Gräfe, Michael: Die Bedeutung entzündlicher Reaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose - Untersuchungen an einem in vitro Modell menschlicher kardialer Endothelzellen

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Kapitel 2. Isolierung und Charakterisierung humaner kardialer makrovaskulärer und mikrovaskulärer Endothelzellen

Das Verständnis der Pathogenese der Arteriosklerose ist in den letzten 20 Jahren revolutioniert worden. Wesentlich für das moderne Verständnis dieser chronischen Erkrankung haben die Arbeiten von R. Ross beigetragen, der in den 70er Jahren die „Response to injury“ Hypothese formulierte ( 202 ). Diese Hypothese besagte, daß es an bestimmten Stellen des Gefäßbettes zu einem Verlust des Gefäßendothels käme und dieses der Ausgangspunkt für Thrombozytenaggreagte darstellen würde, die wiederum durch Freigabe von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, wie z.B. PDGF, eine Kaskade von Ereignissen triggerten, die letztendlich in der arteriosklerotischen Läsion endeten ( 99 , 204 ). Im Laufe der Jahre wurde diese Hypothese modifiziert und den neuen Erkenntnissen angepaßt, ist aber in ihrem grundlegenden Gedanken auch heute noch gültig ( 201 ). Zunächst stand die Reaktion der glatten Muskelzellen im Vordergrund der Forschung ( 203 ). Durch die Entdeckung der Adhäsionsmoleküle erweiterte sich der Blickpunkt auf die Endothelzellen ( 190 ). Da Adhäsionsmoleküle die Interaktion von Leukozyten mit dem Endothel vermitteln, lag es nahe zu vermuten, daß das Einwandern von Makrophagen und Lymphozyten ( 98 ) in die Gefäßwand im Bereich von Cholesterineinlagerungen durch endotheliale Adhäsionsmoleküle gesteuert würde. Diese Hypothese konnte durch den Nachweis von vermehrt expremierten Adhäsionsmolekülen und einer vermehrten Adhäsion von Leukozyten im Bereich arteriosklerotischer Läsionen gestützt werden ( 58 , 179 , 245 ). Die zur Zeit allgemein vertretene Auffassung besagt, daß die frühen Stadien der Arteriosklerose einem entzündungsähnlichen Prozeß gleichen, der durch die Einlagerung von Lipoproteinen in die Gefäßwand induziert wird und zunächst als ein reparativer Prozeß verstanden werden kann, der jedoch, wenn er überhand nimmt und chronisch bleibt, zu einer Zerstörung des Organs „Gefäß“ führt ( 201 ).


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Einen wesentlichen Anteil an den modernen Erkenntnissen der Arteriosklerose haben Tiermodelle beigetragen, die es ermöglichten, die arteriosklerotischen Veränderungen im Kontext der regulativen Prozesse des gesamten Körpers zu studieren. Leider sind die aus diesen Modellen gewonnen Erkenntnisse nur beschränkt auf den Menschen übertragbar, da die arteriosklerotischen Läsionen der Tiermodelle den im menschlichen Organismus vorkommenden nur ähneln und damit nur Teilaspekte darstellen können ( 29 ). Dies führte dazu, für Studien der Arterioskleroseentstehung menschenähnliche Primaten, Affen, zu verwenden ( 145 , 155 ). Auf der anderen Seite war man bemüht, neue und bessere Tiermodelle zu entwickeln (LDL-Rezeptor deficient mice, ApoE deficient mice), die die Veränderungen der menschlichen Arteriosklerose besser nachbilden ( 114 , 185 ).

Als weitere Möglichkeit die Mechanismen der Arterioskleroseentstehung zu studieren, bieten sich in vitro Versuche mit menschlichen Zellkulturen an, die den Vorteil haben, die Reaktionsweisen spezifischer Zellpopulationen unter definierten Bedingungen studieren zu können, allerdings außerhalb der physiologischen Umgebung des Körpers.

Techniken zur Isolation menschlicher Endothelzellen, glatter Muskelzellen und Monozyten sind vielfältig beschrieben worden. Als Modell werden meist aus Nabelschnüren gewonnene Zellen verwendet, da das Gewebe leicht zu beschaffen ist, und sich die Zellen einfach isolieren lassen ( 68 , 115 ). Vielfältige Befunde zeigen jedoch, daß Morphologie und Funktion der Gefäßzellen regional unterschiedlich ist ( 77 , 218 ). Daher muß die Übertragbarkeit von Ergebnissen, die mit Zellen der Nabelschnur gewonnen wurden, auf andere Gefäß- und Organbereiche jeweils überprüft werden.

