Gräfe, Michael: Die Bedeutung entzündlicher Reaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose - Untersuchungen an einem in vitro Modell menschlicher kardialer Endothelzellen

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Kapitel 1. Zusammenfassung

In den letzten Jahren sind bedeutende Fortschritte im Verständnis der Pathogenese der Arteriosklerose gemacht worden. Die kardiovaskulären Erkrankungen als Manifestation der Arteriosklerose sind unverändert Ursache für über 50% der Todesfälle in den westlichen Ländern ( 165 ). Nach dem 75. Lebensjahr sind sie sogar für ca. 70% der Todesursachen verantwortlich.

Die Arteriosklerose ist eine Erkrankung, die aus einem komplexen Interagieren molekularer und zellulärer Veränderungen in der Intima der Arterien beginnt und durch ein Zusammenspiel genetischer und umweltbedingter Faktoren (Hyperlipidämie, Hypertonie, Zigarettenrauchen) moduliert wird. Diese Interaktionen implizieren aber zugleich, daß Faktoren auf der Ebene der Gefäßwand und der einzelnen Zelle spezifisch die Empfindlichkeit gegenüber den Risikofaktoren modifizieren und so den Verlauf und den Phänotyp der Arteriosklerose beeinflussen.

Durch die Entwicklung spezifischer monoklonaler Antikörper gegen zelluläre Komponenten der Gefäßwand und gegen Plasmafraktionen, durch Tiermodelle und durch neue molekularbiologische Techniken, konnten wichtige Faktoren in der Ätiologie der Arteriosklerose identifiziert werden. Da einzelne dieser identifizierten Faktoren in einem komplexen in vivo System schlecht untersucht werden können, bietet sich als Alternative an, diese Untersuchungen in in vitro Modellen unter gut definierten Bedingungen durchzuführen.

Trotz der Einführung von Tiermodellen zum Studium der Arteriosklerose ( 185 , 256 ) ist es aufgrund der Speziesunterschiede notwendig, die Mechanismen der Arterioskleroseentstehung auch in einem menschlichen Modell zu studieren. Dies ist naturgemäß in vivo nur eingeschränkt möglich.

In vitro Modelle mit vaskulären Zellen bieten sich als Alternative an, um die in der Patho


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genese der Arteriosklerose wichtigen Mechanismen und zellulären Interaktionen zu untersuchen. Diese Modelle haben den Vorteil, daß die Versuche mit humanem Gewebe durchgeführt werden können und - falls es gelänge aus bestimmten Abschnitten der Zirkulation Zellen zu isolieren - auch organspezifische Eigenheiten zu definieren. Für das Organ Herz existieren diese Modelle nicht.

Endothelzellen sind an den frühen Stadien der Atherogenese entscheidend beteiligt, da sie durch vielfältige Funktionen die lokale Homöostase der Gefäßwand aufrecht erhalten. Sie wirken nicht nur regulierend auf den Gefäßtonus und die lokale Koagulation ein, sondern sind ganz wesentlich an der Monozyten- und Lymphozytenrekrutierung, die die frühen arteriosklerotischen Läsionen kennzeichnet, beteiligt.

Zielsetzung war es daher, aus der kardialen Zirkulation ein Modell menschlicher kultivierter Endothelzellen zu etablieren, das eine genügende Anzahl und Reinheit der isolierten Zellen garantiert, um Versuche unter möglichst physiologischen Bedingungen zu ermöglichen.

Diese Zielsetzung konnte durch die Etablierung von Methoden realisiert werden, mit denen aus menschlichen Koronararterien Endothelzellen isoliert und in Kultur vermehrt wurden. Um ein Vergleichssystem aus einem Bereich der kardialen Zirkulation zur Verfügung zu haben, in der die typischen arteriosklerotischen Veränderungen nicht auftreten, wurden zusätzlich aus Herzmuskelgewebestücken Endothelzellen der Mikrozirkulation gewonnen. Die für die Isolation der Endothelzellen benötigten Koronararterien und Herzmuskelgewebestücke wurden bei Herztransplantationen aus explantierten Herzen gewonnen. Für die Untersuchungen wurden Herzen von Patienten, die an einer Kardiomyopathie oder einer Klappenerkrankung erkrankt waren sowie Patienten mit angeborenen Herzfehlern verwendet. Dies sollte arteriosklerotisch bedingte zelluläre Veränderungen ausschließen. Da die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der kardialen Endothelzellen nicht bekannt waren, mußte neben der reinen zahlenmäßigen Isolation der Zellen auch eine Charakterisierung erfolgen.

Durch Verwendung bekannter endothelialer Marker, wie von Willebrandt Faktor und CD31, konnten die isolierten Zellen als Endothelzellen identifiziert werden. Die primär isolierten Kulturen zeigten jedoch eine Verunreinigung mit nicht-endothelialen Zellen, so daß zusätzlich auch Methoden zur Reinigung von nicht-endothelialen Zellen entwickelt werden mußten.


