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Kapitel 2. Ergebnisse und Schlussfolgerungen

2.1 Spannungsabhängige Kalziumkanäle

2.1.1 Vorkommen von L-Typ-Kalziumkanälen in humanen arteriellen Gefäßmuskelzellen

Erst kürzlich wurden spannungsabhängige Kalziumkanäle direkt mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik in humanen arteriellen Gefäßmuskelzellen untersucht. In unserem Arbeitskreis wurden spannungsabhängige Kalziumkanäle in frisch-isolierten Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien studiert. Dabei ließen sich Dihydropyridin-sensitive Kalziumkanalströme vom L-Typ nachweisen. Die Daten wurden in der Dissertationsschrift von Herrn Dr. rer. nat. Christian Ried veröffentlicht (1997) und decken sich mit zeitgleich publizierten Befunden einer französischen Arbeitsgruppe um Prof. Dr. S. Richard (1997). Es ist festzustellen, dass die Dichte der Kanäle erheblich vom Arterientyp und von der Spezies abhängt. Beispielsweise ist die Dichte von L-Typ-Kanälen (~4 Kanäle pro µm²) in frisch-isolierten Gefäßmuskelzellen von Hirnarterien der Ratte 40fach höher als in koronararteriellen Gefäßmuskelzellen des Menschen (~1 Kanal pro 10 µm²) (zur Übersicht mit Literaturangaben siehe 3.1.5.). Aufgrund der geringen L-Typ-Kanal-Dichte erscheinen humane koronararterielle Zellen als wenig geeignet, um die Permeation von Ca²⁺ durch singuläre L-Typ-Kalziumkanäle der C-Klasse zu studieren.

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2.1.2 Permeation von Ca²⁺ durch komplexe L-Typ-Kanäle und durch _1C-Untereinheiten

L-Typ-Kanäle der C-Klasse bestehen aus der Pore-formierenden _1C-Kanaluntereinheit und akzessorischen Hilfsuntereinheiten. Die Permeationsrate von Ca²⁺ durch singuläre Kalziumkanäle wurde bislang nicht unter physiologischen Bedingungen gemessen. In bisherigen konventionellen Einzelkanalregistrierungen wurden hohe Konzentrationen von divalenten Ladungsträgern (meist isomolares Ba²⁺) verwendet. In den vorliegenden Arbeiten wurden erstmals Ströme durch singuläre arterielle und neuroendokrine L-Typ-Kalziumkanäle der C-Klasse in Lösungen mit physiologischen divalenten Ladungsträgerkonzentrationen und bei physiologischen Membranpotenzialen gemessen. In den Messungen zeigte sich, dass arterielle und neuroendokrine L-Typ-Kanäle einheitliche Einzelkanalleitfähigkeiten in hohen und niedrigen Ba²⁺-Lösungen besitzen (ca. 25 pS mit 110 mM Ba²⁺ und ca. 10 pS mit 2 mM Ba²⁺). Der Einzelkanalstrom des arteriellen L-Typ-Kanals betrug 0,1 bis 0,3 pA in physiologischen Ca²⁺-Lösungen (2 mM) und bei physiologischen Membranpotenzialen (-60 mV bis -40 mV); die zugehörige Einzelkanalleitfähigkeit wurde mit 5,5 pS bestimmt. Gleichartige Befunde ergaben sich für _1C-Untereinheiten, die in CHOC9-Zellen stabil transfiziert und exprimiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass L-Typ-Kanäle mit einer relativ hohen Rate von Ca²⁺ (ca. 1 Mill. Ca²⁺/s bei -40 mV und 36^°C) permeiert werden. Die hohe Permeationsrate wird durch die ₁-Kanaluntereinheit bestimmt. Die vorliegenden Messergebnisse erlauben theoretische Betrachtungen über den Ca²⁺-Einstrom durch L-Typ-Kanäle im arteriellen Gefäßmuskel unter physiologischen Membranpotenzialen und Ionenbedingungen.