Idealerweise sollten für Untersuchungen zur koronaren Herzerkrankung Zellen aus Koronararterien verwendet werden. Da bei Herztransplantationen Koronararterien zur Verfügung stehen, bietet sich die Möglichkeit an, aus diesen Gefäßen Endothelzellen zu isolieren und diese für in vitro Versuche zu isolieren und zu kultivieren.

Derartige Modelle waren für menschliche Koronararterien nicht bekannt und mußten daher neu etabliert werden. Dies betraf nicht nur die Isolationstechnik aus den Koronararterien, sondern auch die nachfolgende Kultivierung, Zellvermehrung und Reinigung von nicht-endothelialen Zellen.


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Um die für die Entstehung der Arteriosklerose typischen Eigenschaften der koronaren Endothelzellen erkennen zu können, ist ein zelluläres Vergleichssystem notwendig, das ebenfalls aus dem menschlichen Herzen stammen sollte, um den Vergleich nicht durch spezifische Eigenschaften anderer Organe zu komplizieren. Für diesen Zweck bietet es sich an, Zellen aus der Mikrozirkulation menschlicher Herzen zu isolieren. Diese Zellen würden aus dem gleichen Organ stammen, aus dem die koronaren Zellen isoliert werden, aber aus einem anderen Gefäßbereich, in dem die typischen arteriosklerotischen Veränderungen der großen Arterien nicht beobachtet werden.

Vergleichbar wie für die Isolation makrovaskulärer Endothelzellen, gab es für die Isolation kardialer mikrovaskulärer Endothelzellen kaum publizierte Erfahrungen. Die Isolation kardialer Endothelzellen wurde aus Kaninchen ( 216 ), Meerschweinchen ( 167 ) und Rindern ( 157 ) beschrieben. Die Methoden gingen von anderen Voraussetzungen aus, was die Verarbeitung des Herzmuskels und die Vorbereitung der Versuchstiere betraf. Diese publizierten Methoden waren aber der Ausgangspunkt für die zu entwickelnden Methoden zur Isolierung humaner kardialer mikrovaskuläre Endothelzellen.

Zur Etablierung eines Modells kultivierter menschlicher Endothelzellen aus Koronararterien und aus der kardialen Mikrozirkulation mußte die Technik der Isolierung der beiden Zellarten - entsprechend den spezifischen Gegebenheiten explantierter humaner Herzen - neu entwickelt werden. Ein Hauptproblem dabei war, die jeweils isolierten Zellen in ihren Eigenschaften von einander abzugrenzen und ihre Identität als mikro- bzw. makrovaskuläre Endothelzellen zu etablieren. Da sowohl die morphologischen als auch die funktionellen Eigenschaften humaner kardialer Endothelzellen nicht bekannt waren, war es zunächst notwendig, auf Grundlage der Isolationstechniken, die Zellen zu charakterisieren.

Hierfür sind Kulturen hoher Reinheit notwendig, die durch die bislang beschriebenen Isolationstechniken nicht zu gewährleisten waren. Neben der reinen Gewinnung der Zellen war es daher notwendig auch Methoden zur Trennung der isolierten Endothelzellen von nicht-endothelialen Zellen zu entwickeln.

In den folgenden Kapiteln wird die Isolation und morphologische Charakterisierung kardialer Endothelzellen dargestellt. In den Kapiteln 3 - 5 werden dann spezifische Zellfunktionen bei Interaktionen mit Lipoproteinen, Entzündungsmediatoren und Leukozyten beschrieben. Die hier gewonnenen Ergebnisse belegen, daß die aus menschlichen Herzen isolierten Endothel


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zellen zum Teil sehr gefäßbettspezifisch reagieren und so die unterschiedliche Herkunft der Zellen aus den verschiedenen Gefäßbereichen der kardialen Zirkulation belegen.

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2.1 Ergebnisse

2.1.1 Histologische Untersuchung von menschlichem Myokardgewebe:

Es wurden zunächst histologische Untersuchungen an menschlichem Myokardgewebe vorgenommen, um verschiedene immunologische Charakteristika auf ihre Verwendung zur Identifikation und Charakterisierung der isolierten kardialen Endothelzellen zu überprüfen.

Ulex Europaeus färbte das Endothel der Arterien, Kapillaren und Venen an, aber auch das Epikard und das Endokard. Ein ähnliches Färbemuster wurde auch mit dem CD31 Antikörper beobachtet, der ebenfalls das Endothel von Arterien, Kapillaren, Venen sowie das Peri- und Endokard anfärbte. Antikörper gegen von Willebrand Faktor reagierten mit dem gesamten vaskulärem Endothel. Im Gegensatz zu CD31 und UEA-I wurde das Endokard jedoch nur sehr schwach und das Epikard überhaupt nicht gefärbt (Abbildung 2.1).