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Die bislang von anderen Autoren für Zellen verwendeten Trennmethoden waren wegen ihrer schlechten Diskriminationsfähigkeit oder geringen Leistungsfähigkeit nicht anwendbar. Durch die Verwendung paramagnetischer Dynabeads, die mit Proteinen gekoppelt werden können, war es möglich, die isolierten Mischkulturen mit hoher Effizienz und Reinheit zu trennen. Dazu wurden paramagnetische Dynabeads mit dem Lectin Ulex Europaeus gekoppelt. Diese Dynabeads lagern sich spezifisch an Endothelzellen an und können in einem Magnetfeld zusammen mit den Endothelzellen gesammelt werden. Die Kulturen zeigten nach dieser Trennprozedur und Färbung mit Endothelmarkern, wie z.B. CD31, und anschließender Analyse im Durchflußzytometer eine Reinheit von > 95% Endothelzellen, so daß die gewonnenen Zellkulturen für die geplanten Untersuchungen gut geeignet erschienen ( 87 ).

Die isolierten Zellen aus Koronararterien und der kardialen Mikrozirkulation wurden unter identischen Kulturbedingungen kultiviert, um für Untersuchungen vergleichbare Ausgangsbedingungen zu schaffen. Da die Isolationsprozedur eine hohe Ausbeute von Zellen und hoch reine Kulturen gewährleistete, konnten Untersuchungen mit diesen Zellen zu frühen Kulturzeitpunkten durchgeführt werden, ehe - durch exzessive Zellteilungen und lange Kulturdauer - eine Alterung und Dedifferenzierung der Zellen auftrat. Die Charakterisierung und Isolierung der kardialen Endothelzellen ist in Abschnitt 2 dargestellt.

Dieses in vitro Modell kultivierter menschlicher kardialer Endothelzellen konnte nun zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der Pathogenese der Arteriosklerose verwendet werden. Dabei war ein Schwerpunkt der Vergleich zellulärer Funktion von Endothelzellen aus der Mikro- und der Makrozirkulation, zwei Gefäßarealen, die unterschiedlich die Veränderungen der arteriosklerotischen Gefäßerkrankungen spiegeln. Arteriosklerotische Plaques werden in den großen Gefäßen (Aorta, Arteria Carotis, Arteria femoralis) beobachtet ( 71 ), dagegen nicht in der Mikrozirkulation. Die Veränderungen der Mikrozirkulation spiegeln sich lediglich in funktionellen Veränderungen wieder, die wesentlich durch die Risikofaktoren der Arteriosklerose wie arterielle Hypertonie ( 117 , 126 ) und Hypercholesterinämie ( 44 ), aber auch durch einen Diabetes mellitus ( 184 ), beeinflußt werden.

Die Reaktion mikro- und makrovaskulärer kardialer Endothelzellen auf Lipoproteine wurde


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bestimmt, um ein zelluläres Korrelat für die unterschiedliche Reagibilität der kardialen Gefäßregionen zu finden. Dabei läßt sich nutzen, daß subendotheliale Einlagerung von Lipoproteinen in der Arterienwand durch das Auftreten oxidativ veränderter LDL gekennzeichnet sind ( 266 ).

Um die Effekte oxidierter LDL an kardialen Endothelzellen zu studieren, wurden normale und oxidierte low density Lipoproteine (ox-LDL) mit Endothelzellen der kardialen Mikro- und Makrozirkulation inkubiert und die Veränderungen verschiedener koagulatorischer Endothelzellfunktionen untersucht. Während normale LDL keine signifikanten Wirkungen induzierte, verursachte oxidiertes LDL an makrovaskulären koronaren Endothelzellen eine verminderte Sekretion des Gewebe-Plasminogen-Aktivators (t-PA) und einen Anstieg der Sekretion des Plasminogen Aktivator Inhibitors 1 (PAI-1) und der Gewebefaktorbildung, der als ein wichtiger Aktivator der extrinsischen Gerinnungsaktivierung angesehen wird ( 88 ). Erstaunlicherweise reagierten mikrovaskuläre Endothelzellen, trotz identischer Kulturbedingungen, nur mit geringen Änderungen der gemessenen Parameter, so daß eine gefäßbettspezifische Reaktionsweise der Endothelzellen aus der kardialen Zirkulation zutage trat. Dieses unterschiedliche Verhalten mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen ist möglicherweise ein Faktor, der die präferentielle Lokalisation arteriosklerotischer Plaques in den großen Gefäßen mit bedingt. Auf der anderen Seite zeigt die unterschiedliche Reaktion der Zellen, daß mit den etablierten Isolations- und Trennmethoden in der Tat unterschiedliche Zellpopulationen gewonnen werden konnten (siehe Abschnitt 3).

