Gräfe, Michael: Die Bedeutung entzündlicher Reaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose - Untersuchungen an einem in vitro Modell menschlicher kardialer Endothelzellen

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Kapitel 4. Untersuchungen zur Expression von Adhäsionsmolekülen und der Adhäsion von Leukozyten auf kardialen Endothelzellen

4.1 Einleitung

Sowohl tierexperimentelle Untersuchungen als auch Untersuchungen menschlicher arteriosklerotischer Gefäße haben gezeigt, daß die Adhäsion von Monozyten und Lymphozyten am Endothel im Bereich von subendothelialen Cholesterinablagerungen und die nachfolgende Einwanderung der anhaftenden Leukozyten in den subendothelialen Raum charakteristische Befunde früher arteriosklerotischer Läsionen darstellen ( 58 , 200 ). Grundlage jeder Leukozyten-Endothel-Adhäsion sind Oberflächenproteine beider Zellen, die durch Interaktionen zu einer Haftung der Leukozyten am Endothel führen.

E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 sind Adhäsionsmoleküle, die die Interaktion und Adhäsion von Monozyten mit dem Endothel vermitteln und daher eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der Arteriosklerose spielen ( 64 , 98 , 201 ). VCAM-1 und ICAM-1 gehören zur Familie der Immungloblin-ähnlichen Adhäsionsmoleküle und konnten auf Endothelzellen im Bereich arteriosklerotischer Läsionen nachgewiesen werden ( 178 , 179 , 245 ). VCAM-1 und ICAM-1 interagieren mit den leukozytären Adhäsionsrezeptoren VLA-4 (CD49d/CD29) bzw. LFA-1 (CD11a/CD18) und Mac-1 (CD11b/CD18) ( 22 , 220 ). E-Selectin, das ebenfalls in arteriosklerotischen Läsionen nachgewiesen wurde ( 179 ), gehört neben P- und L-Selectin zur Gruppe der Selectine und wird nur auf aktivierten Endothelzellen exprimiert. Es interagiert mit sialyl Lewisx haltigen Liganden auf neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten ( 137 , 169 , 222 , 248 ).

Neben Zytokinen wie Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha) und Interleukin-1 (IL-1) können auch aktivierte T-Zellen und Thrombozyten über das CD40 - CD40 Ligand System Endothelzellen aktivieren ( 104 ). CD40 ist ein transmembranäres Glykoprotein, das aufgrund seiner


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strukturellen Ähnlichkeit zur Gruppe der TNF-Rezeptorfamilie gerechnet wird. Zu dieser Gruppe werden unter anderem die beiden TNF-Rezeptoren TNF1- und TNF2-Rezeptor und der CD95 oder Fas Rezeptor gezählt ( 17 , 21 ). CD40 wurde zunächst auf Lymphozyten beschrieben und steuert dort die B-Zellaktivierung und klonale Expansion nach Antigen Kontakt ( 49 ). Es hat weiterhin einen wesentlichen Anteil bei der Umschaltung der Antikörperbildung vom Typ IgM zum Typ IgG ( 125 ). Neben B-Lymphozyten wird CD40 auch auf vaskulären Fibroblasten ( 70 ), Endothelzellen ( 109 ) und nach Stimulation mit Zytokinen auch auf glatten Muskelzellen exprimiert ( 110 ). Stimulation des CD40 Rezeptors aktiviert Endothelzellen ähnlich wie Stimulation über den TNFalpha Rezeptor und führt zur Expression von Adhäsionsmolekülen und Sekretion von Chemokinen ( 122 ).

Der Ligand des CD40 Rezeptors ist ein TNF-ähnliches Glykoprotein von ca. 33 KDa. CD40-Ligand (CD154, TRAP) wird auf aktivierten T-Lymphozyten und aktivierten Plättchen exprimiert ( 104 ). Interaktionen von CD40 mit CD40 Ligand werden als ein wesentlicher pathogenetischer Mechanismus bei der Transplantatvaskulopathie angenommen ( 134 ).

Klinische Studien haben eine Verbindung zwischen der Aktivität des Renin-Angiotensin Systems (RAS) und dem Auftreten ischämischer Ereignisse belegt ( 32 , 38 ). Studien mit ACE-Hemmern zeigten deren protektiven Effekt für das kardiovaskuläre System ( 3 , 183 ). Die dieser Beobachtung zugrundeliegenden Mechanismen werden aber noch nicht vollständig verstanden. Es wird vermutet, daß zusätzliche Interaktionen des RAS und der Gefäßwand bestehen, die über eine Beeinflussung des Gefäßtonus und des Blutdrucks hinausgehen. Da Endothel Leukozyten Wechselwirkungen wesentlich den Verlauf der Arteriosklerose bestimmen, könnte das RAS diese Wechselwirkungen auf Seiten der Endothelzellen oder der Leukozyten beeinflussen.

Interaktionen der CD40 tragenden Endothelzellen mit CD40 Ligand positiven Zellen auf der einen Seite sowie die Komponenten des Renin Angiotensin Systems könnten die Pathologie der Entstehung arteriosklerotischer Läsionen modulierend beeinflussen, indem sie proinflammatorische oder anti-inflammatorische Wirkungen ausüben. Der Einfluss dieser beiden Systeme ist jedoch in Hinblick auf die Pathogenese der Arteriosklerose in einem mensch


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lichen System bisher nicht untersucht worden, so daß die Wertigkeit unklar bleibt.

In der vorliegenden Arbeit wurde daher in einem in vitro Modell mit Zellen aus menschlichen Koronararterien die Wirkungen des Angiotensin II und des CD40 Liganden auf entzündliche Komponenten in der Pathogenese der Arteriosklerose charakterisiert. Vergleichend wurden Endothelzellen aus der Mikrozirkulation des Herzens, also aus einem Gefäßbereich, in dem normalerweise keine arteriosklerotischen Läsionen beobachtet werden, untersucht.


