Gräfe, Michael: Die Bedeutung entzündlicher Reaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose - Untersuchungen an einem in vitro Modell menschlicher kardialer Endothelzellen

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Kapitel 3. Wirkungen von normalen und oxidiertem LDL auf mikro- und makrovaskuläre kardiale Endothelzellen

3.1 Einleitung

Das Auftreten oxidativ modifizierter Low Density Lipoproteine (ox-LDL) ist ein charakteristischer Befund in den subendothelialen Cholesterinablagerungen früher arteriosklerotischer Läsionen ( 265 ). Sie induzieren eine Dysfunktion des Endothels ( 62 , 73 ) und eine chronische Entzündungsreaktion, die durch inflammatorische Zytokine, z.B. Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha) ( 13 ) und Wachstumsfaktoren ( 153 ) vermittelt wird und durch die vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen und Akkumulation von Leukozyten, vor allem Mono- und Lymphozyten, gekennzeichnet ist ( 98 , 128 ). Eine weitere charakteristische Wirkung der oxidierten Lipoproteine auf Endothelzellen ist eine Verschiebung der koagulatorischen Homöostase in Richtung einer vermehrten Koagulation, die sich in vitro u.a. in einer erhöhten Aktivität des Plasminogen Aktivator Inhibitors-1 (PAI-1) ( 95 , 130 , 238 ) und einer verminderten Expression von Gewebe Plasminogen Aktivator (t-PA) ( 130 , 140 ) widerspiegelt.

Im Gegensatz zu den bei der Entstehung arteriosklerotischer Läsionen beteiligten Prozessen, ist die aus der klinischen Erfahrung und durch Studien belegte bevorzugte Lokalisation arteriosklerotischer Läsionen in bestimmten Gefäßbereichen weniger gut zu verstehen. Neben hämodynamischen Faktoren ( 8 , 237 ) könnten auch lokal unterschiedliche Reaktionen der Gefäßzellen auf umgebenden Stimuli eine Ursache darstellen ( 252 ).

Grundsätzlich wäre es möglich, dieses Phänomen der bevorzugten Lokalisation arteriosklerotischer Läsionen in bestimmten Gefäßarealen in Tiermodellen zu untersuchen. Diese sind jedoch aufgrund der begrenzten Übertragbarkeit der Ergebnisse auf das menschliche System diesbezüglich nur begrenzt aussagefähig ( 72 ). Unterschiede zwischen Gefäßen verschiedener Spezies ( 10 ), aber auch verschiedener Körper- und Organregionen einer Spezies ( 77 ), lassen es notwendig erscheinen, zum Studium der koronaren Herzerkrankung, Koronargefäße und


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aus ihnen gewonnenes Material zu verwenden, da die Verwendung von Gefäßen aus anderen Körperregionen, z.B. aus dem embryonalen Gewebe der Nabelschnur, nicht die koronarspezifischen Eigenheiten aufweist.

Direkte Untersuchungen am Menschen über die Einlagerung von Fetten in die Gefäßwand sind im Augenblick noch in einem experimentellen Stadium ( 267 ). Als Alternative zur Untersuchung der gefäßspezifischen Eigenheiten bietet sich das in Kapitel 2 beschriebene System kultivierter Endothelzellen aus koronaren Endothelzellen und der Mikrozirkulation des Herzens an. Die Zellen aus Koronararterien stammen aus Gebieten, in denen häufig arteriosklerotische Läsionen beobachtet werden, während die mikrovaskulären Endothelzellen aus einem Gefäßareal, in dem arteriosklerotische Plaques nicht beobachtet werden, stammen.

In der vorliegenden Studie wurden daher Zellen aus menschlichen Koronararterien isoliert und endotheliale Funktionen, die in der Pathogenese der Arteriosklerose von Bedeutung sind, in vitro untersucht. Es wurden zusätzlich Endothelzellen aus der Mikrozirkulation des Herzens isoliert und beide Zellarten hinsichtlich ihrer Reaktion auf oxidativ modifizierte Lipoproteine miteinander verglichen.


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3.2 Ergebnisse

3.2.1 Isolierung und Charakterisierung der LDL

3.2.1.1 Isolierung

Bei der schrittweisen Gradientenultrazentrifugation bildete sich im ersten Schritt eine Dichte der Kaliumbromidlösung von D = 1,019 g/ml aus. Inhaltsstoffe mit Dichten < 1,019 g/ml wanderten an die Oberfläche, Stoffe mit Dichten > 1,019 g/ml an den Boden des Zentrifugengefäßes.