Anlage zu 2.1.2.:

1. Gollasch, M., Hescheler, J., Quayle, J., Patlak, J., Nelson, M.T.: Single Ca-channel currents from arterial smooth muscle at physiological calcium concentrations. Am. J. Physiol. 263: C948-C952 (1992).
2. Gollasch, M., Ried, C., Liebold, M., Haller, H., Hofmann, F., Luft, F.C.: High permeation of L-type calcium channels at physiological calcium concentrations: homogeneity and dependence on the 1 subunit. Am. J. Physiol. 263: C948-C952 (1996).

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2.1.3 Regulation von L-Typ-Kalziumkanälen durch G_i-Proteine und Proteinkinase C

In diesem Teilthema wurden intrazelluläre Signalwege untersucht, die L-Typ-Kalziumkanäle der C-Klasse regulieren. Durch Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden in Patch-Clamp-Versuchen wurde gezeigt, dass die hormonelle Aktivierung von G_i2-Proteinen zur Stimulation von L-Typ-Kalziumkanälen der C-Klasse in kultivierten GH₃-Zellen führen kann. Dieser Signalweg erfordert die gleichzeitige hormonelle Aktivierung von Proteinkinase C (vermutlich über G_q/11-Proteine). Die Befunde bildeten die Voraussetzung für den Nachweis gleichartiger Signalwege zur Stimulation von L-Typ-Kalziumkanälen in Gefäßmuskelzellen durch andere Arbeitsgruppen. Diese Befunde und Zusammenhänge werden unter 3.1.5 diskutiert.

Anlage zu 2.1.3.

1. Gollasch, M., Haller, H., Schultz, G., Hescheler, J.: Thyrotropin-releasing hormone induces opposite effects on Ca²⁺ channel currents in pituitary cells by two pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10262-10266 (1991).
2. Gollasch, M., Kleuss, C., Hescheler, J., Wittig, B., Schultz, G.: Gi2 and protein kinase C are required for thyrotropin-releasing hormone-induced stimulation of voltage-dependent Ca²⁺ channels in pituitary GH₃ cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6265-6269 (1993).

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2.1.4 Expression von L-Typ-Kanälen und Differenzierung von Gefäßmuskelzellen

Eine Vielzahl von Untersuchungen hat sich mit der Differenzierung von Gefäßmuskelzellen beschäftigt. Allerdings wurde bislang die differentielle Expression von Ionenkanälen in Gefäßmuskelzellen nicht ausreichend untersucht. In der folgenden Arbeit konnte für kultivierte Gefäßmuskelzellen gezeigt werden, dass die Anzahl von L-Typ-Kanälen (insbesondere die Anzahl der ₁- und ß₂-Untereinheiten) direkt mit der Expression von glattmuskulärem -Actin und schweren glattmuskulären Myosinketten korreliert. Retinolsäure bewirkte eine Redifferenzierung der Zellen und gleichzeitige Induktion von L-Typ-Kalziumkanälen. Die Ergebnisse zeigen, dass L-Typ-Kanäle als neuer Marker für den Differenzierungsgrad von Gefäßmuskelzellen fungieren könnten. Die differentielle Expression von Ionenkanälen könnte von physiologischer Bedeutung für Gefäßmuskelzellen sein und sich auf das Verhalten der Zellen unter pathophysiologischen Bedingungen auswirken.

Anlage zu 2.1.4.

1. Gollasch, M., Haase, H., Ried., C., Lindschau, C., Miethke, A., Morano, I., Luft, F.C., Haller, H.: Expression of L-type calcium channels depends on the differentiated state of vascular smooth muscle cells. FASEB J. 12: 593-601 (1998).

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2.1.5 Stellenwert der Untersuchungsergebnisse

Eine Übersicht über die Bedeutung der eigenen Untersuchungsergebnisse und den internationalen Kenntnisstand ist in der folgenden Publikation gegeben (Anlage zu 2.1.5.):

1. Gollasch, M., Nelson, M.T.: Voltage-dependent Ca²⁺ channels in arterial smooth muscle cells. Kidney Blood Pressure Res. 20: 355-371 (1997).