Die Färbung zum Nachweis alkalischer Phosphatase Aktivität zeigte eine positive Reaktion im Bereich der inneren Begrenzung kleiner Arterien, kleiner Venen und auch perikapillär. Große Gefäße, das Epi- und Endokard blieben dagegen negativ. Die histologischen Präparate erlaubten es jedoch nicht, die positive alkalische Phosphatase Reaktion einer bestimmten Zellart zu zuordnen (Siehe Seite 27#LINKCONTENT#27#/LINKCONTENT#).

Die Ergebnisse zeigten, daß Immunoreaktivität gegen UEA-I, CD31 und von Willebrandt Faktor auf menschlichen kardialen Endothelzellen nachweisbar ist. Von Willebrandt Faktor wird nur auf vaskulärem Endothel exprimiert und eignet sich daher am besten zur Identifizierung der isolierten Endothelzellen.


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Abbildung 2.1: Histologische Präparate menschlichen Herzens wurden mit Antikörpern gegen von Willebrand Faktor (a), CD31 (b) gefärbt. Zusätzlich erfolgte eine Anfärbung mit dem Ulex Europaeus Lectin (c) und der alkalischen Phosphataseaktivität (d)

2.1.2 Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen:

Während der Perfusion des Herzmuskelstücks mit Krebs-Henseleit Puffer konnten normalerweise Kontraktionen des Gewebes beobachtet werden, die unter der Perfusion mit Ca2+-freiem Krebs-Henseleit Puffer sistierten. Sie wurden als Indikator für eine gute


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Perfusion der Mikrovaskulatur angesehen, die damit zugänglich für die im nächsten Schritt zugegebenen, abbauenden Enzyme war. Nach Beenden der 30 minütigen Perfusion mit Enzymen wurde das Muskelgewebe aufgeschnitten. Die mit Enzymen perfundierten Areale hoben sich von den nicht perfundierten durch Farbe und Konsistenz des Gewebes ab, das sich hell gefärbt und eine geleeartige Konsistenz annahm. Diese Anteile des Gewebes wurden erneut in der Enzymlösung inkubiert und die Desaggregation des Gewebes durch Entnahme von Alliquots beobachtet. Es zeigten sich perlschnurartige Gebilde, die bei Anfärbung mit FITC markiertem Ulex Europaeus Lectin, fluoreszierten. Diese perlschnurartigen Gebilde entsprachen Endothelzellverbänden, aus dem Gewebe herausgelösten Kapillarfragmenten (siehe Abbildung 2.2).

Abbildung 2.2: Ein bei der Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen gewonnenes Kapillarfragment. a) Phasenkontrastdarstellung. b) Färbung mit FITC Ulex Europaeus Lectin (Vergrößerung 1:100)

Nach Filtern durch ein Nylonsieb und Zentrifugieren der Zellsuspension wurde diese auf 300 cm2 (4 T-75 Kulturflaschen) Wachstumsfläche ausgesät und - wie auf Seite 81#LINKCONTENT#81#/LINKCONTENT# beschrieben - kultiviert.


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2.1.3 Isolation makrovaskulärer Endothelzellen aus Koronararterien:

Makrovaskuläre Endothelzellen wurden zunächst mit der gleichen Enzymmischung, die für die Isolation mikrovaskulärer Endothelzellen verwendet worden war, gewonnen. Gleichzeitig wurde auch die alleinige Wirkung von Collagenase II untersucht. Beide Verfahren ergaben vergleichbare Ergebnisse. Wegen der einfacheren Handhabung wurde im weiteren Collagenase II alleine verwendet. Die Menge der isolierten Endothelzellen hing stark von der Länge der präparierten Gefäße ab. Verläßlich ließen sich Kulturen anlegen, wenn die Gefäßsegmente > 5 cm lang waren. Die Zellen eines ca. 5 cm langen Gefäßsegmentes wurden auf eine Wachstumsfläche von 25 cm2 ausgesät und erreichten innerhalb von 10-14 Tagen Konfluenz.