Neben den Interaktionen zwischen Lipoproteinen und kardialen Endothelzellen wurden auch die Wechselwirkungen der kardialen Endothelzellen mit Entzündungsmediatoren (Zytokinen) und Leukozyten untersucht, da in den letzten Jahren die Wichtigkeit der im Bereich arteriosklerotischer Plaques zu beobachtenden Entzündungsreaktionen zunehmend erkannt worden ist ( 164 , 201 ). Ein Verständnis der Vorgänge, die die Leukozytenadhäsion regulieren, würde auch neue Ansätze in der Therapie der Arteriosklerose ermöglichen. Bei den hier durchgeführten Untersuchungen zur Interaktion zwischen Leukozyten und kardialen Endothelzellen konnte beobachtet werden, daß makrovaskuläre koronare Endothelzellen besonders empfindlich für aktivierende Stimuli, z.B. proinflammatorische Zytokine, reagieren. Bei diesen Versuchen zeigte sich außerdem, daß Angiotensin II, das sowohl auf den


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Gefäßtonus regulierend ( 78 ) wirkt, als auch trophische Wirkungen auf glatte Muskelzellen ( 76 ) und Fibroblasten ( 170 ) hat, die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selectin sowie E-Selectin abhängige Adhäsion auf makrovaskulären Endothelzellen induzierte. Auch hier reagierten mikrovaskuläre Endothelzellen nur mit einem leichten Anstieg der E-Selectin Expression, eine vermehrte Adhäsion ließ sich nicht nachweisen. Durch spezifische Rezeptorblocker konnte der Rezeptor, der die Wirkungen des Angiotensin II auf die E-Selectin Expression vermittelt, identifiziert werden: Angiotensin II Typ 1 Rezeptoren. Diese Ergebnisse demonstrierten einen bisher unbekannten proinflammatorischen Effekt des Angiotensin II auf Endothelzellen und zeigten zum ersten Mal eine Verbindung zwischen dem Renin-Angiotensin-System und Leukozyten-Endothel-Interaktionen auf ( 89 ).

Andere Autoren haben inzwischen stimulatorische Wirkungen des Angiotensin II auch auf die Expression anderer Adhäsionemoleküle ( 195 ) und auf die Sekretion von Chemokinen ( 45 ) gezeigt und damit die Bedeutung dieser proinflammatorischen Effekte des Angiotensin II für die Pathogenese der Arteriosklerose unterstrichen. Letztlich können auch die posi_tiven Wirkungen der ACE-Hemmer und der AT1-Rezeptorblocker auf die Mortalität und das Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse, die wiederholt in großen Studien gezeigt wurden ( 189 , 268 ), mit den Wirkungen des Angiotensin II auf zelluläre Funktionen erklärt werden, indem diese Medikamente zu einer verminderten inflammatorischen Wirksamkeit des Angiotensin II führten.

Neben humoralen Faktoren wie Zytokinen und Angiotensin II können jedoch auch zelluläre Komponenten eine Entzündungsreaktion induzieren. CD40-Ligand (CD154) ist ein TNF ähnliches Protein, das auf der Zelloberfläche von aktivierten T-Lymphozyten ( 84 ) und - wie kürzlich gezeigt werden konnte - auch von aktivierten Thrombozyten exprimiert wird ( 104 ).

Wie die hier durchgeführten Versuche zur Wirkung von CD40-Ligand auf vaskuläre Endothelzellen belegen, induzierte CD40 Ligand auf Endothelzellen sowohl eine Expression von Adhäsionsmolekülen als auch eine vermehrte Leukozytenadhäsion. Die Effekte durch CD40 Stimulation waren im Vergleich zu TNFalpha etwas schwächer ausgeprägt aber qualitativ ähnlich. Da der aktive CD40 Ligand nur auf der Zelloberfläche aktivierter CD4+ T-Lymphozyten und aktivierter Thrombozyten zu finden ist, bleiben die Wirkungen lokal begrenzt. Sie


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stellen aber einen zusätzlichen Entzündungsstimulus dar, der - wie inzwischen von anderen Autoren gezeigt worden ist ( 111 , 134 ) - für entzündliche Erkrankungen durchaus von Bedeutung sein kann und somit auch für die Pathogenese der Arteriosklerose.