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4.2 Ergebnisse

4.2.1 Charakterisierung der Expression von Adhäsionsmolekülen und ihrer mRNA in kardialen Endothelzellen

Die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 auf der Zelloberfläche wurde mit Hilfe eines Zell-ELISA bestimmt. Dabei wurde die Bindung der spezifischen Antikörper an der Zelloberfläche mit einer Farbreaktion sichtbar gemacht und photometrisch bestimmt. Die gemessene Extinktion (ausgedrückt in relativen Einheiten) war dabei proportional zu der Menge der an der Zelloberfläche exprimierten Adhäsionsmoleküle.

Die mRNA der Adhäsionsmoleküle wurde durch RT-PCR ermittelt. Die Menge der spezifischen mRNA wurde als Verhältnis zu der mRNA eines konstant exprimierten Gens, der Pyruvatdehydrogenase (PDH), ausgedrückt.

4.2.1.1 Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit TNFalpha

Die Proteinexpression der Adhäsionsmoleküle wurde vergleichend auf mikro- und makrovaskulären koronaren Endothelzellen durchgeführt, um Unterschiede dieser beiden Zellarten in der Regulation der Adhäsionsmoleküle zu erkennen. Die mRNA der Adhäsionsmoleküle wurde nur in makrovaskulären koronaren Endothelzellen untersucht. Sowohl mikro- als auch makrovaskuläre koronare Endothelzellen exprimierten unter Kontrollbedingungen kein E-Selectin und VCAM-1. ICAM-1 wurde dagegen bereits von nicht stimulierten Zellen exprimiert. Inkubation mit TNFalpha (0,1 - 10 000 U/ml) induzierte in beiden Zellarten eine konzentrationsabhängige vermehrte Expression aller drei Adhäsionsmoleküle. Es zeigte sich jedoch, daß E-Selectin in makrovaskulären koronaren Endothelzellen bei geringeren Konzentrationen von TNFalpha eine halbmaximale Expression induzierte. Die halbmaximale 55Stimulation für E-Selectin wurde bei makrovaskulären koronaren Endothelzellen mit 0,1 U/ml TNFalpha und bei mikrovaskulären Endothelzellen bei 6,3 U/ml TNFalpha beobachtet (Abbildung 4.1).

Betrachtet man den Zeitgang der Expression, so zeigte sich, daß nach 4 Stunden E-Selectin und nach 8 Stunden VCAM-1 eine maximale Expression aufwies, während die Expression von ICAM-1 nach 4 Stunden erhöhte Werte gegenüber nicht stimulierten Zellen aufwies, die über 24 Stunden noch weiter anstiegen.

Abbildung 4.1: Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 auf makrovaskulären und mikrovaskulären kardialen Endothelzellen. Die Zellen wurden 4 h (E-Selectin), 12 h (VCAM-1) oder 24 h (ICAM-1) mit TNFalpha stimuliert und die Expression der Adhäsionsmoleküle mit einem Zell-ELISA quantifiziert. (n = 12, *, +, # = p<0,05; **, ++, ## = p < 0,01).

Die Analyse der mRNA in makrovaskulären koronaren Endothelzellen bestätigte und ergänzte die mit Hilfe des Zell-ELISA gefundenen Daten. In nicht stimulierten Zellen konnte keine VCAM-1 und E-Selectin mRNA nachgewiesen werden. Stimulation mit TNFalpha (1000 U/ml) induzierte einen starken Anstieg der jeweiligen mRNA mit einem Maximum bei ca. 4-8 Stunden und einem danach folgenden Abfall der mRNA. mRNA für ICAM-1 fand sich bereits in unstimulierten Zellen und stieg unter Stimulation mit TNFalpha nur gering an.

Zusammenfassend ergibt sich, daß TNFalpha in mikro- als auch in makrovaskulären Endothel


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zellen eine starke Zunahme der Proteinexpression und der mRNA aller drei untersuchten Adhäsionsmoleküle induzierte.

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Abbildung 4.2: Duplex PCR für E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 und PDH als Standard. Es wurde jeweils die mRNA der Adhäsionsmoleküle in koronaren makrovaskulären Endothelzellen im Zeitverlauf von nicht stimulierten Zellen und von Zellen die über 4, 8, 12 und 24 Stunden mit 1000 U/ml TNFalpha stimuliert wurden, dargestellt.


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Abbildung 4.3: Duplex PCR für E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 mit PDH als Standard. Die PCR Produkte wurden durch HPLC quantifiziert. Die mRNA nichtstimulierter makrovaskulärer Endothelzellen (offene Symbole) und mit 1000 U/ml TNFalpha stimulierter Zellen (gefüllte Symbole) wurde im Zeitverlauf analysiert und vergleichend dargestellt (n=3). **, ++, ## = p < 0,01.


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4.2.1.2 Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit IL4

Inkubation mikrovaskulärer Endothelzellen mit IL-4 (0,1 - 500 U/ml) induzierte einen Anstieg der VCAM-1 Expression. In Kulturen makrovaskulärer koronarer Endothelzellen war dieser stimulierende Effekt durch IL-4 wesentlich deutlicher ausgeprägt und erreichte eine vergleichbare Wirkung wie TNFalpha. Bei beiden Zellarten wurden maximale Effekte bei 200 U/ml IL-4 beobachtet, bei Konzentrationen > 10 U/ml war die Konzentrations-Wirkungsbeziehung allerdings sehr flach. Die Expression von E-Selectin wurde in Kulturen mikrovaskulärer Endothelzellen nicht beeinflußt. In Kulturen makrovaskulärer koronarer Endothelzellen wurde über den gesamten Konzentrationsbereich eine leicht erhöhte E-Selectin Expression gemessen, die keine Abhängigkeit von der verwendeten IL-4 Konzentration zeigte. IL-4 hatte keinen signifikanten Einfluß auf die E-Selectin mRNA. Auch die ICAM-1-1 mRNA wurde durch IL-4 nicht signifikant moduliert. Die Expression von ICAM-1 auf der Zelloberfläche änderte sich in Kulturen makrovaskulärer koronarer Endothelzellen nicht; in Kulturen mikrovaskulärer Endothelzellen konnte nur bei der höchsten verwendeten Konzentration eine leichte Zunahme der Expression beobachtet werden (Abbildung 4.4 und 4.5).

