieren. Dabei zeigte sich eine deutlich gesteigerte PPARγ-Expression in der hyperplastischen Neointima der Rattenaorta 7 und 14 Tage nach Ballonangioplastie. Und auch in humanen Koronar­arterien fanden wir eine vermehrte Anreicherung von PPARγ in Gefäßmuskelzellen früher atheroma­töser Gefäßwandveränderungen und ihrer Vorläuferstadien (Abbildung 1-2).

Abb. 1:

Abb. 1: PPARγ wird in vaskulären Zellen exprimiert. (A) Nachweis von PPARγ1 mRNA in glatten Gefäßmuskelzellen (AOSMC, CASMC, UASMC) und Endothelzellen (HUVEC) mittels RNase-Protection Assays (GAPDH dient als interne Kontrolle). (B) Western Blots weisen das Vorliegen von PPARγ1 Protein im Zellkern glatter Gefäßmuskelzellen nach (NE: Nukleäre Extrakte, *: Artefakt-Bande) [15].


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Abb. 2:

Abb. 2: Immunhistochemischer Nachweis von PPARγ in vaskulären Läsionen. (A) In humanen athero­sklerotischen Läsionen liegt PPARγ in Gefäßmuskelzellen und Makrophagen vor (Typ I: Precursor-Läsion, Typ II, frühes Atherom). (B) Nach Ballonangioplastie wird PPARγ vermehrt in aortalen Ratten-Gefäßmuskelzellen der hyperplastischen Intima exprimiert. (I = Intima; M = Media; d = Tage nach Ballonangioplastie; Kolokalisationsfärbungen mit CD68 als Makrophagen-Marker oder α-Smooth Muscle Aktin für Gefäßmuskelzellen) [15].

Unsere und verschiedene andere Arbeitsgruppen haben zudem gezeigt, daß auch PPARα, ähnlich wie PPARγ, ebenfalls in Gefäßmuskelzellen, Endothelzellen, Makrophagen und Monozyten in vitro und in vivo exprimiert wird und beide PPARs in diesen Zellen funktionell wirksam sind [18,22].

2.1.2. PPAR-Liganden

Aktiviert werden PPARs durch spezifische Liganden, von denen eine Reihe endogener und synthe­tischer Formen bekannt sind. PPARα wird durch endogene Liganden wie Fettsäuren (Palmitin- und Arachidonsäure) und einige Eicosanoide (Hydroxyeicosatetaenoic acid = 8(S)-HETE) aktiviert [23]. Hochaffine synthetische PPARα-Liganden stellen die lipidsenkenden Fibrate (Fenofibrat, Clofibrat, WY-14,643 u.a.) dar [24], die in der Klinik zur Therapie von Hyperlipoproteinämien eingesetzt werden. Als endogene Liganden für PPARγ agieren die oxidierten Fettsäuren 9(S)-HODE und 13(S)-HODE (Hydroxyoctadecadienoic acid) und das Prostaglandinderivat 15-deoxy-Δ2,14-Prostaglandin J2 (PGJ2) [25,26]. Insulin-Sensitizer vom Typ der Thiazolidindione (TZD, z.B. Troglitazon, Rosiglitazon, Ciglita­zon u.a.), die klinische Anwendung in der Behandlung des Typ 2 Diabetes finden, wurden als potente synthetische PPARγ-Liganden identifiziert [27].

In ihrer biochemischen Struktur besitzen PPARs ähnlich wie andere nukleäre Hormonrezeptoren eine Ligand-bindende und eine DNA-bindende Domäne (DBD). Nach Aktivierung der PPARs durch ihre Liganden bilden diese funktionell aktive Heterodimere mit dem Retinoid X Rezeptor (RXR). Diese PPAR / RXR-Heterodimere binden über die DBD an spezifische DNA-Fragmente, die sogenannten PPAR Response Elements (PPRE) in der Promotorregion bestimmter Zielgene und regulieren da­durch deren Transkription (Abbildung 3) [28]. Weiterhin können PPARs die Transkription spezifischer [Seite 5↓]Gene durch inhibitorische Interaktion mit Signalkaskaden wie dem ERK1/2 MAPK Pathway, sowie anderen Transkriptionsfaktoren modulieren [9,10,11,12].

Abb. 3:

Abb. 3: Schematische Darstellung der Genregulation durch PPARs. (L: PPAR-Ligand; RA: Retinoic Acid = RXR-aktivierender Ligand; PPRE: PPAR Response Element, modifiziert nach [29])

2.1.3. Nachweis von biologisch aktivem PPARγ in vaskulären Zellen

Um eine mögliche biologische Relevanz des von uns in vaskulären Zellen nachgewiesenen PPARγ nachzuweisen, untersuchten wir in Transfektionsexperimenten ob bekannte PPARγ-Liganden wie TZD und PGJ2 auch in Gefäßmuskelzellen zu einer Aktivierung von PPARγ führen. Hierzu unterzogen wir Rattengefäßmuskelzellen einer transienten Transfektion mit einem PPAR Response Element Reporter Plasmid (PPRE-CAT). Dabei beobachteten wir eine Aktivierung des PPRE-CAT durch endogenes PPARγ nach dessen Aktivierung durch seine Liganden PGJ2 und die TZD Troglitazon und Rosiglita­zon, was auf eine funktionelle Bedeutung von PPARγ in der Gefäßwand hindeutet.