2.1.4 Beurteilung der isolierten Zellen

24 h nach Aussaat der isolierten Zellen wurden die Kulturschalen gespült, um verbliebene Herzmuskelzellen und Erythrozyten zu entfernen. Die jetzt mögliche Beurteilung der Zellen zeigte, daß sich Gruppen von 3 - 20 Zellen auf der Kulturschale gebildet hatten. Innerhalb einer Woche hatten sich die Zellen so vermehrt, daß ca. 50% der Kulturschale mit Zellen bedeckt war. Mit zunehmender Kulturdauer waren neben Zellen mit der typischen Morphologie einer Endothelzelle, auch Zellen anderer Morphologie sichtbar, die sich häufig zwischen die Endothelzellverbände mischten und nicht in Art eines Monolayers, sondern überlappend, wuchsen. Nach Passagieren der Zellen nahm der Anteil der nicht-endothelialen Zellen weiter zu. Ein Färbung der Endothelzellen mit den Endothelmarkern CD31, UEA-I und DiI-Ac-LDL und anschließender Analyse mit einem Durchflußzytometer bestätigte den visuellen Eindruck: in Primärkulturen fanden sich ca. 10-20% nicht-endotheliale Zellen, nach der ersten Passage stieg dieser Anteil auf 20-50% an (siehe Abbildung 2.3).


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Abbildung 2.3: Aufnahme von Ac-DiI-LDL durch mikrovaskuläre und makrovaskuläre koronare Endothelzellen. Nach Inkubation der Zellen über 4 h mit Ac-DiI-LDL wurde die Fluoreszenz der Zellen im Durchflußzytometer analysiert. a) makrovaskuläre koronare Endothelzellen. b) mikrovaskuläre Endothelzellen nach Abtrennung nicht-endothelialer Zellen. c) mikrovaskuläre Endothelzellen vor Abtrennung nicht-endothelialer Zellen mit paramagnetischen Dynabeads. d) Fibroblasten dienten als Negativkontrolle


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2.1.5 Zelltrennung mit paramagnetischen Dynabeads

Da für die angestrebten Untersuchungen definierte und reine Zellkulturen benötigt wurden, mußte eine Technik entwickelt werden, die es ermöglicht, die in den isolierten Kulturen vermischten Zellen, zu trennen. Es wurden dazu paramagnetische Dynabeads, die mit UEA-I oder CD31 gekoppelt worden waren, verwendet. Nach Inkubation der Zellsuspension mit den Dynabeads, banden diese an die Oberfläche der Endothelzellen und es konnten die Zellen, an die Dynabeads gebunden hatten von denen an die keine Dynabeads gebunden hatten, durch ein magnetisches Feld getrennt werden. Versuche das Verhältnis Zellen zu Dynabeads zu optimieren, ergab, daß ein Verhältnis von 1:10 gute Trennergebnisse erbrachte. Bei niedrigeren Konzentrationen wurden nicht alle Zellen mit genügend Dynabeads beladen, um im Magnetfeld erfaßt zu werden. Höhere Konzentrationen an Dynabeads erbrachten keine Verbesserung der Zelltrennung. Obwohl UEA-I und CD31 spezifisch mit Endothelzellen reagieren (siehe Seite 15#LINKCONTENT#15#/LINKCONTENT#), wurde beobachtet, daß wiederholt nicht-endotheliale Zellen in der Endothelzellfraktion nach der Zelltrennung waren. Dies wurde immer dann beobachtet, wenn die Kulturschalen bei der Trennung bereits sehr dicht bewachsen waren. Offensichtlich gelang es beim Ablösen der Zellen von der Kulturschale nicht, die Zellen vollständig voneinander zu separieren, so daß Zellverbände von mehreren Zellen auftraten, in denen auch nicht-endotheliale Zellen eingebunden waren, und die dann im Zellverband mit den Endothelzellen bei der magnetischen Trennung erfaßt wurden. Es wurde daher angestrebt, die Zelltrennung bereits dann durchzuführen, wenn ca. 75% der Kulturschale mit Zellen bewachsen waren.

Nach der Zelltrennung zeigten die Zellen einen typischen endothelialen Phänotyp mit polygonaler Zellform, ein sog. "Pflastersteinrelief", mit eng aneinander gelagerten Zellen, die bei Konfluenz in einem einschichtigen Monolayer wuchsen. Nur vereinzelt waren Zellen, die eine andere Morphologie als die Endothelzellen aufwiesen, sichtbar. Während makrovaskuläre koronare Endothelzellen diese typische Zellform, die auch bei Nabelschnurendothelzellen beobachtet wurde, aufwiesen, zeigten die mikrovaskulären Zellen eine etwas länglichere Zellform und wuchsen in wirbelartigen, "Fischzug" ähnlichen Formen. Die Beurteilung der getrennten Zellkulturen zeigte, daß sie > 95% Endothelzellen enthielten (siehe Abb. 2.4). Neben der Reinheit der Zellkulturen mußte ihre Identität als vaskuläre Endothelzellen bestätigt werden. Die dazu durchgeführten Färbungen mit Antikörpern gegen von


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Willebrandt Faktor zeigten eine homogene Anfärbung der mikrovaskulären als auch der makrovaskulären koronaren Endothelzellen.