Die Daten zeigen, daß IL-4 die Expression und mRNA von VCAM-1 erhöhte, die Expression und mRNA von E-Selectin und ICAM-1 jedoch nicht wesentlich beeinflußte.


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Abbildung 4.4: Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 auf mikrovaskulären und makrovaskulären koronaren Endothelzellen unter Stimulation mit IL-4. Die Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle wurde mit einem Zell-ELISA gemessen. (n=5, *,#,+ =p<0,05, **,++,## = p<0,01)


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Abbildung 4.5: Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden mit IL-4 (200 U/ml) über 24 h stimuliert und die mRNA der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in einer Duplex-PCR mit PDH als Standard zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert. (n=3, + = p<0,05)


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4.2.1.3 Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit Phorbolester

Phorbolester (PMA, 10-11 - 10-7 M) induzierte in Kulturen mikro- und makrovaskulärer koronarer Endothelzellen einen Anstieg der E-Selectin Expression mit maximalen Effekten bei ca. 10-8 M. Die Effekte auf makrovaskulären koronaren Endothelzellen waren ausgeprägter als auf mikrovaskulären Endothelzellen. Die VCAM-1 Expression war bei den niedrigsten Konzentrationen von PMA leicht erhöht und bei zunehmenden Phorbolesterkonzentrationen rückläufig. Die ICAM-1 Expression wurde nicht moduliert. Die bestimmten relativen mRNA Konzentrationen in makrovaskulären koronaren Endothelzellen zeigten ebenfalls eine leichte Stimulation für VCAM-1, dagegen eine deutliche Zunahme der E-Selectin mRNA. Die Daten legen nahe, daß Phorbolester die Expression und mRNA von E-Selectin und VCAM-1 erhöht, die von VCAM-1 jedoch nur bei niedrigen Konzentrationen.

Abbildung 4.6: Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach Stimulation mit Phorbolester (PMA, 10-11 - 10-7 M). Die Expression der Adhäsionsmoleküle auf der Endothelzelloberfläche wurde mit Hilfe eines Zell-ELISA bestimmt. (n=5, *,#,+ =p<0,05, **,++,## = p<0,01)


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Abbildung 4.7: mRNA der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach Stimulation mit IL-4 (200 U/ml). Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden mit Phorbolester (PMA, 10-8 M) über einen Zeitraum von 24 Stunden stimuliert und die mRNA der Adhäsionsmoleküle in einer Duplex-PCR mit PDH als Standard zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert. (n=3, *, +, # = p<0,05)


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4.2.1.4 Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit Angiotensin II

Stimulation makrovaskulärer koronarer Endothelzellen mit Angiotensin II (10-11 - 10-5 M) induzierte eine vermehrte Expression von E-Selectin, während VCAM-1 und ICAM-1 nicht in ihrer Expression verändert wurden. Maximale Effekte wurden bei 10-7 M Angiotensin II beobachtet und erreichten 55% der maximal durch TNFalpha induzierten Effekte. Auf mikrovaskulären Endothelzellen wurde ein ähnlicher stimulierender Effekt beobachtet, der jedoch deutlich geringer ausgeprägt war. Auf die Expression von ICAM-1 und VCAM-1 hatte Angiotensin II auch bei mikrovaskulären Endothelzellen keinen stimulierenden Effekt.

Abbildung 4.8: E-Selectin Expression auf mikro- und makrovaskulären Endothelzellen nach Stimulation mit Angiotensin II. Die Zellen wurden über 4 Stunden mit Angiotensin II stimuliert und anschließend mit Hilfe eines Zell-ELISA die Expression von E-Selectin bestimmt (n=4, *=p<0,05, **=p<0,01)


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Abbildung 4.9: Nach Stimulation mit Angiotensin II über 4 Stunden wurde die Expression von VCAM-1 (Dreiecke) und ICAM-1 (Quadrate) untersucht. (n=5, *=p<0,05, **=p<0,01)

Analyse der korrespondierenden mRNA Ergebnisse zeigte (Abb. 4.10), daß Angiotensin II (10-7 M) die E-Selectin mRNA gegenüber unstimulierten Kontrollen vermehrte. Der Effekt war geringer ausgeprägt als bei Stimulation mit TNFalpha, zeigte aber bei 3 unabhängigen Versuchen bereits eine statistisch signifikante Erhöhung (p<0,05) der mRNA gegenüber nicht stimulierten Kontrollkulturen.


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Abbildung 4.10: E-Selectin mRNA nach Stimulation mit Angiotensin II. Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden über 4 Stunden mit Angiotensin II (10-7 M) stimuliert. Nach RNA Extraktion erfolgte eine Duplex PCR mit PDH als Standard. A) Agarose Gel der Amplifikationsprodukte. B) HPLC Chromatogramm der Amplifikationsprodukte

Angiotensin II induzierte in mikro- und makrovaskulären koronaren Endothelzellen einen Anstieg der E-Selectin Expression und E-Selectin mRNA, während die Expression von ICAM-1 und VCAM-1 nicht moduliert wurde.


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Abbildung 4.11: Stimulation von Endothelzellen aus Nabelschnurvenen mit TNFalpha und CD40 Ligand (CD154) über 4 Stunden. Die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 wurde nach Färbung mit spezifischen monoklonalen Antikörpern im Durchflußzytometer analysiert (n = 3).