Neben der gefäßbettabhängigen unterschiedlichen Induktion der E-Selectin abhängigen Leukozytenadhäsion konnten auch Unterschiede der L-Selectin abhängigen Interaktionen zwischen Leukozyten und kardialen Endothelzellen beobachtet werden. So zeigte sich, daß L-Selectin abhängige Adhäsion vorzugsweise an Endothelzellen aus der kardialen Mikrozirkulation auftrat und an makrovaskulären koronaren Endothelzellen kaum zu beobachten war. Kultivierte mikrovaskuläre Endothelzellen sind damit eines der wenigen in vitro Modelle mit Zellen humanen Ursprungs, mit dem L-Selectin abhängige Adhäsion an spezifische L-Selectin Liganden beobachtet werden kann. Eine Charakterisierung des L-Selectin Liganden ergab, daß er sich von anderen bekannten Liganden auf hochendothelialen Venolen des Lymphsystems ( 135 , 208 ) in seiner Regulation und seinen Zuckerkomponenten unterscheidet und möglicherweise eine Proteoglykan ist.

Aus diesen Ergebnissen könnte spekuliert werden, daß Angiotensin II und CD40 vor allem in frühen Stadien der Entstehung arteriosklerotischer Läsionen eine Bedeutung als proinflammatorische Leukozytenadhäsion-induzierende Faktoren haben, während L-Selectin in späteren Stadien, wenn sich bereits eine Neovaskularisation im Bereich des Plaques ausgebildet hat ( 14 , 271 ), für die Leukozytenrekrutierung von Bedeutung ist.


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Abbildung 1.1: Interaktionen von Endothelzellen, Leukozyten und Thrombozyten und ihre Modulation durch Zytokine, Angiotensin II und oxidierte LDL bei der Pathogenese der Arteriosklerose


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Das Modell kultivierter kardialer menschlicher Endothelzellen ermöglichte es, zelluläre Funktionen, die in der Pathogenese der Arteriosklerose von Bedeutung sind, zu untersuchen und dabei regionale Unterschiede sowohl koagulatorischer Funktionen als auch Funktionen, die für die Leukozytenrekrutierung von Bedeutung sind, zu identifizieren und so zu einem besseren Verständnis der Pathomechanismen der Arteriosklerose beizutragen. Die Untersuchungen zeigten weiter, daß sich auch für die Therapie ein neues Verständnis ergeben könnte.

Der Wirkungen oxidierter LDL kann eine Ratio für das Einsetzen von Antioxidantien in die Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen darstellen. Für Probucol gibt es neben zahlreichen Untersuchungen an Tiermodellen ( 43 , 254 ) auch Studien, die die Wirksamkeit bei koronarer Herzerkrankung am Menschen belegen ( 199 , 232 ). Für andere Antioxidantien, wie z.B. Vitamin-E, Vitamin C und beta-Caroten, liegen jedoch noch keine einheitlichen Ergebnisse vor ( 105 , 186 , 226 ), so daß ein Therapiekonzept noch nicht abgeleitet werden kann.

Eine Therapie mit ACE-Hemmern oder AT1 Rezeptorblockern, die lokal die Verfügbarkeit bzw. die Wirksamkeit des Angiotensin II vermindern, könnte - aufgrund der hier dargelegten Ergebnisse - nicht nur als eine antihypertensive Therapie, sondern auch als eine antiinflammatorische und damit antiarteriosklerotische Therapie verstanden werden und einen Teil der positiven Wirkungen erklären, die in verschiedenen großen Studien für diese Medikamente gezeigt worden sind.

L-Selectin spielt neben der Rezirkulation von Leukozyten ( 35 ) auch bei Reperfusionsschäden des Myokards ( 34 ) eine Rolle. Möglicherweise ist auch die Leukozytenakkumulation in arteriosklerotischen Plaques L-Selectin abhängig, was aufgrund der fehlenden Detektionsmöglichkeiten bisher nicht bewiesen werden konnte. Neue Techniken der in vivo Markierung von biologischen Molekülen eröffnet die Möglichkeit, diese fehlenden Informationen zu ergänzen ( 60 ), um dann durch selektive Inhibition von L-Selectin abhängigen ( 168 ) Adhäsionsmechanismen Reperfusionsschäden bei Myokardinfarkten und die Leukozytenrekrutierung in die Gefäßwand zu hemmen.

Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen an einem neu entwickelten in vitro Modell humaner


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menschlicher kardialer Endothelzellen unterschiedliche Reaktionen der Zellen aus Koronararterien und aus der kardialen Mikrozirkulation. Durch die differentielle Untersuchung mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen in ihrer Reaktion auf oxidierte Lipoproteine und verschiedene Entzündungsmediatoren war es möglich, mehrere Endothelzellfunktionen zu definieren, die in beiden Zellarten unterschiedlich reguliert werden. Diese unterschiedlichen zellulären Reaktionen können in den frühen Stadien der Arteriosklerose für die Progression der Erkrankung von Bedeutung sein und ermöglichen es, die Pathogenese der Arteriosklerose auf zellulärer Ebene differenzierter zu betrachten.


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