Eine scharf begrenzte, weißliche Bande im oberen Sechstel des Zentrifugengefäßes, mit einer Dichte von D < 1,019 g/ml, bildete sich über einer klaren, etwa 3/6 des Gefäßes ausmachenden zum Boden hin unscharf begrenzten Bande, aus. 2/6 des Zentrifugengefäßes füllte am Boden ein mittel - dunkelgelber Bodensatz. Der Überstand wurde verworfen und der Bodensatz weiter verwendet.

Bei dem zweiten Zentrifugationsschritt bildete sich im Kopfteil des Gefäßes eine mittelgelbe, nach unten scharf begrenzte, ca. 1/6 des Zentrifugengefäß ausfüllende, Bande aus.

Dieser Überstand (D < 1,063 g/ml) stellten die LDL Fraktion dar. Die mittlere, ca. 3/6 ausfüllende, nach unten unscharf begrenzte Bande, sowie der mittel - dunkelgelbe Bodensatz wurden verworfen.

Es konnten aus 20 ml Plasma ca. 4 - 5 ml Überstand gewonnen werden (Proteinkonzentration: zwischen 1 - 2 mg/ml). Diese Fraktion enthielt die LDL.


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3.2.1.2 Aufarbeitung der LDL

Zur weiteren Reinigung und Umpufferung wurden die isolierten LDL über eine Gelfiltrationsäule (Sephadex 75) gegeben. Die Absorptionen von 100 Fraktionen des Eluates (Fraktion = 1,2 ml/min.) wurde bei 280 nm gemessen. Zwischen den Fraktionen 36 - 37 wurde eine relative Absorption von 1,224 gemessen. Die Fraktionen Nr. 36 + 37 wurden zur weiteren Bearbeitung aufgehoben.

3.2.1.3 Charakterisierung der n-LDL

In der Agarose Gelelektrophorese mit dem Lipidophor ALL IN 12 System erkannte man nach Auftragen einer Plasmaprobe auf dem Agarose Träger zwei scharfe Banden: eine Beta-Lipoproteinbande und eine Alpha-Lipoproteinbande. Nach Auftragen der durch Ultrazentrifugation gewonnene LDL-Fraktion bildete sich eine scharfe Bande, die der Beta-Lipoproteinbande entsprach und somit das LDL repräsentierte.

Die Bestimmungen des Cholesterin- und Triglyceridgehaltes in der durch Zentrifugation gewonnenen Fraktion zeigte bei insgesamt 7 Bestimmungen einen mittleren Cholesteringehalt der Fraktionen von 222 ± 23 mg/dl und einen Triglyceridgehalt von 58 ± 5 mg/dl. Setzte man nun die Ergebnisse ins Verhältnis, so ergab sich ein Cholesterin/Triglyceridquotient von 1 : 3,8. Dieser Quotient entsprach somit dem erwarteten Verhältnis von Cholesterin/ Triglyceriden in LDL.


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3.2.1.4 Herstellung und Charakterisierung der ox-LDL

Um eine Vergleichbarkeit der hier dargestellten Untersuchungen mit denen anderer Autoren zu ermöglichen, wurde zum einen der Oxidationsgrad der verwendeten LDL bestimmt und zum anderen die am weitesten verbreitete Methode zur Modifikation der LDL, die Oxidation durch 2-wertige Metallionen (Cu2+), verwendet.


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Zur Beurteilung des Oxidationsgrades der ox-LDL wurden untersucht :

Die relative Mobilität der LDL in der Agarose Gelelektrophorese.

Auf dem Agarose Gelträger wurde die Laufgeschwindigkeit der ox- LDL im Vergleich zu n-LDL beurteilt (10 µg/ml Protein aufgetragen). Die Banden waren scharf begrenzt und unterschieden sich in ihrer Laufstrecke. Vom Startpunkt gemessen war die n-LDL Bande 0,6 cm, die ox-LDL Bande 1,1 cm weit gelaufen. Setzt man nun beide Strecken ins Verhältnis, so ergab sich ein Lauffaktor von 1 : 1,8.

Abbildung 3.1: Agarose Gel Elektrophorese. n-LDL (untere Bande) und ox-LDL (obere Bande) zeigen eine unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit. Der Auftragungspunkt derProben ist rechts


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2. Bestimmung des Gehaltes an TBARS reaktiven Substanzen

Die Quantifizierung des Oxidationsgrades der LDL erfolgte durch Bestimmung der thiobarbitursäurereaktiven Äquivalente (TBARS). Der mit der TBARS Methode gemessene Malondialdehydgehalt der ox-LDL betrug 13,63 ± 1,18 nmol Malondialdehyd/mg LDL Protein (n = 4). Die Ergebnisse der Malondialdehydmessungen wurden für n-, und ox-LDL in Abbildung 3.2. aufgetragen.