Durch den Nachweis der Expression biologisch aktiver PPARs in vaskulären und inflammatorischen Zellen haben sich in den vergangenen Jahren eine Reihe höchst interessanter Konzepte zur pharma­kologischen Behandlung metabolischer Risikofaktoren und gleichzeitiger Prävention / Therapie kardio­vaskulärer Komplikationen entwickelt. Denn nachdem PPARs initial vor allem durch ihre Auswirkun­gen auf metabolische Vorgänge von klinischer Bedeutung zu sein schienen, indem sie als Trans­kriptionsfaktoren die Expression verschiedener am Lipid- und Glukosestoffwechsel beteiligter Gene regulieren, belegen neuere Untersuchungen zusätzliche Effekte der PPARs auf das kardiovaskuläre System und daran beteiligter migratorischer, proliferativer und inflammatorischer Prozesse [9,10,11,12].

2.2. Hemmung der Migration vaskulärer und inflammatorischer Zellen durch PPARs

In einer frühen Studie war von Ronald Law und seiner Arbeitsgruppe bereits gezeigt worden, daß Troglitazon die Intimahyperplasie nach Ballonangioplastie der Rattenaorta hemmt [30]. Troglitazon, ein Thiazolidindeon, agiert als Ligand für PPARγ, welches wir als biologisch aktiven nukleären Rezeptor in vaskulären Zellen nachgewiesen haben. Basierend auf diesen bisherigen Ergebnissen ließ sich vermuten, daß PPARγ das eigentliche intrazelluläre Ziel von TZD in vaskulären Zellen dar­stellt und für die negative Wachstumsregulation nach Angioplastie verantwortlich ist. In den folgenden Arbeiten untersuchten wir deshalb die durch PPARγ regulierten Zellfunktionen und die beteiligten zellulären Zielstrukturen. Dabei galt das Interesse insbesondere den Auswirkungen von PPARγ auf die Migration und Proliferation vaskulärer Zellen.

In Untersuchungen an humanen und Rattengefäßmuskelzellen konnten wir eine Hemmung der chemotaktischen Antwort auf den potenten Migrationsfaktor PDGF sowohl durch die TZD-PPARγ-Liganden Troglitazon, Rosiglitazon, als auch den physiologischen PPARγ-Liganden PGJ2 nachweisen [Seite 6↓](Abbildung 4) [15]. Um zu überprüfen, ob diese migrationshemmende Wirkung der PPARγ-Liganden auch auf andere Chemotaxine zutrifft, untersuchten wir deren Effekte auf die durch Thrombin, TNFα und IGF-1 ausgelöste Migration von Rattengefäßmuskelzellen. Dabei hemmten alle 3 PPARγ-Liganden die durch jedes der Chemotaxine induzierte Migration in konzentrationsabhängiger Weise [13] [31]. Diese Ergebnisse wurden durch vergleichbare Beobachtungen von Marx et al. bestätigt [18].

Abb. 4:

Abb. 4: PPARγ-Liganden hemmen die PDGF-induzierte Gefäßmuskelzell-Migration. (Migrations­experimente mit aortalen Ratten-Gefäßmuskelzellen; PPARγ-Liganden = TRO, RSG, 15d-PGJ2; Darstellung als Mittelwert ± SEM; n= 6; * p < 0.05 vs. PDGF allein) [15].

Die durch verschiedene Migrationsfaktoren stimulierte Migration humaner Endothelzellen und von Monozyten wird ebenfalls durch die o.g. PPARγ-Liganden potent gehemmt [16,17,32]. Darüber­hinaus konnten wir auch eine ausgeprägte migrationshemmende Wirkung von PPARα-Liganden vom Typ der Fibrate in Endothelzellen und Monozyten nachweisen (Abbildung 5) [17], wohingegen PPARα-aktivierende Liganden in Gefäßmuskelzellen interessanterweise keinen Einfluß auf die Migration haben [18,33].

Zum besseren Verständnis der migrationshemmenden Wirkungen der PPARs folgten Untersuchungen zu den Migrationsmechanismen vaskulärer und inflammatorischer Zellen und den Interaktionen von PPARs mit der chemotaktischen Signaltransduktion.


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Abb. 5:

Abb. 5: Die Migration humaner Endothelzellen wird durch PPARα- und γ-Liganden gehemmt. (VEGF dient als Migrationsfaktor für HUVEC, PPARα-Liganden = WY, FEN; PPARγ-Liganden = TRO, CIG; Darstellung als Mittelwert ± SEM; n= 4; * p < 0.05 vs. VEGF allein) [17].