Abbildung 2.4: Analyse von mikrovaskulären und makrovaskulären koronaren Endothelzellen im Durchflußzytometer nach Färbung mit CD31 Antikörpern. Die Reinheit der Kulturen nach Abtrennung nicht-endothelialer Zellen wurde mit Hilfe des CD31 Antikörper beurteilt. a) makrovaskuläre koronare Endothelzellen. b) mikrovaskuläre Endothelzellen. Nabelschnurvenen Endothelzellen (c) dienten als Positivkontrolle, Fibroblasten (d) als Negativkontrolle


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Die isolierten Endothelzellkulturen wurden auf alkalische Phosphatase Aktivität untersucht. Es zeigte sich, daß die Endothelzellfraktion der mit paramagnetischen Dynabeads getrennten Kulturen keine alkalische Phosphatase Aktivität besaß. Erfolgte die Färbung jedoch bei den nicht getrennten Kulturen, wies ein großer Anteil der Zellen eine positive Reaktion auf. Die alkalische Phosphatase positiven Zellen waren meist größer als Endothelzellen, zeigten eine unregelmäßige Zellbegrenzung mit z.T. langen Zellausläufern und wuchsen nicht wie Endothelzellen kontaktinhibiert, sondern häufig über der Endothelzellschicht. Dies läßt vermuten, daß alkalische Phosphatase positive Zellen nicht Endothelzellen sondern möglicherweise Perizyten entsprachen.

Abbildung 2.5: Darstellung der alkalischen Phosphataseaktivität mikrovaskulärer Endothelzellen vor (a) und nach (b) Abtrennung nicht endothelialer Zellen durch paramagnetische Dynabeads. Alkalische Phosphataseaktivität stellte sich rot dar


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2.2 Diskussion der Ergebnisse

Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, daß es möglich ist, Endothelzellen aus Koronararterien und aus der Mikrozirkulation menschlicher Herzen mit hoher Ausbeute und großer Reinheit zu isolieren.

Die Isolation makrovaskulärer koronarer und mikrovaskulärer Endothelzellen aus menschlichen Herzen war bislang nicht beschrieben worden. Es existierten lediglich einige Publikationen, die die Isolation mikrovaskulärer kardialer Endothelzellen bei Tieren wie Kaninchen ( 216 ), Ratte ( 187 ) und Meerschweinchen ( 167 ) beschrieben.

Wie aus diesen Publikationen ersichtlich, war offensichtlich die Perfusion des Gewebes mit einer Enzymlösung wesentlich für eine effektive Isolierung kardialer mikrovaskulärer Endothelzellen. Dieser Schritt, der von Nees et al ( 167 ) bei Isolation von Endothelzellen aus Meerschweinchenherzen eingesetzt wurde, konnte die Zellausbeute gegenüber der von Simionescu et al ( 216 ) beschriebenen Methode verbessern. Offenbar führt die Perfusion des Herzens mit Enzymen zu einer Desintegration der kleinen Gefäße vom umliegenden Gewebe und erhöht so die Ausbeute der zu isolierenden Endothelzellen.

Eine Publikation von Nishida et al ( 173 ) zur Isolation von Endothelzellen aus menschlichen Herzen zeigte, wie schwierig die Etablierung einer Isolationsmethode für Endothelzellen aus menschlichem Myokardgewebe ist. Die Autoren konnten nur geringe Mengen mikrovaskulärer Endothelzellen isolieren. Eine geringe Zahl isolierter Zellen machte es schwierig, wenn nicht sogar unmöglich, Experimente in frühen Kulturpassagen durchzuführen, bevor lange Kultivierung und wiederholte Zellteilungen zu einer Alterung der Zellen führen ( 83 , 235 , 249 ).

Im Gegensatz zu Versuchen mit Nagern stand bei den hier durchgeführten Experimenten zur Isolation menschlicher kardialer Endothelzellen kein komplettes Herz zur Verfügung, sondern nur Myokardstücke von ca. 5 cm Durchmesser. Es mußte daher die Technik der Isolierung den Gegebenheiten angepaßt werden. Schwierig war zunächst, eine ausreichende Perfusion des Gewebes zu erzielen, da die Enzymlösung an den Schnittkanten des Gewebes ablief.


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Durch Verschließen größerer, angeschnittener Gefäße mit kleinen Klemmen konnte jedoch meist eine gute Perfusion erreicht werden.