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2.2 Kaliumkanäle

2.2.1 Vorkommen und Charakterisierung von Kaliumströmen in humanen Gefäßmuskelzellen

Die Diversität von Kaliumkanälen in animalischen Gefäßmuskelzellen ist groß. Allerdings existieren nur sehr wenige Untersuchungen zur Identifizierung von Kaliumkanälen in humanen Gefäßmuskelzellen. Im vorliegenden Teilthema wurden Kaliumkanalströme in frisch-isolierten Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik identifiziert und charakterisiert. Es wurden vier diverse Kaliumkanalströme detektiert: (1) ein verzögerter auswärtsgerichteter K_(dr)-Strom (I_K(dr)), (2) ein Ca²⁺-aktivierter K_Ca-Strom (I_K(Ca)), (3) ein ATP-abhängiger K_ATP-Strom (I_K(ATP)) und (4) spontane transiente Auswärtsströme (STOCs, „spontaneous transient outward currents“). Die Kaliumströme waren nicht uniform in den Zellen verteilt. Diese Befunde lassen vermuten, dass es unterschiedliche Populationen von Gefäßmuskelzellen in der Gefäßwand humaner Koronararterien gibt. Die identifizierten Kaliumkanalströme unterschieden sich in einigen Parametern von Kaliumströmen in nicht koronaren humanen Gefäßmuskelzellen. Diese Befunde sind von Bedeutung für die Entwicklung gefäß- und speziesselektiver Pharmaka und das Verständnis der Regulation des Gefäßtonus durch endogene Wirkstoffe (z.B. PACAP 27) sowie pathophysiologischer Vorgänge im arteriellen Gefäßmuskel, wie beispielweise ischämische Prekonditionierung.

Anlage zu 2.2.1.

1. Gollasch, M., Ried, C., Bychkov, R., Luft, F.C., Haller, H.: Potassium currents in human coronary artery vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 78: 676-689 (1996).

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2.2.2 Modulation von K_ATP- und K_Ca-Kanälen durch vasoaktive Wirkstoffe

ATP-abhängige Kaliumkanäle (K_ATP-Kanäle) sind Zielstruktur für eine neue Klasse von gefäßaktiven Pharmaka, den s.g. Kaliumkanalöffnern (KCO). Die Wirkung dieser Pharmaka auf humane K_ATP-Kanäle ist nicht ausreichend untersucht. In den folgenden Arbeiten wurden Interaktionen von Pinacidil mit K_ATP-Kanälen in humanen Koronararterien untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass (1) Pinacidil K_ATP-Kanäle geringer Leitfähigkeit in Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien öffnet, (2) K_ATP-Kanäle in relativ geringer Dichte in humanen koronararteriellen Gefäßmuskelzellen vorkommen und (3) die Öffnung von K_ATP-Kanälen zur Relaxation von humanen Koronararterien führt. In den Untersuchungen zeigte sich, dass Pinacidil ebenfalls Ca²⁺-aktiverte (K_Ca) Kaliumkanäle öffnet und somit ein nichtselektiver KCO in humanen Koronararterien ist. In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Öffnung von K_Ca-Kanälen zur Relaxation von humanen Koronararterien durch Nitrate beiträgt.

Anlage zu 2.2.2.

1. Gollasch, M., Bychkov, R., Ried, C., Behrendt F., Scholze, S., Luft, F.C., Haller, H.: Pinacidil relaxes porcine and human coronary arteries by activating ATP-dependent potassium channels in smooth muscle cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 681-692 (1995).
2. Bychkov, R., Gollasch, M., Ried, C., Luft, F.C., Haller, H.: Effects of pinacidil on Ca²⁺-activated and ATP-dependent K⁺ channels in human coronary artery vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 273: C161-C171 (1997).
3. Bychkov, R., Gollasch, M., Steinke, T., Ried, C., Luft, F.C., Haller, H.: Calcium-activated potassium channels and nitrate-induced vasodilation of human coronary arteries. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285: 293-298 (1998).