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4.2.1.5 Expression von Adhäsionsmolekülen nach Stimulation mit CD40-Ligand

Um die Wirkung einer Stimulation des CD40 Rezeptors von Endothelzellen zu untersuchen, wurden Endothelzellen mit einer Ziellinie, die durch Transfektion CD40 Ligand (CD154) exprimierte, P3x.TBA7, inkubiert. In Vorversuchen war eine Konzentration von ca. 2*105 Zellen pro cm2 als optimale Zellkonzentration ermittelt worden. Die P3x.TBA7 Zellen wurden mit 2% Paraformaldehyd fixiert, um parakrine Effekte auszuschließen. Als Negativkontrolle dienten CD154 negative Zellen, P3xWT, als Positivkontrolle wurde eine Stimulation mit TNFalpha (500 U/ml) durchgeführt. Die Analyse der Adhäsionsmoleküle erfolgte mit einem Durchflußzytometer, da nach Beenden der Inkubation nicht alle CD154 positiven Zellen abgespült werden konnten und im Zell-ELISA mit den Signalen der Endothelzellen interferierten. Im Durchflußzytometer dagegen konnten, aufgrund der unterschiedlichen Zellgrößen, die verschiedenen Zellpopulationen getrennt werden.

Wie bereits im Zell-ELISA beobachtet, exprimierten nicht stimulierte Nabelschnurvenen Endothelzellen kein E-Selectin und VCAM-1 und geringe Mengen an ICAM-1. Nach Stimulation mit TNFalpha kam es zu einer vermehrten Expression aller drei Adhäsionsmoleküle. Auch Stimulation des CD40 Rezeptors induzierte eine vermehrte Expression von E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1. Sie war jedoch etwas geringer ausgeprägt als nach Stimulation mit TNFalpha und erreichte 50 - 70% der TNFalpha induzierten Expression. Ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 4.11. dargestellt.

4.2.2 Charakterisierung der Adhäsion von HL60 Zellen an kardialen Endothelzellen

Die Adhäsion von HL60 und NALM6-L Zellen an mikrovaskulären Endothelzellen wurde in einem Adhäsionsassay untersucht. Dabei wurden Endothelzellen für 4 Stunden stimuliert und anschließend in eine Flußkammer gelegt. Es wurden HL60 Zellen mit einer konstanten Flußrate von 117 µl/min und einer durch die Form der Flußkammer bedingten variablen Wand


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schubspannung von 0,6 - 2,6 dyne/cm2 über die Zellen perfundiert. Die Zahl der adhärierten Leukozyten wurde nach 5 Minuten pro Gesichtsfeld bei unterschiedlichen Wandschubspannungen ausgezählt. Dabei ist die Adhäsion in den Bereichen hoher Wandschubspannung (>1 dyne/cm2) Selectin abhängig, in den Bereichen niedriger Wandschubspannung dagegen Selectin unabhängig. Da in den Bereichen hoher Wandschubspannung nur wenige Zellen adhärierten, wurden in einigen Versuchen die Zahlen der adhärierten Zellen in drei Bereiche zusammengefaßt: 1) > 2 dyne/cm2, 2) 1-1.9 dyne/cm2, 3) < 1 dyne/cm2.

4.2.2.1 Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation mit TNFalpha

Die Adhäsion von HL60 Zellen in Abhängigkeit der Wandschubspannung wurde an unstimulierten und TNFalpha stimulierten kardialen Endothelzellen untersucht.

In Vorversuchen mit HUVEC war die TNFalpha Konzentration ermittelt worden, bei der eine maximale Adhäsion der HL60 Zellen auftrat. Es wurden dazu die HUVEC mit 0.1 - 1000 U/ml TNFalpha stimuliert und die Adhäsion im Bereich hoher Wandschubspannung bestimmt. Es zeigte sich, daß an nicht stimulierten HUVEC nur vereinzelte HL60 Zellen adhärierten. Bei zunehmenden Konzentrationen von TNFalpha kam es auch zu einer Zunahme der HL60 Adhäsion. Es wurden dabei maximale Effekte bei ca. 100 U/ml und eine halbmaximale Stimulation bei 2 U/ml beobachtet. Für die Versuche wurden daher 500 oder 1000 U/ml TNFalpha verwendet, um sicher zu stellen, daß eine maximale Stimulation erfolgte.

Wie bereits mit Endothelzellen aus Nabelschnurvenen beobachtet, induzierte TNFalpha bei mikro- und makrovaskulären koronaren Endothelzellen eine Zunahme der adhärierenden HL60 Zellen im Vergleich zu unstimulierten Kontrollzellen. Dabei adhärierten in den Bereichen hoher Wandschubspannung (>1 dyne/cm2) weniger Zellen als in den Bereichen niedriger Wandschubspannung (<1 dyne/cm2). Bei nicht stimulierten Endothelzellen adhärierten im Bereich hoher Wandschubspannung keine oder nur vereinzelt Zellen. Die E-Selectin Abhängigkeit der Adhäsion wurde durch blockierende Anti-E-Selectin Antikörper verifiziert: im Bereich hoher Wandschubspannung konnte die Adhäsion durch den Antikörper vollständig blockiert werden (Abbildung 4.12).


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Abbildung 4.12: Adhäsion von HL60 Zellen an TNFalpha stimulierte kardiale Endothelzellen. Die Zellen wurden mit 1000 U/ml TNFalpha über 4 Stunden stimuliert und anschließend die Adhäsion von HL60 Zellen bestimmt. Gezählt wurde die Anzahl der fest adhärierenden Zellen pro Gesichtsfeld (Vergrößerung 1:100, n=4-12, * = p < 0,05, ** p < 0,01 TNFalpha gegen TNFalpha + BBA2, # = p<0,05, ## = p<0,01 Kontrolle gegen TNFalpha)

4.2.2.2 Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation mit Angiotensin II

Da Angiotensin II eine Steigerung der E-Selectin Expression auf koronaren Endothelzellen induzierte, ergab sich die Frage, ob diese Steigerung der E-Selectin Expression auch zu einer vermehrten Leukozytenadhäsion führen könne. Dazu wurden koronare makrovaskuläre Endothelzellen mit Angiotensin II (10-7 M) über 4 Stunden stimuliert und anschließend die Adhäsion von HL60 Zellen unter Flußbedingungen quantifiziert. Als Positivkontrolle wurde die HL60 Zelladhäsion nach Stimulation mit TNFalpha gemessen. Die Adhäsion nach Stimulation mit Angiotensin II wurde in Prozent der Positivkontrolle (TNFalpha induzierte Adhäsion) berechnet.