Für oxidiertes LDL wird in der Literatur ein Oxidationsgrad, der 15-20 nmol TBARS/mg LDL entspricht, angeführt ( 231 , 260 ), d.h. die in diesen Versuchen verwendeten ox-LDL entsprechen von ihrem Oxidationsgrad, den von anderen Autoren verwendeten Oxidationsgraden.

3. Die Aufspaltung der Apo-B 100 Bande in der SDS-PAGE.

Ein SDS-PAGE Kleingel wurde mit n- und ox-LDL Banden in aufsteigender Proteinkonzentration (2,5, 5, 10 und 20 µg/ml) beladen. Die n-LDL Banden zeigten eine konzentrationsabhängige Zunahme der Intensität einer Bande kurz unterhalb des Startpunktes. Diese Bande stellte das Apo-B 100 Protein mit einem Molekulargewicht von 513 KD dar ( 119 ).

Bei der Auftrennung der ox-LDL Proben zeigte sich ab einer Proteinkonzentration von 10 ug/ml eine deutliche Verringerung der Apo-B 100 Proteinbande und das Auftreten von multiplen Proteinbanden im Molekulargewichtsbereich unter 250 KDa. (wie bei ( 73 ) beschrieben).


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3.2.1.5 Endotoxinnachweis

Nach 60 Minuten Inkubation bei 37 ° C bildete sich bei den Positivkontrollen ab einem Endotoxingehalt von 0,06 EU/ml ein festes Gel aus. Bei den LDL-Proben kam es in keinem Fall zu einer festen Gelbildung. Der Endotoxingehalt der LDL-Proben lag damit unter 0,06 EU/ml.



Abbildung 3.2: Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) Assay: Der TBARS Assay wurde verwendet, um den Oxidationsgrad von n-LDL und mit Cu2+ oxidierten LDL zu bestimmen (n = 4)


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3.2.2 Wirkungen der LDL Fraktionen auf die t-PA-Sekretion mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen

Die t-PA Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mit Hilfe eines ELISA bestimmt.

Bei mikrovaskulären Endothelzellen beobachtete man über den gesamten Bereich der eingesetzten n-LDL Proteinkonzentrationen keine signifikante Änderung der t-PA Sekretion (13,7 ± 0,8 ng/ml/1 Mio Zellen) gegenüber der unbehandelten Kontrolle (14,6 ± 0,6 ng/ml/1 Mio Zellen).

Mit ox-LDL stimulierte Zellen sezernierten niedrigere t-PA Mengen über den gesamten Proteinkonzentrationsbereich von 3 - 100 µg/ml gegenüber der Kontrolle sowie den Zellen, die mit n- LDL inkubiert wurden (p< 0,05). Die maximale Verringerung der t-PA Sekretion mit 6,3 ± 0,5 ng/ml/1 Mio Zellen fand sich bei 12,5 µg/ml LDL-Protein.

Unstimulierte mikrovaskuläre Endothelzellen zeigten gegenüber unstimulierten koronaren Endothelzellen eine signifikant erniedrigte t-PA Sekretion (p< 0,05, 14,6 ± 0,6 µg/ml/1 Mio Zellen vs. 29,6 ± 1,2 µg/ml/1 Mio Zellen). Eine Stimulation der Zellen mit 10 U/ml Thrombin induzierte einen signifikanten Anstieg der t-PA Sekretion.

Bei koronaren Endothelzellen ergab sich unter Stimulation mit n-LDL im Konzentrationsbereich von 3 - 100 µg/ml Protein kein signifikanter Unterschied gegenüber der Kontrolle. Ox-LDL induzierten im gesamten Konzentrationsbereich von 3 -100 µg/ml Protein eine signifikante Erniedrigung der t-PA Sekretion gegenüber der Kontrolle (p< 0,05), ab einer Proteinkonzentration von 12,5 - 100 µg/ml auch eine signifikante Erniedrigung gegenüber den durch n-LDL induzierten t-PA Meßwerten (p< 0,05). Bei 100 µg/ml LDL-Protein erreichte die t-PA Konzentration minimal 14 ± 3 µg/ml/1 Mio Zellen gegenüber 30 ± 1 µg/ml bei Kontrollen und 31 ± 2 µg/ml/1 Mio Zellen bei n-LDL.