Durch die hier beschriebene Isolationsprozedur konnte eine ca. 100-fach bessere Ausbeute im Vergleich zu den von Nishida et al. veröffentlichten Daten zur Isolation von humanen kardialen Endothelzellen ( 173 ) erzielt werden.

Die Kontamination von Endothelzellkulturen mit nicht-endothelialen Zellen ist ein immerwährendes und stets neu zu lösendes Problem. Während bei der Isolation von mikrovaskulären Endothelzellen aus Nagern über Probleme einer Verunreinigung mit nicht-endothelialen Zellen nicht berichtet wurde ( 167 , 187 ), war bei menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen bereits in der Primärkultur eine Verunreinigung mit nicht-endothelialen Zellen zu erkennen. Die nicht-endothelialen Zellen wuchsen schneller als Endothelzellen und tendierten dazu, die Kultur bei zunehmender Dauer zu überwachsen. Es mußte daher zusätzlich eine Methode zur Reinigung der isolierten Zellen von nicht-endothelialen Zellen gefunden werden.

Die bislang verwendeten Trennmethoden für Zellen waren wegen ihrer schlechten Diskriminationsfähigkeit oder geringen Leistungsfähigkeit nicht anwendbar.

Die Isolation einzelner Zellklone wird zur Isolierung bestimmter Zellpopolationen aus einem Zellgemisch angewandt. Dazu wird das zu trennende Zellgemisch so ausgesät, daß im Durchschnitt pro Kulturgefäß eine Zelle gelangt. Diese Technik ist bei gut und schnell wachsenden Zellen anwendbar und erprobt ( 40 ). Mikrovaskuläre kardiale menschliche Endothelzellen wachsen jedoch langsam und gehen bei schlechten Wachstumsbedingungen in Apoptose über ( 91 ). Offensichtlich spielen neben Matrixkomponenten und Wachstumsfaktoren ( 83 ) auch parakrin sezernierte Komponenten für das Wachsen und Überleben der Zellen eine Rolle, die bei zu geringer Zelldichte nicht gewährleistet sind. Daher konnte die Technik der Reinigung der Zellkulturen durch klonale Selektion bei kardialen mikrovaskulären Endothelzellen nicht angewendet werden.

Eine weitere Methode zur Zelltrennung ist die Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode


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beruht darauf, daß sich Zellen entsprechend ihrer Dichte in einem Dichtegradienten anordnen. Diese Methoden wurden zur Isolierung von Kapillaren aus dem Gehirn ( 28 ) und von Nees et al. ( 167 ) zur Anreicherung von kardialen mikrovaskulären Endothelzellen verwendet. Zur Abtrennung von menschlichen kardialen Endothelzellen von nicht-endothelialen Zellen eignete sich diese Methode jedoch nicht, da die Dichten der zu trennenden Zellen sehr ähnlich waren und so Überlappungsbereiche bestanden, die eine effektive Zelltrennung unmöglich machten.

Als weitere Methode zur Isolierung bestimmter Zellpopulationen aus einem Zellgemisch ist die Durchflußzytometrie angewendet worden. Nach Markierung von Endothelzellen mit spezifischen Markern, z.B. mit Ac-DiI-LDL, das sehr schnell von Endothelzellen aufgenommen wird, lassen sich endotheliale fluorenszenzmarkierte Zellen von nicht markierten in einem Flüssigkeitsstrom mit speziellen Durchflußzytometern trennen ( 173 , 251 ). Diese Methode erfordert einen hohen apparativen Aufwand, die Trennleistung ist relativ niedrig, und die isolierten Zellen sind durch bakterielle Kontaminationen während der Trennprozedur gefährdet.

Auch paramagnetische Dynabeads sind zur Trennung von Zellpopulationen verwendet worden. Diese lassen sich einfach mit Antikörpern oder anderen Proteinen koppeln. Die mit Antikörpern gekoppelten Dynabeads lagern sich an die das entsprechende Antigen tragenden Zellen an. In einem Magnetfeld können dann die mit Dynabeads beladenen Zellen von Zellen, die keine Dynabeads gebunden haben, abgetrennt werden. Mit dieser Methode ist es sogar möglich, Leukozytensubpopulationen aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften zu trennen ( 152 ). Auch Endothelzellen konnten mit dieser Methode durch Kopplung des Ulex europaeus Lectins an paramagnetischen Dynabeads aus Deziduagewebe angereichert werden ( 75 ).