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Angiotensin II induzierte eine deutliche Zunahme der Zelladhäsion, die gegenüber nicht stimulierten koronaren Endothelzellen in allen Wandschubspannungsbereichen signifikant erhöht war. Bei 2 dyne/cm2 betrug die Angiotensin II induzierte Adhäsion 55 ± 16% der Positivkontrolle. Während die Zugabe eines Anti-E-Selectin Antikörpers die TNFalpha induzierte Adhäsion in diesem Wandschubspannungsbereich vollständig blockierte, konnte die Angiotensin II induzierte Adhäsion nicht vollständig gehemmt werden. Es muß daher vermutet werden, daß neben E-Selectin noch andere Adhäsionsmoleküle durch Angiotensin II induziert wurden. Es schienen dies jedoch weder VCAM-1 noch ICAM-1 zu sein, da diese in ihrer Expression von Angiotensin II nicht moduliert wurden (siehe Seite 65#LINKCONTENT#65#/LINKCONTENT#). An mikrovaskulären Endothelzellen induzierte Angiotensin II keine messbaren Veränderungen der HL-60 Adhäsion (Abbildung 4.13).

Abbildung 4.13: Adhäsion von HL60 Zellen an Angiotensin II stimulierte kardiale Endothelzellen. Die Zellen wurden mit 10-7 M Angiotensin II über 4 Stunden stimuliert und anschließend die Adhäsion von HL60 Zellen bestimmt. Gezählt wurde die Anzahl der fest adhärierenden Zellen pro Gesichtsfeld (Vergrößerung 1:100). Die Zahl der adhärierten Zellen wurde in Prozent der Positivkontrolle (TNFalpha stimulierte Zellen) dargestellt. n=4-12, * = p < 0,05, ** p < 0,01 Angiotensin II gegen Kontrolle, # = p<0,05, ## = p<0,01 Angiotensin II gegen Angiotensin II + BBA2


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Eine weitere Versuchsserie wurde durchgeführt, um zu differenzieren ob die Stimulation der E-Selectin abhängigen Adhäsion über Angiotensin II Typ1 oder Typ2 Rezeptoren vermittelt wurde. Koronare makrovaskuläre Endothelzellen wurden dazu mit Angiotensin II in Anwesenheit des Typ1 Rezeptorblockers DUP 753 (10-5 M) als auch des Typ2 Rezeptorblocker PD 123 177 (10-5 M) stimuliert. DUP 753 verminderte die Angiotensin II Wirkung um 66% (p<0,05), während PD123177 keine signifikante Hemmung verursachte. Gabe beider Rezeptorblocker zeigte einen vergleichbaren hemmenden Effekt, wie die Gabe von DUP 753 alleine. Es ist daher wahrscheinlich, daß die Angiotensin II induzierte Expression von E-Selectin und die E-Selectin abhängige Adhäsion durch Angiotensin II Typ1 Rezeptoren vermittelt werden.

Abbildung 4.14: Wirkungen der Angiotensin II Rezeptorblocker DUP 753 (Typ1 Rezeptorblocker) und PD 123177 (Typ2 Rezeptorblocker) auf die Angiotensin II induzierte E-Selectin abhängige Adhäsion von HL60 Zellen. Makrovaskuläre koronare Endothelzellen wurden in Anwesenheit von DUP 753, PD123177 oder beiden Substanzen stimuliert und die Adhäsion von HL60 Zellen bestimmt. (n=5, * = p < 0,05; ** = p<0,01)


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4.2.2.3 Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation mit CD40 Ligand

CD40 gehört in die Gruppe der TNF-Rezeptoren und induzierte - ähnlich wie TNFalpha - die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1. In welchem Maße auch die Adhäsion von HL60 Zellen beeinflußt wird, wurde mit Hilfe des Adhäsionsassays untersucht. Zur Stimulation wurde eine Myelomzellline, die stabil mit CD154 transfiziert worden war (Klon P3x.TBA7), verwendet. Um parakrine Effekte auszuschließen, wurden die CD154 positiven Zellen zuvor mit 2% Paraformaldehyd fixiert.

Ähnlich wie nach Stimulation mit TNFalpha, das als Positivkontrolle verwendet wurde, kam es in allen Wandschubspannungsbereichen zu einer Zunahme der HL60 Zelladhäsion. Wandschubspannungsabhängig adhärierten relativ mehr Zellen bei niedrigen Schergraden. Allerdings waren die durch CD40 Stimulation induzierte Effekte deutlich geringer als die durch TNFalpha induzierten und betrugen im Wandschubspannungsbereich 2-2,6 dyn/cm2 36% und im Wandschubspannungbereich 1-1,9 dyn/cm2 55% der TNFalpha induzierten Adhäsion. CD154 negative Kontrollzellen (P3xWT) induzierten keine vermehrte Adhäsion im Vergleich zu unstimulierten Kontrollzellen. Die stimulierende Wirkung konnte vollständig mit einem blockierenden CD154 Antikörper (MoAB TRAP, 10 µg/ml) blockiert werden, während ein Kontrollantikörper gleichen Isotyps keine signifikante Hemmung vermittelte und so die Spezifität der Stimulation des CD40 Rezeptors belegten. Die E-Selectin Abhängigkeit wurde durch die Zugabe eines blockierenden E-Selectin Antikörpers bestätigt (MoAB BBA2, 10 µg/ml).