2.3. Migrationsmechanismen und Interaktion von PPARs mit der chemotaktischen Signaltransduktion

2.3.1. Migration und chemotaktisches Signaling vaskulärer und inflammatorischer Zellen

Grundlagen der Zellmigration

Die Migration vaskulärer und inflammatorischer Zellen ist eine komplexe zelluläre Antwort auf Chemo­taxine, die durch Thrombozyten, Makrophagen / Monozyten, Endothelzellen oder Gefäßmuskelzellen freigesetzt werden und auf die veränderte Vaskulatur wirken [5]. Damit Zellen migrieren können, muß sowohl deren Adhäsion / Deadhäsion an der extrazellulären Matrix oder benachbarten Zellen gewähr­leistet sein, als auch eine Steigerung der Zellmotilität, eine gerichtete Chemotaxis und die Gewebs­invasion durch Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix erfolgen [34,35]. In den vergangenen Jahren konnten eine Vielzahl migrationsregulierender Wachstumsfaktoren, Zytokine und Proteasen in der Vaskulatur nachgewiesen werden, jedoch war noch immer wenig über die intrazellulären Signal­transduktionsmechanismen bekannt, die die Zellmigration steuern.

Mechanismen der chemotaktischen Signaltransduktion – Bedeutung der ERK1/2 MAPK

In vorangegangenen Studien war gezeigt worden, daß bei diesen chemotaktischen Signalkaskaden den Mitogen-Aktivierten Protein Kinasen ERK1/2 (ERK1/2 MAPK) eine entscheidende Rolle zukommt und die PDGF-vermittelte Gefäßmuskelzellmigration durch den pharmakologischen ERK1/2 MAPK-Kinase Inhibitor PD98059 gehemmt werden kann [36,37].


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In weiterführenden Arbeiten konnten wir mithilfe pharmakologischer Inhibitoren und Antisense-Oligodesoxynukleotiden zeigen, daß die Migration von Gefäßmuskelzellen, Endothelzellen und Mono­zyten auch nach Stimulation mit anderen vasoaktiven Faktoren abhängig von der Aktivierung der ERK1/2 MAPK ist [8,13,17,31,32,38]. Dies bedeutet, daß die ERK1/2 MAPK einem intrazellulären Knotenpunkt konvergierender migratorischer Signale entspricht, der die chemotaktische Signalüber­tragung in diesen Zellen ausgehend von so unterschiedlichen Zelloberflächenrezeptoren wie G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Angiotensin II, Thrombin) [13,38], Tyrosin-Kinase Rezeptoren (PDGF, IGF-1, VEGF) [8,13,17],endothelialen Leptin-Rezeptoren oder Zytokinrezeptoren (TNFα, CRP, MCP-1) [31,32] vermittelt.

Steuerung der Zellmotilität durch ERK1/2 MAPK und MLCK

Die besondere Bedeutung der ERK1/2 MAPK bei der Zellmigration läßt sich vermutlich darauf zurück­führen, daß sie sowohl zytosolische, als auch nukleäre Faktoren nach ihrer Translokation in den Zell­kern reguliert [39,40,41]. Wir untersuchten daher zunächst mögliche zytosolische, ERK1/2-abhängig regulierte Signalmoleküle, die an der Migration beteiligt sind. Die Myosin Light Chain Kinase (MLCK) ist ein durch Phosphorylierung aktiviertes zytosolisches Protein, das durch Phosphorylierung der leichten Myosinketten (Myosin Light Chain, MLC) an der Steuerung der Zell-Kontraktilität und Zell-Motilität beteiligt ist [39]. Wir konnten nachweisen, daß Migrationsfaktoren wie PDGF in Gefäßmuskel­zellen eine ERK1/2 MAPK-abhängige, transiente Phosphorylierung der MLCK induzieren [8], was mit Berichten über eine Regulation der MLCK-Aktivität durch ERK1/2 MAPK in verschiedenen Tumorzell­linien übereinstimmt (Abbildung 7) [39,42].

Die Bedeutung der MLCK in der chemotaktischen Signaltransduktion von Gefäßmuskelzellen konnten wir anhand von Migrationsexperimenten nachweisen, in denen sich die PDGF-stimulierte Gefäß­muskelzellmigration durch den spezifischen MLCK-Inhibitor ML9 dosisabhängig hemmen ließ (Abbildung 6) [8]. Vergleichbare Ergebnisse einer Migrationshemmung durch ML9 erhoben wir auch in Endothelzellen. Im Gegensatz zur Zellmotilität fanden wir in unseren Untersuchungen keinen Hinweis für eine Beteiligung der ERK1/2 MAPK an der Adhäsion vaskulärer oder Entzündungszellen an ver­schiedenen Matrices [8].

Abb. 6:

Abb. 6: Die Gefäßmuskelzellmigration ist ERK1/2 MAPK- und MLCK-abhängig. Hemmung der PDGF-stimulierten Migration aortaler Rattengefäßmuskelzellen durch den pharmakologischen ERK1/2 MAPK-Pathway Inhibitor PD98059 und den MLCK-Inhibitor ML9. (Darstellung als Mittelwert ± SEM; n= 3; * p < 0.05 vs. PDGF allein) [8].