Paramagnetische Dynabeads wurden ebenfalls auf ihre Tauglichkeit zur Trennung kardialer Endothelzellen von nicht-endothelialen Zellen getestet. Neben dem Anti-Endothelzellantikörper MoAB 1915 wurde Ulex europaeus an die paramagnetischen Dynabeads gekoppelt. Es zeigte sich, daß sowohl der Antikörper als auch das Lectin zur Zelltrennung geeignet waren. Die Zelltrennung erbrachte die besten Ergebnisse, wenn das Verhältnis Zellen - Dynabeads etwa 10 Dynabeads pro Endothelzelle betrug. Bei höheren Mengen an Dynabeads pro Zelle wurde keine weitere Verbesserung der Zelltrennung erreicht, bei einem geringeren Zell-Dynabeadsverhältnis wurden nicht alle Endothelzellen erfaßt. Die Dynabeads wurden innerhalb


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weniger Tage von den Endothelzellen freigesetzt und beeinflußten weder die Morphologie noch meßbar zelluläre Funktionen. Wenn die Kulturschalen zum Zeitpunkt der Trennung bereits konfluent bewachsen waren, mußte oftmals eine zweite Zelltrennung mit paramagnetischen Dynabeads angeschlossen werden. Die Effektivität der durchgeführten Zelltrennungen konnte sowohl durch immunologische als auch durch histologische Färbungen bestätigt werden und zeigte Endothelzellkulturen mit einem Anteil nicht-endothelialer Zellen, der deutlich geringer als 5% war.

Die Zelltrennung mit paramagnetischen Dynabeads hat sich als zuverlässig und gut reproduzierbar erwiesen. Sie erlaubte es, große Mengen mikrovaskulärer Endothelzellen in kurzen Zeiträumen zu bearbeiten. Diese Methode könnte daher auch auf andere Zellsysteme angewendet werden, die bislang nicht als reine Zellkulturen isoliert werden konnten. Damit konnte neben der Forderung nach einer ausreichenden Menge der isolierten Zellen auch die zweite Forderung nach hochreinen Kulturen erfüllt werden. Diese Voraussetzungen ermöglichten es, die isolierten Zellen hinsichtlich ihrer Morphologie und Funktion zu charakterisieren.

Die Isolation koronarer Endothelzellen wurde in Anlehnung an die bei Nabelschnurvenen verwendete Technik durchgeführt. Die Menge der isolierten koronaren Endothelzellen war von der Länge des zur Verfügung stehenden Koronargefäßes abhängig und geringer als die der isolierten Zellen der kardialen Mikrozirkulation. Die isolierten koronaren Endothelzellen wurden ebenso wie die mikrovaskulären Endothelzellen mit paramagnetischen Kügelchen von nicht-endothelialen Zellen gereinigt und unter identischen Bedingungen kultiviert, um für charakterisierende Untersuchungen identische Voraussetzungen zu haben.

Eine vergleichende Betrachtung der zellulären Morphologie beider Endothelzellen ergab, daß koronare Endothelzellen - wie es z.B. für Endothelzellen aus Nabelschnurvenen beschrieben worden war ( 115 ) - eine polygonale Zellform ausbildeten und in einem kontaktinhibierten Monolayer wuchsen. Endothelzellen der Mikrozirkulation bildeten dagegen eine länglichere, spindelartige Zellform aus und das Gesamtbild zeigte ein unruhigeres Wachstumsbild mit Zellen, die in wirbelartigen Strukturen angeordnet waren.

Wie bei den histologischen Untersuchungen konnten, sowohl bei makro- als auch mikrovas


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kulären Endothelzellen, die Expression des von Willebrand Faktors ( 116 ) und Ulex Europaeus Lectin ( 4 ) bindende Oberflächenstrukturen nachgewiesen werden. Diese Parameter sind damit geeignet, Endothelzellen gegenüber nicht-endothelialen Zellen abzugrenzen, jedoch nicht, mikrovaskuläre von makrovaskulären Endothelzellen zu unterscheiden. Auch das CD31 Antigen ( 172 ) konnte auf Endothelzellen beider Gefäßregionen nachgewiesen werden. CD31 eignet sich aufgrund der starken konstitutiven Oberflächenexpression ( 171 ) auf Endothelzellen, besonders gut zur Identifikation von Endothelzellen, jedoch nicht zur Unterscheidung von Endothelzellen unterschiedlicher Gefäßregionen.

Es ist postuliert worden, daß mikrovaskuläre Endothelzellen alkalische Phosphataseaktivität besäßen und diese als Unterscheidungskriterium von makrovaskulären Zellen verwendet werden könnte. Die Vermutung wurde von histologischen Untersuchungen abgeleitet, die eine positive alkalische Phosphatasereaktion im Bereich kleiner Gefäße gezeigt hatten ( 41 ) als auch von Färbungen mit Antikörpern gegen alkalische Phosphatase ( 211 ). Auf der anderen Seite wurde beschrieben daß Perizyten ebenfalls alkalische Phosphatase Aktivität besitzen würden ( 30 ).