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Abbildung 4.15: E-Selectin abhängige Adhäsion von HL60 Zellen nach Stimulation von CD40. a) Nabelschnurvenen Endothelzellen wurden mit CD40 Ligand exprimierenden P3x.TBA7 Zellen für 4 Stunden stimuliert und anschließend die Adhäsion von HL60 Zellen im Wandschubspannungsbereich 1 - 1,9 dyn/cm2 bestimmt. b) Vergleich der Adhäsion nach Stimulation mit TNFalpha (500 U/ml), CD40 Ligand (200 000 P3x.TBA7 Zellen/cm2), CD40 Ligand negativen Zellen (P3xWT) sowie in Anwesenheit eines Anti-CD40 Antikörpers (MoAB TRAP, 10µg/ml) und eines Anti-E-Selectin Antikörpers (MoAB BBA2, 10 µg/ml). n=5, *=p<0,05, **=p<0,01 Kontrolle gegen TNFalpha; #=p<0,05, ##=p<0,01 gegen CD40 Ligand alleine; ++=p<0,01 TNFalpha gegen CD40 Ligand


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4.3 Diskussion der Ergebnisse

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigten, daß sowohl das Angiotensin II als auch CD40-CD40 Ligand Interaktionen entzündliche Reaktionen des Endothels aus der menschlichen koronaren Zirkulation spezifisch und charakteristisch modulieren.

Die Regulation der Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle durch verschiedene inflammatorische Zytokine ist von anderen Autoren ausführlich untersucht worden ( 24 , 27 , 37 , 139 , 148 ). Unbekannt war jedoch, daß auch Angiotensin II auf koronaren makrovaskulären Endothelzellen eine vermehrte E-Selectin Expression induziert. Diese Induktion der E-Selectin Expression war gefäßbettspezifisch, da nur eine geringe Expression auf Endothelzellen der Mikrozirkulation durch Angiotensin II induziert wurde ( 86 , 89 ). Gefäßbettspezifische Unterschiede der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie sie hier gefunden wurden, sind bisher in einem humanen System nicht beschrieben worden. Ein Grund liegt sicher darin, daß es keine geeigneten Modelle für diese Untersuchungen gab. In vivo Untersuchungen am Menschen sind dann möglich, wenn die Meßgrößen registrierbar sind, wie es z.B. bei hämodynamischen Meßgrößen der Fall ist. In Bezug auf die Bestimmung der Expression von Adhäsionsmolekülen war man bisher auf histologische Untersuchungen an Operations- oder Sektionsmaterial angewiesen ( 179 ). Um wenigstens indirekt eine Aussage über die Stärke der Expression von Adhäsionsmolekülen zu erhalten, wurde bei verschiedenen Erkrankungen die Konzentration der Adhäsionsmoleküle im Blut gemessen ( 2 ). Die Wertigkeit dieser Messungen ist bislang unklar. Möglicherweise können jedoch in Zukunft durch neue Techniken der in vivo Markierung von spezifischen Molekülen solche Untersuchungen durchgeführt werden ( 60 , 264 ).

Die an kultivierten humanen kardialen Endothelzellen untersuchten Mechnismen der Regulation von Adhäsionsmolekülen zeigte, daß die grundsätzlichen Regulationsmechanismen, die bei Endothelzellen aus Nabelschnurvenen beobachtet wurden, auch bei kardialen Endothelzellen auftraten ( 90 ): Die inflammatorischen Zytokine Tumor Nekrose Faktor


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(TNFalpha) und Interleukin-1 (IL-1) induzierten eine vermehrte Expression der drei Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin ( 25 , 181 , 191 ), Interleukin-4 ausschließlich von VCAM-1 ( 182 ).

Die durch Angiotensin II induzierte Stimulation der E-Selectin Expression erreichte etwa die Hälfte der maximal durch TNFalpha induzierbaren Wirkungen. Maximale Effekte wurden bei Angiotensin II Konzentrationen von 10-7 M beobachtet, bei denen auch andere Effekte des Angiotensin II in vitro beobachtet wurden ( 9 ).

Bemerkenswert war, daß bei Stimulation makrovaskulärer koronarer Endothelzellen mit TNFalpha niedrigere Konzentrationen als bei Stimulation mikrovaskulärer Endothelzellen notwendig waren, um vergleichbare Effekte zu induzieren. Es muß daher von einer besonders empfindlichen Regulation der E-Selectin Expression auf koronaren makrovaskulären Endothelzellen ausgegangen werden. Diese Empfindlichkeit der E-Selectin Regulation auf makrovaskulären koronaren Endothelzellen ist wohl auch der Grund dafür, daß dieser Effekt des Angiotensin II bisher nicht bekannt war, da als Modell meist Endothelzellen aus Nabelschnurvenen oder der Aorta verwendet wurden ( 5 , 138 , 169 ).

Neben den gefäßbettspezifischen Wirkungen des Angiotensin II zeigte sich auch hinsichtlich der Regulation der endothelialen Adhäsionsmoleküle eine Spezifität, da selektiv die E-Selectin Expression moduliert wurde, während die Expression anderer ebenfalls untersuchter endothelialer Adhäsionsmoleküle wie z.B. VCAM-1 und ICAM-1 nicht änderte. Kürzlich konnte Pueyo et al ( 195 ) und Tummala et al ( 241 ) zeigen, daß auf Rattenendothelzellen durch Angiotensin II eine VCAM-1 Expression induziert werden kann. Da die Autoren nicht die Expression anderer Adhäsionsmoleküle untersucht haben, muß offenbleiben, ob Angiotensin II in diesem Modell auch die Expression von E-Selectin induzieren kann.

Die in den Versuchen mit koronaren makrovaskulären Endothelzellen durch Angiotensin II induzierte Expression von E-Selectin ist auch funktionell wirksam, da sie zu einer vermehrten Adhäsion von Leukozyten in vitro führte. Entsprechend der nur geringen Stimulierbarkeit der E-Selectin Expression auf mikrovaskulären Endothelzellen konnte keine signifikante Steigerung der Leukozytenadhäsion an mikrovaskulären Endothelzellen beobachtet werden.