[Seite 9↓]Regulation der Zellinvasion durch Matrix-Metalloproteinasen und Transkriptionsfaktoren

Neben der Regulation zytosolischer Kinasen spielt die ERK1/2 MAPK eine wichtige Rolle in der Steuerung nukleärer Ereignisse, da sie durch die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren die Expres­sion von Genen reguliert, die ihrerseits das Zellverhalten modulieren. Die Beteiligung nukleärer Signalereignisse an der Zellmigration wird durch Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe belegt die zeigen, daß die Migration von Gefäßmuskelzellen in vitro durch Inhibitoren der Transkription und Translation gehemmt werden kann [13]. Dies stimmt mit Ergebnissen anderer Studien überein die aufzeigten, daß die invasive Komponente der Zellmigration von der de novo Synthese und Freisetzung von Matrix Metalloproteinasen (MMPs) abhängt [43,44]. MMPs führen zu einem Abbau extrazellulärer Matrixproteine und erlauben dadurch den vaskulären und inflammatorischen Zellen eine Invasion und Gewebsdurchquerung [5,35]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeiten führten wir daher Experimente an Gefäßmuskelzellen und Monozyten durch, in denen wir nachweisen konnten, daß die Expression der Matrixmetalloproteinase MMP-9 ERK1/2 MAPK-abhängig reguliert wird [32] (Abbildung 7). Vergleichbare Ergebnisse liegen auch aus Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen an Gefäßmuskelzellen vor [18]. Aus diesen Zusammenhängen entwickelten wir die Arbeitshypothese, daß die ERK1/2 MAPK möglicherweise als intrazellulärer Verzweigungspunkt chemotaktischer Signale agiert, indem sie einerseits die zytosolische Motilitätsmaschinerie via MLCK aktiviert und anderseits über die Regulation nukleärer Faktoren die MMP-Synthese und damit die Zellinvasion steuert. Wir untersuchten daraufhin die Rolle der ERK1/2 MAPK bei der durch Chemotaxine induzierten Expres­sion und Regulation der Transkriptionsfaktoren Ets-1, c-fos und Egr-1. Diese Transkriptionsfaktoren sind für die Zellmigration von Bedeutung, da die Promoterregionen verschiedener, pathophysiologisch relevanter Matrixmetalloproteinasen “Nucleotide Recognition Elements“ für Ets-1, c-fos und Egr-1 beinhalten [45,46]. In diesem Zusammenhang hatten Santiago et al. gezeigt, daß eine Egr-1 Depletion glatter Gefäßmuskelzellen deren Migration in vitro und die Neointimabildung nach Angio­plastie in vivo hemmt [47]; und in Endothelzellen konnten Iwasaka und Kollegen durch Ets-1 Anti­sense Oligodesoxynucleotide sowohl die Migration als auch die Angiogenese inhibieren [48]. In Unter­suchungen an glatten Gefäßmuskelzellen und Makrophagen konnten wir nun nachweisen, daß die durch Migrationsfaktoren (PDGF-BB, TNFα) induzierte Expression von Ets-1, c-fos und Egr-1 in beiden Zelltypen durch ERK1/2 MAPK vermittelt wird (Abbildung 8) [7,8]. Weiterhin konnten wir zeigen, daß in verschiedenen Formen pathologisch veränderter Gefäße (atherosklerotischen Läsionen LDL-Rezeptor defizienter Mäuse und hyperplastisch-neointimalen Läsionen der Rattenaorta nach Ballonangioplastie) die aktivierte Form der ERK1/2 MAPK und die Transkriptionsfaktoren Ets-1, c-fos und Egr-1 innerhalb der Läsionen vermehrt kolokalisiert nachweisbar sind (Abbildung 9) [7].

Abb. 7:

Abb. 7: Die durch PMA induzierbare MMP-9 Expression ist ERK1/2-abhängig und wird durch den pharmakologischen ERK1/2 MAPK-Pathway Inhibitor PD98059 gehemmt. Repräsentativer Western Blot von Gesamtzelllysaten humaner THP-1 Monozyten mit densitometrischer Analyse. (Darstellung als Mittelwert ± SEM; n= 3; * p < 0.05 vs. PMA allein) [32].


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Abb. 8:

Abb. 8: Die TNFα stimulierte Expression der Transkriptionsfaktoren Ets-1, Egr-1 und c-fos ist ERK1/2 MAPK-abhängig und wird durch den ERK1/2 MAPK-Pathway Inhibitor PD98059 gehemmt. (Western Blot-Untersuchungen aortaler Rattengefäßmuskelzellen; der Transkriptionsfaktor SP-1 dient als interne Kontrolle, da er nicht durch TNFα oder ERK1/2 MAPK reguliert wird) [7].

Abb. 9:

Abb. 9: In der hyperplastischen Intima der Rattenaorta sind 2 Wochen nach Ballonangioplastie TNFα (a), die Transkriptionsfaktoren Ets-1 (b), Egr-1 (c) und c-fos (d), sowie aktivierte, phosphorylierte ERK1/2 MAPK (e) immunhistochemisch vermehrt in Gefäßmuskelzellen nachweisbar (Pfeile). Charakteristische Anfärbung der Läsion mit α-Smooth Muscle Aktin als Marker glatter Gefäßmuskelzellen (f) [7].