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Abbildung 3.3: Sekretion von t-PA in den Kulturüberstand nach Stimulation von mikrovaskulären (a) und makrovaskulären koronaren Endothelzellen (b) mit n-LDL (Dreiecke) oder ox-LDL (Rauten). # = p<0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL

3.2.3 Wirkungen der LDL Fraktionen auf die PAI-1 Aktivität und PAI-1 Sekretion mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen

Die PAI-1 Aktivität wurde durch die hemmende Wirkung des PAI-1 auf t-PA Aktivität bestimmt. Dazu wurde der die PAI-1 Aktivität enthaltenden Probe eine definierte Menge t-Pa zugesetzt und die verbleibende t-PA Aktivität mit Hilfe eines chromogenen Substrates bestimmt. Die PAI-1 Antigen Konzentration wurde mit Hilfe eines ELISA ermittelt.

Für mikrovaskuläre Endothelzellen zeigten sich bei Inkubation mit n-LDL über den gesamten getesteten Proteinbereich (3 - 100 µg/ml) gleichbleibende PAI-1 Aktivitäten. Bei Inkubation mit ox-LDL wurde zunächst ein leichter Anstieg der PAI-1 Aktivität beobachtet, die gemessenen PAI-1 Werte waren bei nur Proteinkonzentrationen von 3µg/ml und 100 µg/ml signifikant gegenüber den Kontrollwerten erhöht. Dies spiegelt wahrscheinlich eher


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versuchsbedingte technische Variationen wieder als eine wirkliche Steigerung der PAI-1 Aktivität (Abbildung 3.4).

Bei Inkubation koronarer Endothelzellen mit n-LDL kam es zu einem leichten Abfall der PAI-1 Aktivität, dann aber bis 100 µg/ml zu gleichbleibenden PAI-1 Aktivitäten.

ox-LDL induzierte bei zunehmender LDL-Konzentration einen Anstieg der PAI-1 Aktivität, die bis maximal 62 ± 10 AU/ml/1 Mio Zellen bei 75 µg/ml LDL stieg und bei 100 µg/ml wieder auf 55 ± 9 AU/ml/1 Mio Zellen abfiel. Diese Werte waren signifikant (p< 0,05) gegenüber der Kontrolle und den durch n-LDL induzierten Werten erhöht (Abbildung 3.4).

Die PAI-1 Aktivitäten in unbehandelten mikro- und makrovaskulären Endothelzellen unterschieden sich nicht signifikant. Bei Stimulation mit 10 U/ml Thrombin kam es nur bei makrovaskulären koronaren Endothelzellen zu einem Anstieg der PAI-1 Aktivität.


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Abbildung 3.4: PAI-1 Aktivtät von mikrovaskuläre Endothelzellen (a) und koronare Endothelzellen (b) unter Inkubation mit n-LDL (Dreicke) und ox-LDL (Rauten). # = p<0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL

Die Sekretion von PAI-1 Antigen wurde nur in Kulturen makrovaskulärer koronarer Endothelzellen bestimmt. Bei Inkubation mit n-LDL zeigte sich keine signifikante Änderung der PAI-1 Konzentration. Bei Inkubation mit ox-LDL kam es jedoch zu einem Anstieg der PAI-1 Konzentration, die bei 100 µg/ml ox-LDL signifikant sowohl gegenüber den unbehandelten Kontrollen, als auch gegenüber den mit n-LDL behandelten Kulturen erhöht war (p<0.05, Abbildung 3.5).


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Abbildung 3.5: Sekretion von PAI-1 Antigen durch makrovaskuläre koronare Endothelzellen unter Inkubation mit n-LDL (Dreiecke) und ox-LDL (Rauten). # = p < 0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL

3.2.4 Wirkungen der LDL Fraktionen auf die prokoagulante Aktivität (PKA) mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen

Als prokoagulante Aktivität wurde die Zeit in Sekunden gemessen, bei der eine Thrombusbildung auftrat. Eine Verkürzung dieses Zeitintervalls deutete also auf einen Anstieg der PKA hin, eine Verlängerung auf einen Abfall.

Mit n-LDL inkubierte mikrovaskuläre Endothelzellen zeigten im LDL Proteinkonzentrationsbereich von 3 - 100 µg/ml gegenüber den unbehandelten Kontrollen einen leichten Abfall der


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PKA-Aktivität von 170 ± 10 s/1 Mio Zellen auf maximal 234 ± 16 s/1 Mio Zellen (p<0,05). Die PKA unter der Inkubation mit 3 - 100 µg/ml ox-LDL änderte sich nicht signifikant gegenüber Inkubation mit n-LDL und unbehandelten Kontrollen (Abbildung 3.6).