Die in Rattenendothelzellen beobachtete Induktion der VCAM-1 Expression durch


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Angiotensin II ( 195 , 241 ) ging mit einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-_B einher. NF-_B ist der wesentliche Transkriptionsfaktor der Regulation von E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 ( 51 , 52 ). Es kann daher davon ausgegangen werden, daß Angiotensin II auch die E-Selectin Expression über NF-_B induziert. Während bei glatten Muskelzellen die Signaltransduktion der Angiotensin Rezeptoren bereits ausführlich untersucht worden ist ( 19 , 262 ), sind die Effekte des Angiotensin II auf Endothelzellen weit weniger gut untersucht. Möglicherweise bewirkt Angiotensin II, ähnlich wie bei glatten Muskelzellen, zunächst eine Induktion von IL-6, das dann NF-_B und nachfolgend E-Selectin aktiviert ( 96 ).

Aus Versuchen mit glatten Muskelzellen und Endothelzellen ist bekannt, daß Angiotensin II auch an der Regulation der NADPH Oxidase beteiligt ist ( 93 , 100 ). Stimulation dieser Zellen mit Angiotensin II führte zu einer vermehrten intrazellulären Produktion von Sauerstoffradikalen.

Die Untersuchungen von Schreck et al ( 210 ) aber auch anderer Autoren ( 259 ) legen nahe, daß Sauerstoffradikale ein möglicher Aktivierungsmechanismus des Transkriptionsfaktors NF-_B sein könnten. Es wäre daher vorstellbar, daß Angiotensin II auch über Stimulation der NADPH Oxidase und Erhöhung intrazellulärer Sauerstoffradikalkonzentrationen eine Aktivierung des NF-_B und damit des E-Selectins induziert. Chen et al. konnten an glatten Muskelzellen nachweisen, daß die Angiotensin II abhängige Stimulation eines weiteren NF-_B abhängigen Gens, des Chemokins MCP-1, durch Katalase gehemmt wird ( 45 ). Diese Befunde sprechen für die Beteiligung von Sauerstoffradikalen an der Signaltransduktion des Angiotensin II.

Auf koronaren Endothelzellen konnten durch Bindungsstudien, RT-PCR und durch funktionelle Untersuchungen sowohl AT1 als auch AT2 Rezeptoren nachgewiesen werden ( 145 , 228 ). Neben den klassischen Angiotensin-Rezeptoren wurden andere, atypische Angiotensin-Rezeptoren auf Endothelzellen vermutet ( 127 , 193 ).

Um die Frage zu klären, welche Angiotensin-Rezeptoren an der Induktion der E-Selectin Expression auf koronaren Endothelzellen beteiligt sind, wurden spezifische Rezeptorantagonisten für AT1 und AT2 Rezeptoren verwendet. Die hier erhobenen Ergebnisse mit


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humanen koronaren Endothelzellen zeigten funktionell lediglich Wirkungen von AT1 Rezeptoren. Ob dieses daran liegt, daß AT2 Rezeptoren keine Rolle bei der Regulation des E-Selectins spielen oder aber die hier verwendeten humanen koronaren Endothelzellen durch die Kulturbedingungen keine AT2 Rezeptoren exprimierten, kann nicht entschieden werden. Dazu wären z.B. in-situ Hybridisierungsmarkierungen notwendig, die bisher für Angiotensin Rezeptoren nicht gelungen sind. Es könnte so auch geklärt werden, welche Zellspezies AT2 Rezeptoren exprimiert, da in menschlichem Myokardgewebe der AT2 Rezeptor der dominierende Rezeptor zu sein scheint ( 197 ).

Die E-Selectin Induktion auf koronaren Endothelzellen durch AT1 Rezeptoren findet eine Entsprechung in Befunden, die für die Induktion der VCAM-1 Expression durch Angiotensin II erhoben wurden ( 195 ). Sie zeigten, daß die VCAM-1 Expression an Rattenendothelzellen ebenfalls durch AT1 Rezeptoren vermittelt wurde.

Neben den bisher unbekannten Wirkungen des Angiotensin II auf die E-Selectin Expression und E-Selectin abhängige Leukozytenadhäsion wurde ein weiterer Mechanismus der Regulation von Adhäsionsmolekülen, der in der Pathogenese arteriosklerotischer Plaques von Bedeutung sein könnte, untersucht: die Interaktion von endothelialen CD40 Rezeptoren und ihren auf aktivierten T-Lymphozyten exprimierten Liganden CD154.

CD40 ist ein Rezeptor der strukturelle Ähnlichkeiten mit den TNF-Rezeptoren besitzt und daher, sowie aufgrund der Signaltransduktion, über sogenannte TNF Rezeptor assoziierte Proteine (TRAFs) zur Familie der TNF-Rezeptoren gezählt wird ( 17 , 20 ). Aus Versuchen mit CD40 Rezeptor stimulierenden Antikörpern ging hervor, daß CD40 ähnliche proinflammatorische Effekte auf Endothelzellen wie TNFalpha ausübt ( 122 ); die Effekte erschienen in den verwendeten Systemen aber gering zu sein.

Der Ligand des CD40, CD154, wird auf aktivierten CD4+ T-Lymphozyten exprimiert. CD154 kommt auch in einer löslichen Form vor ( 12 ), im Gegensatz zu TNFalpha ist die biologische Wirkung des sezenierten CD154 jedoch nicht gesichert. Daher muß davon ausgegangen werden, daß seine Wirkung an die Anwesenheit CD154 positiver Zellen gebunden ist.


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Die Bedeutung des CD40 Systems wurde weiterhin durch die Beobachtung unterstrichen, daß aktivierte Thrombozyten ebenfalls CD154 exprimieren und damit Endothelzellen zur Expression von Adhäsionsmolekülen und Sekretion von Chemokinen aktivieren können. Da die Bildung thrombozytenhaltiger Thromben eine häufige Komplikation arteriosklerotischer Plaques darstellt ( 65 ), ergibt sich eine neue Bewertung von Thromben für die Pathogenese der Arteriosklerose.