 

[Seite 11↓]Chemotaktische Signalübertragung via PI3 Kinase / Akt / eNOS

Als weiterer, insbesondere für die Endothelzellmigration wichtiger Signalweg wurde bereits von ande­ren Arbeitsgruppen der ERK1/2 MAPK-unabhängige Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) / Akt /eNOS Pathway beschrieben, der die Zellmotilität durch Reorganisation des Aktin / Myosin Zytoskeletts ermöglicht [49,50,51]. Im Rahmen unserer Untersuchungen an Endothelzellen konnten wir erstmalig nachweisen, daß neben dem bekannten Migrationsfaktor VEGF auch das Peptidhormon Leptin und der Entzündungsmediator CRP (C-reaktives Protein) durch Aktivierung der PI3K und der Protein­kinase Akt die Phosphorylierung der endothelialen NO-Synthase und die Endothelzellmigration stimu­lieren (Abbildung 10) [16,17].

Abb. 10:

Abb. 10: Leptin stimuliert die Migration (A) und Phosphorylierung von Akt und eNOS (B) in humanen Endothelzellen (HUVEC).( A: Darstellung als Mittelwert ± SEM; n= 3; * p < 0.05 vs. unstimulierter Kontrolle; B: Western Blot Analyse mit phospho-spezifischen Antikörpern gegen Akt und eNOS) [16].

2.3.2. Interaktion von PPARs mit Signalmolekülen der Migration

Auswirkungen von PPARs auf den ERK1/2 MAPK Pathway

Da nach unseren Untersuchungen der ERK1/2 MAPK eine Schlüsselrolle in der Zellmigration zu­kommt, überprüften wir zunächst, ob die migrationshemmende Wirkung der PPAR-Liganden auf einer Inhibition der zytosolischen Aktivierung von ERK1/2 MAPK beruht. Hierzu konnten wir zeigen, daß keiner der von uns getesteten PPARα- oder PPARγ-Liganden die durch verschiedene Chemotaxine induzierte zytosolische ERK1/2 MAPK-Aktivität in vaskulären und inflammatorischen Zellen hemmt (Abbildung 11) [13,17,31,32]. Dies wies auf eine Hemmung der chemotaktischen Signaltransduktion durch PPAR-Liganden an einem Punkt distal der ERK1/2 MAPK hin, der möglicherweise auf nukleärer Ebene liegt.


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Abb. 11:

Abb. 11: Die Phosphorylierung und Aktivierung der ERK1/2 MAPK wird nicht durch PPARα- oder γ-Liganden beeinflußt. Western Blot Untersuchung VEGF-stimulierter Endothelzellen (HUVEC) mithilfe phospho-spezifischer ERK1/2 MAPK Antikörper. Behandlung mit den PPARγ-Liganden TRO / CIG oder den PPARα-Liganden FEN / WY wie dargestellt [17].

Es ist gezeigt worden, daß PPARγ-Liganden in Makrophagen die Zytokin-induzierte Expressionder NO-Synthase und der Gelatinase B durch Transrepression der Transkriptionsfaktoren NFkB und AP-1 hemmen[52].Es ist weiterhin bekannt, daß die ERK1/2 MAPK nach ihrer zytosolischen Aktivierung in den Nukleus transloziert, wo sie die Aktivität von Transkriptionsfaktoren reguliert die wiederum das Zellverhalten modulieren [53]. Eine PPARγ-vermittelte Transrepression von ERK1/2 MAPK-regulierten Transkriptionsfaktoren oder eine PPARγ-assoziierte Hemmung der nukleären ERK1/2 MAPK Trans­lokation könnten somit mögliche Mechanismen für die antimigratorische Wirkung der PPARγ-Liganden in Gefäßmuskelzellen darstellen.

Da wir zeigen konnten, daß die chemotaktische Wirkung von Angiotensin II in Gefäßmuskelzellen ERK1/2 MAPK-abhängig ist [38], untersuchten wir in einer weiteren Arbeit den Effekt des PPARγ-Liganden Troglitazon auf die Angiotensin II-vermittelte ERK1/2 MAPK Translokation in den Zellkern. Die zytoplasmatische Aktivierung der ERK1/2 MAPK durch Angiotensin II in Gefäßmuskelzellen erfolgt durch Signaltransduktion via PKCζ → MEK → ERK1/2 MAPK [54]. Durch Untersuchungen mit Immun-Komplex-Phosphorylierungs-Assays und Western-Blot Analysen konnten wir nachweisen, daß weder die Angiotensin II-stimulierte zytosolische PKCζ-Aktivität, noch die konsekutive ERK1/2 MAPK Phosphorylierung durch den PPARγ-Liganden Troglitazon gehemmt wird [6]. Demgegenüber führte Troglitazon zu einer signifikanten Hemmung der Angiotensin II-induzierten Translokation von ERK1/2 MAPK in den Zellkern und auch seiner nukleären Aktivität (Abbildung 12) [6]. Da PPARγ überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, resultieren diese Ergebnisse vermutlich aus einer inhibitorischen Interaktion von Ligand-aktiviertem PPARγ mit ERK1/2 MAPK und erklären einen Teil der migrationshemmenden Effekte der PPARγ-Liganden.