Bei makrovaskulären koronaren Endothelzellen blieben im Proteinkonzentrationsbereich von 3 - 100 µg/ml n-LDL die PKA Meßwerte gegenüber den unbehandelten Kontrollen unverändert.

Inkubation mit 3 - 12,5 µg/ml ox-LDL induzierte keine signifikanten Unterschiede gegenüber den PKA Werten unter n-LDL und Kontrollbedingungen. Bei höheren Konzentrationen (25 - 100 µg/ml) von ox-LDL wurde ein signifikanter Anstieg der PKA (p< 0,05) induziert. Maximal wurden bei 100 µg/ml LDL-Protein 76 ± 5 s gegenüber einem Kontrollwert von 200 ± 6 s gemessen.

Die bei unbehandelten mikro- und makrovaskulären Endothelzellkulturen gemessenen PKA Werte waren nicht unterschiedlich (181 ± 11 s gegenüber 200 ± 6 s). Inkubation der Zellkulturen mit Thrombin induzierte in beiden Zellarten einen Anstieg der PKA, der bei makrovaskulären koronaren Endothelzellen deutlicher ausgeprägt war (Abbildung 3.6).


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Abbildung 3.6: Prokoagulante Aktivität mikrovaskulärer Endothelzellen (a) und koronare Endothelzellen (b) unter Inkubation mit n-LDL (Dreiecke) und ox-LDL (Rauten). # = p<0,05 gegen Kontrollen, * = p<0,05 gegen n-LDL

3.2.5 Wirkungen der LDL Fraktionen auf die Angiotensin Converting Emzyme Aktivität (ACE) mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen

Der Einfluß oxidierter LDL auf die ACE Aktivität mikro- und makrovaskulärer koronarer Endothelzellen wurde durch fluorometrische Bestimmung der Spaltung eines Tripeptids (HHL) bestimmt. Die Meßwerte für die ACE-Aktivität in beiden Zellarten ergaben, daß sowohl die Zugabe von n- als auch von ox-LDL keine signifikante Änderung der ACE-Aktivität induzierte: in Kulturen mikrovaskulärer Endothelzellen wurden bei 100 µg/ml LDL n-LDL 209 ± 31 mU/1Mio. Zellen und für ox-LDL 238 ± 56 mU/1 Mio. Zellen gemessen. Die Kontrollwerte betrugen 256 ± 30 mU/1 Mio. Zellen. In Kulturen makrovaskulärer koronarer Endothelzellen wurde bei 100 µg/ml LDL Protein für n-LDL eine ACE-Aktivität


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von 71 ± 6 mU/1 Mio. Zellen und für ox-LDL von 87 ± 7 mU/1 Mio. Zellen bestimmt. Die Kontrollwerte unbehandelter Zellen betrugen 76 ± 5 mU/1 Mio. Zellen.

Wie aus den Werten zu ersehen ist, war ACE-Aktivität der unbehandelten Kontrollen für mikrovaskuläre Endothelzellen deutlich höher als für makrovaskuläre koronare Endothelzellen (p<0.05).

Um zu überprüfen, ob die gemessene Enzymaktivität tatsächlich spezifisch für das ACE war, wurden Inhibitionsexperimente mit dem ACE-Hemmer Lisinopril (10-6 M) durchgeführt. Dabei konnte in Kulturen mikrovaskulärer Endothelzellen die ACE-Aktivität auf 33 ± 6 mU/1 Mio. Zellen (12 %, p< 0,05) und in Kulturen makrovaskulärer Zellen auf 19 ± 2 mU/1 Mio. Zellen (25 %, p<0,05) gesenkt werden (siehe Tabelle 3.1).

Tabelle 3.1: ACE-Aktivität mikrovaskulärer und makrovaskulärer koronarer Endothelzellen. Die ACE Aktivität wurde mit Hilfe eines fluorimetrischen Assays nach Inkubation der Zellen mit n-LDL und ox-LDL bestimmt.