Zur Untersuchung der inflammatorischen Wirkungen durch Interaktionen von CD40 - CD154 wurde die Wirkung der CD40 Rezeptorstimulation auf die Expression von Adhäsionsmolekülen und auf die Leukozytenadhäsion an kardialen mikrovaskulären Endothelzellen und Nabelschnurvenen Endothelzellen untersucht. In den hier durchgeführten Versuchen wurde zur Stimulation des CD40 Rezeptors auf Endothelzellen nicht ein stimulierender Antikörper oder der lösliche Ligand, sondern eine mit CD40 Ligand (CD154) transfizierte Myelomzellinie verwendet ( 84 , 85 ), die der in vivo Situation mit CD154 positiven aktivierten T-Lymphozyten ähnlich ist.

Es wurden durch CD40 Stimulation ähnliche Effekte wie durch Stimulation mit TNFalpha in Bezug auf Expression von Adhäsionsmolekülen und Adhäsion von Leukozyten beobachtet. Die CD40 Ligand induzierten Effekte erreichten ca. 50% der TNFalpha induzierten Effekte und waren also insgesamt schwächer als die durch TNFalpha induzierten. Trotz dieser etwas schwächeren Wirkungen induzierte die Stimulation des CD40 Rezeptors auf Endothelzellen ein inflammatorisches Signal, das für entzündliche Reaktionen von Bedeutung sein könnte ( 26 , 111 ), jedoch aufgrund der Lokalisation des CD154 Rezeptors auf Lymphozyten lokal begrenzt auftritt, im Gegensatz zu den humuralen Wirkungen des TNFalpha.

Stimulation des CD40 Rezeptor aktiviert unter anderem den Transkriptionsfaktor NF-_B ( 106 ). Ähnlich wie bei den TNF-Rezeptoren induziert die Bindung des Liganden an den Rezeptor eine Aktivierung verschiedenenr TRAFs, die dann zur Aktivierung des I-_B-NF-_B Systems führen ( 46 ). Es ist daher auch verständlich, daß das Wirkungsspektrum des TNFalpha und des CD40 Rezeptors ähnlich ist und neben der Aktivierung von Adhäsionsmolekülen und Chemokinen auch Gewebefaktor (tissue factor) einschließt ( 217 ).

Neben diesen in vitro Untersuchungen zeigen die Untersuchungen anderer Autoren die Be


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deutung der CD40- CD154 Interaktionen für die Pathogenese der Arteriosklerose. So konnte an einem Arteriosklerosemodell mit LDL Rezeptor-defizienten Mäusen gezeigt werden, daß die Unterbrechung der CD154 - CD40 Interaktion mit CD154 Antikörpern die Größe arteriosklerotischer Läsionen und ihren Lipidgehalt stark verminderte. Außerdem zeigten die mit Anti-CD154 behandelten Tiere weniger Makrophagen und T-Lymphozyten und eine niedrigere Expression von VCAM-1 im Bereich arteriosklerotischer Läsionen ( 150 , 151 ).

Vielfältige Befunde haben die Bedeutung des RAS für die Pathogenese der Arteriosklerose aufgezeigt. Frühe Befunde zeigten eine Korrelation des Plasmareninspiegels und dem Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse ( 32 ). Neuere Befunde legen nahe, daß hypertensive Patienten mit dem Deletionspolymorphismus DD des ACE Gens, der mit höheren Plasma ACE-Spiegeln einhergeht, ein höheres Risiko an einem Myokardinfarkt zu erkranken, besitzen ( 38 , 188 ). Behandlung von Patienten mit eingeschränkter linksventrikulärer Funktion und nach Myokardinfarkt zeigten eine bessere Prognose als Patienten, die nicht mit einem ACE-Hemmer behandelt wurden ( 3 , 183 ). Auch tierexperimentelle Studien zeigten positive Wirkungen von ACE-Hemmern bei der Restenosebildung nach Ballonangioplastie ( 192 ) und in bestimmten Arteriosklerosemodellen ( 47 ). Alle diese Befunde konnten durch die hämodynamischen Effekte der ACE-Hemmer nicht erklärt werden. Unter Einbeziehung der hier gewonnen Ergebnisse muß die Ansicht, daß ACE-Hemmer nicht nur durch ihre hämodynamischen Effekte wirksam sind, bestärkt werden. Eine Verminderung der Angiotensin II Bildung würde neben blutdrucksenkenden Effekten und trophischen Wirkungen auf glatte Muskelzellen ( 206 ) auch die proinflammatorischen Effekte des Angiotensin II auf das vaskuläre Endothel vermindern und so zu einer verminderten Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokinen, sowie zu einer verminderten Rekrutierung mononuklärer Zellen in arteriosklerotische Gefäßabschnitte führen. Damit wird erstmals eine Verbindung zwischen dem RAS und dem Entstehen und der Progression arteriosklerotischer Läsionen aufgezeigt.

Diese Befunde können die Grundlage für ein differenziertes therapeutisches Vorgehen bei kardiovaskulären Erkrankungen bilden. So kann eine ACE hemmende Medikation nicht nur als eine blutdrucksenkende Therapie verstanden werden, sondern darüber hinaus - aufgrund


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der günstigen zellulären Wirkungen - auch als eine antiarteriosklerotische Therapie.

Auch eine antiaggregatorische Therapie bekommt durch die dargestellen Befunde eine Erweiterung als antiarteriosklerotische Therapie: wie oben dargestellt, können aktivierte T-Lymphozyten und Blutplättchen durch Stimulation des CD40 Rezeptors einen inflammatorischen Stimulus auf Endothelzellen ausüben. Eine antiaggregatorische Therapie würde durch Hemmung der Plättchenaktivierung lokale Entzündungsreaktionen vermindern und somit nicht nur die Bildung von Gefäßthromben reduzieren, sondern auch langfristig plättcheninduzierte proarteriosklerotische Wirkungen vermindern.

Dies sind zwei Beispiele dafür, daß durch die Etablierung des hier geschilderten Untersuchungsmodells mit kultivierten kardialen Endothelzellen neue Denkmodelle der pathophysiologischen Zusammenhänge entstehen können und die Differentialtherapie kardiovaskulärer Erkrankungen neue Beurteilungskritierien bekommt.


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Mon Aug 19 9:38:56 2002