In der histologischen Untersuchung menschlichen Myokardgewebes hatte sich eine heterogene Verteilung alkalischer Phosphataseaktivität in den Gefäßen gezeigt, mit Bevorzugung der kleinen Gefäße und Kapillaren, während im Bereich der großen Gefäße keine alkalische Phosphataseaktivität nachweisbar war. Anhand der histologischen Präparate konnte jedoch nicht entschieden werden, ob Endothelzellen selbst alkalische Phosphataseaktivität zugeordnet werden kann. Um dieses Problem weiter zu klären, wurden auch an Zellkulturen alkalische Phosphatase Aktivität histochemisch untersucht. Kultivierte Endothelzellen zeigten keine alkalische Phosphataseaktivität. In Primär- und Mischkulturen dagegen konnte bei einigen Zellen alkalische Phosphataseaktivität nachgewiesen werden. Da sich auch die Morphologie der alkalische Phosphatase positiven Zellen von der der Endothelzellen unterschied, muß vermutet werden, daß alkalische Phosphatase positive Zellen nicht Endothelzellen, sondern einer anderen Zellart, möglicherweise Perizyten, entsprachen.

Der Kontamination der isolierten kardialen Endothelzellen mit Perizyten ist bislang keine ausreichende Bedeutung geschenkt worden. Aufgrund der hier gemachten Erfahrungen kann festgestellt werden, daß alkalische Phosphatase Aktivität nicht eine Eigenschaft kardialer


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mikrovaskulärer Endothelzellen ist, sondern wahrscheinlich kontaminierender Perizyten. Perizyten stellen einen wesentlichen Anteil der isolierten nicht-endothelialen Zellen dar und können vor allem in den höheren Passagen zu einer Fehldeutung der Eigenschaften kardialer mikrovaskulärer Endothelzellen führen.

Bei der Isolationsprozedur der mikrovaskulären Endothelzellen ist es möglich, daß neben den vaskulären Endothelzellen auch Zellen des Epikards oder des Endokards oder auch großer Gefäße mit isoliert werden. Eine Beimengung von Zellen aus großen Gefäßen ist durch die Isolationsprozedur gegeben und kann nicht verhindert werden. Da die Mikrozirkulation jedoch den größten Anteil der Zirkulation des Herzens ausmacht ( 15 ) kann davon ausgegangen werden, daß auch der überwiegende Anteil der isolierten Endothelzellen aus der Mikrozirkulation stammt.

Die morphologische Charakterisierung mikro- und makrovaskulärer kardialer Endothelzellen zeigte Unterschiede der Zellform auf. Die in den Kapiteln 3 bis 5 dargestellte Charakterisierung der beiden Zellarten belegt auch funktionelle Unterschiede in der Reaktion beider Zellarten auf oxidierte Lipoproteine, sowie eine unterschiedliche Expression von Adhäsionsrezeptoren für die Interaktion mit Leukozyten. Diese Befunde können als Bestätigung gesehen werden, daß die isolierten Zellpopulationen aus unterschiedlichen Gefäßbereichen stammen. Da Liganden für L-Selectin vorwiegend auf mikrovaskulären Endothelzellen exprimiert werden, ergäbe sich bei Generierung spezifischer Antikörper gegen diese L-Selectin-Liganden eine Möglichkeit, auch mit immunologischen Methoden eine Unterscheidung makrovaskulärer koronarer und mikrovaskulärer kardialer Endothelzellen vorzunehmen.

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichten es, Endothelzellen aus menschlichen Koronararterien und der Mikrozirkulation des Herzens zu isolieren. Die zur Verfügung stehenden Muskelstücke lieferten durch Etablierung einer neuen Isolationstechnik, ausreichende Mengen mikrovaskulärer Endothelzellen. Es ist mit diesen Zellen möglich, funktionelle Experimente bereits in frühen Passagen durchzuführen. Die gewonnenen


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kardialen Zellen konnten durch mehrere immunologische Marker als Endothelzellen identifiziert werden. Durch Einführung einer Zelltrennungsprozedur mit Hilfe paramagnetischer Dynabeads war es möglich, Zellkulturen mit großer Reinheit zu gewinnen, wie es sonst nur für Endothelzellen aus großen Gefäßen, z.B. Nabelschnurvenen, möglich war. Die funktionelle Charakterisierung zeigte eine Heterogenität der Eigenschaften beider Zellarten und wird in den folgenden drei Kapiteln dargestellt.


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