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Abb. 12:

Abb. 12: Der PPARγ-Ligand TRO hemmt die Angiotensin (AII)-induzierte ERK1/2 MAPK-Translokation vom Zytosol in den Nukleus. (A) Repräsentativer Western Blot nukleärer und zytosolischer Zellextrak­te aortaler Rattengefäßmuskelzellen. Untersuchung mit Antikörpern gegen Gesamt-ERK1/2 MAPK. (B) Densitometrie von 3 Western Blot Analysen, Darstellung als Mittelwert ± SEM; * p< 0.05 vs. Kontrolle, # p< 0.05 vs AII allein) [6].

Inhibition von Matrix-Metalloproteinasen und Transkriptionsfaktoren durch PPARγ-Liganden

Im Folgenden untersuchten wir den Einfluß von PPARγ-Liganden auf ERK1/2 MAPK-regulierte, nukleäre Komponenten der Migration. Hierzu konnten wir in vivo und in vitro zeigen, daß die PPARγ-Liganden Troglitazon und Rosiglitazon die Migration glatter Gefäßmuskelzellen downstream der zytosolischen Aktivierung von ERK1/2 MAPK hemmen, indem sie die ERK1/2 MAPK-abhängige Expression von Ets-1 inhibieren (Abbildung 13) [8]. Der Transkriptionsfaktor Ets-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Migration, da er die Synthese der Matrixmetalloproteinasen 1,3 und 9 reguliert, die ihrer­seits durch den Abbau extrazellulärer Matrixproteine den Gefäßmuskelzellen eine Invasion und Durch­querung der die Gefäßmedia und Intima trennenden Lamina elastica interna erlauben [1,48,55]. Folgerichtig konnten wir in weiterführenden Untersuchungen an Monozyten und Rattengefäßmuskel­zellen eine Inhibition der induzierbaren MMP-9 Synthese durch PPARγ-Liganden, nicht aber durch PPARα-Liganden, nachweisen, was mit Ergebnissen von Marx et al. aus Arbeiten an humanen Gefäßmuskelzellen übereinstimmt [18,32].


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Abb. 13:

Abb. 13: Die Expression des Transkriptionsfaktors Ets-1 ist ERK1/2 MAPK-abhängig und wird durch PPARγ-Liganden in vitro und in vivo gehemmt. (A) Western Blot Untersuchung aortaler Rattengefäß­muskelzellen mit Ets-1-Antikörpern nach Stimulation mit PDGF und Behandlung mit den PPARγ-Liganden TRO und RSG, oder dem pharmakologischen ERK1/2 MAPK Pathway Inhibitor PD98059 (unten: Densitometrie, n=3, Mittelwert ± SEM; * p< 0.05 vs. PDGF allein). (B) Immunhistochemischer Nachweis von Ets-1 und phosphorylierter, aktivierter ERK1/2 MAPK in Rattenaorten 2 h nach Ballon­angioplastie (Pfeil); Hemmung der Verletzungs-induzierten Ets-1 Expression durch Behandlung mit TRO [8].

Im Gegensatz zur nukleären ERK1/2-abhängigen Signaltransduktion via Ets-1 wird die zytosolische MLCK-Aktivierung downstream von ERK1/2 nicht durch PPARγ-Liganden gehemmt, die somit vermut­lich keinen Einfluß auf die MLCK-gesteuerte Motilitätsmaschinerie in Gefäßmuskelzellen haben (Abbildung 14) [8].

Zusammenfassend läßt sich daraus folgern, daß die migrationshemmende Wirkung von PPARγ-Liganden auf einer Inhibition der chemotaktischen Signalübertragung via ERK1/2 MAPK → Ets-1 → MMP-9 beruht (Abbildung 15).


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Abb. 14:

Abb. 14: Die Phosphorylierung von MLCK ist ERK1/2 MAPK-abhängig und wird durch die PPARγ-Liganden TRO und RSG nicht gehemmt. (A) Untersuchung PDGF-stimulierter aortaler Rattengefäß­muskelzellen mit Western Blotting gegen Phospho-Serin nach vorangegangener Immunpräzipitation von MLCK. Hemmung der PDGF-induzierten MLCK-Phosphorylierung durch den pharmakologischen ERK1/2 MAPK Pathway Inhibitor PD98059. (B) Densitometrie von 3 Western Blot Analysen, Darstel­lung als Mittelwert ± SEM; # p< 0.05 vs. Kontrolle, * p< 0.05 vs PDGF allein) [8].

Abb. 15:

Abb. 15: Die Aktivierung der ERK1/2 MAPK stellt einen Aufzweigungspunkt der chemotaktischen Signaltransduktion in Gefäßmuskelzellen dar. PPARγ-Liganden hemmen durch Inhibition der ERK1/2-abhängigen Ets-1 Expression und der MMP9-Synthese die Zellinvasion. In der Abbildung sind die an der Zellinvasion und der Motilität beteiligten zytosolischen und nukleären Mechanismen zusammen­fassend schematisch dargestellt [8].