 

Kontrolle

Lisinopril

(10-6 M)

n-LDL

(100 µg/ml)

ox-LDL

(100 µg/ml)

Koronare Endothelzellen

76 ± 5

mU/ 106 cells

19 ± 2

mU/ 106. cells

71 ±5

mU/ 106. Cells

87 ± 7

mU/ 106. Cells

Mikrovaskuläre Endothelzellen

256± 30

mU/ 106 Zellen

33± 6

mU/ 106 Zellen

209 ± 31

mU/ 106 Zellen

238 ± 6

mU/ 106 Zellen


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3.3 Diskussion der Ergebnisse

Die oben aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß oxidierte LDL die Sekretion koagulatorischer und fibrinolytischer Faktoren, die von Endothelzellen sezerniert werden, modulierten und so das koagulatorische Gleichgewicht in Richtung einer vermehrten Koagulation verschoben. Ferner zeigten die Ergebnisse erstmals, daß Endothelzellen unterschiedlicher Herkunft, in diesem Fall aus makrovaskulären Koronararterien und der Mikrozirkulation des Herzens, unterschiedlich auf ox-LDL reagierten: vor allem makrovaskuläre koronare Endothelzellen reagierten auf Inkubation mit oxidierten LDL mit einem Anstieg der Sekretion koagulatorischer Faktoren, PAI-1 und Tissuefactor und einem Abfall der Sekretion des fibrinolytisch wirkenden t-PAs. Inkubation mikrovaskulärer Endothelzellen mit ox-LDL induzierte dagegen nur eine geringe Modulation dieser Faktoren.

Charakteristikum arteriosklerotischer Läsionen ist die Akkumulation von Cholesterin und Cholesterinestern in der Gefäßwand. Ursprung dieses Cholesterins sind die Plasmalipoproteine. Bei intaktem Endothel sind die interendotheliale Verbindungen zu dicht, um den Durchtritt von Proteinen, die größer als Albumin sind, zu zulassen. Da Lipoproteine ein Molekulargewicht haben, das größer als 106 Dalton ist ( 119 ), wandern die Lipoproteine in plasmalemnalen Vesikeln durch die Endothelzellschicht, ein Vorgang der als Transzytose bezeichnet wird ( 215 ). van Hinsbergh et al zeigten, daß dieser Vorgang nicht Rezeptor vermittelt und daher von der Konzentration der Lipoproteine im Blut abhängig ist ( 246 ). Dies bedeutet aber gleichzeitig, daß der Serumcholesterinspiegel als wesentliche, bestimmende Größe für die subendothelialen Cholesterineinlagerungen verantwortlich ist. Die Cholesterineinlagerungen induzieren eine Reaktion des Organismus, die durch die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen und T-Lymphozyten gekennzeichnet ist und zum Ziel hat, die Fetteinlagerungen der Gefäßwand abzubauen. Pathologisch anatomisch entspricht dieses Stadium dem „fatty streak“, das reversibel ist und in allen Lebensabschnitten beobachtet wird ( 123 ).


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Die in engem Kontakt mit den umliegenden Zellen stehenden Lipoproteine werden innerhalb kurzer Zeit modifiziert ( 42 , 223 ). Diese Modifikation der Lipoproteine ist durch das Auftreten oxidierter Epitope charakterisiert ( 266 ). Die Bedeutung des Auftretens oxidierter LDL konnte durch den Nachweis oxidierter LDL in arteriosklerotischen Läsionen und durch die positiven Wirkungen verschiedener Antioxidantien ( 232 ) bestärkt werden. Cyrus et al ( 59 ) zeigten kürzlich in einem Tiermodell mit apo E defizienten Mäusen, daß die Ausschaltung des 12/15-Lipoxygenase Gens in Makrophagen, eines Enzyms, das als ein LDL modifizierendes Enzym betrachtet wird ( 131 ), die Bildung oxidierter Lipoproteine und die Ausbildung arteriosklerotischer Läsionen stark verminderte. Dieser Befund unterstreicht die Bedeutung der Lipooxygenasen für die LDL Oxidation, und gleichzeitig die Bedeutung oxidativer Modifikation der Lipoproteine für die Ausbildung arteriosklerotischer Plaques.

Die biologischen Wirkungen oxidierter LDL induzieren eine komplexe Veränderung der Genexpression, die neben hemmenden auch stimulierende Wirkungen zeigten. Die stimulierenden Wirkungen manifestieren sich u.a. in den durch ox-LDL induzierten proinflammatorischen Effekten, z.B. der Sekretion von Zytokinen und Chemokinen ( 57 , 196 ) und der Expression von Adhäsionsmolekülen ( 128 , 156 , 212 ). Diese proinflammatorischen Effekte sind besonders für Endothelzellen gut belegt und führen letztlich zu einer vermehrten Adhäsion von Leukozyten, vor allem Monozyten und Lymphozyten, im Bereich der arteriosklerotischen Läsionen ( 164 ).