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2.2.3 Ca²⁺-Sparks und K_Ca-Kanäle in Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien

Ca²⁺-Sparks sind intrazellulär lokalisierte Ca²⁺-Transienten, die durch Öffnung von Ryanodin-sensitiven Ca²⁺-Freisetzungskanälen (Ryanodinrezeptoren) des sarkoplasmatischen Retikulums entstehen. Diese Ca²⁺-Signale öffnen kolokalisierte Ca²⁺-aktivierte (K_Ca) Kaliumkanäle in der Plasmamembran und induzieren dadurch s.g. STOCs („spontaneous transient outward currents“) in verschiedenen animalischen glattmuskulären Zellen. In diesem Teilthema wurden Ca²⁺-Sparks und STOCs in Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien untersucht. Es wurde gezeigt, dass Ca²⁺-Sparks/STOCs in humanen koronararteriellen Zellen vorkommen. Humane Ca²⁺-Sparks/STOCs unterscheiden sich in einigen Eigenschaften und insbesondere in ihrer Regulation von animalischen Zellen erheblich. Indirekt wurde der Nachweis geführt, dass Ca²⁺-Sparks/STOCs in humanen koronararteriellen Zellen durch den plasmalemmalen Na⁺/Ca²⁺-Austauscher reguliert werden. Die Ergebnisse lassen die Existenz einer funktionellen Membranmikrodomäne vermuten, die aus einem L-Typ-Kanal, multiplen K_Ca-Kanälen, multiplen Ryanodinrezeptoren und einem/mehreren Na⁺/Ca²⁺-Austauscher/n besteht.

Anlage zu 2.2.3.

1. Bychkov, R., Gollasch, M., Ried, C., Luft, F.C., Haller, H.: Regulation of spontaneous transient outward potassium currents in human coronary arteries. Circulation 95: 503-510 (1997).
2. Fürstenau, M., Löhn, M., Luft, F.C., Haller, H., Gollasch, M.: Calcium sparks in human coronary artery smooth muscle cells resolved by confocal imaging. J. Hypertens. 18: 1215-1222 (2000).

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2.2.4 Bedeutung von K_Ca-Kanälen, die durch Ryanodin-sensitive Ca²⁺-Freisetzungskanäle des sarkoplasmatischen Retikulums reguliert werden

Andere Arbeitsgruppen haben vermutet, dass Ca²⁺-Sparks/STOCs gefäßrelaxierend wirken. Allerdings ist dieser Mechanismus nicht ausreichend belegt. In einem postnatalen Entwicklungsmodell wurde die Bedeutung von Ca²⁺-Sparks und STOCs für die Regulation des myogenen Tonus von geringlumigen Hirnarterien untersucht. Es wurde gezeigt, dass L-Typ-Kanäle, Ca²⁺-Spark-generierende Ryanodinrezeptoren und K_Ca-Kanäle als funktionelle Einheit operieren, die die Feineinstellung des myogenen Tonus bewerkstelligt. Während der Anstieg der globalen intrazellulären Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]) zur Vasokonstriktion führt, bewirken lokale Ca²⁺-Sparks eine Vasodilatation durch Öffnung von K_Ca-Kanälen. In Hirnarterien der Ratte bewirken die globale intrazelluläre [Ca²⁺]-Konzentration per se und eine Ca²⁺-Spark-Frequenz von <10^-2 Hz keine ausreichende K_Ca-Kanalaktivität, um den myogenen Tonus zu regulieren.

Anlage zu 2.2.4.

1. Gollasch, M., Wellman, G. C., Knot, H. J., Jaggar, J. H., Damon D. H., Bonev, A. D., Nelson, M. T.: Ontogeny of local SR calcium signals in cerebral arteries. Ca²⁺ sparks as elementary physiological events. Circ. Res. 83: 1104-1114 (1998).

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2.2.5 Stellenwert der Untersuchungsergebnisse

Eine Übersicht über die Bedeutung der eigenen Untersuchungsergebnisse und den internationalen Kenntnisstand ist in den folgenden Publikationen gegeben:

1. Gollasch, M.: Potassium channels in the coronary circulation. In: Potassium channels in cardiovascular biology. Eds. S.L. Archer and N.J. Rusch, Kluwer, New York, S. 591-615 (2001). ISBN 0-306-46402-0
2. Gollasch, M., Löhn, M., Fürstenau, M., Nelson, M.T., Luft, F.C., Haller, H.: Ca²⁺ channels, “quantized“ Ca²⁺ release, and differentiation of myocytes in the cardiovascular system. J. Hypertens. 18: 989-998 (2000).

Beide Arbeiten finden sich auf den Seiten 18 bis 35 und in der Anlage zu 2.2.5.

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