[Seite 16↓]PPARs hemmen die endotheliale Migration via Inhibition des Akt → eNOS Signalwegs

Untersuchungen an Endothelzellen und Monozyten ergaben, daß PPARγ- und PPARα-Liganden auch in diesen Zellen keinen Effekt auf die zytosolische Aktivierung und Phoshorylierung von ERK1/2 MAPK haben [17,32]. Im Gegensatz zu Gefäßmuskelzellen jedoch, bei denen wir keinen Effekt der PPAR-Liganden auf die Aktivierung des Phosphatidylinositol-3 Kinase (PI3K) → Akt Signalwegs hatten nachweisen können [14], beobachteten wir in Endothelzellen eine signifikante Hemmung der Migrationsfaktor-induzierten Akt-Phosphorylierung durch verschiedene PPARγ- und PPARα-Liganden (Abbildung 16) [16,17]. Neben der Aktivierung von Akt wurde auch die downstream von Akt gelegene Phosphorylierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS) durch alle untersuchten PPARγ- und PPARα-Liganden gehemmt [17]. Daraus folgt, daß PPARα- und γ-Liganden die endotheliale Migration durch Inhbition des PI3K→ Akt → eNOS Signalings hemmen.

Abb. 16:

Abb. 16: PPAR-Liganden hemmen die VEGF-induzierte Akt-Phosphorylierung in Endothelzellen. Western Blot Untersuchungen VEGF-stimulierter HUVEC und Behandlung mit den PPARγ-Liganden TRO / CIG und den PPARα-Liganden FEN / WY [17].

Eine mögliche Erklärung für die Hemmung der Migrationsfaktor-induzierten Akt-Aktivierung durch PPAR-Liganden ergibt sich aus aktuellen Daten unserer Arbeitsgruppe, in denen wir zeigen konnten, daß PPARγ-Liganden die Expression des Tumorsuppressor Gens PTEN in Endothelzellen induzieren [16]. Vergleichbare Ergebnisse wurden von Patel et al. in Makrophagen erhoben [56]. PTEN ist eine duale Protein- und Phosphoinositid-Phosphatase, die den PI3K → Akt Signalweg negativ reguliert und die Aktivierung und Phosphorylierung von Akt inhibiert [57], und somit ein mögliches Target der migra­tionshemmenden Wirkung von PPAR-Liganden in Endothelzellen darstellt (Abbildung 17).

Die migrationshemmenden Effekte von PPARs auf Endothelzellen spielen möglicherweise eine Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose, da hier die Endothelzellmigration zur Neovaskularisierung des atherosklerotischen Plaques und damit zu einer erhöhten Vulnerabilität für eine Plaque-Ruptur beiträgt [1].


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Abb. 17:

Abb. 17: Die PPARγ-Liganden TRO und CIG induzieren die Expression der Phosphatase PTEN in Endothelzellen. Repräsentative Western Blot Untersuchung der zeitabhängigen Zunahme der PTEN-Expression in HUVEC nach Stimulation mit TRO oder CIG. (F-Actin dient als interne Kontrolle) [16].

2.4. Hemmung der Gefäßmuskelzellproliferation durch PPARs und ihre Effekte auf die ERK1/2 MAPK-abhängige mitogene Signaltransduktion

2.4.1. PPARγ-Liganden hemmen die Gefäßmuskelzellproliferation

Neben den migrationshemmenden Wirkungen von PPARγ-Liganden untersuchten wir auch ihre Effekte auf die Gefäßmuskelzellproliferation, die eine entscheidende Rolle in der Pathogenese athero­sklerotischer Plaques und restenosebedingter Gefäßwandläsionen spielt [1,5,34]. Wir konnten nach­weisen, daß verschiedene PPARγ-Liganden (Troglitazon, Rosiglitazon, 15d-PGJ2) zu einer konzentra­tionsabhängigen Hemmung der durch unterschiedliche Mitogene (bFGF, AII, Insulin) induzierten DNA-Synthese in humanen und Rattengefäßmuskelzellen führen (Abbildung 18) [14,15]. Die beobachtete antiproliferative Effektivität der untersuchten PPARγ-Liganden war in unseren Untersuchungen mit ihrer migrationshemmenden Wirkung vergleichbar.

Abb. 18:

Abb. 18: PPARγ-Liganden hemmen die bFGF-induzierte Gefäßmuskelzell-Proliferation. (3H-Thymidin Inkorporation aortaler Ratten-Gefäßmuskelzellen 24 h nach Stimulation mit bFGF; PPARγ-Liganden = TRO, RSG, 15d-PGJ2; Darstellung als Mittelwert ± SEM; n= 6; * p < 0.05 vs. bFGF allein) [15].