Als weiterer Wirkungsschwerpunkt oxidierter Lipoproteine auf Endothelzellen sind ihre Wirkungen auf die Sekretion prokoagulatorischer und fibrinolytischer Gerinnungsfaktoren zu erwähnen. Bei Patienten mit Arteriosklerose wurde eine verminderte fibrinolytische Kapazität nachgewiesen ( 56 ), die in vitro mit einer gesteigerten Aktivität des Plasminogen Aktivator Inhibitors 1 (PAI-1) einhergeht ( 95 , 180 ). Auch in vitro konnte von verschiedenen Autoren gezeigt werden, daß Endothelzellen unter Inkubation mit oxidierten LDL vermehrt prokoagulatorische Faktoren wie PAI-1 ( 238 ) und Tissuefactor ( 61 , 66 ) und vermindert fibrinolytische Faktoren wie t-PA ( 130 ) und NO ( 74 ) bilden.

Die geschilderten Befunde zeigen die Bedeutung oxidierter LDL für verschiedene zelluläre


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Funktionen auf. Alle diese Untersuchungen wurden in Tiermodellen oder mit Endothelzellen aus Nabelschnurvenen durchgeführt. Es war jedoch nicht bekannt, wie Zellen aus der menschlichen koronaren Zirkulation auf ox-LDL reagieren würden. Das Fehlen dieser Befunde bildete den Ausgangspunkt für die hier durchgeführten Untersuchungen.

Die mit kardialen Endothelzellen durchgeführten Untersuchungen zeigten überraschenderweise eine unterschiedliche Reaktion makro- und mikrovaskulärer Endothelzellen menschlicher Herzen auf oxidierte LDL. Dabei wurden vor allem in makrovaskulären koronaren Endothelzellen Zellfunktionen empfindlicher von ox-LDL moduliert als in mikrovaskulären Endothelzellen. Koronare makrovaskuläre Endothelzellen reagierten mit einer Steigerung der PAI-1 Sekretion und Hemmung der t-PA Sekretion, während beide Funktionen in mikrovaskulären koronaren Endothelzellen nur gering beeinflußt wurden. Diese mit makrovaskulären Endothelzellen gewonnenen Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Autoren, die ähnliche Ergebnisse mit Endothelzellen aus Nabelschnurvenen erzielt hatten ( 130 , 136 , 140 , 238 ). Die geringe Reaktion mikrovaskulärer Endothelzellen, die unter identischen Bedingungen kultiviert worden waren ist dagegen ein neuer interessanter Befund, der unterstreicht, daß die Herkunft der Endothelzellen eine wesentlicher Faktor ist, der bei der Interpretation der Ergebnisse zu beachten ist.

Neben der Veränderung der PAI-1 und der t-PA Sekretion wurde in koronaren makrovaskulären Endothelzellen die Bildung des prokoagulatorisch wirkenden Tissuefactors induziert. Tissuefactor ist ein transmembranäres Glykoprotein, das von Endothelzellen exprimiert wird und eine zentrale Rolle in der Aktivierung der extrinsischen Gerinnungskaskade spielt ( 23 ). Eine gesteigerte Bildung von Tissuefactor in makrovaskulären koronaren Endothelzellen ist ein weiterer Faktor, der neben t-PA und PAI-1 die koagulatorische Homöostase unter Einwirkung oxidierter Lipoproteine verändert. Die durch ox-LDL induzierte Änderung der Tissuefactor Bildung entsprach quantitativ den Veränderungen, die von anderen Autoren nach Stimulation mit TNFalpha beobachtet ( 23 , 39 ). Im Unterschied zu Thrombin, das in beiden Zellarten eine Steigerung der Tissuefactorbildung induzierte und als Positivkontrolle eingesetzt wurde, blieben bei Inkubation mit ox-LDL die Effekte auf makrovaskuläre Endothelzellen beschränkt. Die in den hier durchgeführten Versuchen gezeigte präferentielle Veränderung koagulatorischer Endothelfunktionen makrovaskulärer koronarer Endothelzellen im Vergleich zu mikrovaskulären Endothelzellen


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legt die Vermutung nahe, daß ihre gerinnungsaktiven Faktoren im Vergleich zu mikrovaskulären Endothelzellen besonders empfindlich reguliert werden.

Um zu untersuchen, ob die von ox-LDL ausgeübten Wirkungen zu einer allgemeinen Veränderung der Zellfunktion führten oder auf die untersuchten gerinnungsaktiven Faktoren beschränkt blieben, wurden Versuche durchgeführt, in denen als nicht koagulatorische Funktion die ACE-Aktivität der Endothelzellen unter Inkubation mit ox-LDL gemessen wurde. Die ACE-Aktivität blieb nach Inkubation mit n- oder ox-LDL unverändert, so daß davon ausgegangen werden kann, daß die Wirkungen des ox-LDL auf die gemessenen Gerinnnungsfunktionen beschränkt blieben. Interessanterweise war jedoch die ACE Grundaktivität der mikrovaskulären Endothelzellen 3,3-fach höher als die der makrovaskulären koronaren Endothelzellen. Auch andere Autoren hatten bereits gezeigt, daß die ACE Aktivität im Bereich der Mikrozirkulation des Schweines größer ist als in Bereich der großen Gefäße ( 67 ).

Vielfältige Befunde zeigen, daß es bereits Hinweise über Unterschiede endothelialer Funktionen in den verschiedenen Gefäßbereichen und Organen gab. Als morphologische Unterschiede kann die Expression organspezifischer Antigene ( 11 ), die Expression unterschiedlicher Zelloberflächenmarker auf Endothelzellen in verschiedenen Bereichen der Mikrozirkulation ( 218 ) und die differentielle Expression des MECA79 Antigens in den verschiedenen Bereichen des Immunsystems ( 18 ) genannt werden. Neben diesen morphologischen Unterschieden ist auch eine Reihe funktionell unterschiedlicher Reaktionsweisen der Endothelzellen beschrieben worden. Beim Rind zeigten Arterien des Herzens, der Niere und des Schwanzes eine unterschiedlich Rezeptor abhängige Reaktion auf Bradykinin ( 10 ). Andere Autoren beschrieben, daß Gefäße aus dem gleichen Organ, aber verschiedenen Gefäßregionen, unterschiedlich auf chronische Druckbelastung reagierten: Banding der Aorta induzierte eine Dysfunktion des Koronarendothels, während das Endothel der Mikrogefäße des Koronarkreislaufs nicht betroffen war ( 77 ).


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Kürzlich wurden auf Endothelzellen spezifische Rezeptoren für ox-LDL (LOX-1) nachgewiesen ( 209 ), die aufgrund ihrer Struktur zur Rezeptorklasse der Lectinfamilie gerechnet werden. Sie unterscheiden sich von den Scavenger Rezeptoren der Macrophagen, da acetyliertes LDL, das typischerweise durch die Scavenger-Rezeptoren aufgenommen wird, nicht vom LOX-1 Rezeptor gebunden wird ( 162 ). Während die Regulation des Rezeptors bereits untersucht wurde ( 132 , 161 ), ist über die intrazellulären Signaltransduktionswege des LOX-1 Rezeptors bisher nichts bekannt.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß für die Beurteilung der Wirkung oxidierter LDL auf Endothelzellen eine differenziertere Betrachtungsweise als sie üblicherweise praktiziert wird, notwendig ist. Die hier durchgeführten Versuche haben gezeigt, daß es nicht ausreichend ist, allgemein von Wirkungen oxidierter LDL auf Endothelzellen zu sprechen, sondern es sind lokale und zelluläre Faktoren mit in die Betrachtungsweise einzubeziehen. Ähnliches gilt auch für den Vergleich tierischer Modelle mit dem menschlichen System, bei dem sogar größere Abweichungen als die hier aufgezeigten auftreten können. Als Beispiel sei hier das Vorhandensein des L-Selectin Liganden GlyCAM-1 genannt, der in Nagern und Rindern nachweisbar ist, jedoch bisher nicht im Menschen gefunden wurde ( 94 , 135 , 236 ). Auch für die Beurteilung der Wirkungen einer ACE-Aktivität inhibierenden Therapie hatten sich aus dem Unterschied der Expression von Chymase und ACE im Rattenherzen und im menschlichen Herzen ( 243 , 244 ) Fehlbeurteilungen ergeben.

Neben einer differenzierteren Beurteilung der pathophysiologischen Wirkung oxidierter LDL auf Endothelzellen, können die Befunde auch dazu beitragen, das Verständnis für die präferentielle Lokalisation von arteriosklerotischen Läsionen in großen, makrovaskulären Gefäßbereichen zu verstehen. Die klinische Erfahrung, daß das Auftreten von Gefäßläsionen und Gefäßthrombosen vor allem in großen Gefäßen beobachtet wird ( 154 , 200 ), kann damit z.T. auch auf lokale Faktoren der Gefäßwand zurückgeführt werden und durch diese neuen in vitro Befunde ein besseres Verständnis finden.

Die unterschiedliche Reaktionsweise mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen auf ox-LDL ist neben einem pathophysiologisch wichtigem Befund eine Bestätigung dafür, daß die als mikro- und makrovaskuläre Endothelzellen isolierten Zellen tatsächlich aus unterschiedlichen Gefäßarealen stammen.


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