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2.4.2.  Bedeutung des ERK1/2 MAPK-Signalwegs in der Gefäßmuskelzellproliferation

Es ist bekannt, daß die ERK1/2 MAPK nicht nur eine Schlüsselrolle in der Migration spielt, sondern auch mitogene Signale bei der Zellproliferation überträgt. Wir führten daher Untersuchungen an Gefäßmuskelzellen mit unterschiedlichen Wachstumsfaktoren durch und konnten mithilfe von Antisense-Strategien und pharmakologischen Inhibitoren nachweisen, daß die Proliferation dieser Zellen nach Stimulation mit Insulin, AII oder PDGF ERK1/2 MAPK-abhängig vermittelt wird [38,58,59]. Da wir gezeigt hatten, daß die zytosolische ERK1/2 MAPK Aktivierung nicht durch PPARγ-Liganden beeinflußt wird, suchten wir Komponenten der mitogenen Signaltransduktion, die down­stream von ERK1/2 MAPK liegen. Eine besondere Rolle nahm dabei die Untersuchung der Mechanis­men der Insulin-induzierten mitogenen Signaltransduktion in der Gefäßmuskulatur ein, da diese inbe­sondere im Zusammenhang mit der antidiabetischen Wirkung der PPARγ-Liganden interessant sind.

Insulin führt durch Bindung an den Insulin-Rezeptor zu einer Rezeptor-Autophosphorylierung, die als Teil verschiedener Kaskaden zytosolischer Protein-Kinasen die ERK1/2 MAPK aktiviert [58,60], welche nach ihrer nukleären Translokation spezifische Transkripitionsfaktoren phosphoryliert, die ihrerseits die Expression von zellwachstumsassoziierten "Early-Response"-Genen wie c-fos indu­zieren [40,41]. Ein solcher Transkriptionsfaktor ist Elk-1, der durch ERK1/2 MAPK an Serin- und Threoninstellen phosphoryliert wird [40] und durch Interaktion mit dem in der Promotorregion liegen­den Serum-Response-Element (SRE) die Expression des c-fos Gens reguliert [41].

Wir konnten nachweisen, daß der pharmakologische ERK1/2 MAPK Pathway Inhibitor PD98059 neben einer dosisabhängigen Hemmung der Insulin-induzierten Proliferation auch die Expression von c-fos-mRNA hemmt [59]. Um die Beteiligung weiterer Komponenten der Signaltransduktionskaskade zu untersuchen, nahmen wir transiente Transfektionen glatter Gefäßmuskelzellen mit einem Elk-1/Gal-Expressionsvektor und seinem Gal/CAT Reporter Plasmid, beziehungsweise mit SRE/CAT Reporter Plasmiden vor. Sowohl für Elk-1, als auch für das SRE konnte in transfizierten Zellen eine signifikante Aktivierung durch Insulin gezeigt werden, die durch PD98059 gehemmt wurde [59]. Aus diesen Ergeb­nissen folgt, daß dem ERK1/2 MAPK → Elk-1 → SRE → c-fos Pathway eine entscheidende Rolle in der mitogenen Signaltransduktion Insulins in Gefäßmuskelzellen zukommt (Abbildungen 19).

Abb. 19:

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Abb. 19: Insulin stimuliert die ERK1/2 MAPK-abhängige Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen. Die Insulin-induzierte BrdU-Inkorporation aortaler Rattengefäßmuskelzellen (A) wird durch den pharmako­logischen ERK1/2 MAPK Pathway Inhibitor PD98059 konzentrationsabhängig gehemmt (B). (C) Re­präsentativer Northern Blot der Insulin-stimulierten mRNA-Expression des Transkriptionsfaktors c-fos und der Hemmung durch PD98059 (CHOB dient als interne Kontrolle). Darstellung der Ergebnisse von Transfektionsexperimenten, die eine Hemmung der Insulin-induzierten Aktivierung von Elk-1 (D) und SRE (E) durch PD98059 nachweisen. (Werte als Mittelwert ± SEM; * p < 0.01 vs. Kontrolle, # p < 0.01 vs Insulin allein, Elk-1ΔA: Negativ-Mutante ohne Elk-1 / MAPK-Phosphorylierungsstelle) [59].


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2.4.3. Hemmung der ERK1/2 MAPK-vermittelten mitogenen Signaltransduktion durch PPARγ

Elk-1 gehört ebenso wie Ets-1 zur Familie der Ets-Transkriptionsfaktoren, die von einigen Autoren als eine Famile nukleärer Effektoren des Ras → Raf → ERK1/2 MAPK Pathways angesehen werden [61]. Übereinstimmend mit unseren Ergebnissen zur Ets-1-Inhibition durch PPARγ-Liganden beobachteten wir in weiterführenden Transfektionsexperimenten auch eine Hemmung der Insulin-stimulierten Elk-1-Aktivierung durch den PPARγ-Liganden Troglitazon (Abbildung 20) [14]. Zusammenfassend bedeuted dies, daß PPARγ-Liganden in Gefäßmuskelzellen die mitogene Signaltransduktion via ERK1/2 MAPK→ Elk-1 → SRE → c-fos hemmen.

Abb. 20:

Abb. 20: Der PPARγ-Ligand TRO hemmt die Insulin-induzierte Elk-1 Aktivierung. Transfektionsex­perimente aortaler Rattengefäßmuskelzellen analog zu Abbildung 18 D unter Zugabe von TRO in ansteigenden Konzentrationen. (Werte als Mittelwert ± SEM; * p < 0.01 vs. Insulin allein, Elk-1ΔA: Negativ-Mutante ohne Elk-1 / MAPK-Phosphorylierungsstelle) [14].


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20.10.2004